專利名稱：從福爾馬林固定的毛發(fā)干內(nèi)抽提dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從特殊毛發(fā)千內(nèi)DNA抽提的方法。
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，福爾馬林常用作動(dòng)物組織標(biāo)本、醫(yī)學(xué)尸體及病理組織標(biāo)本的防腐固定。 有文獻(xiàn)報(bào)道福爾馬林對(duì)固定后的標(biāo)本組織的遺傳信息存在一定的破壞，且浸泡固定的時(shí)間越 長(zhǎng)對(duì)DNA破壞越大。
毛發(fā)分為毛干和毛根兩部分，主要成分為角質(zhì)蛋白，包括纖維蛋白與富含胱氨酸的非螺 旋蛋白，正是這種角質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)使得其具有不易腐爛的特點(diǎn)，因而在古墓遺骸清理過(guò)程中， 大多數(shù)古墓主人遺骸僅殘存毛發(fā)與骨。同時(shí)，毛發(fā)也是法醫(yī)鑒定常用的證物之一。利用毛發(fā) 進(jìn)行遺傳物質(zhì)提取時(shí)，常選用含毛囊細(xì)胞的毛根部分，這是因?yàn)閺拿壹?xì)胞中獲取遺傳物質(zhì) 相對(duì)毛發(fā)干要容易很多。但在考古學(xué)和法醫(yī)學(xué)鑒定中，常常因發(fā)現(xiàn)時(shí)間太晚毛囊己經(jīng)丟失， 或者由于防腐液浸泡時(shí)間過(guò)久毛根部分已經(jīng)破壞。而從毛干部分提取遺傳物質(zhì)則相對(duì)困難。 目前，已有從新鮮毛發(fā)干內(nèi)提取基因組的報(bào)道，也有從浸泡短暫固定的組織標(biāo)本內(nèi)提取基 因組的報(bào)道，但尚未有從長(zhǎng)期浸泡固定的毛發(fā)干中提取基因組的成功例子，這一方面由于 毛發(fā)干是角質(zhì)化組織、主成分為蛋白質(zhì)，毛干部分消化難；另一方面，福爾馬林不僅具有與 蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使其活性位點(diǎn)的活性降低或喪失，而且也能促使DNA-DNA交聯(lián)和 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)導(dǎo)致DNA的斷裂與提取困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在解決福爾馬林長(zhǎng)期浸泡固定的毛發(fā)干中難以提取遺傳物質(zhì)的難題，提 供一種從福爾馬林浸泡固定的毛發(fā)干、脫離肌體較長(zhǎng)時(shí)間的毛發(fā)干、古毛發(fā)干等各類非新鮮 的毛發(fā)干中提取DNA的方法。
本發(fā)明的詳細(xì)技術(shù)方案為(1)毛發(fā)干預(yù)處理取毛發(fā)干，充分洗滌除盡雜質(zhì)，隨后依
次用質(zhì)量濃度2.0M的NaOH與2.(P/o的HCr冼滌，之后用無(wú)菌蒸餾水多次漂洗，依次用梯度 酒精洗滌，無(wú)菌條件下晾干備用；(2)毛發(fā)干的修復(fù)處理0'C-10'C下把毛發(fā)干在裝有0.01 mmol/L的檸檬酸鈉溶液的勻漿器內(nèi)磨碎，直到肉眼看不到毛發(fā)干碎片，轉(zhuǎn)移研磨液至新的滅 菌EP管中，沸水浴5 15min;自然降至室溫后加入無(wú)水乙醇混勻，室溫靜置，離心，收集 沉淀；(3)抽提DNA:向沉淀中加入頭發(fā)消化液和蛋白酶K溶液，37'C 57'C水浴，持續(xù)消 化1~2小時(shí);消化完畢后以酚/氯仿/異戊醇方法提取DNA。上述頭發(fā)消化液的成分如下:Tris-Cl 10mmol/L (pH為8.0)、 NaCl 100 mmol/L、 CaCl2 1.0mmoI/L、 DTT 20~200 mmol/L、 SDS質(zhì) 量百分比含量0.5%~5.0°/0、 Triton X-100體積百分比含量0.5%~4.0 %、其余為無(wú)菌雙蒸水。
3蛋白酶K溶液的濃度為500 li g ~50mg/ml。
本發(fā)明先利用適當(dāng)高溫，不僅使甲醛-蛋白質(zhì)、甲醛-DNA、 DNA-DNA、 DNA-蛋白質(zhì)等 交聯(lián)之間的鍵打開(kāi)，而且使蛋白質(zhì)封閉的活性位點(diǎn)的活性部分或全部恢復(fù)。同時(shí)，為了消除 長(zhǎng)時(shí)間高溫存在的負(fù)面影響，通過(guò)把古尸毛發(fā)干研磨至碎，增大了與熱接觸的表面積從而縮 短高溫修復(fù)的時(shí)間，修復(fù)過(guò)程中釋放出來(lái)的甲醛類有害物質(zhì)通過(guò)離心去除。樣品再用本發(fā)明 的消化液和蛋白酶K消化，然后通過(guò)酚氯仿抽提，以獲取足夠量的高質(zhì)量的DNA。相對(duì)于現(xiàn) 有的EDTA-SDS-酶解、SDS-酶解、Triton X-100-酶解等方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是先對(duì)毛發(fā)干樣 品進(jìn)行修復(fù)，使其蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)的活性得以全部或部分恢復(fù)，以更好地發(fā)揮蛋白酶的酶 解活性。此外，本發(fā)明消化液的配制充分考慮毛發(fā)千裂解的特點(diǎn)，大大提高了毛發(fā)裂解效率， 縮短了毛發(fā)消化的時(shí)間。本方法不僅可以用于福爾馬林浸泡的毛發(fā)干內(nèi)基因組的抽提，而且 還可用于古毛發(fā)干內(nèi)基因組的抽提，獲得的基因組質(zhì)量好、濃度高，可廣泛應(yīng)用于分子生態(tài) 多樣性、分子鑒定、目的基因擴(kuò)增、系統(tǒng)進(jìn)化等各項(xiàng)研究。本發(fā)明的方法高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單 且易于操作。


圖1從實(shí)施例1~3得到的基因組DNA擴(kuò)增后的電泳圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
從福爾馬林固定10年的毛發(fā)中取遠(yuǎn)離毛囊2cm的毛發(fā)干20cm，先用洗滌精充分洗滌， 除去頭發(fā)上的所有雜質(zhì)，用無(wú)菌蒸餾水多次漂洗，隨后用無(wú)菌的2.0 %的NaOH洗滌5分鐘， 接著用無(wú)菌的2.0 %的HC1洗漆5分鐘，之后用無(wú)菌蒸餾水漂洗至少3次，再依次用75%和 無(wú)水乙醇各洗漆一次，晾干后備用。
2°。條件下把毛發(fā)干在裝有300 u 1 pH為6.0、濃度為0.01 mmol/L的檸檬酸鈉修復(fù)液的 勻漿器內(nèi)磨碎，以肉眼看不到毛發(fā)干碎片方可，轉(zhuǎn)移研磨液至新的滅菌容積為2 ml的EP管 中，勻漿器用等體積的新鮮的修復(fù)液洗滌2次并都轉(zhuǎn)入到EP管中，隨后沸水浴修復(fù)8min。 修復(fù)完畢后自然降至室溫時(shí)加入等體積無(wú)水乙醇混勻后，室溫靜置15 min， 14000Xg離心 20min,收集沉淀。
向沉淀中加入溫度為56'C的毛發(fā)消化液600ul，頭發(fā)消化液的各成分組成為pH為8.0 的Tris-Cl的含量10 mmol/L、 NaCl的含量100 mmol/L、 CaCl2的含量1.0 mmol/L、 DTT的含 量80.0mmol/L、 SDS的質(zhì)量百分比含量2.0 %、 Triton X-100體積百分比含量2.0 %、其余為 無(wú)菌雙蒸水。再加入10ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，56'C水浴，每10分鐘輕 輕顛倒EP管數(shù)次，持續(xù)消化1小時(shí)。
消化完畢后向離心管中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(V/V/V: 25: 24: 1)，上下輕輕倒
轉(zhuǎn)EP管充分混勻，室溫(25°C)靜置10min,接著在2'C下，14000g離心14 min，輕輕收集上清液并轉(zhuǎn)入到新的離心管中。將上清液用酚/氯仿/異戊醇重復(fù)抽提一次，收集上清液。
向上清液中加入2.5倍體積的-20'C冷凍的無(wú)水乙醇，上下輕輕倒轉(zhuǎn)離心管10次后，室溫置于沉淀lh后，2'C 10000Xg離心10min，收集沉淀。
沉淀用含10%乙醇的0.1M擰檬酸鈉洗滌沉淀。每用lml消化液加入2ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2'C條件下10000Xg離心5分鐘，棄上清。重復(fù)該步驟一次。隨后，沉淀用75%乙醇洗沉淀1次，每用lml消化液A加入2ml 75%乙醇，室溫放置10分鐘，不時(shí)顛倒混合，2'C條件下10000Xg離心5分鐘，棄上清。接著，用100%乙醇洗滌沉淀1次，每用lml消化液A加入2. ml 75%乙醇，室溫放置20分鐘，不時(shí)顛倒混合，2'C條件下10000Xg離心5分鐘，棄上清，收集沉淀。沉淀物置于室溫干燥15分鐘后，加適量TE或無(wú)菌雙蒸水溶解沉淀，即為毛發(fā)遺傳信息DNA提取液，4'C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2
取福爾馬林固定30年的毛發(fā)，取遠(yuǎn)離毛囊的2cm處截取毛發(fā)干20cm，先用洗滌精充分洗滌，除盡頭發(fā)上的所有雜質(zhì)，用無(wú)菌蒸餾水漂洗8次，隨后用無(wú)菌的2.0。/。的NaOH洗滌5分鐘，接著用無(wú)菌的2.0 n/。的HCl洗滌5分鐘，之后用無(wú)菌蒸餾水漂洗至少3次，再依次用75%和無(wú)水乙醇各洗滌一次，晾干后備用。
修復(fù)樣品的制備與修復(fù)處理下把毛發(fā)干在裝有300iUpH為6.0，濃度為0.01 mmol/L的檸檬酸鈉修復(fù)液的勻漿器內(nèi)磨碎,以肉眼看不到毛發(fā)干碎片方可，轉(zhuǎn)移研磨液至新的滅菌容積為2 ml的EP管中，勻槳器用等體積的新鮮的修復(fù)液洗滌2次并都轉(zhuǎn)入到EP管中，隨后沸水浴修復(fù)15min。修復(fù)完畢后自然降至室溫時(shí)加入等體積無(wú)水乙醇混勻后，室溫靜置15min，14000X g離心20min，收集沉淀。
向沉淀中加入溫度為56。C的600 iU毛發(fā)消化液，頭發(fā)消化液的組成為pH為8.0的Tris-Cl的含量10 mmol/L、 NaCl的含量100 mmol/L、 CaCl2的含量1.0 mmol/L、 DTT的含量500.0 mmol/L、 SDS的質(zhì)量百分比含量4.0 %、 Triton X-100體積百分比含量4.0 %、溶劑為無(wú)菌雙蒸水。再加入10ul濃度為50mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，56'C水浴，每10分鐘輕輕顛倒EP管數(shù)次，持續(xù)消化1小時(shí)。
其余抽提DNA步驟同實(shí)施例1。 一
實(shí)施例3
從清代木伊毛發(fā)，木伊距今300年，取毛發(fā)中遠(yuǎn)離毛囊的毛發(fā)干20cm，先用洗滌精充分洗滌，除靜頭發(fā)上的所有雜質(zhì)，用無(wú)菌蒸餾水多次漂洗，隨后用無(wú)菌的2.0 。/。的NaOH洗滌5分鐘，接著用無(wú)菌的2.0 Q/。的HC1洗滌5分鐘，之后用無(wú)菌蒸餾水漂洗至少3次后，依次用75%和無(wú)水乙醇各洗滌一次，晾干后備用。
修復(fù)樣品的制備與修復(fù)處理5'C條件下把毛發(fā)干在裝有300ulpH為6.0，濃度為O.Ol
5mmol/L的檸檬酸鈉修復(fù)液的勻槳器內(nèi)磨碎至肉眼看不到毛發(fā)干碎片，轉(zhuǎn)移研磨液至新的滅菌容積為2 ml的EP管中，勻漿器用等體積的新鮮的修復(fù)液洗漆2次并都轉(zhuǎn)入到EP管中，隨后沸水浴修復(fù)5min。修復(fù)完畢后自然降至室溫時(shí)加入等體積無(wú)水乙醇混勻后，室溫靜置15 min，14000Xg離心20min，收集沉淀。
向沉淀中加入溫度為56°C的毛發(fā)消化液600 " 1，頭發(fā)消化液的組成為:pH為8.0的Tris-Cl的含量10 mmol/L、 NaCl的含量100 mmol/L、 CaCl2的含量1.0 mmol/L、 DTT的含量40.0mmol/L、 SDS的質(zhì)量百分比含量1.0%、 Triton X-100體積百分比含量1.0 %、溶劑為無(wú)菌雙蒸水。再加入10ul濃度為lmg/ml的蛋白酶K，充分混勻，56。C水浴，每10分鐘輕輕顛倒EP管數(shù)次，持續(xù)消化3小時(shí)。 —
其它抽提DNA步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例4 PCR擴(kuò)增實(shí)施例1~3得到的DNA
將實(shí)施例1~3中得到的基因組DNA作為模版，用線粒體短片段重復(fù)序列引物行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物3%瓊脂糖電泳。電泳圖見(jiàn)附圖1，其中泳道1~4依次代表Alu I site位點(diǎn)、Contro1region(L16209)位點(diǎn)、HaeIII位點(diǎn)、HincII位點(diǎn)的陰性對(duì)照；泳道5~8依次為實(shí)施例1:獲得的長(zhǎng)約106bp的Alu I site位點(diǎn)序列、約131bp的Control region(L16209)位點(diǎn)序列、約89 bp的HaeIII位點(diǎn)序列、約75bp的HincII位點(diǎn)序列；泳道9 12代表實(shí)施例2，仍獲得Alu I site位點(diǎn)序列、Control region(L16209)位點(diǎn)序列、HaeIII位點(diǎn)序列和HincII位點(diǎn)序列；泳道13-16代表實(shí)施例3，仍獲得Alu I site位點(diǎn)序列、Control region(L16209)位點(diǎn)序列、HincII位點(diǎn)序列，但未獲得HaeIII位點(diǎn)序列；泳道17代表50bp marker;每條泳道都有一條小于50bp的DNA亮帶，是引物二聚體。
權(quán)利要求
1.一種從福爾馬林固定的毛發(fā)干內(nèi)抽提DNA的方法，其特征在于包含下列步驟(1)毛發(fā)干預(yù)處理取毛發(fā)干，充分洗滌除盡雜質(zhì)，隨后依次用質(zhì)量濃度2.0％的NaOH與2.0％的HCl洗滌，之后用無(wú)菌蒸餾水多次漂洗，再依次用梯度酒精洗滌，無(wú)菌條件下晾干備用；(2)毛發(fā)干的修復(fù)處理0℃～10℃下把毛發(fā)干在裝有0.01mmol/L的檸檬酸鈉溶液的勻漿器內(nèi)磨碎，直到肉眼看不到毛發(fā)干碎片，轉(zhuǎn)移研磨液至新的滅菌管中，沸水浴5～15min；自然降至室溫后加入無(wú)水乙醇混勻，室溫靜置，離心，收集沉淀；(3)抽提DNA向沉淀中加入頭發(fā)消化液和蛋白酶K溶液，37℃～57℃水浴，持續(xù)消化1～2小時(shí)；消化完畢后以酚/氯仿/異戊醇方法提取DNA；所述頭發(fā)消化液的成分如下Tris-Cl 10mmol/L(pH為8.0)、NaCl 100mmol/L、CaCl21.0mmol/L、DTT 20～500mmol/L、SDS質(zhì)量百分比含量0.5％～5.0％、Triton X-100體積百分比含量0.5％～4.0％、其余為無(wú)菌雙蒸水；蛋白酶K溶液的濃度為0.5mg～50mg/ml。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述頭發(fā)消化液的成分如下Tris-Cl 10 mmol/L (pH為8.0)、 NaCl 100 mmol/L、 CaCl2 1.0腿ol/L、 DTT 40~500 mmol/L、 SDS質(zhì)量百分比含量1%~5.0%、 TritonX-100體積百分比含量1%~4.0 %、其余為無(wú)菌雙蒸水；所述蛋白酶K溶液的濃度為20mg 50mg/mL。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述頭發(fā)消化液的成分如下 Tris畫Cl 10 mmol/L (pH為8.0)、 NaCl 100 mmol/L、 CaCl2 1.0mmol/L、 DTT 500 mmol/L、 SDS質(zhì)量百分比含量4.0。/。、 Triton X-100體積百分比含量4.0%、其 余為無(wú)菌雙蒸水；所述蛋白酶K溶液的濃度為50mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從福爾馬林固定的毛發(fā)干內(nèi)抽提DNA的方法，將毛發(fā)干洗滌預(yù)處理后，0℃～10℃下把毛發(fā)干在裝有0.01mmol/L的檸檬酸鈉溶液的勻漿器內(nèi)磨碎，沸水浴5～15min，修復(fù)毛發(fā)干；加乙醇靜置、離心收集沉淀；向沉淀中加入頭發(fā)消化液和蛋白酶K溶液，37℃～57℃水浴，持續(xù)消化1～2小時(shí)；消化完畢后提取DNA。本發(fā)明先對(duì)毛發(fā)干樣品進(jìn)行修復(fù)，使其蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)的活性得以全部或部分恢復(fù)。此外，消化液的配制充分考慮毛發(fā)干裂解的特點(diǎn)，大大提高了毛發(fā)裂解效率，縮短了毛發(fā)消化的時(shí)間。本方法不僅可以用于福爾馬林浸泡的毛發(fā)干內(nèi)基因組的抽提，而且還可用于古毛發(fā)干內(nèi)基因組的抽提。
文檔編號(hào)C07H21/04GK101492486SQ20091004286
公開(kāi)日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者曾樂(lè)平, 慧 王, 童建斌, 羅學(xué)港, 旦 陳, 黃菊芳 申請(qǐng)人:中南大學(xué)