專利名稱：參與紅薯中類胡蘿卜素累積的IbOrange基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自含有大量類胡蘿卜素的“Shinwhangmi”甘薯的Orange基因。更 具體地，本發(fā)明涉及通過控制基因表達能夠提高類胡蘿卜素產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，其是通過控制 與類胡蘿卜素的生物合成有關(guān)并且參與成色素細(xì)胞中的類胡蘿卜素累積的基因以及編碼 所述蛋白質(zhì)的基因完成的。
背景技術(shù)：
甘薯(Ipomoea batatas L. Lam)為一種能夠在相對貧瘠的土壤中種植的塊根作 物，其每公頃的產(chǎn)量高達約30噸。因此，其通常作為人類食用的食物和牲畜的飼料。特別 地，在干物質(zhì)中大約70%為淀粉，甘薯早已被用于獲取醇的原材料，現(xiàn)在也是被認(rèn)為作為是 一種環(huán)保型的作物，其可作為一種替代能源而使用，即用于生產(chǎn)生物乙醇。由于近年急劇的工業(yè)化和人口增長，世界各地的環(huán)境和糧食問題尤為突出。因 此，目前人們正在積極開發(fā)能夠抵抗荒漠區(qū)、污染區(qū)或寒冷區(qū)等等的極端環(huán)境條件的農(nóng)業(yè) 作物。特別地，為了開發(fā)具有產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢并可在上述惡劣環(huán)境區(qū)域中種植的甘薯，目前人們正 基于分子培育方法，開發(fā)具有抵抗惡劣條件的環(huán)境的轉(zhuǎn)基因甘薯(Limet al.Mol Breeding 19，227-239，2007)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的報道，有超過十億的兒童患有維生素A缺乏癥，由此造 成每年超過50萬兒童失明。胡蘿卜素是維生素A的前體化合物。鑒于胡蘿卜素具 有的作為營養(yǎng)加強劑和食物援助的生理活性，關(guān)于食品中類胡蘿卜素的積累代謝研究對于 提高其營養(yǎng)價值是一個重要的研究課題。胡蘿卜素被認(rèn)為是具有較高抗氧化活性的物 質(zhì)，不僅因為其生理活性，而且因為其在植物自身在對抗氧化應(yīng)激的防御機制中起到的關(guān) 鍵作用。最近，人們發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素的生物合成受一種植物激素ABA的影響。因此，有必 要進一步研究以確定這些抗氧化物質(zhì)和環(huán)境壓力間的關(guān)系。同時，康奈爾大學(xué)(美國)的Lu等人報告指出突變Orange基因與菜花的成色素 細(xì)胞中的類胡蘿卜素的累積有關(guān)(Lu S等，2006 Plant Cell. 18 :3594-3605,2006) 發(fā)明詳述技術(shù)問題本發(fā)明系針對上述需要而設(shè)計。本發(fā)明的發(fā)明人從具有高含量的類胡蘿卜素的 “arinwhangmi”甘薯中克隆了 Orange基因。因此，在對大腸桿菌中的重組蛋白的生成進行 確認(rèn)之后，本發(fā)明得以完成。技術(shù)方案為了解決上述問題，本發(fā)明提供了來源于甘薯的與類胡蘿卜素累積相關(guān)的 IbOrange 蛋白。進一步地，本發(fā)明提供編碼rtOrange蛋白質(zhì)的基因。進一步地，本發(fā)明提供包含rtOrange基因的重組載體。進一步地，本發(fā)明提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
更進一步地，本發(fā)明提供為rtOrange基因的擴增設(shè)計的引物對。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠確定的是Orange蛋白質(zhì)的表達和源于“Shinwhangmi”甘薯的 Orange基因由諸如ABA、乙烯磷、茉莉酸甲酯、水楊酸等與植物干旱應(yīng)激和防御機制有關(guān)的 植物激素誘導(dǎo)。因此，可以預(yù)期的是，通過由H3Orange基因提高類胡蘿卜素的含量，能夠開 發(fā)出不僅具有改進功能而且對環(huán)境壓力具有抵抗力的植物。


圖1表示源自甘薯(“Shinwhangmi ”)的Orange基因的核苷酸序列和由此推測出 的氨基酸序列。下劃線區(qū)域表示質(zhì)粒定位信號，由942bp組成的cDNA編碼由313個氨基酸 組成的蛋白質(zhì)。圖2表示由本發(fā)明的甘薯(Ipomoea batatas)的IbOrange基因推測出orange蛋 白質(zhì)的氨基酸序列，其中也記載來自其它各種植物的氨基酸序列用于比對(牽牛花、番茄、 葡萄、黃豆、大豆、棉花、擬南芥、花椰菜、高粱、玉米、水稻和大麥)。圖3表示由本發(fā)明的甘薯(Ipomoea batatas)的BOrange推斷的氨基酸序列和 來自其它各種植物(牽牛花、番茄、葡萄、黃豆、大豆、棉花、擬南芥、花椰菜、高粱、玉米、水 稻和大麥)的Orange基因間的基因相似性關(guān)聯(lián)。圖4表示由RT-PCR測定的本發(fā)明的rtOrange基因的表達類型以及各種種類 的甘薯的電泳。在該圖中，分別地，Ym表示“Yoolmi”，Jm表示“Shinjami ”并且Hm表示 “Shinwhangmi”。圖5表示由RT-PCR測定的本發(fā)明的rtOrange基因的表達類型以及甘薯的各部分 的電泳。特別地，L表示葉子，S表示莖，其它包括貯藏根、須根以及厚的色素根。圖6表示由RT-PCR測定的本發(fā)明的rtOrange基因的表達類型以及用植物激素 (諸如ABA、乙烯磷(即乙炔的前體)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA))處理的甘薯的葉 和根的電泳并且在處理后的0、12、24、36或48小時進行RT-PCR。圖7表示該蛋白質(zhì)的電泳結(jié)果，其表明，泳道1，在大腸桿菌中的rtOrange的重組 蛋白的產(chǎn)生；泳道2，具有His-tag的可溶的^Orange ；泳道3，具有His-tag的不可溶的 IbOrange ；以及泳道4，具有GST-tag的不可溶的IbOrange。本發(fā)明的最佳實施方式為實現(xiàn)上述本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供源自甘薯(Ipomoea batatas)的^Orange 蛋白質(zhì)，其與類胡蘿卜素累積相關(guān)。本發(fā)明H3Orange蛋白質(zhì)的范圍包括，從“Shinwhangmi”甘薯中分離的具有SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)以及所述蛋白質(zhì)的功能等價物。術(shù)語“功能等價物” 指的是，氨基酸殘基添加、取代或缺失的產(chǎn)物，其具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列的至少 70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、更為優(yōu)選地至少95%的同源性的氨基酸序列， 因此表現(xiàn)為具有與SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)基本上相同生理活性的蛋白質(zhì)。進一步地，本發(fā)明提供編碼上述rtOrange蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的基因包括編碼 rtOrange蛋白質(zhì)的基因組DNA和cNDA。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因可以包含由SEQ ID N0:1所 表示的核苷酸序列。另外，鑒于rtOrange基因?qū)?yīng)于多基因家族并且具有包含在甘薯中的各種同源基因，本發(fā)明的H3Orange基因不僅可以包括具有SEQ ID NO :1所表示的核苷酸序 列的rtOrange基因也包括BOrange基因的多基因家族。進一步地，本發(fā)明的范圍也包括該核苷酸序列的突變體。特別地，上述基因可以含 有具有與SEQ ID NO :1的核苷酸序列的至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%、更 為優(yōu)選地至少95%的同源性的核苷酸序列。所述針對特定的聚核苷酸的“序列同源性％” 通過比較對齊的兩個序列的比較區(qū)域來確定。鑒于此，在比較區(qū)域中的部分聚核苷酸可以 包含相比于與所述兩個序列的最優(yōu)比對相關(guān)的參考序列(沒有任何添加或缺失)的添加或 缺失(即間隔)。本發(fā)明的全長^Orange cDNA有942bp組成且其編碼313個氨基酸殘基(見圖 1)。依據(jù)氨基酸序列計算，等電點(Pl)和分子量(Mw)分別為8.46*34.4kDa。采用基因 BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其攜帶有包含重復(fù)半胱氨酸殘基的CxxCxGxG的重復(fù)基序，該重復(fù)基序在 其它公知為DnaJ蛋白的orange蛋白質(zhì)中被很好地保留，其為一種分子伴侶?？梢源_定的是本發(fā)明的^Orange基因在包括Yulmi (灰白色甘薯),Shinjami (紫 色甘薯)和Siinwhangmi (黃色甘薯)在內(nèi)的各種甘薯中表達(見圖4)。具體而言，IbOrange 基因通常在整株植物中表達，而其在葉子和須根中更強地表達(見圖5)。本發(fā)明rtOrange基因的高表達能夠通過諸如ABA、乙烯磷、茉莉酸甲酯、水楊酸等 的植物激素來誘導(dǎo)。盡管在已經(jīng)用ABA處理的葉子中沒有顯著的變化，IbOrange基因在處 理后36小時的根中表達較高。對于用eth印hone處理而言，IbOrange基因的表達在處理后 36小時的葉和根中被誘導(dǎo)。尤其地，在葉子中的表達更高。對于用茉莉酸甲酯處理而言，在 處理后12小時的葉子中誘導(dǎo)的H3Orange基因表達較高，保持該高水平36小時。在根中， 該表達在處理后的M小時開始增強，并且在36小時時達到最高水平。對于用水楊酸處理 而言，在葉子和根中均無顯著的變化。然而，在處理后12小時至36小時的期間內(nèi)H3Orange 基因的表達稍微增強(見圖6)。進一步地，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的rtOrange基因的重組載體。所述重組載體優(yōu) 選地為重組大腸桿菌表達載體。術(shù)語“重組體”表示一種細(xì)胞，其復(fù)制異源核苷酸或表達核苷酸、多肽、異源多肽或 由異源核苷酸編碼的蛋白。重組細(xì)胞能夠表達在天然狀態(tài)的細(xì)胞中不存在的基因或基因片 段，其形式為正義或反義。另外，如果所述基因通過人工方法被修飾且重引入該細(xì)胞，則重 組細(xì)胞能夠表達在自然狀態(tài)中存在的基因。本文所使用的術(shù)語“載體”指被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的DNA片段和核苷酸分子。載體能夠 用于復(fù)制DNA并且能獨立地在宿主細(xì)胞中被復(fù)制。術(shù)語“轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(delivery system) ”和 “載體”通?；Q地使用。術(shù)語“表達載體”指含有所需編碼序列和其它適合的核苷酸序列 的重組DNA分子，其對于在特定宿主有機體中的操縱相關(guān)的編碼序列的表達是必要的。本發(fā)明的載體能夠被構(gòu)建為一般用于克隆或表達的載體。另外，本發(fā)明的載體能 夠構(gòu)建為以原核細(xì)胞或真核細(xì)胞作為宿主的的載體。例如，當(dāng)本發(fā)明的載體是表達載體且 以原核細(xì)胞作為宿主時，其一般包括強啟動子，該強啟動子能夠促進轉(zhuǎn)錄(例如，PLX啟動 子)trp啟動子、Iac啟動子、T7啟動子、tac啟動子等等)、用于啟動轉(zhuǎn)錄的核糖體結(jié)合位 點、以及用于轉(zhuǎn)錄/翻譯的終止序列。當(dāng)大腸桿菌被作為宿主細(xì)胞應(yīng)用時，在大腸桿菌中的 色氨酸生物合成中所涉及的啟動子和操縱子區(qū)以及噬菌體λ (即pLX啟動子)的左側(cè)啟動子能夠作為調(diào)節(jié)位點使用。同時，能夠在本發(fā)明中使用的載體能夠通過使用質(zhì)粒(實例pSC101、ColEl、 pBR322、pUC8/9、pHC79、pGEX 系列、pET 系列以及 pUC19)、噬菌體(實例λ gt4 · λ B、 λ-Charon、λ Δζ 以及Μ13等等)或病毒來構(gòu)建，其典型地在相關(guān)領(lǐng)域中應(yīng)用。同時，當(dāng)本發(fā)明的載體為表達載體且具有真核細(xì)胞作為載體，能夠使用源自哺乳 動物基因組(實例金屬硫蛋白)的啟動子或源自哺乳動物病毒(實例腺病毒后期啟動 子、痘苗病毒、7. 5Κ啟動子、SV40啟動子、細(xì)胞巨化病毒以及HSV的tk啟動子)的啟動子。 一般包括作為轉(zhuǎn)錄終止序的聚腺苷酸序列。本發(fā)明的載體可以包括耐抗生素基因，其典型地在相關(guān)領(lǐng)域作為選擇標(biāo)記使用。 其實例包括耐以下抗生素的基因氨比西林、慶大霉素、卡比青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那 霉素、遺傳霉素、新霉素或四環(huán)素等等。本發(fā)明進一步提供用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。對于宿主細(xì)胞而言，任 何相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員具有能夠使用本發(fā)明的載體的穩(wěn)定且持續(xù)克隆和表達的能力。其實 例包括包括大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21、大腸桿菌RRl、大腸桿菌LE392、大腸桿菌B、 大腸桿菌X 1776、大腸桿菌W3110、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillus)、蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)等的芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株，包括鼠傷寒沙門菌、粘 質(zhì)沙雷菌和各種假單胞菌屬O^eudomonas sp.)等等的腸桿菌及菌株。優(yōu)選地宿主細(xì)胞是 大腸桿菌。另夕卜，當(dāng)真核細(xì)胞用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化，可使用釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆蟲細(xì)胞、人細(xì)胞(例如CHO (中國倉鼠卵巢)細(xì)胞株、W138、BHK、C0S_7、293、 H印G2、3T3、RIN以及MDCK細(xì)胞株)等等作為宿主細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，可采用以下方法將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)運到宿主細(xì)胞CaCl2 方法(Cohen, S. N.等，Proc. Natl. Acac. ki. USA，9 :2110-2114 (1973) )、Hanahan 方法 (Hanahan, D.，J. Mol. Biol.，166 :557-580(1983))或電穿孔法(Dower, W. J.等，Nucleic-Acids Res.，16 :6127-6145(1988))等等。另外，當(dāng)宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，能夠通過以下方 法將載體引入宿主細(xì)胞顯微注射法(Capecchi, M. R.，Cell, 22 :479 (1980))、磷酸鈣沉淀 法(Graham, F. L. et al. ,Virology, 52 :456 (1973))、電穿孔法(Neumann, E.等，EMBO J. , 1 841 (1982))、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法(Wong, Τ. K.等，Gene，10 :87 (1980))、二乙氨基乙基葡聚糖 處理法(Gopal，Mol. Cell Biol.，5 :1188-1190(1985))或基因轟擊法(Yang等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,87 :9568-9572(1990))等等。本發(fā)明進一步提供用于^Orange基因的擴增的引物對。該引物對由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO :4表達的寡核苷酸組成。該引物對可以由包括以下的引物對組成至少一種選自由具有包括在SEQ ID NO 3的序列中的20個或更多的連續(xù)核苷酸的片段組成的寡核苷酸組成的組的寡核苷酸，以及 至少一種選自由具有包括在SEQ ID NO :4的序列中的20個或更多的連續(xù)核苷酸的片段組 成的寡核苷酸組成的組的寡核苷酸。優(yōu)選地，該引物對可以由包括至少一個選自由寡核苷酸組成的組的寡核苷酸的引 物對組成，該寡核苷酸由包含在SEQ ID NO :3序列中的具有21或更多、22或更多、23或更 多、M或更多、25或更多J6或更多、27或更多、觀或更多、四或更多、30或更多個連續(xù)核苷酸組成，以及該引物對還可以由包括至少一個選自由寡核苷酸組成的組的寡核苷酸的引物 對組成，該寡核苷酸由包含在SEQ ID NO :4序列中的具有21或更多、22或更多、23或更多、 24或更多、25或更多J6或更多、27或更多、觀或更多、四或更多、30或更多個連續(xù)核苷酸 組成。最優(yōu)選地，本引物對可以由具有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的引物對組成。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“引物”表示與需復(fù)制的核苷酸鏈互補的單鏈寡核苷酸，并且其 能夠作為用于引物增長產(chǎn)物的合成的起始點而起作用。上述引物的長度和順序應(yīng)該滿足增 長產(chǎn)物的合成的啟動所需要的條件。根據(jù)本發(fā)明，作為引物使用的寡核苷酸可以包括核苷 酸類似物，例如，磷硫酰、烷基磷硫?；蚝怂犭幕蛘卟迦朐噭⒄找幌聦嵤├龑Ρ景l(fā)明進一步詳細(xì)地說明。然而，其僅是對本發(fā)明具體地示例 性說明而決不是通過這些實施例來對本發(fā)明的范圍進行限制。
實施例<實施例1>甘薯rtOrange基因的克隆，核苷酸序列和基因相似性分析QIAGEN 白勺 RNeasy Mini Kit hK^M (Ipomoea batatas (L.) Lam, Shinwhangmi 種)的葉中分離總RNA。進一步采用hvitrogen的用于RT-PCR的SuperScript III第 一鏈合成系統(tǒng)合成第一 cDNA。為了分離Orange基因，基于TIGR植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Plant Transcript Assembl ies)提供的網(wǎng)站(http //plantta. tigr. org/),采用花椰菜的 Orange基因進行BLAST分析。結(jié)果，從與甘薯具有遺傳相似性的牽?；?Ipomoea nil)的 EST克隆中，發(fā)現(xiàn)與Orange基因具有相似核苷酸序列的克隆。通過使用該基因，產(chǎn)生用于克 隆來自甘薯的Orange基因的引物。該基因的序列如下正向引物(5‘ -atggtatattcaggta gaatcttgtcgctc-3‘ ；SEQ ID NO :3)和反向弓丨物(5' -ttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3' ；SEQ ID NO :4)。接頭序列(粗體)在各個引物的5’端與引物的核苷酸序列相連接，以 便能夠使用由hvitrogen提供的gateway expression system。所得的核苷酸序列如下 正向引物(5 ‘ - CAAAAAAGCAGGCTNN atggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3 ‘
；SEQ ID NO 5)和反向引物(5' -CAAGAAAGCTGGGTNttaatcaaatgggtcaattc gtgggtcatg-3' ；SEQ ID NO :6)。使用 Clonetech 提供的 advantage2 聚合酶進行 PCR。在 使用pGEMeasy克隆用載體(!Iomega)克隆具有所需尺寸的PCR產(chǎn)物后，通過序列測定來確 定整個核苷酸序列。所得cDNA被命名為rtOrange cDNA。^Orange基因的cDNA全長為942bp，編碼313個氨基酸并且在N，端具有信號 肽靶向質(zhì)粒(圖1)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的基因BLAST比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在具有重復(fù)半胱氨酸的 CxxCxGxG的重復(fù)基序，其是一種已知為伴侶分子的且在其它orange蛋白中保存的DnaJ 蛋白。通過{審用 BlastX 禾口 ClustalW(http://plant, pdrc. re. kr/Rene/aliRn/Clustalff. html)確定在來自本發(fā)明的rtOrange的編碼序列的氨基酸序列和各種植物種的Orange 基因間的基因相似性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牽?；?Ipomoea nil)具有最高的同源性。另外，番茄 (Lycopersicon esculentum)、葡萄基因(Vitis vinifera)、擬南芥的 At5g61670 基因和花 椰菜基因(Brassica oleracea var. botrytis)被發(fā)現(xiàn)具有73%至80%的序列同源性(圖 2和圖3)。<實施例2>在甘薯的不同品種和組織中的rtOrange基因的表達分析
為了分析本發(fā)明的rtOrange基因在甘薯的不同種類和組織中的表達圖譜，進行 RT-PCR0特別地，使用來自QIAGEN的RNeasy Mini Kit來分離中RNA，使用來自hvitrogen 的用于 RT-PCR 的 Superscript III First-Strand Synthesis System 來合成第一 cDNA。 使用的引物的核苷酸序列如下(正向引物5' -atcttgtcgctctcgtcctccacgacgccg-3'( SEQ ID NO :7)，反向引物5, -cgtgggtcatgctcgcttgccatagccatc-3 ‘ (SEQ ID N0:8))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rtOrange基因已經(jīng)在所有檢測過的種類中表達，包括^olmi (Ym)，即 灰白色甘薯，Shinjami (Jm)，即紫色甘薯，以及^inwhangmi (Hm)，即黃色甘薯(圖4)。進一 步地，根據(jù)對植物的不同的組織的分析，發(fā)現(xiàn)rtOrange基因已經(jīng)普遍在植物中全部表達， 而在植物的葉子和須根中表達較高(圖幻。因此，了解到rtOrange基因為在植物(而不是 僅在特定種中)中同種地表達的基因。<實施例3>用各種植物激素處理后的rtOrange基因的表達分析為了確定本發(fā)明的rtOrange基因相對于各種植物激素(諸如ABA、乙烯磷、茉莉酸 甲酯、水楊酸等等，其與植物的防御機制和干旱應(yīng)激有關(guān))的表達圖譜，將植物用各種所述 激素處理并隨后在各個時間點(即在激素處理后0、12、24、和48小時)分離RNA并用與本文 實施例1和2相同的方式合成cDNA。將與rtOrange基因具有特異性，且已經(jīng)在上述實施例 2中使用過的引物，用于RT-PCR。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在各種激素的影響下rtOrange基因的表達圖譜 如下ABA ；盡管在葉子中沒有顯著的變化，處理后36小時在根中發(fā)現(xiàn)rtOrange基因表達 較高，乙烯磷；對于葉子和根，在處理后36小時發(fā)現(xiàn)讓0儀1^基因表達較高，尤其在葉子中 表達更高，茉莉酸甲酯；對于葉子，在處理后12小時且維持直到36小時，誘導(dǎo)rtOrange基 因進行高表達，且對于根，該表達從12小時開始輕微地增大并在處理后36小時達到最大， 水楊酸；在葉子和根中沒有顯著的變化，但是在處理后12小時至36小時發(fā)現(xiàn)rtOrange基 因的表達輕微地升高(圖6)。一般來說，已知在干旱應(yīng)激下，ABA(其為植物激素的一種)的量增加以便ABA能 夠有效地控制植物的氣孔的開啟或關(guān)閉，作為對干旱條件的反應(yīng)。同時，盡管類胡蘿卜素為 ABA的前體材料，但仍相信對于干旱應(yīng)激ABA的增高與類胡蘿卜素的量的提高具有直接的 聯(lián)系。因此，如本實驗所表明的，對應(yīng)于ABA處理rtOrange基因的表達提高說明在干旱應(yīng) 激和rtOrange基因間的緊密的關(guān)系。<實施例4>根據(jù)在大腸桿菌中rtOrange基因的表達所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特性為了確定從rtOrange基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是否具有所需的大小，將rtOrange基因 的編碼區(qū)域克隆到PD0NR207載體中，且隨后被引入到表達載體pDEST 17和pDEST 15中， 其中含有組氨酸親和標(biāo)記物和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白。用于表達的大腸桿菌 (BL21DE3株)用所得的表達載體轉(zhuǎn)化并且orange蛋白的表達有IPTG誘導(dǎo)。該蛋白從大 腸桿菌分離，并隨后使用SDS-PAGE分析來表明其特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有組氨酸標(biāo)記的34kDa 重組體蛋白質(zhì)57kDa GST-融合蛋白被成功地表達(圖7)。結(jié)果再次證明，本發(fā)明克隆的 IbOrange基因確實是編碼orange蛋白的基因。綜上所述，通過由rtOrange基因提高類胡蘿卜素含量，預(yù)期可以培育出不僅能夠 提高植物的機能活性而且對環(huán)境壓力具有強抵抗力的作物。
權(quán)利要求
1.來自甘薯(紅薯)WBOrange蛋白，其中所述蛋白由SEQID NO :2所示的氨基酸 序列組成。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的rtOrange蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQID NO :1所示的核苷酸 序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的表達通過ABA、乙烯磷、茉莉酸 甲酯或水楊酸增加。
5.包括權(quán)利要求2所述的基因的重組載體。
6.用權(quán)利要求5所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，其為大腸桿菌。
8.用于擴增^Orange基因的引物對，其由SEQID NO 3和SEQ ID NO 4所示的寡核 苷酸組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自紅薯的與類胡蘿卜素累積有關(guān)的IbOrange蛋白、編碼該蛋白的基因、含有該基因的重組載體、用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和用于擴增IbOrange基因的引物對。根據(jù)本發(fā)明，通過IbOrange基因增加類胡蘿卜素的產(chǎn)量，預(yù)期可以培育出既具有改善的功能活性，又對環(huán)境應(yīng)力具有強抵抗力的作物。
文檔編號C07K14/415GK102083985SQ200880129850
公開日2011年6月1日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者安榮玉, 李幸順, 郭尚洙, 金且英, 金善荷 申請人:韓國生命工學(xué)研究院