專利名稱：：具有條件性復制起點的環(huán)形dna分子及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新的條件性復制DNA分子，該DNA分子可以用于基因治療或重組蛋白質的產(chǎn)生。在下文中，將根據(jù)本發(fā)明的新DNA分子指定為pCORTM。
背景技術：
：基因治療在于通過將遺傳信息引入受影響的器官或細胞而修正缺陷或異常。該信息可以通過體外引入從器官提取的細胞，然后再輸入到體內(nèi)；或者在體內(nèi)直接引入靶組織。作為高分子量和負電荷分子，DNA自發(fā)穿過磷脂細胞膜是有困難的。因此使用多種載體使基因轉移發(fā)生另一方面為病毒載體，另一方面為天然或合成的化學和/或生物化學載體。病毒載體(逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等)是非常有效的，尤其用于穿過膜，但是存在某些風險，例如病原性、重組、復制和免疫原性。化學和/或生物化學載體避免了這些風險(見Behr，1993，Cotton和Wagner1993綜述)。例如，它們是通過與DNA形成沉淀物而起作用的陽離子(磷酸鈣、DEAE-葡聚糖等)，這些沉淀物可以被細胞“吞噬”。它們也可以是能與細胞膜融合的脂質體，DNA分子整合于其中。合成的基因轉移載體通常為脂類或陽離子聚合物，它們與DNA復合，并與其形成具有表面正電荷的粒子。作為該類型載體的實例，可以特別提及雙十八烷基酰胺甘氨酰精胺(DOGS，TransfectamTM)或N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基胺(DOTMA，LipofectinTM)。然而，使用化學和/或生物化學載體或裸露DNA，意味著生產(chǎn)大量藥理學純DNA的可能性。對此的理由是，在基因治療技術中，醫(yī)學產(chǎn)物由DNA本身組成，以適當量制造具有適于人類基因治療用途的特性的DNA是必須的。在非病毒載體學的情況下，所用載體為細菌起源的質粒。用于基因治療的質粒通常攜帶(i)復制起點，(ii)標志基因，例如抗生素抗性基因(卡那霉素、氨芐青霉素等)以及(iii)一個或多個轉基因，這些轉基因具有其表達所必需的序列(增強子、啟動子、聚腺苷酸化序列等)。然而，目前可利用的技術并非完全令人滿意。一方面，保持在體內(nèi)傳播的風險。因此，存在于體內(nèi)的細菌可以以低頻率接受該載體。如果涉及體內(nèi)基因治療，該風險的可能性將更大，在所述體內(nèi)基因治療中，DNA可以傳播到患者體內(nèi)，并可以與感染該患者的細菌或共生菌落的細菌接觸。如果接受此質粒的細菌為腸細菌，例如大腸桿菌(E.coli)，該質粒可以進行復制。這類事件導致治療基因的傳播。如果用于基因治療處理的治療基因編碼例如淋巴因子、生長因子、抗癌基因、或其在宿主內(nèi)功能缺陷但可能修正遺傳缺陷的蛋白質，這些基因中部分的傳播可能具有不可預見的令人擔憂的作用(例如，如果病原細菌獲得了人類生長因子基因)。另一方面，通常用于非病毒基因治療的質粒也具有抗生素抗性標志(氨芐青霉素、卡那霉素等)。由于任何抗生素治療(使用與選擇質?？剐曰蛳嗤易宓目股?將導致對討論中的質粒的選擇，因此獲得這類質粒的細菌由此擁有了無法否定的選擇優(yōu)勢。從這個角度，氨芐青霉素屬于在世界范圍內(nèi)使用最頻繁的α-內(nèi)酰胺家族。作為非抗生素抗性基因的選擇標志在細菌中的用途因此將特別有利。它將避免對可能接受了攜帶這類標志的質粒的細菌的選擇。因此，盡可能的尋求對治療基因和抗性基因的傳播限制格外重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主題是明確地建議一種新的DNA分子，該DNA分子可以用于基因治療或用于在體外產(chǎn)生重組蛋白質，并且僅在可以彌補這些非病毒載體的某些功能的細胞中復制。本發(fā)明也涉及用于制備這些DNA分子的特別有效的方法。所述DNA分子具有去除了質粒傳播相關風險的優(yōu)點，這些風險例如(1)復制和傳播，可以導致治療基因不受控制地過表達，(2)抗性基因的傳播和表達。根據(jù)本發(fā)明的DNA分子中含有的遺傳信息有效地包括了治療基因以及調節(jié)其表達的信號，大大限制該質粒宿主細胞譜的有效的條件性復制起點，長度縮短的、優(yōu)選不同于賦予抗生素抗性的基因的選擇標志，如果合適，還可以含有使質粒多聚體解離的DNA片段。這些分子(及其含有的遺傳信息)轉移至微生物并穩(wěn)定保持的可能性非常有限。最后，根據(jù)本發(fā)明的載體(由于其環(huán)形結構、縮短的長度以及超螺旋形式，本發(fā)明的載體也稱為小質粒)具有如下額外的優(yōu)點由于其與常規(guī)使用的ColE1衍生質粒相比具有縮短的長度，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子具有較好的體內(nèi)生物利用度，而且該DNA分子或pCOR以穩(wěn)定的染色體外形式停留在不含起始蛋白質的原核或真核宿主細胞中。它們特別具有改善的細胞穿透或分布能力。因此，公認組織擴散系數(shù)與分子量成反比(Jain，1987)。類似的，在細胞中，高分子量的分子具有更低的穿過細胞膜的滲透性。另外，為了使質粒進入其表達所必需的核，高分子量也是一個缺點，核孔對擴散入核加以了大小限制(Landford等，1986)。根據(jù)本發(fā)明的DNA分子非治療部分(特別是復制起點和選擇基因)的長度縮短，也使縮短DNA分子長度成為可能。使該質粒在細菌中復制并選擇的部分(1kb)降低了三倍，例如，計算3kb為復制起點和抗性標志載體部分。上述在(i)分子量和(ii)負電荷方面的降低，賦予本發(fā)明分子以提高的組織、細胞和核生物利用度以及擴散。更精確地，本發(fā)明涉及可用于基因治療的環(huán)形DNA分子，該分子包括至少一個目的核酸序列，其特征在于允許其復制的區(qū)域包括復制起點，該復制起點在宿主細胞中的功能需要存在至少一種該宿主細胞的外源特定蛋白質。該DNA分子可以以單鏈或雙鏈形式存在，并且有利地具有超螺旋形式。對于本發(fā)明目的，所用宿主細胞可以是多種來源。它們可以是真核或原核細胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，它們是原核細胞。細菌質粒的復制傳統(tǒng)上需要至少一種由宿主細胞編碼的RNA聚合酶、RNA酶、DNA聚合酶等類型的蛋白質。因為上文所解釋的原因，使用這種類型的復制，不可能完全克服任何在治療機體中傳播的可能風險。有利的是，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子復制起點的功能需要特定的宿主細胞外源蛋白質。該特征的意義在于，將所述質粒的宿主譜減小為表達該起始蛋白質的特定菌株。在本發(fā)明上下文中發(fā)展的DNA分子因此有利的具有所謂的條件性復制起點。根據(jù)本發(fā)明使用的條件性復制起點可以來源于具有下述特征的質粒或噬菌體在其復制起點中含有重復序列或重復子，它們編碼至少一種對其特異的復制起始蛋白質(Rep)。作為舉例，可以提及下述質?；蚴删w的條件性復制系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述DNA分子中使用的復制起點來自被稱為R6K的天然大腸桿菌質粒。R6K的復制功能集中在5.5kbp的DNA片段中(圖1)，該片段含有3個復制起點α、β和γ(γ和α提供90％的復制)和編碼∏復制起始蛋白質和蛋白質Bis的操縱子。將上述質粒保持在其特征性拷貝數(shù)(每個基因組15拷貝)所需的最小量遺傳信息包括在兩個元件中400bp的oriγ和基因pir，該基因產(chǎn)物為∏起始蛋白質。Oriγ可以劃分為兩個功能部分核心部分和激活元件(圖1)。復制所必需的核心部分含有重復子(7個正向重復，每個22bp)和側翼序列，SEQIDNo.1中描述的∏蛋白質與該重復子結合，側翼序列是宿主蛋白質(IHF，DnaA)的靶標。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選模式，所述載體的復制起點完全或部分由質粒R6K的γ復制起點組成，更優(yōu)選完全或部分由SEQIDNo.1或其衍生物之一組成。上述復制起點具有長度非常有限的優(yōu)點，只在特定的起始蛋白質(即由基因pir(SEQIDNo.2)產(chǎn)生的Pi蛋白質)的存在下才有功能。由于該蛋白質以反式作用，將oriγ與pir基因物理分離是可能的，可以將pir基因引入選為這些質粒特定宿主的細胞的基因組中?！堑耐蛔兛梢愿淖兤湟种乒δ?Inuzuka和Wada，1985)，并導致R6K衍生物拷貝數(shù)增加至初始拷貝數(shù)的10倍以上。這些置換可以在40個氨基酸的結構域中，或者在∏蛋白質的其他區(qū)域中，因此40個氨基酸的結構域內(nèi)的突變似乎通過∏來負責對質?？截悢?shù)的控制(圖2)。根據(jù)本發(fā)明的有利的實施方案，在宿主細胞中表達的∏蛋白質源于SEQIDNo.2中描述的基因或如上定義之衍生物之一的表達，特別是與pir基因相比含有突變的基因pir116的表達。該突變對應于在從起始密碼子開始的106位由亮氨酸取代脯氨酸。在這種情況下，R6K衍生物的拷貝數(shù)約為每個基因組250個拷貝。對于本發(fā)明目的，術語衍生物表示有別于所考慮的序列、通過一個或多個遺傳和/或化學性質的修飾而獲得的任何序列，以及與這些序列或片段雜交并且其產(chǎn)物具有復制起始蛋白質∏的活性的任何序列。術語遺傳和/或化學性質的修飾，可以理解為指一個或多個殘基的任何突變、置換、缺失、添加和/或修飾。術語衍生物也包括與所考慮的序列同源、得自其它細胞來源(特別是人源或來自其他生物細胞)并具有相同類型活性的序列。這些同源序列可以通過雜交實驗獲得。雜交可以從核酸文庫開始，使用天然序列或其片段作為探針，在傳統(tǒng)的嚴緊性條件下進行(Maniatis等，cf.Generaltechniquesofmolecularbiology)，或者優(yōu)選在高嚴緊性條件下進行。除了如上定義的條件性復制起點，所述DNA分子還含有包括一個(或多個)確保DNA分子在所選宿主內(nèi)被選擇的基因的區(qū)域。該基因可以是賦予抗生素抗性(例如卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、壯觀霉素、青紫霉素等)的基因類型的傳統(tǒng)標志。然而，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，該區(qū)域不同于賦予抗生素抗性的基因。因此它可以是這樣一個基因在確定的培養(yǎng)條件下，其產(chǎn)物對宿主的存活是必需的。例如，它可以是-編碼天然或合成起點的抑制型tRNA的基因。其更優(yōu)選為琥珀密碼子tRNA(TAG)-其產(chǎn)物是在某種培養(yǎng)條件下的細胞代謝所必需的基因，即參與代謝物(氨基酸、維生素等)的生物合成的基因、或者是使細胞可吸收存在于培養(yǎng)基中的物質(特定的氮源或碳源)的分解代謝基因等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選模式，該區(qū)域含有編碼特定密碼子的抑制型tRNA的基因表達盒。后者可以特別從編碼苯丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸和組氨酸的那些中被選擇。更特別為琥珀密碼子抑制型tRNA(TAG)。在此特定情況下，用于在宿主細胞中選擇本發(fā)明主題的DNA分子的系統(tǒng)包括兩個元件1)DNA分子上編碼琥珀密碼子(TAG)的抑制型轉運RNA的基因，該基因構成選擇標志，即所知的(sup)基因，以及2)特定宿主，其在確定培養(yǎng)條件下必需的基因含有琥珀密碼子TAG。在含有TAG密碼子基因的產(chǎn)物是必需的培養(yǎng)條件下，只有在允許sup表達的質粒存在于細胞中時，該細胞才可以生長。培養(yǎng)條件從而構成該DNA分子的選擇壓力。所用sup基因可以為天然來源(Glass等，1982)或來自任何合成的構建體(Normanly等，1986，Kleina等，1990)。依賴于含有琥珀突變的基因，就其確定多種選擇性培養(yǎng)基而言，這樣的系統(tǒng)提供了巨大的靈活性。例如在細菌乳酸乳球菌(Lctococcuslactis)中，琥珀密碼子位于嘌呤生物合成基因中。當細菌在乳中繁殖時，允許攜帶編碼抑制型tRNA的基因的質粒的選擇。這樣的標志具有非常短小不含起源于噬菌體或轉座子的非“外源”序列的優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，DNA分子也包括位點特異性重組酶的靶DNA片段，該片段使質粒多聚體解離。因此，引入到復制起點例如為oriγ的環(huán)形DNA分子中的這類片段，使此類質粒的多聚體解離。特別是從攜帶突變的pir等位基因(例如pir116)的菌株制備DNA分子時，可以觀察到這樣的多聚體，突變的pir等位基因可能使R6K衍生物的拷貝數(shù)增加。可以使用多種在序列之間產(chǎn)生位點特異性重組的系統(tǒng)實現(xiàn)所述重組。更優(yōu)選使用特定的分子內(nèi)重組序列獲得本發(fā)明的位點特異性重組，該分子內(nèi)重組序列可以在特定蛋白質(通常指重組酶)的存在下彼此重組。在此特定情況下，這些特定蛋白質為重組酶XerC和XerD。因此，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子通常也含有允許所述位點特異性重組的序列。在根據(jù)本發(fā)明的基因構建體中存在的特定重組系統(tǒng)(重組酶和特異性識別位點)可以是不同起源。特別地，使用的特定序列和重組酶可以屬于不同的結構類型，尤其是屬于轉座子Tn3解離酶家族或噬菌體λ整合酶家族。在屬于轉座子Tn3家族的重組酶中，特別要提到轉座子Tn3或轉座子Tn21和Tn522解離酶(Stark等，1992)；噬菌體μ的Gin轉化酶或質粒(例如RP4par片段)解離酶(Abert等，Mol.Microbiol.12(1994)131)。在屬于噬菌體λ整合酶家族的重組酶中，特別要提到噬菌體λ(Landy等，Science197(1977)1147)、P22和Φ80的整合酶(Leong等，J.Biol.Chem.260(1985)4468)；流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的HP1(Hauser等，J.Biol.Chem.267(1992)6859)；噬菌體P1的Cre整合酶；質粒pSAM2整合酶(EP350341)或2μ質粒FLP重組酶和大腸桿菌XerC和XerD重組酶。構成本發(fā)明主題的DNA分子優(yōu)選含有天然的大腸桿菌質粒ColE1的片段cer。所用的cer片段是來自ColE1的382bpHpaII片段，已經(jīng)證實該片段導致順式質粒多聚體解離(Summers等，1984；Leung等，1985)。也可以使用更小長度的HpaII-TaqI片段(280bp)，或在HpaII中含有的更小片段(約220bp)，所述片段具有同樣的性質(Summers和Sherratt，1988)。所述解離通過特定的分子內(nèi)重組而發(fā)生，涉及四個由大腸桿菌基因組編碼的蛋白質ArgR、PepA、XerC和XerD(Stirling等，1988，1989；Colloms等，1990；Blakely等，1993)。天然大腸桿菌質粒ColE1的cer片段的插入可以獲得質粒多聚體的高度解離，從而產(chǎn)生高比例的可復制形式的單體。已經(jīng)證實，cer位點插入到含有pBluescriptSK+的ColE1復制起點的微環(huán)中，并未引起有效的多聚體解離(Kreiss等，Appl.Microbiol.Biotechnol，49560-567(1998))，因此這一點尤其出乎意料，質粒順式的有效解離是不可預測的，似乎依賴于質粒構型。對于pCOR質粒，當pCOR中存在cer時，實現(xiàn)了有效的順式解離，從而產(chǎn)生未預料到的高度的可復制形式的單體。從該角度，使用全部或部分ColE1cer片段或其如上所述之衍生物之一是特別有利的。根據(jù)執(zhí)行變化，本發(fā)明的DNA分子也可以包括能夠特異地與配體相互作用的序列。優(yōu)選能夠通過雜交與特定寡核苷酸形成三螺旋的序列。該序列因此可能通過與固定在支持物上的互補寡核苷酸的選擇性雜交來純化本發(fā)明的分子。(見申請WO96/18744及WO02/07727)。所述序列可以是天然存在于美國申請人的公開申請2003/186268中說明的質粒復制起點中，或者天然存在于WO02/07727中說明的轉基因中，作為選擇，如果不影響目的基因和復制起點的功能，其可以定位于本發(fā)明DNA分子的任何位點。經(jīng)雜交形成的三螺旋因此發(fā)生在寡核苷酸和存在于所述DNA中的特定互補序列之間。就此而言，為了獲得最佳產(chǎn)量和最佳選擇性，在本發(fā)明中使用完全互補的寡核苷酸和特定序列。特別的，它們可以是寡核苷酸聚(CTT)和特定序列聚(GAA)。例如，含有例如CTT重復基序的寡核苷酸能夠和含有互補單元(GAA)的特定序列形成三螺旋。討論的序列尤其可以是含有7、14或17個GAA單元的區(qū)域，在寡核苷酸中含有相應數(shù)量的重復CTT。在此情況下，寡核苷酸與多嘌呤鏈以反平行方向結合。這些三螺旋僅在Mg2+存在下穩(wěn)定(Vasquez等，Biochemistry，347243-7251(1995)；Beal和Dervan，Science，2511360-1363(1991))。如上所述，該特定序列可以是天然存在于pCOR中的序列、或是隨后人工引入后者的合成序列。使用能夠與天然存在于pCOR中的序列(例如質粒復制起點或標志基因中)形成三螺旋的寡核苷酸尤其有利。合成能夠與這些天然同嘌呤-同嘧啶區(qū)域形成三螺旋的寡核苷酸是特別有利的，因為其可用于未經(jīng)修飾的pCOR質粒中。特別優(yōu)選的可以與特定寡核苷酸形成三螺旋的靶序列已在ColE1和pCOR復制起點中確定。ColE1衍生質粒含有12聚體同嘌呤(homopurine)序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQIDNO33)，其上游被參與質粒復制的RNA-II轉錄物加帽(Lacatena等，Nature，294623(1981))。該序列與12聚體互補寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQIDNO34)形成穩(wěn)定的三螺旋結構。pCOR骨架含有14個非重復堿基的同嘌呤片段(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQIDNO35)，其位于pCORγ復制起點的A+T富集片段(Levchenko等，NucleicAcidsRes.，241936(1996))。該序列與14聚體互補寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQIDNO36)形成穩(wěn)定的三螺旋結構。相應的寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQIDNO37)和5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQIDNO38)有效并特異地靶向分別位于ColE1ori復制起點或pCOR(復制起點γ)內(nèi)的互補序列。使用能夠與復制起點或標志基因中存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸也是特別有利的，因為使用相同的寡核苷酸，使含有所述復制起點或所述標志基因的任何DNA的純化成為可能。因此，沒有必要為了將特定的人工序列整合其內(nèi)而對質粒或雙鏈DNA進行修飾。盡管優(yōu)選完全互補的序列，仍然可以理解，倘若不導致親合力的過多損失，寡核苷酸序列和存在于DNA內(nèi)的序列之間的一些錯配是可以容忍的?？梢蕴峒按嬖谟诖竽c桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQIDNO39)。在此情況下，打斷多聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可以被第三鏈的鳥嘌啉識別，從而形成G*TA三體，當其與兩個T*AT三體在側翼相接時，該G*TA三體是穩(wěn)定的(Kiessling等，Biochemistry，312829-2834(1992))。根據(jù)特定的實施方案，使用的寡核苷酸可以包括序列(CCT)n、序列(CT)n或序列(CTT)n，其中，n為1-15的整數(shù)。使用(CT)n或(CTT)n型的序列尤其有利。寡核苷酸也可以結合(CCT)、(CT)或(CTT)單元。使用的寡核苷酸可以是天然的(由未經(jīng)修飾的天然堿基形成)或經(jīng)過化學修飾的。特別地，寡核苷酸可以具有某些化學修飾，使其具有核酸酶抗性或保護性、或對特定序列的親合力增加。作為本發(fā)明的DNA分子的代表，可以最特別地提及質粒pXL2774及其衍生物。對于本發(fā)明目的，將術語衍生物理解為指任何衍生自pXL2774、并且含有除熒光素酶基因之外的一個或多個目的基因的構建體。也可以提及含有治療基因表達盒的質粒pXL3029、pXL3030，以及質粒pXL3179或NV1FGF。在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及包括FGFa或FGF-1基因的pCOR，該質粒指定為pXL3179或NV1FGF，美國申請人的專利4,686,113中對其進行了說明。本發(fā)明也涉及特定宿主細胞構建方法的開發(fā)，該宿主細胞對產(chǎn)生這些治療性DNA分子特別有效。本發(fā)明的另一個主題涉及產(chǎn)生環(huán)形DNA分子的方法，該方法特征在于在允許對轉化所述DNA分子的宿主細胞進行選擇的條件下，培養(yǎng)含有至少一種如上定義之DNA分子和蛋白質的宿主細胞，該蛋白質可以在或不在原位表達、對所述宿主細胞是外源且特異的并調節(jié)所述DNA分子復制起點的功能。更優(yōu)選從相應基因原位表達調節(jié)該DNA分子復制起點功能的蛋白質?？梢允褂幂o助復制子攜帶編碼復制起始蛋白質的基因，該輔助復制子與條件性復制起點的衍生物兼容，或者可以使用轉座子、噬菌體或其他任何載體重組引入宿主細胞基因組中。在表達蛋白質的基因被置于輔助復制子中的特定情況下，后者也含有可用于細胞中有效轉錄的啟動子區(qū)，以及位于3’末端、指明轉錄終止信號的區(qū)域。關于啟動子區(qū)，當所考慮的基因能在細胞中發(fā)揮功能時，可以是天然負責表達該基因的啟動子區(qū)。也可以是不同起源的區(qū)域(負責表達其他蛋白)、或者甚至是合成來源。特別地，可以是原核或噬菌體基因的啟動子。例如，可以是從細胞基因組獲得的啟動子。作為編碼復制起始蛋白質的基因，可以使用野生型基因或突變的等位基因，它們可能為起始蛋白質獲得特異性質粒(或衍生物)的增加的拷貝數(shù)，其中所述起始蛋白質調節(jié)了所用DNA分子中復制起點的功能。特別對質粒R6K(Inuzuka和Wada，1985；Greener等，(1990)、Rtsl(Terawaki和Itoh，1985；Terawaki等，1990；Zeng等，1990)、F(Seelke等，1982；Helsberg等，1985；Kawasaki等，1991)、RK2(Durland等，1990；Haugan等，1992，1995)和pSC101(Xia等，1991；Goebel等，1991；Fang等，1993)描述了這類突變。當使用的DNA分子具有來源于質粒R6K的復制起點的情況下，起始蛋白質是同一質粒的∏蛋白質的衍生物。表達能夠顯著增加初始拷貝數(shù)的該蛋白質的突變形式是特別有利的。為了做到這一點，整合到宿主細胞中的基因優(yōu)選由SEQIDNo.2中描述序列或其衍生物的全部或部分所代表，最優(yōu)選為pir116基因。相關突變對應于以亮氨酸替換脯氨酸。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，所述pir116基因直接整合到宿主細胞基因組中。在所選培養(yǎng)條件下必需的特定宿主細胞基因有利的含有被所選DNA分子中抑制型tRNA識別的特定密碼子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選模式，所述特定密碼子為琥珀TAG密碼子。在此特定情況下，在含有TAG密碼子的基因產(chǎn)物為必需的培養(yǎng)條件下，只有在宿主細胞中存在允許sup表達的質粒的情況下，細胞才能生長。培養(yǎng)條件因而構成該DNA分子的選擇壓力。含有琥珀密碼子的基因優(yōu)選為參與氨基酸精氨酸生物合成的基因。該基因即argE，編碼N-乙酰鳥氨酸酶(N-acetylornithinase)(Meinnel等，1992)，在此情況下含有對應于點突變Gln-53(CAG)->TAG的TAG密碼子；通過在M9基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提供攜帶sup基因的質粒的選擇壓力(Maniatis等，1989)。然而，也可以是例如維生素或核酸堿基的生物合成基因，或者是允許使用特定氮源或碳源的基因、或是在選擇的培養(yǎng)條件下其功能是細胞存活所必需的基因。宿主細胞優(yōu)選選自大腸桿菌菌株，更優(yōu)選以菌株大腸桿菌XAC-1為代表。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，在所術方法中使用的宿主細胞為基因組中含有pir116基因并用質粒pXL2774或其衍生物之一轉化的大腸桿菌菌株XAC-1。根據(jù)本發(fā)明的有利變體，在所述方法中使用的宿主細胞是原核細胞，其endA1基因或同源基因被失活。endA基因編碼大腸桿菌核酸內(nèi)切酶I。這種周質酶具有非特異性剪切雙鏈DNA的活性(Lehman，I.R.，G.G.Roussos和E.A.Pratt(1962)J.Biol.Chem.237819-828；WrightM.(1971)J.Bacteriol.10787-94)。對多種大腸桿菌(野生型或endA)進行的研究顯示，在這些細菌菌株提取物中孵育的質粒DNA的降解，在endA+菌株中存在，但是在endA突變株中不存在(WnendtS.(1994)BioTechniques17270-272)。由Promega公司使用其純化系統(tǒng)(Shoenfeld，T.，J.Mendez，D.Storts，E.Portman，B.fPatterson，J.Frederiksen和C.Smith，1995.EffectsofbacterialstrainscarryingtheendAlgenotypeonDNAqualityisolatedwithWizardplasmidpurificationsystems.Promeganotes53)，對從endA+菌株或endA突變株中分離的質粒的質量進行研究。其結論如下從endA突變體制備的DNA質量整體優(yōu)于從測試的endA+菌株制備的DNA質量。因此，該質粒DNA制劑的質量受任何所述核酸內(nèi)切酶的污染所影響(該DNA的相對長期降解)。不難設想endA基因的缺失或突變使不再具有所述核酸內(nèi)切酶活性的突變體在整體上與野生型一樣。(Dürwald，H.和H.Hoffmann-Berling(1968)J.Mol.Biol.34331-346)?？梢酝ㄟ^突變、全部或部分缺失、斷裂等失活endA1基因。選作產(chǎn)生pCOR質粒的大腸桿菌菌株endA基因的失活，可以更特別地通過如下方法實現(xiàn)使用P1噬菌體轉移由Cherepanov和Wackernagel描述的ΔendA::TcR刪除(Cherepanov，P.P.和W.Wackernagel.1995.GenedisruptioninEscherichiacoliTcRandKmRcassetteswiththeoptionofFlp-catalyzedexcisionoftheantibiotic-resistancedeterminant.Gene1589-14)；或通過同源重組，用突變或缺失的endA等位基因交換存在于目的細菌基因組中的野生型等位基因。本發(fā)明中這種類型菌株的使用，可以有利地改進產(chǎn)生的DNA的質量。本發(fā)明也涉及含有如上所述之DNA分子的任何重組細胞。所述細胞可以是真核、原核類型等多種起源的細胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，在所述方法中使用的大腸桿菌XAC-1宿主細胞指定為TEX1，包括失活的traD基因或其同源基因，以去除F′轉移。traD在tra操縱子之一的5′末端，編碼直接參與DNA轉移和DNA代謝的81.7kDa膜蛋白(Frost等，MicrobiologyReviews，1994，58162-210)。traD突變體不轉移DNA(Panicker等，J.Bacteriol.，1985，162584-590)。可以使用本領域熟知的方法，通過突變、完全或部分缺失或斷裂來失活游離的traD基因(見實施例9)。失活該基因的一種方法在實施例1中得到說明，將由此獲得的大腸桿菌XAC-1pir116endA-traD-菌株指定為TEX1(Soubrier等，GeneTherapy，1999，61482-1488)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在所述方法中使用的宿主細胞，是含有pri42突變和pir116突變的大腸桿菌菌株XAC-1。pir116和pir42突變影響pi蛋白質的不同結構域。pir116突變影響拷貝數(shù)控制區(qū)，而pir42突變影響推定的亮氨酸拉鏈基序，如圖11所示。含有pir116和pir42突變的pir基因，分別在圖12、SEQIDNOs21和22中說明其核酸和氨基酸序列。pir42突變包括從蛋氨酸密碼子開始第124位C到T的轉換，因此導致第42位脯氨酸被亮氨酸置換。pir42突變由Miron等描述(ProcNatlAcadSciUSA，1994.91(14)p.6438-42；EMBOJ，1992.11(3)p.1205-16)，據(jù)報導，與含有野生型pir基因的相同質粒相比，“oriγR6K-KmR-pir42”質粒的拷貝數(shù)增加了2.5倍。然而，pir42突變從不與pir116突變聯(lián)合使用或描述，盡管其他拷貝增加型突變(copy-upmutation)(例如pir基因中的cop21)與pir116聯(lián)合時，沒有表現(xiàn)出質?？截悢?shù)的增加，但是在大腸桿菌XAC-1endA-traD-菌株中，pir116和pir42突變的聯(lián)合令人驚訝地顯示出質?？截悢?shù)的顯著增加。從而，與單獨含有pir116的菌株或與含有聯(lián)合其他pir基因突變cop21(例如突變(Inuzuka等，F(xiàn)EBSLett，1988228(1)p.7-11))的pir116突變的宿主細胞相比，在包括突變pir116和pir42基因的大腸桿菌宿主菌株中，申請人表明這種聯(lián)合在產(chǎn)生的質粒拷貝數(shù)方面取得了未曾預料的結果。例如，與pir116菌株或含有pir116和cop21突變的菌株相比，大腸桿菌TEX1pir42(＝XAC-1endA-traD-pir116pir42)顯示出質?？截悢?shù)增加2至5倍(見實施例11)。在另一個實施方案中，pir基因包括至少一個突變，該突變可以出現(xiàn)在例如拷貝數(shù)控制區(qū)、亮氨酸拉鏈樣基序、DNA結合區(qū)、或一個或多個這些區(qū)域或由pir基因編碼的蛋白質pi的其它區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的原核宿主細胞，也包括由pir基因拷貝編碼的蛋白質pi中相同或不同結構域內(nèi)的一個或多個突變，例如DNA結合域、和/或拷貝數(shù)控制區(qū)和/或亮氨酸拉鏈基序。原核重組宿主細胞可以在質?；蛩拗骷毎蚪M中包括異源pir基因。根據(jù)本發(fā)明其后說明的一個方面，這類突變可以通過使用以熒光為基礎的篩選方法進行篩選。如實施例13中顯示，使用根據(jù)本發(fā)明以熒光為基礎的篩選方法，對包括pir基因中至少一個突變、突變pir116和DNA結合域中的突變的宿主細胞進行篩選。使用以熒光為基礎的篩選方法檢測宿主細胞產(chǎn)生高拷貝數(shù)質粒的能力，所述宿主細胞含有出現(xiàn)在DNA結合域和pir116的突變，即，例如在構建體100B中，其中292位酪氨酸(K)被蛋氨酸(M)置換；在構建體114C中，其中130位谷氨酸(E)被纈氨酸(V)置換；或在構建體201C中，其中117位天冬氨酸(D)被甘氨酸(G)置換(圖26)。根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案，在所述方法中使用的宿主細胞是原核宿主細胞，其recA基因或同源基因被失活。根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選為包括突變pir116、pir42、endA-、traD-、recA-的大腸桿菌菌株XAC-1。將這種菌株指定為TEX2pir42?？梢允褂帽绢I域技術人員熟知的方法將rdcA失活。recA編碼主要的重組蛋白質，該基因的突變降低了能夠導致質粒多聚化、由重組介導的質粒變異和分子間重組頻率。如實施例12所說明，可以通過PCR獲得在5’末端含有3個終止密碼子(每個讀碼框一個)的缺失的recA基因。隨后通過基因置換將產(chǎn)生的失活基因引入TEX1基因組(實施例12.1)。使用本領域技術人員所知的將所述質粒引入給定細胞的任何技術獲得這些細胞。特別地，這些技術特別可以是轉化、電穿孔、接合、原生質體融合或其他本領域技術人員所知的任何技術。菌株XAC-1pir116在布達佩斯條約下，于2003年10月10日、以保藏號I-3108保存于CollectionNationaleDeCulturesdeMicro-organismes(CNCM)，InstitutPasteur，28，rueDr.Roux，75724ParisCedex15，法國。菌株TEX2pir42在布達佩斯條約下，于2003年10月10日、以保藏號I-3109保存于CollectionNationaleDeCulturesdeMicro-organismes(CNCM)，InstitutPasteur，28，rueDr.Roux，75724ParisCedex15，法國。在任何疫苗接種或基因和細胞治療實施中，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子可以用于將基因轉移至給定的細胞、組織，或機體，或者用于在體外產(chǎn)生重組蛋白質。它們特別可以用于體內(nèi)直接使用或細胞的體外或離體修飾以將它們移植入患者。從這個方面，本發(fā)明的另一個主題涉及任何藥物組合物，該組合物包括至少一種如上定義的DNA分子。該分子可以或不可以與化學和/或生物化學轉染載體聯(lián)合。所述載體特別可以包括陽離子(磷酸鈣、DEAE-葡聚糖等)或脂質體。聯(lián)合的合成載體可以是陽離子聚合物或脂類。這類載體可以提及的實例為DOGS(TransfectamTM)或DOTMA(lipofectinTM)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以設計成用于局部、口服、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、眼內(nèi)或透皮施用。所述質粒優(yōu)選以可注射形式或藥膏(inapplication)使用。質?？梢耘c任何藥理學上接受用于可注射劑型(特別是接受治療部位的直接注射)的媒介物(vehicle)混合。這特別可以包括消毒的等滲溶液或干粉組合物，特別是凍干的組合物，根據(jù)情況，通過添加滅菌水或生理鹽水配成可注射溶液。這尤其可以包括以葡萄糖或氯化鈉稀釋的Tris或PBS溶液。對患者受影響的部位直接注射是有利的，因為這樣使治療作用集中在受影響組織的水平。使用的劑量可以作為多個參數(shù)的函數(shù)被調節(jié)，尤其是作為基因、載體、使用的給藥模式、相關藥理學或治療所需時期的函數(shù)。本發(fā)明的DNA分子可以含有一個或多個目的基因，即一個或多個核酸(合成的或半合成的DNA、gDNA、cDNA等)，其在靶細胞中的轉錄以及可能的翻譯，產(chǎn)生治療性、疫苗性、農(nóng)藝或獸醫(yī)目的的產(chǎn)物。在治療性目的基因中，可以更特別提及的是編碼酶、血液衍生物、激素和淋巴因子白介素、干擾素、TNF等(FR92/03120)；生長因子；神經(jīng)遞質或其前體、或合成酶、以及營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、VEGF-B、VEGF-C等)；載脂蛋白ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR93/05125)；肌營養(yǎng)不良蛋白或小肌營養(yǎng)不良蛋白(minidystrophin)(FR91/11947)的基因；腫瘤抑制基因p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等(FR93/04745)；編碼涉及凝血的基因因子VII、VIII、IX等；自殺基因胸腺嘧啶激酶、胞嘧啶脫氨酶等；或編碼所有或部分天然或人工免疫球蛋白(Fab、ScFv等)、RNA配體(WO91/19813)的基因等。治療基因也可以是反義序列或基因，其在靶細胞內(nèi)的表達可以控制基因的表達或細胞mRNA的轉錄。例如，根據(jù)專利EP140,308中說明的技術，這類序列可以在靶細胞內(nèi)被轉錄為與細胞mRNA互補的RNA，從而阻止其翻譯為蛋白質。可以被本發(fā)明pCOR攜帶的目的插入物是RNAi，RNAi可以干擾靶基因的翻譯(Wilson等，CurrOpinMolTher.2003Aug；5(4)389-96)，從而調節(jié)該基因的表達。出于產(chǎn)生疫苗的目的，目的基因也可以是疫苗基因，即編碼抗原性肽、能在人或動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應的基因。這些抗原性肽特別可以是Epstein-Barr病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP185,573)或假狂犬病毒的特異性抗原性肽，或是腫瘤的特異性抗原性肽(EP259,212)。通常，本發(fā)明的DNA分子中，治療性、疫苗性、農(nóng)藝或獸醫(yī)目的的基因也含有用于在靶生物或細胞內(nèi)有效轉錄的啟動子區(qū)，以及位于3′末端、指定轉錄終止信號和聚腺苷酸化位點的區(qū)域。關于啟動子區(qū)，當某啟動子區(qū)能夠在有關細胞或機體內(nèi)運行時，該啟動子區(qū)可以是天然負責所考慮的基因的表達的啟動子區(qū)。該啟動子區(qū)也可以是不同來源的區(qū)域(負責其他蛋白質的表達)，或者甚至是合成來源的區(qū)域。特別地，它們可以是來自真核或病毒基因的啟動子序列。例如，它們可以是從靶細胞基因組獲得的啟動子序列?？梢允褂玫恼婧藛幼邮且蕴禺愋曰蚍翘禺愋浴⒖烧T導或不可誘導、強或弱的方式刺激或抑制基因轉錄的任何啟動子或衍生序列。真核啟動子尤其可以是遍在啟動子(ubiquitouspromoters)(HPRT、PGK、α-肌動蛋白、微管蛋白等基因啟動子)、中間纖維啟動子(GFAP、結蛋白、波形蛋白、神經(jīng)絲蛋白、角蛋白等基因啟動子)、治療基因啟動子(例如MDR、CFTR、因子VIII、ApoAI等基因啟動子)、組織特異性啟動子(丙酮酸激酶、絨毛蛋白、腸脂肪酸結合蛋白、平滑肌α-肌動蛋白等基因啟動子)或刺激應答啟動子(甾體激素受體、視黃酸受體等)。類似地，它們可以是從病毒基因組獲得的啟動子序列，例如腺病毒E1A和MLP基因的啟動子、CMV早期啟動子或RSV的LTR啟動子等。另外，通過增加激活或調節(jié)序列、或允許組織特異性表達或明顯的組織特異性表達的序列，可以對這些啟動子區(qū)進行修飾。此外，目的基因也可以含有引導合成產(chǎn)物進入靶細胞分泌路徑的信號序列。該信號序列可以是合成產(chǎn)物的天然信號序列，但是也可以是任何其他有效的信號序列或人工信號序列。根據(jù)本發(fā)明，使用的優(yōu)選信號序列是由Taniguchi等說明的人類干擾素分泌信號肽(Gene，1980，233(4763)541-5)。依賴于目的基因，本發(fā)明的DNA分子可以用于醫(yī)療或預防一些疾病，包括遺傳性疾病(肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化等)、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、ALS等)、癌癥、凝血功能紊亂或異常脂蛋白血癥相關疾病、病毒感染相關疾病(肝炎、AIDS等)、或用于農(nóng)藝和獸醫(yī)領域等。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的DNA分子用于治療嚴重的肢體缺血疾病(例如外周動脈閉塞性疾病和間歇性跛行)。另外，本發(fā)明也涉及使用條件性復制DNA分子產(chǎn)生重組蛋白質?？梢允褂眉毦a(chǎn)生多種來源(真核或原核)的蛋白質。在細菌中，大腸桿菌由于其易于操作、可獲得大量表達系統(tǒng)以及可獲得大量蛋白質，選為表達異源基因的生物。應當理解，本發(fā)明的系統(tǒng)可以用于其他生物，如上文所指出，取向取決于復制起點的特征。對此用途，目的核酸序列包括在表達信號控制下的編碼區(qū)，該表達信號適合于選用的宿主，特別是原核宿主。它們可以是諸如Plac、Ptrp、PT7、Ptrc、Ptac、PL、PBAD或PR啟動子、Shine-Dalgarno序列等(該組構成了表達盒)。目的核酸序列可以是編碼具有藥劑、農(nóng)業(yè)食品、化學或農(nóng)業(yè)化學價值的蛋白質的任何序列。所述核酸序列可以是結構基因、互補DNA序列、合成或半合成序列等。該表達盒可以引入作為本發(fā)明主題的條件性復制載體上，從而構建使目的蛋白質在大腸桿菌內(nèi)表達的條件性復制載體。此載體具有幾個優(yōu)點不使用抗生素在細菌中對其進行選擇(降低的花費、不需要關于成品中存在抗生素或潛在毒性衍生產(chǎn)物的研究)、基本上沒有質粒在自然界傳播的可能性(條件性復制起點)、可以在完全確定成分培養(yǎng)基中發(fā)酵。給出的實施例顯示這些條件性載體對于產(chǎn)生重組蛋白質的有利特性。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子包括來源于R6K的復制起點ORIγ，其中pir基因被去除并且被引入特定宿主細胞基因組中，該特定宿主細胞用于大規(guī)模產(chǎn)生此DNA分子。臨床試驗和/或以DNA為基礎的基因治療總是需要產(chǎn)生增加數(shù)量的質粒。已經(jīng)設計出攜帶pir基因的生產(chǎn)宿主細胞，其中pir基因含有至少一個突變，例如突變pir116和/或pir42。這類突變的宿主菌株的使用導致增加的質?？截悢?shù)，從而顯著地增加了產(chǎn)物產(chǎn)量。這樣產(chǎn)生的質粒的構型也非常令人滿意。根據(jù)特定的方面，提供以熒光為基礎的全新的拷貝增加型突變體篩選方法。這種以熒光為基礎的方法大大優(yōu)于建立在細菌抗生素抗性水平上的經(jīng)典方法，當質粒的基礎拷貝數(shù)已經(jīng)很高時，比如使用突變pir116獲得的拷貝數(shù)(例如每個細胞約400拷貝)，則不能使用所述的經(jīng)典方法。根據(jù)本發(fā)明的以熒光為基礎的篩選方法優(yōu)選使用cobA基因作為拷貝數(shù)增多的紅色熒光報告基因。來自脫氮假單胞菌(Pseudomonasdenitrificans)的cobA基因(Crouzet等，J.Bacteriol.1999，1725968-79)編碼uroIII甲基轉移酶，該酶是維生素B12途徑的酶，向urogenIII分子添加兩個甲基。Wildt等(NatureBiotechnology，vol.17，1999，pp1175)說明了cobA作為大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞熒光轉錄報告基因的用途。例如，這類熒光報告基因用于選擇含有重組質粒的大腸桿菌菌株，由于編碼uroIII甲基轉移酶的cobA基因的過表達，這樣的菌株蓄積熒光porhyrinoid化合物。當以UV光照射時，細胞發(fā)亮紅色熒光(Biotechniques，1995，vol19，no.7，p.760)。申請人:令人驚訝地發(fā)現(xiàn)攜帶cobA基因的質?？截悢?shù)與從粉紅到紅色的熒光水平之間的密切相關性。因此，根據(jù)本發(fā)明的以熒光為基礎的拷貝增加型突變體篩選方法，可用于篩選多種可以在生產(chǎn)宿主細胞(例如大腸桿菌)基因組中評價的突變體，或者任何插入到生產(chǎn)宿主細胞基因組中、或在質粒中攜帶的基因突變體，如在pir基因中。除了與質?？截悢?shù)的相關性，因為只需要將轉化的宿主細胞接種和培養(yǎng)過夜，并暴露于紫外光下顯示產(chǎn)生的熒光強度，從而直接推導宿主細胞中質粒的拷貝數(shù)，因此本發(fā)明的以熒光為基礎的篩選方法易于并且可快速操作。因此，本發(fā)明提供用于檢測質粒拷貝增加型突變的方法，包括(a)將至少一個突變引入靶序列中；(b)將突變的靶序列轉化入含有質粒的宿主細胞，該質粒包括編碼uroIII甲基轉移酶的核苷酸序列，質?？截悢?shù)受所述靶序列影響；(c)在所述核酸序列被表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞，以產(chǎn)生宿主細胞培養(yǎng)物；(d)將宿主細胞培養(yǎng)物暴露于紫外光下；(e)檢測由宿主細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的熒光。根據(jù)本發(fā)明，該方法進一步包括將(e)中檢測到的熒光與包括非突變靶序列的宿主細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的熒光進行比較。uroIII甲基轉移酶基因優(yōu)選由來自脫氮假單胞菌的cobA基因編碼。突變可以存在于含有異源pir基因的質粒中，所述pir基因包括至少一個突變。在pir其他區(qū)域中，例如在拷貝數(shù)控制區(qū)和/或DNA結合域、和/或亮氨酸拉鏈基序、和/或pir基因的其它區(qū)域中，該質?？梢园ㄖ辽僖粋€突變。在異源pir基因拷貝數(shù)控制區(qū)和亮氨酸拉鏈基序中，該質粒也可以包括至少一個突變。該質粒可以進一步包括pir基因DNA結合區(qū)中的突變。另外，該質?？梢栽趐ir基因中編碼拷貝控制區(qū)和/或DNA結合區(qū)、和/或亮氨酸拉鏈樣基序、或蛋白質∏其他區(qū)域的相同或不同區(qū)域中包含一個或多個突變。在限制范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的原核重組宿主細胞包括pir116突變和DNA結合區(qū)中的第二個突變，例如pir292、pir130、或pir117(圖26)。使用通用質粒(例如微環(huán))，可以方便地產(chǎn)生這類突變的生產(chǎn)宿主菌株。微環(huán)技術特別在申請人的美國專利6,143,530和6,492,164、或在PCT申請WO96/26270中得到說明。微環(huán)是不含任何復制起點的重組DNA分子，因此為任何微生物基因組的基因置換提供了優(yōu)秀的自殺載體。目的基因特別以兩個序列為側翼，這兩個序列允許位點特異性重組，同向定位于微環(huán)中。同向定位說明這兩個序列在重組DNA微環(huán)中具有相同的5′-3′極性。微環(huán)遺傳構建體通常為缺乏復制起點的環(huán)形雙鏈DNA分子，但是也可以為線性形式，并且含有一個或多個目的基因，目的基因以同向定位、允許位點特異性重組的兩個序列為側翼。根據(jù)本發(fā)明這個特定的實施方案，為了微生物基因組中基因置換的目的，微環(huán)可以用于轉化任何感受態(tài)微生物(圖31)。用于基因置換的微環(huán)由母本質粒產(chǎn)生，母本質粒至少包括a)復制起點和選擇標志基因，b)同向定位、允許位點特異性重組的兩個序列，c)置于b)中所述序列之間的一個或多個目的基因。存在于遺傳構建體中的特定重組系統(tǒng)可以為不同來源。特別地，使用的特定序列和重組酶可以屬于不同結構類型，特別是屬于λ噬菌體整合酶家族或屬于轉座子Tn3解離酶家族。在屬于λ噬菌體整合酶家族中，特別可以提及噬菌體λ(Landy等，Science1971147，1977)、P22和Φ80(Leong等，J.Biol.Chem.2604468，1985)的整合酶、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)的HP1(Hauser等，J.Biol.Chem.2676859，1992)、噬菌體P1的Cre整合酶、質粒pSAM2的整合酶(EP350,341)或2μ質粒的FLP重組酶。使用λ噬菌體整合酶家族的位點特異性系統(tǒng)，通過重組制備微環(huán)，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子通常另外包括由于在相應噬菌體或質粒的兩個att附著序列之間重組而產(chǎn)生的序列。在屬于轉座子Tn3家族的重組酶中，特別可以提及轉座子Tn3、或轉座子Tn21和Tn522的解離酶(Stark等，TrendsGenet，8，432-439，1992)；噬菌體mu的Gin轉化酶，或質粒解離酶，例如RP4的par片段的解離酶(Albert等，Mol.Microbiol.12131，1994)。當使用轉座子Tn3家族的位點特異性系統(tǒng)通過重組制備微環(huán)時，除了計劃插入到微生物基因組中的目的基因之外，微環(huán)通常還包括由于在所述轉座子解離酶的兩個識別序列之間重組而產(chǎn)生的序列。允許位點特異性重組的序列也可以從噬菌體P1的loxP區(qū)域衍生，該區(qū)域基本由兩個重復序列組成，這兩個重復序列能夠在稱為Cre的蛋白質的存在下彼此特異性重組(Sternberg等，J.Mol.Biol.150467，1971)。用來產(chǎn)生微環(huán)的質粒因此包括(a)細菌復制起點和選擇標志基因；(b)噬菌體P1的重復序列(loxP區(qū)域)；以及(c)置于(b)中所述序列之間的希望插入到微生物基因組中的一個或多個目的基因?？赡馨ㄔ试S位點特異性重組的序列的微環(huán)來源于噬菌體，例如噬菌體的附著序列(attachmentsequences)(attP和attB序列)，或來源于這些附著序列的序列。存在被稱為整合酶的重組酶(具有或不具有切除酶)時，這些序列可以彼此特異性重組。術語“來源于這些附著序列的序列”包括通過對噬菌體附著序列進行修飾得到的序列，并且這些序列保留了在合適的重組酶存在下特異性重組的能力。因此，這類序列可以是這些序列縮短的片段，或者通過增加其他序列(限制位點等)而延長的片段。它們也可以是通過突變，特別是點突變獲得的變體。根據(jù)本發(fā)明，術語噬菌體或質粒attP和attB序列表示對所述噬菌體或質粒特異的重組系統(tǒng)的序列，即存在于所述噬菌體或質粒的attP序列以及相應的染色體attB序列。附著序列系本領域所熟知，其中包括噬菌體λ、P22、Φ80、P1的附著序列，以及流感嗜血桿菌的HP1，或者質粒pSAM2或2μ質粒的附著序列。微環(huán)易于從上述母本質粒中產(chǎn)生。產(chǎn)生微環(huán)的方法在于將以母本質粒轉化的細胞培養(yǎng)物與帶有或不帶有切除酶的整合酶接觸，以誘導位點特異性重組。通過使用含有所述整合酶基因以及可行時切除酶基因的質?；蚴删w進行轉染或感染，將培養(yǎng)物與帶有或不帶有切除酶的整合酶接觸。作為選擇，例如，誘導存在于宿主細胞中、編碼所述整合酶以及可行時切除酶的基因的表達。如下面所談到的，這些基因可以以整合形式存在于宿主細胞基因組中，存在于復制質粒上、或在本發(fā)明質粒的非治療部分。為了通過體內(nèi)位點特異性重組產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的微環(huán)，在特定情況下將所用帶有/不帶有切除酶的整合酶引入細胞或培養(yǎng)基，或者在細胞或培養(yǎng)基中誘導。為此目的可以使用不同方法。根據(jù)第一個方法，使用含有例如重組酶基因(即，帶有或不帶有切除酶基因的整合酶基因)的宿主細胞，其中的重組酶基因是允許其受調節(jié)表達的形式?？梢栽诶鐔幼?、或可誘導啟動子系統(tǒng)、或溫度敏感系統(tǒng)的控制之下引入帶有或不帶有切除酶基因的整合酶基因。整合酶基因特別可以存在于溫度敏感噬菌體中，在生長期間潛伏，在適宜溫度被誘導(例如溶原性噬菌體λXis-cI857)。作為選擇，該基因可以處于受調節(jié)啟動子的控制之下，例如placUV5啟動子，該宿主細胞稱為大腸桿菌G6191。帶有或不帶有切除酶基因的整合酶可優(yōu)選處于受調節(jié)啟動子的控制之下，例如araBAD(阿拉伯糖)操縱子的PBAD啟動子，該啟動子受阿拉伯糖的調節(jié)(Guzman等，J.Bacteriol，1995，4121-4130；US5,028,530)。在阿拉伯糖作為誘導試劑存在下，使用PBAD啟動子使切除酶和整合酶充分表達，從而允許以高拷貝數(shù)存在于細菌中的質粒90％以上的重組，而缺少阿拉伯糖時，該啟動子被嚴格抑制。帶有/不帶有切除酶的整合酶的表達盒可以由質粒、噬菌體或甚至本發(fā)明質粒的非治療區(qū)攜帶。該表達盒可以整合到宿主細胞基因組中或保持于復制形式。這類宿主細胞特別為大腸桿菌G6264和大腸桿菌G6289。根據(jù)另一個方法，基因表達盒由質?；蚴删w攜帶，這些質粒和噬菌體用于在生長期后轉染或感染細胞培養(yǎng)物。在此情況下，基因沒有必要以使其受調節(jié)表達的形式存在。特別地，可以使用任何組成性啟動子。在質粒制備中，通過直接與蛋白質孵育，DNA也可以在體外與整合酶以及可行時與切除酶接觸。這樣產(chǎn)生的微環(huán)因此包括含有一個或多個將插入到靶微生物中的目的基因的表達盒，缺少復制起點，但包含由attB和attP序列之間位點特異性重組產(chǎn)生的序列attR，或由attB和attP序列之間位點特異性重組產(chǎn)生的序列attL。微環(huán)因此可以用作在任何微生物中基因置換的通用自殺載體。使用圖31中描述的同源重組，攜帶以同源序列為側翼的用于置換的基因以及抗生素抗性基因的微環(huán)，將輕松有效地整合到任何微生物基因組的靶位點中。由第二選擇壓力觸發(fā)的第二個切除事件然后可以有效地選擇僅攜帶新插入到其基因組內(nèi)的基因的微生物。本發(fā)明因此也涉及微生物基因工程方法。這種新方法可以用于設計任何微生物，不管其起源如何。微環(huán)不含任何復制起點，因此可以有效地通用于任何類型微生物的基因置換。通過在微生物中的雙同源重組，該方法為使用噬菌體M13用于基因置換提出了有利的替換方案。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，微環(huán)包括允許選擇第一重組事件的第一選擇性標志，例如抗生素抗性基因。優(yōu)選的第二選擇性標志是基因III或功能性缺失的基因III′。如Boecke等說明，基因III或其功能性變體能夠提供對脫氧膽酸的敏感性(Mol.Gen.Genet.，186，185-92，1982)，從而允許反選擇第二重組事件(圖31)。該方法因此在于使用任何本領域熟知的轉化方法(優(yōu)選使用電穿孔)將微環(huán)引入微生物內(nèi)，在添加抗生素的培養(yǎng)基中或在另一個選擇壓力下選擇微環(huán)整合事件，以及通過使用脫氧膽酸處理或另一個適宜的選擇壓力選擇第二切除事件。本發(fā)明將借助隨后的實施例得到更充分的說明，這些實施例應理解為非限制性說明。圖1參與復制的R6K區(qū)域的功能組織。圖2質粒R6K∏蛋白質的功能域的組織。圖3將pir基因引入大腸桿菌XAC1基因組的程序圖。圖4載體pXL2666、2730和2754構建方案。圖5pXL2774的構建。圖62L發(fā)酵罐中的生長和生產(chǎn)動力學。圖7800L發(fā)酵罐中的生長和生產(chǎn)動力學。圖8pXL3056的構建。圖9大腸桿菌XAC-1pir116(pXL3056+PT7po123)經(jīng)誘導后產(chǎn)生的aFGF蛋白質顯像。變性的全細胞提取物置于12.5％-SDS聚丙烯酰胺凝膠上。M分子量標志(Biorad，低分子量)。使用箭頭和以道爾頓表示其分子量的數(shù)字鑒別各個條帶。1未誘導的XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)；2于42℃誘導的XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)；3未誘導的XAC-1pir116(pXL3056+PT7po123)克隆1；4于42℃誘導的XAC-1pir116(pXL3056+PT7po123)克隆1；5未誘導的XAC-1pir116(pXL3056+PT7po123)克隆2；6于42℃誘導的XAC-1pir116(pXL3056+PT7po123)克隆2；t11μg純化的aFGF；t44μg純化的aFGF。圖10載體pXL3029、pXL3030和pXL3179或NV1FGF圖示。圖11R6Kπ起始蛋白質功能域圖示。圖12包括pir116和pir116pir42突變的pir基因的核苷酸和氨基酸序列。圖13用于同源重組的pir116pir42自殺載體構建體。圖14擴增uidA::pir116+/-pir42區(qū)域時獲得的PCR產(chǎn)物圖示。圖15瓊脂糖凝膠電泳，顯示在TEX1或TEX1pir42中產(chǎn)生的pCOR質粒pXL3179的拓撲學。圖16攜帶pir116cop21基因的pXL3749自殺質粒圖示。圖17瓊脂糖凝膠電泳，顯示大腸桿菌宿主細胞TEX1cop21(1-4道)、大腸桿菌宿主細胞XAC1pir(5-8道)、大腸桿菌TEX1(9-12道)中產(chǎn)生的pXL2979質?？截悢?shù)。圖18recA-自殺載體構建體的克隆程序說明。圖19擴增大腸桿菌TEX2菌株區(qū)域得到的PCR產(chǎn)物圖示。圖20瓊脂糖凝膠電泳，顯示在大腸桿菌TEX2pir42(B道)、大腸桿菌TEX1pir42(C道)、大腸桿菌TEX1(D道)中產(chǎn)生的pCORpXL3179的拓撲學。圖21在大腸桿菌TEX2pir42中發(fā)酵產(chǎn)生的質粒pXL3179的分析。圖22以熒光為基礎的檢測，顯示熒光隨質?？截悢?shù)增加。圖23在以熒光為基礎的檢測中篩選的質粒圖示。圖24質粒pXL3830圖示。圖25示范以熒光為基礎篩選隨機誘變產(chǎn)生的拷貝增加型突變體的瓊脂板。圖26使用以熒光為基礎的篩選方法鑒定的拷貝增加型突變體的評價。圖27插入細菌基因組中的pir116突變體的評價策略圖示。圖28不同pir116*突變體大腸桿菌菌株中pXL3179拷貝數(shù)的評價。圖29用于產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi)同源重組的微環(huán)載體的質粒構建體。圖30用于產(chǎn)生pir116*突變體大腸桿菌菌株的微環(huán)載體的構建。圖31使用微環(huán)載體通過同源重組進行基因置換。圖32培養(yǎng)于含脫氧膽酸鈉培養(yǎng)基的雙重組克隆圖33A和B雙重組子對照PCR的結果。具體實施例方式I-材料與方法A)材料1)培養(yǎng)基使用LB、2XTY和SOC完全培養(yǎng)基，以及M9基本培養(yǎng)基(Maniatis等，1989)。添加15克Difco瓊脂獲得瓊脂培養(yǎng)基。另外，如果有必要，這些培養(yǎng)基可以分別以100mg/l和50mg/l的濃度添加抗生素(青霉素或卡那霉素)。以40mg/l濃度使用生色底物X-Gal和X-Gluc。2)大腸桿菌菌株、質粒和噬菌體分別在下面的實施例中對使用的大腸桿菌菌株、質粒和噬菌體進行鑒定。B)方法1)DNA操作根據(jù)制造商對酶的使用的推薦，或者依照《MolecularCloningaLaboratoryManual》(Maniatis等，1989)中說明的程序，執(zhí)行細菌DNA(質粒和基因組DNA)和噬菌體DNA(M13的復制型)的分離、限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段連接、瓊脂糖凝膠電泳(在TBE緩沖液中)和其他標準技術。電泳中使用的DNA長度標志如下對于線性片段為1kb序列梯度(BRL)，以及對于未消化質粒為超螺旋DNA標志(Stratagene)。根據(jù)適于自動化方法的Sanger技術(Sanger等，1977)，使用熒光雙脫氧核苷酸和TaqDNA聚合酶(PRISMReadyReactionDyeDideoxyTerminatorCycleSequencingKit，AppliedBiosystems)進行測序。通過氨基磷酸酯法，使用α-氰乙基保護基團(Sinha等，1984)，在“AppliedBiosystems394DNA/RNASynthesizer”上合成所用的寡脫氧核苷酸(以“seq+no”表示，見下)。合成后，以氨水處理以去除保護基團。以丁醇沉淀兩次以對寡核苷酸純化和濃縮(Sawadogo等，1991)。用于PCR擴增的寡核苷酸SEQIDNo.35′-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3′SEQIDNo.45′-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3′SEQIDNo.55′-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3′SEQIDNo.65′-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3′在下列條件下，以總體積100μl執(zhí)行PCR反應(Saiki等，1985)。反應混合物包括150ng來自待研究菌株的基因組DNA、兩種寡核苷酸引物(24聚體)各1μg、10xPCR緩沖液10μl(其組成如下“500mMKCl，0.1％明膠，20mMMgCl2，100mMTris-HClpH7.5”)、以及2.5單位TaqDNA聚合酶(AmplitaqPerkin-Elmer)。Perkin-ElmerCetusDNAThermalCycler儀器的PCR條件如下91℃2分鐘，連續(xù)30個變性(91℃，1分鐘)、雜交(42℃，2分鐘)和延伸(72℃，3分鐘)循環(huán)，最后于72℃5分鐘。使用瓊脂糖凝膠電泳分析由此獲得的、使用或未使用限制酶消化的產(chǎn)物。根據(jù)如下程序使用DNA拓撲異構酶執(zhí)行多種質粒種類的分析于37℃將實驗室內(nèi)純化的酶孵育1小時。反應混合物(總體積40μl)組成如下150ng質粒，300ngDNA拓撲異構酶I或150ng大腸桿菌旋轉酶，或160ng金黃色葡萄球菌(S.aureus)DNA拓撲異構酶IV和20μl每種酶特異的緩沖液。這些緩沖液的成分說明如下對于DNA拓撲異構酶I50mMTris-HClpH7.7，40mMKCl，1mMDTT，100μg/mlBSA，3mMMgCl2，1mMEDTA；對于DNA拓撲異構酶IV60mMTris-HClpH7.7，6mMMgCl2，10mMDTT，100μg/mlBSA，1.5mMATP，350mM谷氨酸鉀；對于DNA旋轉酶50mMTris-HClpH7.7，5mMMgCl2，1.5mMATP，5mMDTT，100μg/mlBSA，20mMKCl.2)大腸桿菌的轉化根據(jù)Chung和Miller(1988)說明的TSB(TransformationandStorageBuffer)方法按照常規(guī)執(zhí)行大腸桿菌的轉化。對于例如TG1(Gibson等人，1984)這樣的菌株，獲得的轉化效率約為每μgpUC4K105-106個轉化子(Vieira和Messing；1982)。需要更高的轉化效率時，根據(jù)電穿孔儀制造商(Biorad)推薦的程序，使用電穿孔轉化細菌。此方法可能達到每μgpUC4K形成108-1010個轉化子。3)由陽離子脂質轉染劑(liDofectant)介導的細胞轉染使用的細胞為NIH3T3小鼠成纖維細胞，前一天以每孔50,000個細胞的密度接種到24孔板內(nèi)。使用的培養(yǎng)基為DMEM(Gibco)，含有葡萄糖4.5g/l、添加10％胎牛血清、1％的200mM谷氨酰胺溶液以及抗生素(5.103μ/ml鏈霉素，5.103μg/ml青霉素)(Gibco)。在體積對體積的基礎上，將質粒DNA(1μg，于25μl9‰NaCl中)與脂質轉染劑混合。測試四種“脂質轉染劑電荷/DNA電荷”比0，3，6和9。鑒于1μg質粒DNA攜帶3.1nmol負電荷，脂質轉染劑每分子含有3個正電荷，從而計算出這些比例。在允許形成DNA/脂質體復合物的10分鐘接觸時間之后，將50μlDNA-脂質體混合物引至無血清培養(yǎng)基(500μl)中的細胞上。使用相同的培養(yǎng)基將細胞預清洗兩次，從而避免了血清對轉染的抑制。孵育后(在CO2孵育器中，37℃，2小時)，向培養(yǎng)基添加10％胎牛血清。然后再將細胞孵育24小時。4)真核細胞熒光素酶活性測量轉染24小時之后進行該測量。在ATP、Mg2+和O2存在下，熒光素酶催化熒光素氧化，伴隨產(chǎn)生光子。使用光度計測量，發(fā)射光總量與樣品的熒光素酶活性成正比。所用試劑由Promega提供(熒光素酶檢測系統(tǒng))，按照推薦程序使用。細胞裂解后，通過離心去除各提取物中的不溶級分。以5μl上清進行檢測，這些上清可以或不可以用細胞裂解液稀釋。5)細胞提取物中蛋白質濃度的測量根據(jù)BCA方法(Pierce)使用二辛可寧酸(bicinchoninicacid)(Wiechelman等人，1988)進行該測量。在裂解緩沖液(cf.III-B-4)中制備標準BSA范圍。在體積對體積的基礎上，使用0.1M碘乙酰胺/0.1MTris緩沖液pH8.2，將待測樣品和范圍樣品于37℃預處理1小時。該處理可以防止裂解液中存在的還原試劑(DTT)在檢測中造成的干擾。于562nm讀取檢測結果。實施例1通過同源重組構建XAC-1pir和pir116宿主菌株所用菌株為大腸桿菌菌株XAC-1(Normanly等人，1980)。該菌株的argE基因有利的包括了谷胺酰胺-53(CAG)到琥珀密碼子(TAG)的突變(Meinnel等人，1992)。argE基因屬于argECBH分散操縱子(divergentoperon)，編碼精氨酸生物合成酶N-乙酰鳥氨酸酶。因此XAC-1不能合成精氨酸，從而不能在基本培養(yǎng)基中生長。如果該菌株含有允許抑制型tRNA表達的質粒，這種營養(yǎng)缺陷型將被解除。因此可以通過在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)而選擇攜帶這種質粒的細菌。為了允許從R6K得到的質粒的復制，需要通過同源重組將pir基因引入XAC-1基因組。通過野生型uidA基因與被pir(或pir116)基因中斷的拷貝之間的交換，將pir基因(野生型或突變的)引入uidA基因座。uidA基因編碼水解β-葡糖苷酸的β-葡糖醛酸酶。該基因毫無疑問可以被失活，因為在沒有使用β-葡糖苷酸的標準合成培養(yǎng)基中，它并非生長所必需。另外，可以使用水解釋放藍色色素的生色底物X-Gluc監(jiān)測β-葡糖醛酸酶活性。1)構建攜帶“KmR-uidA::pir(或pir116)盒的自殺載體我們使用的策略涉及單細菌宿主以及對目的菌株基因組修飾的最小化。使用噬菌體M13mp10(MessingetVieira；1982)作為自殺載體(Blum等，1989)。復制必需的基因II中的琥珀突變，將M13的宿主譜縮小為產(chǎn)生琥珀抑制型tRNA的菌株，例如TG1(supE)；因此，它不能在例如XAC-1的大腸桿菌sup+菌株中復制。分別從M13wm34和33中純化含有Tn5卡那霉素抗性基因和-uidA::pir或pir116的3.8kb的BamHI盒(Metcalf等，1994)。將其克隆到以BamHI線性化的M13mp10中。將連接混合物電穿孔至TG1中之后，通過接種于添加卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，篩選重組子克隆。通過限制圖譜和對相應于pir116突變的區(qū)域的測序，說明所獲克隆的一致性。2)通過同源重組將pir或pir116基因引入大腸桿菌XAC-1基因組采用的策略和涉及的多個事件展示于圖3。a)第一次重組事件通過電穿孔使用每個RF(mp10-_uidA::pir或pir116)各10，100或2000ng轉化XAC-1菌株。將每個表達混合物的三分之一接種在含有卡那霉素的LB板上，于37℃孵育過夜。Mp10-_uidA::pir或pir116噬菌體不能在菌株XAC-1(sup+)中復制。因此，只有通過與基因uidA野生型拷貝的同源重組整合到基因組中才能保持卡那霉素抗性(“KmR”)標志。XAC-1電穿孔結果展示于表1中。獲得的轉化效率為每μgpUC4K4.109個轉化子。表1在測試條件下，整合子的數(shù)目隨DNA量非線性增加。給定轉化效率和RF大小(11.7kbp)，可能得到重組水平的近似估算。在100ng考慮時，獲得的重組效率約為10-6。b)第二次重組事件使用菌株對脫氧膽酸的抗性(“DocR”)選擇第二次重組事件。為此目的，在添加0.2％脫氧膽酸鈉的2XTY培養(yǎng)基中，每個構建體培養(yǎng)5個整合子。出現(xiàn)兩個截然不同的群體。于37℃培養(yǎng)約8小時后，某些克隆出現(xiàn)相當明顯的暈(cloudiness)(pir構建體的兩個克隆，以及pir116構建體的三個克隆)。其他克隆于37℃僅一夜后即產(chǎn)生致密菌落。實際上它們都如預期的對卡那霉素敏感(“Kms”)。對于研究的每個電穿孔克隆，將50個Kms后代在添加X-Gluc的LB培養(yǎng)基上劃線。于37℃48小時后，在此培養(yǎng)基上，UidA+克隆為淺藍色，而經(jīng)歷等位基因置換(CaseNo.1，圖3)的克隆保持白色(UidA-)。表2概括了獲得的雙重組子的表型分析。18％至30％的雙重組子經(jīng)歷了等位基因置換。表23)檢驗通過重組所獲菌株的Pir+性質特征為了確保通過雙重組所獲菌株的Pir+特性，我們使用pBW30(Metcalf等人，1994)轉化每個構建體的3個克隆。所有測試菌株都獲得轉化子的事實，可能說明整合到XAC-1基因組中的pir和pir116基因的功能性。在相同條件下，使用母本菌株XAC-1沒有獲得轉化子。我們繼續(xù)研究了兩個XAC-1pir克隆(B和C)以及兩個XAC-1pir116克隆(E和D)。4)使用PCR擴增，檢驗通過重組所獲菌株為了確認等位基因置換，我們使用PCR擴增檢測uidA基因座兩側的基因組區(qū)。每對寡核苷酸由對應于pir內(nèi)部區(qū)域的寡核苷酸和對應于接近染色體uidA的區(qū)域(但不在用于重組的片段之內(nèi))的第二個寡核苷酸組成。依靠Genbank的ECOUIDAA序列(目錄號M14641)確定后一寡核苷酸序列。我們因此可以核實pir基因在細菌基因組中的精確定位。通過M1uI消化，確認其大小與預期相符的擴增片段的性質。實施例2構建來自R6X、攜帶選擇標志supPhe的質粒載體構建含有來自R6K的oriγ和卡那霉素抗性基因的載體(pKL2666)。對菌株BW19610(pir116)5(Metcalf等人，1993)中pXL2666多聚體的觀察，致使我們研究ColE1的cer片段對此現(xiàn)象的影響。我們于是將苯丙氨酸抑制型tRNA(supPhe)表達盒引入載體oriγ-KmR-cer(pXL2730)中。該載體，即pXL2760，作為構建可用于基因治療的載體的基礎。1)含有R6Koriγ和卡那霉素抗性基因的載體的構建和分析a)構建體構建的第一個質粒pXL2666中，卡那霉素抗性基因來自pUC4K(Vieira和Messing；1982)，417bpEcoRI-BamHI片段中含有的復制起點來自自殺載體pUT-T7pol(Herrero等，1990)(圖4)。pXL2666向菌株BW19094和19610(Metcalf等人，1994)中的轉移可能顯示，當與pir菌株中的相同質粒比較時，在pir116菌株中的質粒數(shù)確實增加。然而，對未消化質粒的電泳分析顯示，這種增加伴隨著少數(shù)多聚體形式的出現(xiàn)。這種現(xiàn)象很有可能與質粒多個拷貝之間的分子間重組有關。因此，我們通過將天然大腸桿菌質粒ColE1中的cer片段克隆到pXL2666而構建pXL2730，其中所述cer片段顯示使質粒雙體順式解離(Summers和Sherrat，1984)為pXL2666。所用片段對應于ColE1的382bpHpaII片段(Leung等，1985)。它含有特異性分子間重組位點；為了行使功能，它僅涉及包括重組酶XerC和XerD、以及輔助因子ArgR和PepA的宿主蛋白質(Stirling等人，1988，1989；Colloms等人，1990)。為了確保觀察到的作用的確歸因于cer片段，我們還構建了對照質粒pXL2754，其中cer片段具有165bp缺失。該缺失已被證實取消了cer對多聚體解離的作用(Leung等人，1985)。導致這些質粒構建的多個克隆步驟顯示于圖4。b)質粒種類的定量和定性分析(i)瓊脂糖凝膠電泳構建的不同質粒的電泳分析，允許證明根據(jù)所用菌株而可變的質粒種類。估計未消化質粒相對于超螺旋DNA標志的大小。在pir菌株(BW19094)中，質粒pXL2666、2754和2730幾乎完全為單體形式。正如在DNA旋轉酶對pXL2730作用之后所觀察到的圖譜所證實，每個主要條帶上方的條帶對應于多個較低超螺旋度的拓撲異構體。在pir116菌株(BW19610)的情況下，圖譜是不同的使用質粒pXL2666和2754，觀察到從單體到多聚體(2、3或4個單位)范圍內(nèi)變化的不同種類，主要形式是二聚體。使用EcoRI消化后，僅發(fā)現(xiàn)線性質粒DNA；這些質粒種類對應于質粒多聚體或多種拓撲異構體。然而，由于根據(jù)超螺旋DNA標志確定的形式的大小是單體質粒形式的所有產(chǎn)物，因此很有可能它們是多聚體。多聚體的形成最可能是pir116突變造成的，盡管兩個菌株BW19094和BW19610并非是嚴格等基因的(BW19610為recA)。由pXL2730獲得的圖譜是不同的盡管多聚體形式仍然可見，主要形式為單體形式。Cer片段因此可以不依賴于recA而幫助質粒多聚體的解離，該質粒是我們在BW19610中構建的。(ii)DNA拓撲異構酶處理后的分析為了反駁在pir116等位基因攜帶菌株中觀察到的形式是特定異構體的理論，使每個質粒制劑都經(jīng)過DNA拓撲異構酶作用。多種酶在實驗條件下的活性如下大腸桿菌拓撲異構酶I松弛DNA、大腸桿菌DNA旋轉酶負超螺旋化松弛的DNA、以及金黃色葡萄球菌DNA拓撲異構酶IV解開交結的DNA和松弛超螺旋DNA。DNA拓撲異構酶IV的作用可能說明高分子量質粒形式并非由于幾個質粒分子交結導致；在此情況下，它們將被轉化為單體種類。當然，該酶的功能已在動基體DNA制劑(由交結的DNA分子組成)上得到檢查(未顯示)。因為獲得的種類比未處理的對照移動較少，因此也觀察到了松弛活性。DNA旋轉酶的作用可能將稍為松弛的拓撲異構體轉化為從細菌中提取的更為超螺旋的種類(主要為單體和雙體)。另外，也可能證實制備的DNA主要為超螺旋形式。這樣處理的樣品使上面關于各種構建體的主要種類的結果得到確認。DNA拓撲異構酶I確實松弛DNA，但是僅僅是部分地松弛。這一點可以歸結于所研究的質粒僅含有少量單鏈區(qū)域，這些區(qū)域是該酶優(yōu)先結合之處(Roca，1995)。2)選擇標志supPhe引入pXL2730我們使用合成的抑制型tRNA基因(Phe)表達盒(Kleina等人，1990)。響應于TAG密碼子，這將苯丙氨酸引入到增長的多肽鏈中。另外，這使ArgE蛋白質在XAC-1中生產(chǎn)，ArgE蛋白質足夠活躍以允許在精氨酸缺陷培養(yǎng)基中的良好生長。supPhe在質粒pCT-2-F上于合成啟動子控制下組成性表達(Normanly等人，1986)，該合成啟動子來自大腸桿菌1pp基因的P1pp啟動子序列。該基因下游，轉錄被合成的大腸桿菌操縱子rrnC的終止子TrrnC終止(Normanly等人，1986)。在圖5中說明了多個克隆步驟。在XAC-1中進行了多個亞克隆。通過該菌株的α-半乳糖苷酶活性檢查抑制型tRNA表達盒的功能，該酶活性僅在基因lacZu118am琥珀密碼子抑制時存在。最后步驟由將supPhe表達盒引入pXL2730中組成。使用cer片段(B-1-b)獲得的結果導致我們選擇該質粒而不是pXL2666。我們保留了卡那霉素抗性以便于亞克隆，尤其是為了在最后克隆期間擁有可利用的額外的篩選(KmR損失)。實施例3通過轉染鼠成纖維細胞確認質?？蓱糜诨蛑委?)報告載體pXL2774的構建為了檢驗該系統(tǒng)為基因治療產(chǎn)生質粒DNA的有效性，我們將可以用于真核細胞的報告基因引入pXL2760中。我們使用編碼Photinuspyralis熒光素酶的基因1uc，因為生物發(fā)光測量實驗非常敏感，在大范圍內(nèi)為線性，而且，因真核細胞的內(nèi)源性活性造成的背景噪聲非常低。使用允許高水平表達的人類巨細胞病毒早期基因(CMV啟動子)的啟動子-增強子序列控制Luc基因。在1uc3′末端有一個來源于病毒SV40的非翻譯區(qū)，含有聚腺苷酸化信號(poly(A)+)。進行增加可利用的限制位點數(shù)目的中間克隆(intermediatecloning)之后，將“CMV啟動子-1uc-poly(A)+”盒引入到最小載體(minimalvector)oriγ-cer-supPhe(pXL2760)中，取代KmR標志。產(chǎn)生的質粒被命名為pXL2774。圖6顯示了多個克隆步驟。使用電穿孔將連接混合物轉化到XAC-1pir116中。在豐富培養(yǎng)基(SOC培養(yǎng)基)中孵育使細菌表達選擇標志；因此有必要在接種之前以M9培養(yǎng)基將細胞清洗兩次。這可以去除將會在基本培養(yǎng)基上導致培養(yǎng)高背景噪音的殘留培養(yǎng)基。被選擇接種電穿孔細胞的培養(yǎng)基是M9基本培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以選擇表達抑制型tRNA的細菌，從而選擇我們質粒的出現(xiàn)。添加X-Gal使得可以通過藍色染色顯示抑制型tRNA的表達。于37℃約20小時之后分析培養(yǎng)皿。在無DNA的對照上不出現(xiàn)菌落，確保我們的選擇是正確的，即使是以高密度接種。使用限制(8)檢查的所有克隆確實攜帶質粒，與預期的圖譜吻合。使用涉及離子交換步驟(Promega試劑盒，MegaPreps)的技術，從一升液體M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)(于37℃約18小時)的克隆制備如此構建的質粒，即pXL2774。收集的DNA量約為2mg。2)報告載體pXL2774轉染哺乳動物細胞的分析。通過轉染NIH3T3小鼠成纖維細胞，評價pXL2774轉染真核細胞并表達熒光素酶的能力。選作參照的載體為質粒pXL2622(以CMV啟動子取代SV40啟動子的來自Promega的質粒pGL2)，它攜帶與pXL2774相同的熒光素酶表達盒，但是位于不同的復制子上。它是攜帶氨芐青霉素抗性基因的6.2kb的ColE1衍生物。該質粒作為對照。熒光素酶活性(表示為RLU，或相對發(fā)光單位)顯示于表3。當“脂質轉染劑電荷/DNA電荷”比為6時獲得最好結果；在這些條件下，pXL2622和2774表現(xiàn)相當。表3實施例4確認大腸桿菌中pCOR質粒的自殺載體性質使用質粒pUC4K(oriColEI-KmR，(Vieira和Messing，1982))和pXL2730(來自R6K-KmR的oriγ，見實施例2)進行電穿孔實驗，在JM109大腸桿菌(Yanisch-Perron等人，1985)中證實了得自R6K的pCOR型質粒的非復制性。使用的電穿孔儀為BioradGenePulser，制備并且根據(jù)制造商的程序(Bacterialelectro-transformationandpulsecontrollerinstructionmanual.catalognumber165-2098)使用電感受態(tài)細胞。將電轉化的細胞接種于添加卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上，于37℃孵育過夜。所獲結果如下。結果這些結果顯示，ColEI衍生物(pUC4K)和R6K衍生物(pXL2730)在不表達pir基因的菌株中轉化效率之間具有最小為5logs的差異。在pir+菌株例如XAC-1pir116中，R6K來源的質粒的電轉化效率保守地達到或超過108轉化子/微克質粒。實施例5通過高密度培養(yǎng)大腸桿菌XAC-1pir116(pXL2774)生產(chǎn)質粒DNA發(fā)酵方法5.1.菌株最小質粒(minimalplasmid)pXL2774在XAC-1pir116大腸桿菌(實施例1)中的生產(chǎn)；該質粒包括下列元件oriR6K-cer-tRNAamsupPhe，以及在CMV啟動子控制下的1uc報告基因表達盒(實施例3)。發(fā)展了生產(chǎn)這種類型質粒的高生產(chǎn)力方法。5.2.培養(yǎng)基及條件a)生長培養(yǎng)基用于接種體培養(yǎng)的確定成分培養(yǎng)基成分(g/l)Na2HPO46，KH2PO43，NaCl0.5，NH4Cl1，NH4H2PO43，葡萄糖5，MgSO4·7H2O0.24，CaCl2·2H2O0.015，鹽酸硫胺0.010用于補料分批培養(yǎng)的復合培養(yǎng)基成分(g/l)KH2PO48，K2HPO46.3，Na2HPO41.7，(NH4)2SO40.74，NH4Cl0.12，酵母提取物3，葡萄糖2，MgSO4·7H2O2.4g/l，CaCl2·2H2O0.015，硫胺0.010，鹽溶液(Fe、Mn、Co、Zn、Mo、Cu、B、Al)。用于補料分批培養(yǎng)的確定培養(yǎng)物的成分與復合培養(yǎng)基一致，但是以2.5g/lNH4Cl取代酵母提取物。b)補料分批培養(yǎng)條件在含有1升培養(yǎng)基的2升發(fā)酵罐(SetricFrance)中進行研究以確定培養(yǎng)和產(chǎn)生質粒DNA的最佳條件。使用到達生長穩(wěn)定期起始階段的接種培養(yǎng)物80ml接種發(fā)酵罐。發(fā)酵期間，使用10％(w/v)氨水將pH自動控制并調節(jié)在6.9至7.0之間；溫度保持在37℃；通風設定為在0.2bar壓力下75l/h(1.1vvm)，通過攪動速度上的反作用調節(jié)溶解氧為空氣飽和度的40％，必要時可以使用純氧氣。通過連接到Hewlett-Packard9000的HP3852界面，依次收集并計算所有參數(shù)(pH、溫度、攪動、OD、排出氣中的O2和CO2)。補加培養(yǎng)基的基本成分如下50％碳源，0.7％硫酸鎂，0.02％硫胺；對于復合培養(yǎng)基，添加酵母提取物，優(yōu)選達到濃度為5％至10％之間。為了使培養(yǎng)條件適合于800升發(fā)酵罐，在實驗室規(guī)模執(zhí)行由兩個連續(xù)的接種體培養(yǎng)組成的生產(chǎn)順序。接種體I在搖動的錐形瓶中，接種體II在2升發(fā)酵罐中(分批培養(yǎng))，隨后在7升發(fā)酵罐中補料分批生產(chǎn)培養(yǎng)。5.3.結果在復合培養(yǎng)基、確定成分培養(yǎng)基中，以多種生長速率，對多種培養(yǎng)條件進行研究。在所有情況下，在細菌菌株初始批培養(yǎng)及碳源消耗之后，使用蠕動泵以預先設計的添加程序，將補充培養(yǎng)基添加到發(fā)酵罐中。所述添加程序是從以前的實驗推導而來，在這些實驗中，添加速度由溶解氧水平或恒定生長速率控制。另外，為了沒有困難地將2升發(fā)酵罐條件外推到800升發(fā)酵罐，而不伴有培養(yǎng)基的過度氧化，將培養(yǎng)末最大氧需求設定為2.5-3mM/min。為此，如果有必要，通過改變補充裝料的補充速率來降低微生物的生長速率。如表4所見，在實驗室規(guī)模和800升發(fā)酵罐規(guī)模，在復合培養(yǎng)基和確定成分培養(yǎng)基中都得到良好結果；另外，質粒DNA生長和生產(chǎn)動力學完全可比(cf.圖6及7)。表4X＝生物量(細胞干重)全部結果顯示-可以毫無困難地執(zhí)行將發(fā)酵規(guī)模從2升改變?yōu)?00升，-消耗的氧氣與產(chǎn)生的生物量強烈相關(1.08gO2/g產(chǎn)生的生物量)-沒有選擇壓力時質粒至少穩(wěn)定50代，-可以在復合培養(yǎng)基中獲得高生物量，即每升多于40g干細胞-質粒DNA產(chǎn)量達到每升培養(yǎng)基100mg超螺旋DNA，-DNA產(chǎn)量和生物量之間具有良好的相關性不考慮發(fā)酵持續(xù)時間，產(chǎn)量可以估計為1mg質粒DNA/OD單位，或者2.7mg質粒DNA/g生物量，-確定成分培養(yǎng)基的使用也可能達到高生物量(每升30g干細胞)和高質粒DNA產(chǎn)量(100mg/l)，沒有任何生產(chǎn)力損失。實施例6pL2774至哺乳動物細胞的體外或體內(nèi)轉移6.1.pXL2774至哺乳動物細胞的體外轉移在人類來源或鼠類來源的細胞上，體外測試最小質粒pXL2774轉染多種細胞系的能力。使用pXL2784質粒作為對照。它含有與pXL2774相同的真核表達盒(CMV啟動子-熒光素酶-polyA)，但是其為6.4kb的ColE1衍生物，包括在大腸桿菌中賦予卡那霉素抗性的基因。測試的細胞如下轉染條件如下D-1以每2cm2孔(24孔板)100,000個細胞的密度接種于添加10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′smodifiedEagleMedium)中。D-3在250μl添加或不添加10％FCS的培養(yǎng)基中，使用10μl轉染溶液轉染細胞，轉染溶液含有0.5μgDNA，150mMNaCl，5％葡萄糖和每μgDNA3nmolRPR120535脂質轉染劑。孵育2小時后，使用500μl添加10％FCS的DMEM培養(yǎng)基取代該培養(yǎng)基。D-4更新培養(yǎng)基D-5以PBS清洗細胞，隨后使用100μlPromega裂解緩沖液(PromegaCellLysisBufferE153A)裂解。在LumatLB9501光度計(Berthold)中，以10秒的整合期，對10μl裂解液進行熒光素酶活性檢測。使用的反應物來自Promega(PromegaLuciferaseAssaySubstrate)。在下表5-8中比較的結果，以10μl裂解液的RLU(RelativeLightsUnits，相對光照單位)表示(對4個孔測量的平均值)。并給出變異系數(shù)(CV)。在無血清存在下的轉染結果展示如下。細胞型在血清存在下(10％)的轉染結果展示如下細胞類型細胞類型這些結果揭示了pXL2774體外有效轉染鼠類和人類來源的多種細胞類型的能力。Luc報告基因的表達可以顯示，其轉染效率至少與來自ColE1、攜帶相同熒光素酶表達盒的“標準”質粒一樣好。6.2.pXL2774至動物(小鼠)的體內(nèi)轉移a)模型1小鼠前脛骨肌肉(cranialtibialmuscle)中的裸DNA將溶解于“5％葡萄糖、150mMNaCl”中的裸露質粒DNA注射到OF1小鼠前脛骨肌肉中。注射7天后去除該肌肉，切碎，在750μl裂解緩沖液(PromegaCellLysisBufferE153A)中勻漿，然后以20,000×g離心10分鐘。10μl上清在添加50μl試劑(PromegaLuciferaseAssaySubstrate)之后，進行熒光素酶活性檢測。在LumatLB9501光度計(Berthold)上，以10秒整合期進行讀取。結果展示于下表中。這些結果顯示，條件性復制質粒例如pXL2774確實能夠在體內(nèi)轉染小鼠肌肉，并且能夠以等同于或者甚至高出“標準”質粒的功效進行轉染，所述“標準”質粒來自ColE1，攜帶相同的熒光素酶基因表達盒。b)模型23T3HER2腫瘤模型該模型如下-成年雌性瑞士/裸鼠-皮下注射1073T3HER2細胞至側腹后誘導實驗性腫瘤。-注射細胞7天后注射轉染混合物。注射溶液DNA首先溶解于緩沖液中。添加所有產(chǎn)物后，混合物含有DNA、NaCl(150mM)和5％右旋葡萄糖，溶于水或5mMHEPES緩沖液中。-注射2天后，去除腫瘤組織，稱重，然后切碎并在750μl裂解緩沖液(PromegaCellLysisBufferE153A)中勻漿。離心后(20,000×g，10分鐘)，去除上清并評價熒光素酶活性。與50μl試劑(PromegaLuciferaseAssaySubstrate)混合后，在LumatLB9501光度計(Berthold)上，以10秒整合期測量所獲的全部發(fā)射光，來確定該活性。產(chǎn)生的活性以在整個腫瘤裂解上清液中估計的RLU(相對光照單位)表示。結果這些結果顯示，條件性復制質粒例如pXL2774，確實能夠體內(nèi)轉染小鼠腫瘤細胞，并且能夠以至少能與“標準”質粒相比的功效進行轉染，所述“標準”質粒來自ColE1，攜帶相同的熒光素酶基因表達盒。這些實驗證明，條件性復制質粒，尤其是pXL2774，確實具有動物細胞轉染特性，這是用于基因治療所必需的。更精確地，顯示了下列1)pXL2774體外有效轉染人類或鼠類來源的多種細胞類型的能力；2)pXL2774體內(nèi)轉染小鼠肌肉的能力；3)pXL2774體內(nèi)轉染移植入小鼠的腫瘤細胞的能力。電轉化、發(fā)酵和轉染實驗因此可能證實條件性復制質?？勺鳛橛糜诨蛑委煹妮d體，通過顯示下列i)它們在不表達pir基因(條件性復制起點)的大腸桿菌菌株中沒有可檢測的復制；ii)能夠在不含抗生素的確定成分培養(yǎng)基中，以與工業(yè)生產(chǎn)一致的規(guī)模產(chǎn)生該質粒；iii)這些質?？梢栽隗w外以及尤其是體內(nèi)轉染哺乳動物細胞。實施例7重組蛋白質的體外生產(chǎn)7.1.表達載體的構建為了顯示這種方法的可行性，我們根據(jù)上述標準(實施例2和3)構建表達載體。該載體pXL3056含有1)包括條件性復制起點(oriγ)的細菌部分，ColE1cer片段以及保證細菌內(nèi)選擇的基因(sup)2)以Studier(Studier等，1990)描述之系統(tǒng)為基礎的表達盒，包括噬菌體T7基因10的啟動子、1ac0操縱子、aFGF154編碼基因(酸性成纖維細胞生長因子，含有154個氨基酸的形式)(Jaye等，1986)、以及噬菌體T7終止子。該表達盒與申請WO96/08572中說明的存在于pXL2434質粒上的表達盒一致。pXL3056構建體展示于圖8中。將含有aFGF表達盒的pXL2434的EcoRI-BglII片段(1.1kb)在BglII和EcoRI位點克隆到pXL2979條件性復制載體中(1.1kb純化片段)，產(chǎn)生pXL3056。pXL2979由3個片段的連接產(chǎn)生i)pXL2730的AccI-XbaI片段(提供oriγ和cer的0.8kb片段)，ii)pXL2755的NarI-SaII片段(提供supPhe基因的0.18kb片段)，iii)pXL2660的SalI-SpeI片段(提供卡那霉素抗性基因的1.5kb片段)。pXL2660由pUC4K的1.2kbPstI片段(Vieira和Messing，1982)克隆到pMTL22(Chambers等，1988)中產(chǎn)生，其中pMTL22以PstI線性化。7.2.表達菌株的生產(chǎn)通過轉化將質粒pXL3056引入XAC-1pir116菌株。然后在30℃以質粒PT7po123(Mertens等，1995)轉化產(chǎn)生的菌株。為了在T7啟動子的控制下表達目的基因，細菌必須在其基因組中、質?；蚴删w上含有允許噬菌體T7RNA聚合酶表達的盒。在實施例中，我們使用質粒pT7po123，該質粒與R6K衍生物例如pXL3056兼容，并且允許噬菌體T7RNA聚合酶的溫度誘導型表達。然而，也可以設想以λDE3將XAC-1pir116菌株溶原化(lysogenize)(Studier等，1990)來僅保存一種質粒，并使用IPTG而非溫度誘導T7RAN聚合酶的產(chǎn)生。7.3.aFGF的表達在添加0.2％酪蛋白氨基酸(DIFCO)和卡那霉素(25μg/ml)的M9基本培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)XAC-1pir116菌株(pXL3056+PT7po123)至600nm光密度為0.6-1.0。將培養(yǎng)物的一半置于42℃(誘導T7RNA聚合酶)，另一半保持于30℃(陰性對照)。使用XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)菌株進行相同實驗，該菌株作為缺少T7RNA聚合酶時aFGF表達的對照。得到的結果展示于圖9中。這些結果顯示，aFGF的生產(chǎn)相當于或優(yōu)于使用BL21(DE3)(pXL2434)(WO96/08572)所觀察到的，清楚地說明條件性復制質粒用于體外、尤其是在大腸桿菌中表達重組蛋白質的潛力。實施例8構建表達野生型或雜合p53蛋白質或人類FGF1蛋白質的pCOR載體本實施例描述了含有編碼p53蛋白質的核酸的本發(fā)明的條件性復制載體的構建。該載體可以用于在缺陷(突變的、刪除的)細胞中(例如，特別是腫瘤細胞)恢復p53型活性。真核表達盒含有下列元件1)CMV“立即早期”啟動子(-522至+72位)，隨后為I型單純皰疹病毒腺苷酸激酶基因的前導序列(基因的-60至+1位，參見論文McKnight，S.fL.(1980)NucleicAcidsRes.85949-5964中的序列)2a)編碼野生型p53蛋白質或p53變體的核酸，如申請PCT/FR96/01111中所述(V325K變體＝帶有具有ATG的Kozak序列的V325)；2b)編碼人類FGFa或FGF-1的核酸，如JayeM.Sciences1986；233(4763)451，USpatentNo4,686,113以及EuropeanPatentNo259475中所說明；2c)編碼人類成纖維細胞干擾素分泌信號(Taniguchi等)與人類FGF-1從氨基酸21至154位的天然截短形式之間的融合基因，如Jaye等和US5,849,538所說明。3)SV40的polyA聚腺苷酸化序列。這些元件以片段AscI-XbaI的形式置于pCOR載體pXL2988上的BssHII和SpeI位點之間。除了存在能夠形成DNA三螺旋的序列之外，pXL2988與pXL2979(實施例7.1.)一致，這個能形成DNA三螺旋的序列由17個拷貝的三核苷酸GAA組成，置于γ復制起點旁。產(chǎn)生的質粒命名為pXL3029、pXL3030、pXL3179或NV1FGF(圖10)。通過測量p53或p53superWT的轉錄激活物活性，或通過使用本領域熟知的例如ELISA實驗測量FGF1分泌，在培養(yǎng)物中的p53-SAOS2細胞上驗證這些構建體的功能。實施例9TEX1(XAC1pir116，endA-，traD-)的構建大腸桿菌XAC-1pir116含有F′游離基因，F(xiàn)’游離基因是約100kb、攜帶proB+lacI373lacZu118am的環(huán)形DNA分子。許多雄性大腸桿菌實驗室菌株在其游離基因上攜帶traD36突變，但是對于XAC-1尚未發(fā)現(xiàn)有影響F’轉移能力的突變?；騮raD在tra(轉移)操縱子之一的5′末端，編碼直接涉及DNA轉移和DNA代謝的膜蛋白(Frost等，BBRC，1994，58162-210)。通過在XAC-1pir116endA-內(nèi)的同源重組，以來自pHP45Ω(Prentki和Krisch，1984，Gene，29303-313)的2kbΩ元件(Genbank目錄號M60473)置換來自TraD、包括該基因92％的2kb中央片段。Ω元件含有aadA抗生素抗性基因，以短的反向重復序列為側翼?；騛adA編碼氨基糖苷-3腺嘌呤轉移酶，賦予鏈霉素和壯觀霉素抗性(“SpR”)。使用Ω元件，因其過早終止了RNA和蛋白質的合成，導致整個traD操縱子失活。將所述新的pCOR菌株XAC-1pir116endA-traD::SpR指定為TEX1。當供體為TEX1時，任何駐留質粒(residentplasmids)，無論pCOR或pUC，其轉移都是不可檢測的。在發(fā)酵實驗中評定新pCOR宿主菌株TEX1。使用含有酵母提取物的復合培養(yǎng)基用于XAC-1pir116的補料分批發(fā)酵。pCOR的穩(wěn)定性(多于50代)造成可以使用非選擇性培養(yǎng)基。在這些條件下，XAC-1pir116產(chǎn)生高于40g/l的細胞干重，并從2升發(fā)酵罐獲得100mg/lpCORpXL2774。pCOR拷貝數(shù)估計為每個細胞400-500拷貝，質粒DNA合成速率在發(fā)酵過程中恒定。將這些結果外推到適于制造行業(yè)的800升發(fā)酵罐。發(fā)酵也在缺乏酵母提取物或任何動物來源的原材料的情況下進行。在2升培養(yǎng)物中使用確定成分培養(yǎng)基，得到相似結果(30g/l細胞干重以及100mg/l質粒DNA)，同時沒有生產(chǎn)力損失。實施例10通過同源重組構建XAC-1pir116pir42宿主菌株1)構建攜帶“KmR-uidApir116pir42”盒的自殺載體通過使用PCR的定點誘變(QuickChange定點誘變試劑盒，Stratagene，LaJolla，CA)，修飾實施例1中所述來自M12wm33的KmR-uidA::pir116盒，從而將pir42突變引入pir116基因。在圖13中說明了不同的克隆/誘變步驟。用于誘變的寡核苷酸含有pir42突變及產(chǎn)生ClaI位點的沉默突變，當需要時輕松地通過限制分析顯示pir42的處理。使用的有義和反義寡核苷酸如下有義寡核苷酸編號11076(SEQIDNO7)5’-GTATATGGCGCTTGCTCTCATCGATAGCAAAGAACC-3’pir42ClaI反義寡核苷酸編號11077(SEQIDNO8)5’-GGTTCTTTGCTATCGATGAGAGCAAGCGCCATATAC-3’ClaIpir42用于在大腸桿菌pCOR宿主TEX1基因組中pir116pir42置換pir116的技術建立在Blum等人的技術之上(J.Bacteriol.1989，171，pp538-46)。顯示于圖13中的重組噬菌體pXL3723因為在編碼M13切口酶的基因II中具有防止病毒基因組復制的無義突變，所以在所有非抑制(non-suppressor)大腸桿菌菌株中，它是自殺載體。如所述進行雙重組以構建XAC-1pir116(實施例1，第二點)。通過PCR篩選經(jīng)過雙同源重組事件的克隆，以檢測TEX1基因組中pir42突變的存在。使用從雙重組候選克隆中分離的基因組DNA作為PCR模板。其次，對每個獨特的擴增片段進行測序，所有這些片段具有預期大小。PCR片段顯示于圖14中。PCR引物如下引物11088(SEQIDNO9)5’-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3’引物11089(SEQIDNO10)5’-TCTACACCACGCCGAACACC-3’該分析顯示，檢測的六個雙重組子中有一個經(jīng)歷了等位基因交換。與母本菌株TEX1相比，這個命名為TEX1pir42的新菌株復制pCOR質粒的能力得到進一步評價。2)TEX1pir42的評價將pCOR質粒平行轉化至TEX1和TEX1pir42中，在2ml選擇性M9培養(yǎng)基中生長過夜。然后，使用WizardSVplusminiprepskit(Promega)提取質粒DNA，在兩個菌株中評價pCOR質粒的相對質?？截悢?shù)和拓撲學。在使用pCOR質粒pXL3516(2.56kb)轉化的TEX1pir42中，可重復地得到拷貝數(shù)的2倍增加。為了進一步說明TEX1pir42的特征，在質粒DNA的小量純化(4至6個克隆/菌株)之后，使用瓊脂糖凝膠電泳評價例如pXL3179和pXL2774這類pCOR質粒的拷貝數(shù)和拓撲學。評價經(jīng)EcoRI限制酶線性化的質粒的拷貝數(shù)。在缺少溴化乙錠的情況下對未消化質粒進行拓撲學檢測。產(chǎn)生的瓊脂糖凝膠顯示于圖15，清楚的說明質粒pXL3179在TEX1pir42中產(chǎn)生時，比在TEX1菌株中產(chǎn)生時獲得更高的拷貝數(shù)。圖15也顯示質粒pXL3179的拓撲學，也顯示質?？截悢?shù)的增加，其中質?；旧蠟閱误w形式，少數(shù)質粒為多聚體形式。從這些pCOR質粒獲得的結果也概括于表5中。計算與TEK1中相同質粒比較的相對拷貝數(shù)。觀察到在TEX1pir42中產(chǎn)生的質粒pXL3179和2774質?？截悢?shù)增加2-3倍。表5TEX1pir42中產(chǎn)生的pCOR質粒的復制和拷貝數(shù)*拷貝數(shù)與TEX1中的相同質粒進行比較。實施例11比較實驗TEX1cop21(XAC-1endA-traD-pir116cop21)的構建1)TEX1cop21的構建TEX1cop21菌株的構建與實施例10中對TEX1pir42的說明類似。通過定向誘變、用于將cop21引入pir116基因的寡核苷酸如下有義寡核苷酸11153(SEQIDNO11)5‘-CGCAATTGTTAACGTCCAGCTTACGCTTAAGTAGCC-3’cop21反義寡核苷酸11154(SEQIDNO12)5’-GGCTACTTAAGCGTAAGCTGGACGTTAACAATTGCG-3’將cop21突變作為TCC絲氨酸密碼子引入，取代TCA絲氨酸密碼子，以消除接近突變的HindIII限制位點。用于定向誘變的模板為pXL3395(見圖13)。采用與圖13顯示的用于pir42相似的方法，使用產(chǎn)生的命名為pXL3432的質粒構建自殺M13載體。自殺載體pXL3749顯示于圖16中。通過PCR、隨后以HindIII限制酶切以及測序監(jiān)測cop21和pir116突變，篩選與pXL3749同源重組后獲得的大腸桿菌克隆。測試的六個雙重組子中有一個經(jīng)過了基因置換。產(chǎn)生的菌株命名為TEX1cop212)TEX1cop21的評價使用包括2.5kbKmRpCOR載體pXL2979(見實施例7.1)的多種pCOR質粒轉化TEX1cop21，并通過凝膠電泳檢驗增加的拷貝數(shù)。這種使用pXL2979的實驗顯示于圖17中。使用Promegaminiprepkit制備來自每個菌株的四個獨立克隆的質粒DNA，以EcoRI將質粒DNA線性化，并在瓊脂糖凝膠上電泳，然后使用溴化乙錠染色。每個樣品代表相似量的細菌，由600nm光密度測量。對大腸桿菌TEX1cop21、XAC1pir和TEX1中產(chǎn)生的pCOR質粒pXL2979得到的瓊脂糖凝膠電泳顯示于圖17中。與TEX1相比，當質粒在TEX1cop21中產(chǎn)生時，質?？截悢?shù)明確顯示沒有增加。實施例12TEX2pir42(XAC-1pir116pir42recA-)的構建首先，構建TEX1的recA-衍生物。然后將pir42突變引入到得到的命名為TEX2的菌株中以產(chǎn)生TEX2pir42。1)TEX1的recA-衍生物即大腸桿菌TEX2的構建通過PCR獲得缺失的、在其5’末端含有三個翻譯終止密碼子(每個讀碼框中一個)的recA基因。通過基因置換(Blum等人，J.Bacteriol.，1989，171，pp.538-46)將所述缺失的recA基因引入TEX1基因組中。用于同源重組的自殺載體的構建顯示于圖18中。用于擴增recA片段的PCR引物顯示于表6表6添加到recA序列的限制位點加以下劃線。為了保持發(fā)生同源重組所必需的RecA+表型，使用含有異源recA基因(例如放射土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)的recA基因)和抗生素抗性基因的質粒，為大腸桿菌TEX1提供recA功能，所述異源recA基因能夠補足大腸桿菌recA突變體，抗生素抗性基因例如為氨芐青霉素抗性基因。基因置換后，通過在非選擇性培養(yǎng)基(LB)中的培養(yǎng)稀釋，從重組菌株中消除該質粒。以抗生素抗性的丟失篩選質粒的缺失。產(chǎn)生的菌株命名為TEX2。在圖19中通過PCR監(jiān)測基因置換。在下面的表7中對PCR引物進行說明。表7第一個引物以recA基因序列為基礎。第二個以接近但處于自殺載體pXL3457中的同源區(qū)之外(緊接recA的5’或3’)的序列為基礎，以保證擴增僅僅發(fā)生在基因組片段上。根據(jù)大腸桿菌序列選擇兩個寡核苷酸的序列，該所述大腸桿菌序列包括recA基因座(GenbankECAE000354)。從recA缺失菌株獲得的PCR片段與從野生型菌株獲得的相比更短，如下面表8中所示。表8用于recA擴增的PCR引物獲得的PCR圖譜與預期相同，證實了TEX2基因組中存在截短的recA基因。核實recA-表型(對紫外線敏感)和TEX2的表型特征。如預期的，TEX2的表型特征與TEX1菌株相同，即，ara-、RifR、NalR、SpR、UidA-、Arg-、KmsAmps)。B)大腸桿菌TEX2pir42的構建根據(jù)實施例10中說明的策略，通過雙同源重組構建TEX2pir42菌株，與實施例10不同的是TEX2中的同源重組在攜帶異源recA基因的質粒存在下進行，所述異源recA基因能夠補足大腸桿菌recA突變體，以保持同源重組所需的recA+表型。通過C1a消化的PCR產(chǎn)物的限制分析監(jiān)測基因置換(見圖14)。四個研究的雙重組子克隆中的兩個發(fā)生了基因置換。C)大腸桿菌TEX2pir42的評價1)實驗室規(guī)模質粒生產(chǎn)的評價使用pCOR質粒pXL3179(2.4kb)轉化TEX2pir42。在實驗室規(guī)模，在質?？截悢?shù)增加的重復性、培養(yǎng)條件和穩(wěn)定性(代數(shù))方面，對pXL3179在TEX2pir42中的生產(chǎn)集中研究。研究一致顯示，與pXL3179在TEX1中的生產(chǎn)比較，在相同條件下質?？截悢?shù)增加2-5倍。進一步評定pXL3179在TEX2pir42中生產(chǎn)的質?？截悢?shù)，用TEX1pir42和TEX1生產(chǎn)質?？截悢?shù)作為比較實驗。在該實驗中，從以600nmOD值為基礎的相同的細菌量中提取質粒，并使用瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳后使用溴化乙錠對凝膠進行染色。顯示于圖20中的瓊脂糖凝膠電泳清楚顯示，質粒在TEX2pir42中以高拷貝產(chǎn)生，并且有利的顯示，在TEX2pir42中而非TEX1pir42中產(chǎn)生時，質粒多聚體減少。2)發(fā)酵罐評價在7升大規(guī)模發(fā)酵罐中證實了這些結果，說明如下。a)發(fā)酵培養(yǎng)基成分用于接種體培養(yǎng)物的培養(yǎng)基成分為Na2HPO46g/l，KH2PO43g/l，NaCl0.5g/l，NH4Cl1g/l，NH4H2PO43g/l，葡萄糖5g/l，MgSO4·7H2O0.24g/l，CaCl2·2H2O0.015g/l，鹽酸硫胺0.010g/l。用于補料分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分如下KH2PO48g/l，K2HPO46.3g/l，Na2HPO41.7g/l，NH4Cl2.5g/l，葡萄糖10g/l，MgSO4·7H2O2.6g/l，硫胺0.011g/l，Biospumex36防泡劑0.1ml/l，鹽混合物(見表9)2.5ml/l。表9鹽混合組成補加培養(yǎng)基成分如下50％葡萄糖，0.7％鎂，0.02％鹽酸硫胺，1％Biospumex36防泡劑。b)發(fā)酵參數(shù)以1.2％接種培養(yǎng)物接種含有3升補料分批培養(yǎng)基的7升發(fā)酵罐。接種體制備如下使用0.25ml大腸桿菌菌株TEX2pir42(pXL3179)的冰凍細胞懸液接種在兩升瓶中的250ml接種體培養(yǎng)基中。于37℃、以220rpm將瓶孵育24小時。24小時后，測量不同參數(shù)殘留葡萄糖0g/l，OD600nm為2.7，pH6.24。發(fā)酵過程中，使用NH3自動控制并調節(jié)pH在6.9至7之間。溫度保持在37℃，通過反作用于攪動速率，調整溶解氧為45％pO2。細菌菌株初始批培養(yǎng)約17小時及碳源(葡萄糖)消耗之后，添加補加培養(yǎng)基。保持葡萄糖和酸(例如乳酸和醋酸)濃度接近于0。c)結果與優(yōu)化條件下使用大腸桿菌TEX1(pXL3179)在100升發(fā)酵罐中的生產(chǎn)相比，最終結果展示于表10。就XAC-1pir116而言，就TEX1中產(chǎn)生的pXL3179質?？截悢?shù)而言，7升和800升發(fā)酵罐之間沒有差別。在優(yōu)化條件下，將使用大腸桿菌TEX2pir42在7升發(fā)酵罐中產(chǎn)生的質粒pXL3179與使用大腸桿菌TEX1在100升發(fā)酵罐中的pXL3179生產(chǎn)進行比較。證實就XAC-1pir116(見實施例5.3)而言，在7升、100升或800升發(fā)酵罐中，在TEX1中具有穩(wěn)定的質粒生產(chǎn)速率。表10含有pXL3179的TEX1及TEX2pir42菌株發(fā)酵特點與TEX1相比，在TEX2pit42中，每個細菌中質粒pXL3179拷貝為3倍以上。從以600nmOD為基礎的相同細菌量中，提取對應于不同發(fā)酵時間點的質粒，并使用瓊脂糖凝膠電泳分析。圖21清楚顯示了質粒拷貝數(shù)隨發(fā)酵時間增加。圖21也顯示在Op1328S5TEX2pir42中產(chǎn)生的pXL3179的拓撲學，幾乎全部為單體形式?？傊鶕?jù)本發(fā)明的大腸桿菌宿主菌株TEX2pit42提供了未曾預期的pCOR質?？截悢?shù)的增加，例如pXL3179，與TEX1相比，在實驗室規(guī)模和發(fā)酵罐中，TEX2pir42中的增加為2至5倍。另外，不僅在實驗室規(guī)模，也在可以與工業(yè)生產(chǎn)兼容的大規(guī)模(7升發(fā)酵罐)中，不但質粒拷貝數(shù)顯著增加，而且這樣產(chǎn)生的質粒表現(xiàn)為單體拓撲學。實施例13使用以熒光為基礎的新篩選方法鑒定的新型pir116拷貝增加型突變體為了在細菌宿主細胞中增加pCOR質?？截悢?shù)，我們誘變了編碼pir基因的拷貝增加型突變版本的pir116基因。目前，所有增加R6K衍生質粒的拷貝數(shù)的突變，例如pCOR的實施方案，均在pir基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)。使用PCR隨機誘變后，將突變的pir116基因引入含有下面說明的cobA報告基因的pCOR質粒中。以熒光為基礎的篩選之后，評價所選突變質粒的拷貝數(shù)和拓撲學。我們得到增加質?？截悢?shù)的三個不同的pir116基因突變體。這些新的突變體以前沒有得到說明。對拷貝增加型突變體的經(jīng)典篩選方法建立在抗生素抗性的基礎上。在此方法中，宿主細菌對抗生素的抗性水平是定位于細胞中質粒上的抗生素抗性基因的拷貝數(shù)的函數(shù)。隨著該質?？截悢?shù)的增加以及由此而來的抗生素拷貝數(shù)的增加，抗生素抗性水平也增加。然而，該方法不能應用于含有pir116突變的宿主細胞中的R6K衍生質粒，因為這些細胞中質粒的基線拷貝數(shù)過高(約400拷貝/細胞)。因此，以熒光為基礎、鑒定pir116拷貝增加型突變株的新的篩選方法得到發(fā)展。對此新方法，將cobA基因引入pCOR載體中，為監(jiān)測質粒拷貝數(shù)的增加提供簡單方法。cobA基因得自脫氮假單胞菌(Crouzet等，J.Bacteriol，1725968-79(1990))。它編碼uroIII甲基轉移酶，該酶在維生素B12途徑中向urogenIII分子添加兩個甲基基團。在大腸桿菌中過表達時，cobA引起在近紫外光下發(fā)熒光的紅色產(chǎn)物的蓄積。當暴露于紫外線時，過表達該基因的細菌菌落呈粉色至紅色。我們測試該基因以確定其是否可以在pCOR系統(tǒng)中用作質?？截悢?shù)的報告基因。為了評價質?？截悢?shù)與暴露在UV光下的轉化細菌的熒光水平之間的關系，構建包括缺失自身啟動子的cobA的對照質粒(pXL3767)(圖22)。將該質粒轉化到三個不同的宿主菌株中(XAC1pir、XAC1pir116和TEX1pir42)。在前面實驗的基礎上選擇這些菌株，前面實驗顯示XAC1pir中pCOR質粒的平均拷貝數(shù)為1，在TEX1中高出約五至十倍，在TEX1pir42中約高出15至30倍。如圖22所示，將重組菌落在M9基本培養(yǎng)基上劃線，并在透照儀(tranilluminator)上暴露于UV光下。我們觀察到這些菌落的熒光強度與質?？截悢?shù)正相關，XAC1pir116展示比XACpir更強的熒光，TEX1pir42展示比XAC1pir116更強的熒光。顯示于圖22中的這些結果證明這種以熒光為基礎的檢測方法輕松地區(qū)分測試質粒拷貝數(shù)，特別是菌株TEX1和TEX1pir42中的質?？截悢?shù)。更確切的說，觀察到的紅色熒光強度隨質粒pCOR-cobA拷貝數(shù)增加。證實了熒光和cobA拷貝數(shù)之間的正相關后，我們構建了引入pir116誘變基因的質粒用于篩選。構建并測試四種具有不同組成性模塊組合的質粒(如圖23所示)。當轉化到pir116和pir116pir42等基因菌株中時，這些質粒之一顯示出顯著不同的熒光水平。該質粒即pXL3830，顯示于圖24中相關部分。在篩選和評價實驗中使用對照質粒。首先，使用含有“野生型”pir116的基線水平對照質粒pXL3830設定基線熒光水平。其次，使用含有pir116-pir42雙突變的pXL3795作為陽性對照，與pXL3830相比，pXL3795將質?？截悢?shù)增加4至6倍。使用DiversifyPCRrandommutagenesiskit(BDBiosciencesClontech，PaloAlto，CA，USA)在pir116基因上進行隨機誘變。使用平均每1000堿基對引入2個突變的條件1。通過對12個突變體的測序，運行“條件1”的預實驗顯示，pir116基因中的突變率實際約為2個突變。使用寡核苷酸C8832(5-CTTAACGGCTGACATGGGAATTC-3′)(SEQIDNO23)和C8833(5′-CGATGGGCGAGCTCCACCG-3′)(SEQIDNO24)，將pir116基因作為EcoRI-SstI片段擴增。以EcoRI和SstI消化后，將含有pir116的誘變片段克隆到pXL3830中，取代“野生型”pir116基因。將攜帶誘變pir116的質粒(“pir116*”)轉化到pCOR宿主XAC1pir116的母本大腸桿菌菌株XAC-1中。在UV光下篩選熒光增加的轉化子，并與XAC1(pXL3830)和XAC1(pXL3795)對照比較。副本盤(duplicateplate)不暴露于UV以最小化次級突變。UV光下的代表性篩選板顯示于圖25中。下面的流程圖概括了篩選實驗的結果。在含有報告基因cobA的pCOR質粒中對pir(pi蛋白)進行隨機誘變↓檢測2200個克隆↓24個候選克隆↓確證了16個克隆，評價質?？截悢?shù)/拓撲學/對pir*測序(凝膠)↓選擇了三個最好的克隆用于進一步研究三個選擇的突變體的評價概括于圖26中。與pir116質粒相比，每個突變體顯示拷貝數(shù)的增加。在突變體114C和100B的情況下，質?；緸閱误w形式。與具有增加的拷貝數(shù)和多聚體高含量的pir116pir42質粒(例如突變體201C)相比，這可以是一個優(yōu)點。對每個突變體的pir116*基因進行測序。每個克隆在pir116ORF中含有單個非同類編碼(non-isocodant)突變。全部三個突變影響參與DNA結合的pi蛋白質的C末端。這些突變以前無一得到描述。一旦通過篩選在質粒系統(tǒng)中檢測到，就在生產(chǎn)系統(tǒng)中評價這些突變，即，將pir116基因*引入大腸桿菌pCOR宿主菌株基因組中。用于此評價的策略概括于圖27中。對此評價，將質粒pXL3179轉化到每個在圖26中鑒定具有突變的三個大腸桿菌菌株中，并評定質?？截悢?shù)和拓撲學。這些實驗的結果展示于圖28中。僅對201C觀察到質粒拷貝數(shù)相對于XAC1pir116顯著增加。實施例14具有M13基因III的微環(huán)作為在大腸桿菌中通過同源重組整合的工具1.自殺載體大腸桿菌中雙同源重組的基因置換需要自殺載體。在能夠復制這些載體的宿主中構建并產(chǎn)生這些載體，隨后使用它們重組到不能對其復制的宿主的染色體中。噬菌體M13是非常有用的遺傳工具，可以用于rep突變體中(Metcalf，W.，W.Jiang，等，Gene1381-7(1994))，或當使用M13mp8至11時用于大腸桿菌非抑制菌株中(Blum，P.等，JBacteriol.，171538-46(1989))。與構建有關的某些限制，如插入物大小和不穩(wěn)定性，是經(jīng)常遇到的。攜帶R6KγDNA復制起點的質粒是廣為人知的自殺載體(Miller，V.和J.Mekalanos，JBacteriol.，1702575-83(1988))，但是它們不能用于修飾表達pi蛋白質的大腸桿菌菌株，pi蛋白質允許這類質粒復制。使用新的反選擇標志制造通用自殺載體，并用此通用自殺載體構建大腸桿菌菌株，其中，pir116基因突變體(pir116*)通過同源重組插入到細菌基因組中。此處展示的策略以突變體114C作示范，但是也用于產(chǎn)生具有其它pir116*突變體的菌株。2.反選擇標志(counter-selectablemarker)可以使用不同標志選擇經(jīng)歷第二次重組事件的細菌。該事件導致所述標志的丟失，在某些情況下在染色體和自殺載體之間的重組之后導致基因置換。例如，當把表達來自芽孢桿菌(Bacillus)的SacB基因的細菌在含有蔗糖的培養(yǎng)基上涂板時，該基因是致死性的(Ried，J.L.和A.Collmer，Gene57239-46(1987))。作為另一個實例，四環(huán)素抗性基因賦予了萎蔫酸(fusaricacid)敏感性(Bochner，B.R.等，JBacteriol.143(2)926-3(1980))。噬菌體M13的感染賦予了去垢劑脫氧膽酸敏感性(Blum，P.，等，JBacteriol.171538-46(1989))。由于在某些大腸桿菌菌株中缺乏效率，雙重組子的陽性選擇方法得到發(fā)展。對來自噬菌體M13的基因III作為反選擇標志進行評價。該基因編碼負責顆粒感染性的小病毒體成分。當從多拷貝質粒pBR322過表達時，由于基因III蛋白質插入細菌膜中，基因III賦予細胞脫氧膽酸敏感性(Boeke，J.D.等，MolGenGenet186185-92(1982))。當以單拷貝出現(xiàn)于大腸桿菌基因組中時，沒有報告顯示該基因是否可以用作有效的反選擇標志。因此，我們使用微環(huán)自殺載體檢測該假設。3.使用PCR擴增來自M13的基因III的缺失版本為了減少將構建的微環(huán)載體的大小，選擇仍然能夠賦予脫氧膽酸敏感性的基因III的缺失版本(Boeke，J.D.，P.Model等，MolGenGenet186185-92(1982))。使用PCR從M13mp18擴增該基因以及其自身啟動子作為BglII-XhoI片段(Yanisch-Perron，C.，J.Vieira等，Gene33103-19(1985))(圖29)。所用寡核苷酸如下C195195’-GGCAGATCTTAAACCGATACAATTAAAGG-3’(SEQIDNO25)BglIIC195205’-CCGCTCGAGTTACGATTGGCCTTGATATTCACAAAC-3(SEQIDNO26)XhoI使用T-A克隆將擴增片段克隆到pGEMT-easy(PromegaCorporation，Madison，WI，USA)中，產(chǎn)生pXL4230(圖29)。插入物的核苷酸序列與GenBank目錄號VB0018中的說明一致。轉化入大腸桿菌菌株DH10B(Invitrogen)后，pXL4230賦予脫氧膽酸敏感性，顯示其如預期行使功能。4.以微環(huán)為基礎的自殺載體由于不含任何復制起點，因此微環(huán)質粒可以用作通用自殺載體。為此目的，必須添加選擇標志例如卡那霉素抗性基因以篩選第一次同源重組事件。為了反選擇沒有經(jīng)歷第二次重組事件的細菌，向微環(huán)載體添加基因III’。用于為重組產(chǎn)生微環(huán)的質粒的構建顯示于圖29中。引入噬菌體λ整合酶后，由例如pXL4235的質粒產(chǎn)生微環(huán)，噬菌體λ整合酶在質粒attP和attB之間重組(Darquet，A.M等，GeneTher4(12)1341-9(1997))。在大腸桿菌菌株G6264中，該重組酶在PBAD控制下以阿拉伯糖依賴方式表達，其描述于美國申請?zhí)?9/981,803。產(chǎn)生的微環(huán)含有attL，用于純化的TH(三螺旋)形成序列，選擇標志Tn903卡那霉素抗性基因，反選標志基因III’，以及用于同源重組、克隆到pXL4235多克隆位點的目的片段(圖29)。作為舉例，在圖30中說明用于產(chǎn)生表達pir116拷貝增加型突變體的大腸桿菌菌株的構建體。這些菌株可以用于產(chǎn)生pCOR質粒(Soubrier，F(xiàn).等，GeneTher61482-1488(1999))。由于pir和細菌基因組之間沒有同源性，pir116*序列插入到編碼β-D-葡糖醛酸酶的大腸桿菌染色體uidA基因中。該基因為同源重組發(fā)生提供與大腸桿菌基因組的足夠序列相似性。微環(huán)純化和重組發(fā)生的方案如下。將質粒pXL4256(圖30)轉化到大腸桿菌菌株G6264中，產(chǎn)生G6656。使用G6656的過夜培養(yǎng)物0.5ml接種50ml添加氨芐青霉素(100mg/l)的LB培養(yǎng)基，并在37℃以200rpm振蕩培養(yǎng)至600nm光密度達到0.7。向培養(yǎng)基添加250μl滅菌的10％阿拉伯糖溶液，誘導微環(huán)產(chǎn)生。在37℃、200rpm三十分鐘后，使用WizardPlusMidiprepsDNAPurificationsystem(PromegaCorporation，MadisonWI，USA)提取總質粒DNA。以6μg質粒DNA制劑上樣至0.8％瓊脂糖預制凝膠。使用超螺旋DNA梯度(PromegaCorporation，MadisonWI，USA)作為分子量標準。與50V電泳過夜后，使用SV凝膠純化試劑盒(PromegaCorporation，MadisonWI，USA)從凝膠中提取和純化微環(huán)構建體(5.1kb)。5.使用微環(huán)4256(uidA::pir116*微環(huán)自殺載體)進行雙同源重組在圖31中說明構建該菌株的重組步驟以及相應表型。對于第一次重組事件(整合)，將0.2、1和5μl純化的微環(huán)4256電穿孔至大腸桿菌菌株XAC1中(NormanlyJ等，ProcNatlAcadSciUSA836548-52(1986))，該菌株是pCOR宿主的母本菌株。于37℃過夜培養(yǎng)后，在添加卡那霉素(50mg/l)的LB瓊脂上獲得卡那霉素抗性菌落。為了評價可能含有非重組pXL4256污染物的菌落數(shù)目，在添加卡那霉素或氨芐青霉素的LB瓊脂上，使用50個KmR菌落平行劃線。50個菌落中，僅有4個抵抗卡那霉素和氨芐青霉素，并且經(jīng)質粒限制分析顯示含有非重組的pXL4256。這顯示通過電穿孔獲得的50個菌落中的46個實際上為微環(huán)4256整合子。對于第二次重組事件(切除)，在含有1.5％脫氧膽酸鈉(“Doc”；Sigma)的新鮮制備的LB瓊脂板上分離全部46個KmR整合子，并于37℃孵育過夜。對每個整合子僅獲得少數(shù)脫氧膽酸抗性(DocR)菌落(1至15個)，如圖32所示。該結果與相對稀有事件的選擇一致，例如第二次重組事件。將從15個整合子獲得的100個DocR菌落平行復印(patch)到含有1.5％Doc的LB瓊脂和添加卡那霉素的LB瓊脂上，篩選DocR和Kms雙重組子。篩選的克隆的86％為Kms，顯示其丟失了自殺載體。為了篩選等位基因置換，使用PCR擴增染色體uidA基因座。如果發(fā)生了等位基因置換，預期的PCR片段長度為1.3kb。與野生型uidA基因座對應的片段(即不含整合的pir116*突變)，其長度為0.85kb。顯示于圖33-A的結果說明，等位基因置換發(fā)生在30％的雙重組子中。這一點通過表型分析得到確認，因為這些克隆也是UidA-(β葡糖醛酸酶-)、并且在添加Xgluc的LB瓊脂上產(chǎn)生白色菌落。使用PCR檢查兩個獨立重組子中接近同源重組位點區(qū)域的細菌基因組的完整性。第一個引物(seq6113或seq6115)以pir基因為基礎，第二個(seq6112或seq6116)具有的序列以接近但是位于同源區(qū)之外(緊接uidA-的3’或5’端)的序列為基礎。使用XAC1DNA作為陰性對照，而使用XAC1pir116或TEX1(Soubrier，F(xiàn).等，GeneTher61482-1488(1999))作為陽性對照。用作PCR引物的寡核苷酸如下Seq110885’-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3’(SEQIDNO27)Seq110895’-TCTACACCACGCCGAACACC-3’(SEQIDNO28)Seq61125’-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3’(SEQIDNO29)Seq61135’-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3’(SEQIDNO30)Seq61155’-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3’(SEQIDNO31)Seq61165’-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3’(SEQIDNO32)使用引物seq6112和seq6113的PCR產(chǎn)物的預期大小為0.83kb，使用引物seq6114和seq6115時為0.88kb。結果顯示于圖33-B。以微環(huán)自殺載體獲得的兩個雙重組子顯示預期的PCR圖譜。這說明使用微環(huán)質粒作為自殺載體、M13基因III’作為反選擇標志，可以在大腸桿菌中輕松地實現(xiàn)雙同源重組。這種基因置換技術可以直接、普遍地在任何微生物遺傳背景下執(zhí)行。參考書目Alting-Mees，M.A.，J.A.Sorge，和J.M.Short.1992.MethodsEnzymol.216483-495Blum，P.，D.Holzschu，H.S.Kwan，D.Riggs，和S.Artz.1989.J.Bacteriol.171538-546.Brosius，J.1989.MethodsEnzymol.216469-483.Chambers，S.P.，S.E.Prior，D.A.Barstow，和N.P.Minton.1988.Gene68139-149.Chung，C.T.，和R.H.Miller.1988.NucleicAcidsRes.163580.Colloms，S.D.，P.Sykora，G.Szatmari，和D.J.Sherrat.1990.J.Bacteriol.1726973-6980.Datta，N.，和P.Kontomichalou.1965.Nature208239-241.Dickely，F(xiàn).，D.Nilsson，E.B.Hansen，和E.Johansen.1995.Mol.Microbiol.15839-847.Filutowicz，M.，S.Dellis，I.Levchenko，M.Urh，F(xiàn).Wu，和D.York.1994.Prog.inNucleicAcidRes.andMol.Biol.48239-273.Gibson，T.J.1984.Ph.DThesis.UniversityofCambridge.Greener，A.，M.Filutowicz，M.McEachern，和D.Helsinki.1990.Mol.Gen.Genet.22424-32.Herrero，M.，V.deLorenzo，和K.N.Timmis.1990.J.Bacteriol.1726557-6567.Hodgson，C.P.1995.Bio/Technology13222-225.Inuzuka，M.，和Y.Wada.1985.EMBOJ.42301-2307.Jaye，M.等人，(1986)Science233541-5Kleina，L.G.，J.M.Masson，J.Normanly，J.Abelson，和J.H.Miller.1990.J.Mol.Biol.213705-717.Kowalczykowski，S.C.，和A.K.Eggleston.1994.Annu.Rev.Biocbem.639991-10043.Leung，D.W.，E.Chen，G.Cachianes，和D.V.Goeddel.1985.DNA4351-355.Maniatis，T.，E.F.Fritsch，和J.Sambrook.1989.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.Meinnel，T.，E.Schmitt，Y.Mechulam，和S.Blanquet.1992.J.Bacteriol.1742323-2331.Mertens，N.，E.Remant和W.Fiers.(1995)Bio/Technology13175-179Messing，J.，和J.Vieira.1982.Gene19269-276.Metcalf，W.W.，W.Jiang，和B.L.Wanner.1994.Gene1381-7.Miller，V.L.，和J.J.Mekalanos.1988.J.Bacteriol.1702575-2583.Normanly，J.，J.M.Masson，L.G.Kleina，J.Abelson，和J.H.Miller.1986.Proc.Natl.Acad.Sci.USA836548-6552.Normanly，J.，L.G.Kleina，J.M.Masson，J.Abelson，和J.H.Miller.1990.J.Mol.Biol.213719-726.Roca，J.1995.TIBS20156-160.Saiki，R.K.，S.Scharf，F(xiàn).Faloona，K.B.Mullis，G.T.Horn，H.A.Erlich，和N.Arnheim.1985.Science2301350-1354.Sanger，F(xiàn).，S.Nicklen，和A.R.Coulson.1977.Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467.Sawadogo，M.，和M.W.VanDyke.1991.NucleicAcidsRes.19674.Scott，J.R.1984.Microbiol.Rev.481-23.Simoes，D.A.，M.DalJensen，E.Dreveton，M.O.Loret，S.Blanchin-Roland，J.L.Uribelarrea，和J.M.Masson.1991.Ann.N.Y.Acad.Sci.646254-258.Simon，R.，U.Priefer，和A.Pühler.1983.Bio/Technology1784-791.Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus，和H.K_ster.1984.NucleicAcidsRes.124539-4557.Stirling，C.J.G.Stewart，和D.J.Sherrat.1988.Mol.Gen.Genet.21480-84.Stirling，C.J.，S.D.Colloms，J.F.Collins，G.Szatmari，和D.J.Sherrat.1989.EMBOJ.81623-1627.Studier，F(xiàn).W.，A.H.Rosenberg.，J.J.Dunn和J.W.Dubendorff(1990).MethodsEnzymol18560-89.Summers，D.K.，和D.J.Sherrat.1984.Cell361097-1103.Takahashi，K.，Y.Sawasaki，J.Hata，K.Mukai和T.Goto.(1990)InVitroCellDev.Biol.26265-74.Vieira，J.，和J.Messing.1982.Gene19259-268.Wiechelman，K.，R.Braun，和J.Fitzpatrick.1988.Anal.Biochem.175231-237.Yanisch-Perron，C.Vieira和J.Messing(1985)Gene33103-11913.序列表<110>GencellS.A.；Aventispharmaceuticals，Inc.Soubrier，F(xiàn)abienne<120>具有條件性復制起點的環(huán)形DNA分子，該環(huán)形DNA分子的制備方法及其在基因治療中的用途<130>8888.0132-01<150>US10/268,948<151>2002-10-11<160>39<170>PatentInversion3.1<210>1<211>389<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1tgtcagccgttaagtgttcctgtgtcactgaaaattgctttgagaggctctaagggcttc60tcagtgcgttacatccctggcttgttgtccacaaccgttaaaccttaaaagctttaaaag120ccttatatattcttttttttcttataaaacttaaaaccttagaggctatttaagttgctg180atttatattaattttattgttcaaacatgagagcttagtacgtgaaacatgagagcttag240tacgttagccatgagagcttagtacgttagccatgagggtttagttcgttaaacatgaga300gcttagtacgttaaacatgagagcttagtacgtgaaacatgagagcttagtacgtactat360caacaggttgaactgctgatcttcagatc389<210>2<211>960<212>DNA<213>大腸桿菌<400>2tatacagaatgatgaggtttttttatgagactcaaggtcatgatggacgtgaacaaaaaa60acgaaaattcgccaccgaaacgagctaaatcacaccctggctcaacttcctttgcccgca120aagcgagtgatgtatatggcgcttgctcccattgatagcaaagaacctcttgaacgaggg180cgagttttcaaaattagggctgaagaccttgcagcgctcgccaaaatcaccccatcgctt240gcttatcgacaattaaaagagggtggtaaattacttggtgccagcaaaatttcgctaaga300ggggatgatatcattgctttagctaaagagcttaacctgccctttactgctaaaaactcc360cctgaagagttagatcttaacattattgagtggatagcttattcaaatgatgaaggatac420ttgtctttaaaattcaccagaaccatagaaccatatatctctagccttattgggaaaaaa480aataaattcacaacgcaattgttaacggcaagcttacgcttaagtagccagtattcatct540tctctttatcaacttatcaggaagcattactctaattttaagaagaaaaattattttatt600atttccgttgatgagttaaaggaagagttaacagcttatacttttgataaagatggaaat660attgagtacaaataccctgactttcctatttttaaaagggatgtgttaaataaagccatt720gctgaaattaaaaagaaaacagaaatatcgtttgttggcttcactgttcatgaaaaagaa780ggaagaaaaattagtaagctgaagttcgaatttgtcgttgatgaagatgaattttctggc840gataaagatgatgaagctttttttatgaatttatctgaagctgatgcagcttttctcaag900gtatttaatgaaaccgtacctcccaaaaaagctaaggggtgatatatggctaaaatttac960<210>3<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>3gaccagtattattatcttaatgag24<210>4<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>4gtatttaatgaaaccgtacctccc24<210>5<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5ctcttttaattgtcgataagcaag24<210>6<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>6gcgacgtcaccgaggctgtagccg24<210>7<211>36<212>DNA<213>大腸桿菌<400>7gtatatggcgcttgctctcatcgatagcaaagaacc36<210>8<211>36<212>DNA<213>大腸桿菌<400>8ggttctttgctatcgatgagagcaagcgccatatac36<210>9<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>9gagatcgctgatggtatcgg20<210>10<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>10tctacaccacgccgaacacc20<210>11<211>36<212>DNA<213>大腸桿菌<400>11cgcaattgttaacgtccagcttacgcttaagtagcc36<210>12<211>36<212>DNA<213>大腸桿菌<400>12ggctacttaagcgtaagctggacgttaacaattgcg36<210>13<211>31<212>DNA<213>大腸桿菌<400>13ccctctagatcgatagccatttttactcctg31<210>14<211>29<212>DNA<213>大腸桿菌<400>14cgggatcctgattatgccgtgtctattag29<210>15<211>36<212>DNA<213>大腸桿菌<400>15cccaagcttcttcgttagtttctgctacgccttcgc36<210>16<211>35<212>DNA<213>大腸桿菌<400>16ggtctagaacgtgaaagtggtgaagaacaaaatcg35<210>17<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>17gcgacccttgtgtatcaaac20<210>18<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>18ggtattacccggcatgacag20<210>19<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>19gtggtggaaatggcgatagg20<210>20<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>20gcgattttgttcttcaccac20<210>21<211>918<212>DNA<213>大腸桿菌<400>21atgagactcaaggtcatgatggacgtgaacaaaaaaacgaaaattcgccaccgaaacgag60ctaaatcacaccctggctcaacttcctttgcccgcaaagcgagtgatgtatatggcgctt120gctctcatcgatagcaaagaacctcttgaacgagggcgagttttcaaaattagggctgaa180gaccttgcagcgctcgccaaaatcaccccatcgcttgcttatcgacaattaaaagagggt240ggtaaattacttggtgccagcaaaatttcgctaagaggggatgatatcattgctttagct300aaagagcttaacctgctctttactgctaaaaactcccctgaagagttagatcttaacatt360attgagtggatagcttattcaaatgatgaaggatacttgtctttaaaattcaccagaacc420atagaaccatatatctctagccttattgggaaaaaaaataaattcacaacgcaattgtta480acggcaagcttacgcttaagtagccagtattcatcttctctttatcaacttatcaggaag540cattactctaattttaagaagaaaaattattttattatttccgttgatgagttaaaggaa600gagttaatagcttatacttttgataaagatggaaatattgagtacaaataccctgacttt660cctatttttaaaagggatgtgttaaataaagccattgctgaaattaaaaagaaaacagaa720atatcgtttgttggcttcactgttcatgaaaaagaaggaagaaaaattagtaagctgaag780ttcgaatttgtcgttgatgaagatgaattttctggcgataaagatgatgaagcttttttt840atgaatttatctgaagctgatgcagcttttctcaaggtatttgatgaaaccgtacctccc900aaaaaagctaaggggtga918<210>22<211>305<212>PRT<213>大腸桿菌<400>22MetArgLeuLysValMetMetAspValAsnLysLysThrLysIleArg151015HisArgAsnGluLeuAsnHisThrLeuAlaGlnLeuProLeuProAla202530LysArgValMetTyrMetAlaLeuAlaLeuIleAspSerLysGluPro354045LeuGluArgGlyArgValPheLysIleArgAlaGluAspLeuAlaAla505560LeuAlaLysIleThrProSerLeuAlaTyrArgGlnLeuLysGluGly65707580GlyLysLeuLeuGlyAlaSerLysIleSerLeuArgGlyAspAspIle859095IleAlaLeuAlaLysGluLeuAsnLeuLeuPheThrAlaLysAsnSer100105110ProGluGluLeuAspLeuAsnIleIleGluTrpIleAlaTyrSerAsn115120125AspGluGlyTyrLeuSerLeuLysPheThrArgThrIleGluProTyr130135140IleSerSerLeuIleGlyLysLysAsnLysPheThrThrGlnLeuLeu145150155160ThrAlaSerLeuArgLeuSerSerGlnTyrSerSerSerLeuTyrGln165170175LeuIleArgLysHisTyrSerAsnPheLysLysLysAsnTyrPheIle180185190IleSerValAspGluLeuLysGluGluLeuIleAlaTyrThrPheAsp195200205LysAspGlyAsnIleGluTyrLysTyrProAspPheProIlePheLys210215220ArgAspValLeuAsnLysAlaIleAlaGluIleLysLysLysThrGlu225230235240IleSerPheValGlyPheThrValHisGluLysGluGlyArgLysIle245250255SerLysLeuLysPheGluPheValValAspGluAspGluPheSerGly260265270AspLysAspAspGluAlaPhePheMetAsnLeuSerGluAlaAspAla275280285AlaPheLeuLysValPheAspGluThrValProProLysLysAlaLys290295300Gly305<210>23<211>23<212>DNA<213>大腸桿菌<400>23cttaacggctgacatgggaattc23<210>24<211>19<212>DNA<213>大腸桿菌<400>24cgatgggcgagctccaccg19<210>25<211>29<212>DNA<213>噬菌體M13mp18<400>25ggcagatcttaaaccgatacaattaaagg29<210>26<211>36<212>DNA<213>噬菌體M13mp18<400>26ccgctcgagttacgattggccttgatattcacaaac36<210>27<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>27gagatcgctgatggtatcgg20<210>28<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌<400>28tctacaccacgccgaacacc20<210>29<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>29gaccagtattattatcttaatgag24<210>30<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>30gtatttaatgaaaccgtacctccc24<210>31<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>31ctcttttaattgtcgataagcaag24<210>32<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<400>32gcgacgtcaccgaggctgtagccg24<210>33<211>12<212>DNA<213>大腸桿菌<400>33agaaaaaaagga12<210>34<211>12<212>DNA<213>大腸桿菌<400>34tctttttttcct12<210>35<211>14<212>DNA<213>大腸桿菌<400>35aagaaaaaaaagaa14<210>36<211>14<212>DNA<213>大腸桿菌<400>36ttcttttttttctt14<210>37<211>12<212>DNA<213>大腸桿菌<400>37tctttttttcct12<210>38<211>14<212>DNA<213>大腸桿菌<400>38ttcttttttttctt14<210>39<211>17<212>DNA<213>大腸桿菌<400>39aaaaaagggaataaggg1權利要求1.原核重組宿主細胞，該細胞包括編碼pi蛋白質的異源pir基因以及包含治療性基因和條件性復制起點的染色體外DNA分子，該條件性復制起點在該原核重組宿主細胞中的功能需要pi蛋白質。2.權利要求1中的原核重組宿主細胞，其中異源pir基因包括至少一個突變。3.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中所述一個或多個突變出現(xiàn)在pir基因的編碼拷貝控制區(qū)和/或DNA結合區(qū)，和/或亮氨酸拉鏈樣基序或蛋白質∏的其他區(qū)域的同一或不同區(qū)域內(nèi)。4.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中異源pir基因包括拷貝數(shù)控制區(qū)和亮氨酸拉鏈樣基序中的突變。5.權利要求4中的原核重組宿主細胞，進一步包括在pir基因DNA結合區(qū)內(nèi)的突變。6.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中異源pir基因包括拷貝數(shù)控制區(qū)和DNA結合區(qū)內(nèi)的突變。7.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中異源pir基因包括DNA結合區(qū)和亮氨酸拉鏈樣基序內(nèi)的突變。8.權利要求1中的原核重組宿主細胞，其中異源pir基因在質粒中。9.權利要求1中的原核重組宿主細胞，其中異源pir基因在宿主細胞基因組中。10.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中所述宿主細胞缺乏基因endA。11.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中所述宿主細胞缺乏基因traD。12.權利要求2中的原核重組宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包括突變的recA基因。13.生產(chǎn)質粒的方法，所述質粒包含異源治療性基因和條件性復制起點，其中條件性復制起點在原核宿主細胞中的功能需要相對于該宿主細胞外源的復制起始蛋白質，所述方法包括a)在產(chǎn)生該質粒的條件下培養(yǎng)權利要求2的原核重組宿主細胞；以及b)分離該質粒。14.權利要求13中的方法，其中所述質粒進一步包括不賦予抗生素抗性的選擇基因。15.權利要求14中的方法，其中所述選擇基因編碼特定密碼子的抑制性轉運RNA。16.權利要求15中的方法，其中所述選擇基因為琥珀轉運RNA的抑制因子，并且所述宿主細胞進一步包括含有琥珀突變的基因。17.檢測質?？截愒黾有屯蛔兊姆椒?，包括a)將至少一種突變引入靶序列；b)將所述突變的靶序列轉化到包括質粒的宿主細胞中，其中所述質粒包括編碼uroIII甲基轉移酶的核苷酸序列，并且該質粒的拷貝數(shù)受所述靶序列的影響；c)在表達該核苷酸序列的條件下培養(yǎng)該宿主細胞以產(chǎn)生宿主細胞培養(yǎng)物；d)將所述宿主細胞培養(yǎng)物暴露于UV光；以及e)檢測所述宿主細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的熒光。18.權利要求17中的方法，其中所述核苷酸序列是來自脫氮假單孢菌的cobA基因。19.權利要求17中的方法，進一步包括將(e)中檢測的熒光同由包括未突變靶序列的宿主細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的熒光進行比較。20.包括含有至少一個突變的異源pir基因的質粒。21.權利要求20中的質粒，其中所述一個或多個突變出現(xiàn)在pir基因的編碼拷貝控制區(qū)和/或DNA結合區(qū)，和/或亮氨酸拉鏈樣基序或蛋白質∏的其他區(qū)域的同一或不同區(qū)域內(nèi)。22.權利要求20中的質粒，其中異源pir基因包括拷貝數(shù)控制區(qū)和亮氨酸拉鏈樣基序中的DNA突變。23.權利要求22中的質粒，進一步包括在pir基因DNA結合區(qū)內(nèi)的突變。24.權利要求20中的質粒，其中異源pir基因包括拷貝數(shù)控制區(qū)和DNA結合區(qū)內(nèi)的突變。25.權利要求20中的質粒，其中異源pir基因包括DNA結合區(qū)和亮氨酸拉鏈樣基序內(nèi)的突變。26.權利要求24中的質粒，其中在DNA結合區(qū)內(nèi)的突變?yōu)?14C突變。27.權利要求24中的質粒，其中在DNA結合區(qū)內(nèi)的突變?yōu)?00B突變。28.權利要求24中的質粒，其中在DNA結合區(qū)內(nèi)的突變?yōu)?01C突變。全文摘要提供了具有條件性復制起點的環(huán)形DNA分子及其制備方法。描述了原核重組宿主細胞，該細胞包含激活條件性復制起點的異源復制起始蛋白質以及包含異源治療性基因和條件性復制起點的染色體外DNA分子，該條件性復制起點在原核重組宿主細胞中的功能需要宿主細胞外源的復制起始蛋白質。該宿主細胞可以包括具有至少一個突變的pir基因，該突變可以發(fā)生在pir基因拷貝數(shù)控制區(qū)、pir基因亮氨酸拉鏈樣基序或pir基因DNA結合區(qū)。文檔編號C07K14/50GK101182534SQ20071016209公開日2008年5月21日申請日期2003年10月14日優(yōu)先權日2002年10月11日發(fā)明者F·蘇布里耶申請人:森泰萊昂公司