專利名稱：：對I類MHC親和力提高的修飾的白細(xì)胞Ig樣受體家族(LIR’S)及其在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性中的用途的制作方法對I類MHC親和力提髙的修飾的白細(xì)胞Ig樣受體家族(LIR'S)及其在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性中的用途本發(fā)明涉及對某給定的I類pMHC具有結(jié)合特性的多肽，其特征在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1nM和域?qū)λ鼋o定的I類pMHC分子的解離速率(off-rate，lw)為2S"或更慢，所述多肽與SEQIDNO:7有至少45%相同性和/或55%相似性并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO:3。也提供了所述多肽的多價(jià)復(fù)合物，呈遞所述多肽的細(xì)胞，與治療劑結(jié)合的所述多肽和使用這些多肽的方法。發(fā)明背景免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物(ILT)也稱為白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(LIR)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(MIR)和CD85。該免疫受體家族構(gòu)成了免疫球蛋白超家族的一部分。1997年3月，一項(xiàng)研究(Samaridis等，(1997)￡wrJ/zm^"o/27660-665)首次公開了鑒定到ILT分子，該研究詳述了LIR-l(ILT-2)的序列并注意到這些分子與牛FCY2R、人殺傷細(xì)胞抑制受體(KIR)、人FcaR和小鼠gp49相似。該項(xiàng)研究也注意到與KIR不同，LIR-1主要表達(dá)在單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞上。具有ILT分子的pMHC結(jié)合特征的可溶性多肽及其多價(jià)復(fù)合物為阻斷pMHC分子上的CD8結(jié)合位點(diǎn)提供了方法，例如對于抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的目的。然而，對于該目的，如果與天然ILT分子相比，這些多肽對靶pMHC分子的親和力較高和/或解離速率較慢是理想的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及對某給定的I類pMHC具有結(jié)合特性的多肽，其特征在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1pM和域?qū)λ鼋o定的I類pMHC分子的解離速率(k。ff)為2S'1或更慢，所述多肽與SEQIDNO:7有至少45%相同性和/或55%相似性，并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO:3。也提供了所述多肽的多價(jià)復(fù)合物，呈遞所述多肽的細(xì)胞，與治療劑結(jié)合的所述多肽和使用這些多肽的方法。發(fā)明詳述如上所述，ILT分子也稱為LIR、MIR和CD85。本文所用的術(shù)語ILT應(yīng)理解為包括該免疫受體家族內(nèi)的任何多肽。/丄r免疫受體的ILT家族表達(dá)在淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞表面。ILT分子在它們的胞外區(qū)域具有63-84%的同源性，除了可溶性LIR-4之外的所有ILT分子均是I型跨膜蛋白。目前鑒定的所有ILT分子在它們的胞外區(qū)中具有兩個或四個免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域。(WilIcox等，(2003)4(9)913-919)。各ILT分子也可表達(dá)為許多不同的變體/同種型。(Colonna等，(1997)JMM186(11)1809陽1818)和(Cosman等，C1997)/mmwm."7273-282)。有許多科學(xué)論文詳細(xì)描述了ILT分子的結(jié)構(gòu)和功能，包括以下文獻(xiàn)(Samaridis等，(1997)￡wrJ/m/"z^o/27660-665)，(Cella等，(1997)J五x;Med185(10)1743-1751)，(Cosman等，(1997)/扁薩'(y7273-282)，(Borges等，(1997)///"/"w/7o/1595192-5196)，(CoIonna等，(1997)Met/186(11)1809陽188)，(Colonna等，(1998)J./mww"o/1603096-3100)，(Cosman等，(1999)/,簡廳/og/ca/細(xì)s168177-185)，(Chapman等，(1999)/"畫m.(y11603-613)，(Chapman等，(2000)/甜鼎"/(y12727-736)，(Wilcox等，(2002)5MC^n^/wra/S油幻,'26)，(Shiroshi等，(2003)/WyiS100(5)8856-8861)和(WilIcox等，(2003)4(9)913-919)。WO9848017披露了編碼ILT家族諸成員和它們推測的氨基酸序列的遺傳序列。此申請將LIR分子分為三組。第一組包括具有跨膜區(qū)和短胞質(zhì)尾的多肽，該跨膜區(qū)含有帶正電的殘基。第二組包括具有非極性跨膜區(qū)和長胞質(zhì)尾的多肽。最后，第三組包括的多肽表達(dá)為不具有跨膜區(qū)或胞質(zhì)尾的可溶性多肽。也披露了制備LIR家族的多肽，LIR家族諸成員的拮抗性抗體的方法。此申請討論了可能利用LIR家族成員治療自身免疫疾病和免疫功能受抑制相關(guān)的疾病狀態(tài)。就此而言，提到了可溶形式的LIR家族成員對于某些應(yīng)用有利。這些優(yōu)點(diǎn)包括易于純化來自重組宿主細(xì)胞的可溶形式ILT/LIR，它們適用于靜脈內(nèi)給予，它們有可能用于阻斷細(xì)胞表面LIR家族成員與其配體相互作用而介導(dǎo)所需的免疫功能。也提到了保留所需生物學(xué)活性，例如結(jié)合配體(包括I類MHC分子)的可溶性LIR片段的可能應(yīng)用。另一項(xiàng)研究(Shiroishi等(20(B)100(15)8856-8861)討論了可溶(截短)形式的ILT-2和ILT-4分子。提到了它們在Biacore研究中與可溶性CD8競爭與MHC分子結(jié)合的能力，估計(jì)這可能是ILT-2調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞激活的機(jī)制之一。對于pMHC結(jié)合，此項(xiàng)研究指出"ILT比CD8結(jié)合的親和力高提示ILT可有效阻斷CD8在細(xì)胞表面的結(jié)合"。此項(xiàng)研究指出ILT2與I類MHC的a3結(jié)構(gòu)域結(jié)合并報(bào)道了含有結(jié)構(gòu)域1和2的ILT2片段的晶體結(jié)構(gòu)。集中在ILT-4上的(Colonna等，(1998)J./mmwm/.1603096-3IOO)總結(jié)了ILT2-5的組織分布和特異性。在這些ILT分子中，注意到ILT-2和ILT-4與I類MHC分子結(jié)合。此項(xiàng)研究分析了可溶性ILT-4與各種I類MHC所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。此項(xiàng)研究的結(jié)論是ILT-4能與HLA-A、B和G結(jié)合，但不與HLA-Cw3或HLA-Cw5結(jié)合。WO03041650披露了使用LIR-2禾Q/或LIR-3/LIR-7活性調(diào)節(jié)劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的方法。所披露的調(diào)節(jié)劑包括LIR活性的激動劑和拮抗劑。WO2006033811披露了ILT-3多肽及其融合體作為抑制移植物排斥的治療劑的應(yīng)用。已確定了針對不同pMHC靶標(biāo)的野生型ILT分子的各種可溶性類似物。例如，(Chapman等，(1999)/"而wm矽11603-613)采用基于Biacore的方法來確定與各種HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-G分子結(jié)合的LIR-1(ILT-2)。測定的這些相互作用的Ko值范圍是1X10"M(對于HLA-Gl)-2Xl(T5M(對于HLA-Cw*0702)。此項(xiàng)研究也提到ILT-2對UL18(—種I類MHC的病毒類似物)有親和力，二者之間相互作用的KD以nM計(jì)。另一項(xiàng)研究(Chapman等，(2000)/mmwm'(y12727-736)報(bào)道了含有Dl和D2結(jié)構(gòu)域的截短的LIR-l(ILT-2)多肽的晶體結(jié)構(gòu)。已知LIR-1與UL18病毒I類MHC類似物結(jié)合的親和力高于相似的LIR-2。作者使用截短的LIR-1多肽的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定LIR-1和LIR-2之間存在于溶劑接觸殘基中的差異。采用定點(diǎn)誘變該兩種多肽來證實(shí)哪幾個殘基參與UL18結(jié)合。將LIR-1的野生型殘基換入LIR-2中相應(yīng)的氨基酸位置進(jìn)行定點(diǎn)誘變。此項(xiàng)研究的結(jié)論是LIR-1的殘基38Y、以及76Y、80D或83R中的至少一種參與UL18結(jié)合。作者指出"由于LIR-1對I類MHC蛋白的親和力遠(yuǎn)低于對UL18的，我們未能獲得LIR-1和LIR-2突變體與I類MHC結(jié)合的精確親和力"。圖la(SEQIDNO:l)禾Qlb(SEQIDNO:2)分別顯示了野生型人ILT-2的全部氨基酸和DNA序列。所提供的DNA序列對應(yīng)于NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中給定的登錄號NM—006669。蘇,力/丄r-存微本發(fā)明提供對某給定的I類pMHC具有結(jié)合特性的多肽，其特征在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC分子的解離速率(k。ff)為2S'1或更慢，所述多肽與SEQIDNO:7有至少45%相同性和/或55%相似性，并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO:3。符合以上同源性和I類pMHC-結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的多肽可視作高親和力ILT-樣分子，同樣是本文所述及的。如上所述，天然存在的ILT多肽在其胞外區(qū)中具有兩個或四個免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的高親和力ILT-樣多肽可表達(dá)為具有4個、3個或2個所述結(jié)構(gòu)域的形式。目前優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式具有對應(yīng)于人ILT-2的兩個N-末端結(jié)構(gòu)域的兩個免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，其含有一個或多個突變從而賦予對I類pMHC的高親和力。這些N-末端結(jié)構(gòu)域是利用Cosman等((1999)/mmw"o/168:177-185)的標(biāo)志的結(jié)構(gòu)域一和二。具有所述兩個N-末端結(jié)構(gòu)域的ILT-樣多肽通常具有對應(yīng)于SEQIDNO:3所示氨基酸1-195的序列。優(yōu)選該多肽的特征在于所述多肽與SEQIDNO:7具有至少60%相同性和/或75%相似性。優(yōu)選該多肽的特征在于所述多肽與SEQIDNO:7具有至少75%相同性和/或85%相似性。優(yōu)選該多肽的特征在于所述多肽與SEQIDNO:7具有至少90%相同性和/或95%相似性。本文所用的序列相同性表示所比較的兩條序列中相應(yīng)位置的氨基酸相同。本文中相似性包括相同及相似(功能上等價(jià))的氨基酸。例如，用不同的疏水性氨基酸一次取代多肽中給定位置的一個疏水性氨基酸所形成的多肽可視作與原始多肽相似但不相同。采用FASTA算法測定本文用于表征本發(fā)明多肽的參數(shù)"相似性"和"相同性"，所述算法用獲自WilliamR.Pearson(DepartmentofBiologicalChemistry(生物化學(xué)系)，Box440，JordanHall，Charlottesville,弗吉尼亞州)的FASTA程序組執(zhí)行。采用FASTA程序組測定那些參數(shù)所用的設(shè)置如本文實(shí)施例6所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白該項(xiàng)分析可使用許多來源的FASTA蛋白蛋白比較。(Pearson等，(1988)PA^S852444-2448)提供了FASTA算法的其它細(xì)節(jié)?？赏ㄟ^任何常規(guī)試驗(yàn)測定SEQIDNO:3所示多肽和本發(fā)明任何給定的推定多肽的相對抑制活性，這些試驗(yàn)的讀出值(read-out)與CD8對給定pMHC的結(jié)合親和力有關(guān)。讀出值通常是IC5。值。評估濃度相當(dāng)?shù)臏y試多肽和SEQIDNO:3的多肽，通過參考以各結(jié)果繪制的抑制曲線測定它們各自的IC5()。實(shí)施例5描述了合適的試驗(yàn)。多肽的特征優(yōu)選在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的Kd小于或等于100nM和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC的解離速率(k。ff)為0.1S—1。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知可采用許多方法測定所述親和力和/或解離速率。例如，可通過表面等離振子共振測定所述親和力(KD)和/或解離速率(k。ff)。本文的實(shí)施例4提供了適合于進(jìn)行這種測定的基于Biacore的試驗(yàn)。比較而言，通過實(shí)施例4所述基于Biacore的方法檢測到野生型ILT-2分子的可溶性截短變體(該可溶性多肽的氨基酸序列參見圖2a(SEQIDNO:3))和加載有癌胚抗原(CEA)-衍生YLSGANLNL(SEQIDNO:13)肽的HLA-A*0201之間相互作用的Ko為6^M,解離速率(k。ff)為2.4S"。該可溶性ILT-2分子是野生型人ILT-2同種型1的變體的截短形式，其只含有胞外結(jié)構(gòu)域D1和D2。圖la中加亮顯示了該ILT-2變體分子與ILT-2同種型1的那些變體分子之間不同的氨基酸殘基。圖2b(SEQIDNO:4)詳述了編碼該多肽的天然DNA序列。為提高重組表達(dá)的效率并促進(jìn)該多肽的克隆，將許多突變引入編碼該多肽的DNA中。這些突變未改變所表達(dá)多肽的氨基酸序列。圖3(SEQIDNO.5)顯示了用于重組表達(dá)的DNA序列。本發(fā)明的一個實(shí)施方式提供的多肽是突變的人ILT分子。例如，編碼人ILT-2或其可溶性片段的DNA可用作模板，在該模板中可引入各種突變從而導(dǎo)致本發(fā)明高親和力ILT-樣多肽與靶pMHC復(fù)合物之間相互作用的親和力高和/或解離速率慢。因此，本發(fā)明包括與天然序列相比發(fā)生突變的ILT-2變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白這種人ILT-2氨基酸序列中的一個或多個突變可以是一個或多個取代、缺失或插入?？刹捎煤线m的方法進(jìn)行這些突變，所述方法包括但不限于基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、基于限制性內(nèi)切酶的克隆或不依賴于連接的克隆(LIC)方法的那些方法。許多標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)教材詳述了這些方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)誘變和基于限制性內(nèi)切酶的克隆的其它細(xì)節(jié)可參見(Sambrook禾口Russell，(2001)MolecularCloning-ALaboratoryManual(《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊》)，(第三版)CSHLPress)。LIC方法的其它信息見(Rashtchian，(1995)C辨腸fec/mo/6(1):30-6)。本發(fā)明其它實(shí)施方式包括其中對應(yīng)于SEQIDNO:3的10W、19Q、20G、21S、42K、47W、50R、661、77Y、78Y、79G、80S、81D、82T、83A、84G、85R、87E、99A,101I、102K、141E、146L、147N、1591、168S、172W、174R禾卩188L的一個或多個氨基酸發(fā)生突變的多肽。例如，本發(fā)明多肽可含有以下一個或多個突變10W—L、19Q—M、19Q—L、19Q—V、20G—D、20G—M、20G—Q、20G—F、20G—S、20G—E、20G~>R、21S—Q、21S—R、21S—A、21S—S、42K—R、47W—Q、50R—L、66L—V、77Y—V、77Y—M、77Y—I、77Y—Q、78Y—Q、78Y—I、78Y—G、79G—Q、79G—Y、79G—W、79G—R、79G—V、80S—R、SOS—T、80S—G、81D—G、81D—Q、81D—L、81D—V、82T—G、82T—E、83A—S、83A—G、83A—R、84G—L、84G—Q、84G—A、85R—W、87E—A、99A—I、99A—Y、1011—L、101I—K、1011—Q、10"V、102K—Q、102K—A、102K—R、141E—G、141E—D、146L—D、147N—S、1591—E、168S—G、172W—R、174R—W或188L—D。例如，含有至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個上述突變的多肽通常合適。所用的編號方法與圖2a(SEQIDNO:3)所示相同。采用SEQIDNO:3的編號方法，一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有對應(yīng)于氨基酸19Q—M和21S—Q的突變。采用SEQIDNO:3的編號方法，一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—D、21S—Q、99A—V和168S—G的突變。采用SEQIDNO:3的編號方法，另一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有對應(yīng)于19Q—L、20G—M和21S—Q的突變。采用SEQIDNO:3的編號方法，另一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—Q、21S一R、42K—R和146L—S的突變。采用SEQIDNO:3的編號方法，另一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—D、21S—Q、83A—S、84G—Q、85R—W、87E—A禾口99A—V的突變。采用SEQIDNO:3的編號方法，另一個實(shí)施方式提供的多肽中對應(yīng)于135C或145C中一個或二者的氨基酸突變?yōu)镾。另一實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽所含的氨基酸至少對應(yīng)于SEQIDNO:3的氨基酸1-195。這種多肽是二結(jié)構(gòu)域的實(shí)施方式，其所含的結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于人ILT-2的兩個N-末端免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式提供的多肽由SEQIDNO:6-9或21-61中任一條構(gòu)成或包含其中任一條。當(dāng)然，雖然這些優(yōu)選的多肽可表達(dá)為由SEQIDNO:6-9、16或21-61構(gòu)成或包含它們，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道有少量不影響該實(shí)施方式(多肽)的總體身份和特性的氨基酸取代、缺失和插入是不可避免的。這種少量突變可視作這種多肽的表型沉默突變。從另一方面看，這種突變得到的多肽具有與親代相同的功能并能以相同方式起作用。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式提供的多肽由SEQIDNo:16構(gòu)成或包含SEQIDNo:16。溶if絲譜運(yùn)游/^i^7力幾r-摔多嚴(yán)本發(fā)明多肽可用作可溶性治療劑。在這種情況中，增強(qiáng)這些多肽的溶解性是理想的。本發(fā)明包括含有一個或多個突變的多肽，與缺乏這些突變的相應(yīng)多肽相比，這些突變增強(qiáng)了多肽的溶解性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，要增強(qiáng)多肽的溶解性一般宜使與溶劑接觸的氨基酸突變。參考ILT-2的晶體結(jié)構(gòu)可鑒定這些與溶劑接觸的氨基酸。(參見Chapman等，(2000)/附ww"/(y12727-736)。本發(fā)明包括一個或多個與溶劑接觸的氨基酸發(fā)生突變的多肽。例如，含有至少一個突變的本發(fā)明多肽中用帶電荷的氨基酸取代了與溶劑接觸的疏水性氨基酸。這種溶解性增強(qiáng)的突變優(yōu)選位于本發(fā)明多肽C-末端的6個氨基酸內(nèi)。另一實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽中對應(yīng)于SEQIDNO:3的196L和/或198L的氨基酸分別突變?yōu)?96D和198D。采用SEQIDNO:3的編號方法，另一實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—D、21S—Q、83A—S、84G—Q、85R—W、87E~>A、99A—V、196L—D和198L—D的突變。另一實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽由SEQIDNo:63-80中任一條構(gòu)成或包含其中任一條。另一實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽由SEQIDNo:17或62構(gòu)成或包含SEQIDNo:17或62。"絲簽〃游蘇//7力/丄卩/移嚴(yán)本發(fā)明多肽可以多聚形式使用或與其它部分結(jié)合使用。就這點(diǎn)而言，所制備的本發(fā)明多肽含有在其上連接其它部分的"裝置(meaiis)"是理想的。因此，一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多肽含有"標(biāo)簽"以促進(jìn)連接其它部分。該標(biāo)簽可以在這些多肽的C-末端上。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道有許多標(biāo)簽適用于該目的。這些標(biāo)簽包括但不限于半胱氨酸殘基、六組氨酸肽、生物素和化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)。存在這些標(biāo)簽也可促進(jìn)該多肽的純化。在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明多肽與至少一條聚亞垸基二醇鏈連接?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法實(shí)現(xiàn)這種連接。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，一條或多條聚亞烷基鏈與這些多肽連接。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明該方面的聚乙二醇鏈含有至少兩個聚乙烯重復(fù)單位。多份庸/旁浙力/ZT-摔,-^激本發(fā)明一方面提供含有至少兩個本發(fā)明多肽的多價(jià)復(fù)合物，所述多價(jià)復(fù)合物對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1pM和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC的解離速率(k。ff)為2S"或更慢。在該方面的一個實(shí)施方式中，至少兩個本發(fā)明多肽經(jīng)接頭部分相連形成多價(jià)復(fù)合物。一方面提供的本發(fā)明多肽通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列相連。這些多價(jià)復(fù)合物優(yōu)選為水溶性的，所以應(yīng)相應(yīng)選擇接頭部分。此外，接頭部分優(yōu)選能與這些多肽上確定的位置相連，從而盡可能減少所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)多樣性。該方面的一個實(shí)施方式提供的本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物中聚合物鏈或肽接頭序列在各多肽中不位于該多肽的I類pMHC結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基之間延伸。由于本發(fā)明復(fù)合物可用作藥物，接頭部分應(yīng)該適當(dāng)考慮它們的藥學(xué)適用性，例如它們的免疫原性來選擇。本領(lǐng)域己知滿足以上所需標(biāo)準(zhǔn)的接頭部分的例子，例如連接抗體片段的技術(shù)。兩類接頭優(yōu)選用于產(chǎn)生本發(fā)明的多價(jià)復(fù)合物。其中的多肽通過聚亞烷基二醇鏈或衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭相連的本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物提供了本發(fā)明的某些實(shí)施方式。合適的親水性聚合物包括但不限于聚亞烷基二醇。此類中最常用的聚合物以聚乙二醇或PEG為基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)如下式所示。HOCH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而，其它聚合物可以基于其它合適的、任選取代的聚亞烷基二醇，包括聚丙二醇，以及乙二醇與丙二醇的共聚物。這種聚合物可用于處理或偶聯(lián)治療劑，特別是多肽或蛋白質(zhì)治療劑來實(shí)現(xiàn)有益地改變該治療劑的藥代動力學(xué)(PK)分布，例如降低腎廓清率、延長血漿半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。據(jù)信，一個或多個PEG分子在治療劑周圍形成的"外殼"能在立體上阻礙治療劑與免疫系統(tǒng)反應(yīng)并降低其蛋白水解降解，從而改善PEG-治療劑偶聯(lián)物的PK分布。(Casey等，(2000)，TumorTargetting，4235-244)。所用親水性聚合物的分子大小可根據(jù)高親和力ILT-樣多肽預(yù)定的治療應(yīng)用來具體選擇。已有許多綜述文章和書籍詳細(xì)描述了PEG和類似分子在藥物制劑中的應(yīng)用。例如，參見Harris,(1992)，Po(y"/^/e朋G(yco/C7zem^^y-S/。&c/zw'ctf/cmt/5z'o/"e力c"/4pp〃ca/7o似(《聚乙二酉享{七學(xué)-生凈勿技術(shù)和生華勿醫(yī)藥應(yīng)用》)，Plenum,紐約，紐約州或Harris和Zalipsky，(1997)，C/zem/^o;a"c/5/o/og&fl/^/^//ca/V.om"0/尸o(ye/7yVeweG7_yco/ACSBooks(《聚乙二酉享ifc學(xué)禾口生物學(xué)應(yīng)用ACS手冊》)，華盛頓，哥倫比亞特區(qū)。所用的聚合物可具有線形或分支構(gòu)型?？赏ㄟ^加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和賴氨酸來誘生分支PEG分子或其衍生物。該聚合物一般在其結(jié)構(gòu)中，例如在其一端或兩端，和/或骨架的支鏈處具有一個或多個化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)從而使該聚合物能與高親和力ILT-樣多肽中的靶位點(diǎn)相連。如下所示，所述一種或多種化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)可與親水性聚合物直接相連，或者在親水性聚合物和反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))之間可以具有間隔基團(tuán)/部分反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))-親水性聚合物-反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))-間隔物-親水性聚合物-間隔物-反應(yīng)活性化學(xué)(基團(tuán))用于形成以上概述的該類型構(gòu)建物的間隔物可以是無反應(yīng)活性、化學(xué)穩(wěn)定的、鏈狀的任何有機(jī)部分。這種間隔物包括但不限于以下基團(tuán)-(CH2)n-，其中n二2至U5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二價(jià)亞垸基間隔基團(tuán)位于聚亞烷基二醇鏈和其與該復(fù)合物的多肽分子連接點(diǎn)之間的本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物是本方面的另一種實(shí)施方式。其中聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復(fù)單位的本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物是本方面的另一實(shí)施方式。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔物與反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)相連的親水性聚合物有許多商業(yè)供應(yīng)商。這些供應(yīng)商包括NektarTherapeutics(加利福尼亞州，美國)、NOFCorporation(日本)、Sunbio(韓國)和EnzonPharmaceuticals(新澤西州，美國)。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔物與反應(yīng)活性化學(xué)物質(zhì)相連的可購得的親水性聚合物包括但不限于以下聚合物<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>可利用各種偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))將聚合物分子偶聯(lián)于蛋白質(zhì)和肽治療劑。選擇最合適的偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))在很大程度上取決于所需的偶聯(lián)部位。例如，以下偶聯(lián)化學(xué)(物質(zhì))己用于連接PEG分子(來源NektarMolecularEngineeringCatalogue2003Nektar(分子工程目錄2003))的一個或多個末端N-馬來酰亞胺乙烯基砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亞胺丙酸酯(Succinimidylproprionate)琥珀酰亞胺丁酸酯(Succinimidylbutanoate)硫代酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG基聚合物也可為本發(fā)明多肽的多聚化提供合適的接頭。例如，可以利用含有通過脂肪鏈相連的馬來酰亞胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，產(chǎn)品號22330和22323)。肽接頭是另一類多價(jià)復(fù)合物接頭。這些接頭由氨基酸鏈組成，其作用為產(chǎn)生可使本發(fā)明多肽連接于其上的簡單接頭或多聚化結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)有技術(shù)采用生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)來產(chǎn)生體外結(jié)合研究用的TCR和pMHC分子的四聚體(參見WO99/60119)。然而，鏈霉親和素是微生物來源的多肽，因此用于治療劑中并不理想。其中的多肽通過衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭連接的本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物提供了本方面的另一種實(shí)施方式?？捎迷S多含多聚化結(jié)構(gòu)域的人蛋白質(zhì)產(chǎn)生多價(jià)高親和力ILT-樣多肽復(fù)合物。例如，p53的四聚化結(jié)構(gòu)域已用于產(chǎn)生scFv抗體片段的四聚體，與單體scFV片段相比，該四聚體顯示血清持久性延長和解離速率明顯降低。(Willuda等，(2001)J.5/o/.C/zem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白也具有四聚化結(jié)構(gòu)域，可能用于該類應(yīng)用。在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物可以是二聚體或四聚體。本文的實(shí)施例9和10分別提供了制備本發(fā)明二聚和四聚PEG-連接的高親和力ILT-樣復(fù)合物的詳細(xì)方法。本文的實(shí)施例ll提供了這種多價(jià)復(fù)合物抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞激活能力的數(shù)據(jù)。含有至少兩個本發(fā)明多肽的本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物提供了本方面的另一種實(shí)施方式，其中至少一個所述多肽與治療劑相連。另一方面提供了本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物，其中所述多肽或多價(jià)復(fù)合物是可溶性的。另一方面提供了呈遞至少一種本發(fā)明多肽的分離的細(xì)胞或顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，這種多肽需要某種"裝置"以連接于所述細(xì)胞或顆粒的表面。促進(jìn)這種連接的"裝置"有許多種。例如，特別是在細(xì)胞的情況中，通過制備摻有人ILT-2的至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域的所選多肽的"全長"形式不難提供該連接"裝置"。圖la中以下劃線標(biāo)出了人ILT-2的跨膜結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:1)。然而，這不是將這種多肽連接于細(xì)胞表面的唯一"裝置"。例如，可制備含有與其它多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域相連的本發(fā)明多肽或其片段的融合蛋白。在連接本發(fā)明多肽與顆粒的情況中，不難通過連接含有C-末端標(biāo)簽(例如生物素)的本發(fā)明多肽與包衣有對所述標(biāo)簽特異的結(jié)合部分(例如鏈霉親和素)的顆粒得以實(shí)現(xiàn)。珍斷浙洽/f應(yīng)賴一方面，可用成像化合物(例如適用于診斷目的的標(biāo)記)標(biāo)記本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物。這種標(biāo)記的多肽可用于檢測靶pMHC分子的方法，該方法包括將pMHC與本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物接觸從而結(jié)合該pMHC;和檢測所述結(jié)合。在用例如生物素化的多肽分子形成的四聚復(fù)合物中，可用熒光鏈霉親和素提供可檢測標(biāo)記。這種熒光標(biāo)記的四聚體可適用于FACS分析來例如檢測抗原呈遞細(xì)胞。檢測本發(fā)明可溶性肽的另一種方式是利用抗體，特別是單克隆抗體。參考文獻(xiàn)中己描述了ILT-特異性抗體。例如，IGH/75是巴塞爾免疫學(xué)研究院(BaselInstituteforImmunology,巴塞爾，瑞士)制備的ILT-2特異性IgG。(Riteau等，(2001)M/扁畫/.13(2)193)。在另一方面，本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物或可與治療劑結(jié)合，或額外地與治療劑結(jié)合(例如，共價(jià)或以其它方式相連)。在本發(fā)明一具體實(shí)施方式中，治療劑可以共價(jià)連接于多肽的C末端?？膳c本發(fā)明多肽結(jié)合的治療劑有許多。例如，治療劑可以是免疫效應(yīng)分子。此方面的具體實(shí)施方式提供的免疫效應(yīng)分子是細(xì)胞因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多通常用于"抑制"免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子。與這種免疫抑制細(xì)胞因子結(jié)合的本發(fā)明多肽構(gòu)成本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。與IL-4、IL-10或IL-13或這些細(xì)胞因子的表型沉默變體或片段結(jié)合的本發(fā)明多肽提供了本發(fā)明的具體實(shí)施方式。與未多聚化的野生型ILT或相應(yīng)的本發(fā)明高親和力ILT-樣多肽相比，本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物對給定pMHC的結(jié)合能力增強(qiáng)。因此，本發(fā)明多價(jià)復(fù)合物對于在體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞特別有用，也可用作制備具有這種用途的其它多價(jià)復(fù)合物的中間體。因此，含有本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物或表達(dá)這種多肽的多個細(xì)胞連同藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物提供了本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物或表達(dá)這種多肽的多個細(xì)胞的治療性應(yīng)用提供了相關(guān)的實(shí)施方式。含有與治療劑結(jié)合的本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物連同藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物提供了本發(fā)明的另一方面。與治療劑結(jié)合的本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物的治療性應(yīng)用提供了相關(guān)的實(shí)施方式。本發(fā)明另一方面是本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物或表達(dá)這種多肽的多個細(xì)胞或顆粒在制備治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用，所述藥物適應(yīng)于胃腸外給藥。合適的胃腸外給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑。本發(fā)明另一方面是與治療劑結(jié)合的本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物在制備治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用，所述藥物適應(yīng)于胃腸外給藥。合適的胃腸外給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑。本發(fā)明也提供將治療劑遞送給靶細(xì)胞的方法，該方法包括在允許本發(fā)明多肽或多價(jià)復(fù)合物與潛在的靶細(xì)胞結(jié)合的條件下，使靶細(xì)胞與該多肽或多價(jià)復(fù)合物接觸，所述多肽或多價(jià)復(fù)合物能與給定的I類pMHC分子結(jié)合并連接有治療劑。治療劑的遞送應(yīng)使之能在局部，而非只對與之直接相連的細(xì)胞施加其效力。因此，一種具體的方案設(shè)想將"免疫抑制劑"分子與對腫瘤抗原特異的本發(fā)明多肽或多價(jià)復(fù)合物相連。可將本發(fā)明的可溶性多肽或多價(jià)復(fù)合物與能將藥物前體轉(zhuǎn)化成藥物的酶連接。這樣能將藥物前體只在需要其之處(g卩，所述多肽或多價(jià)復(fù)合物所靶向之處)轉(zhuǎn)化成藥物。預(yù)計(jì)本文披露的多肽和多價(jià)復(fù)合物可用于自身免疫疾病的診斷和治療方法。本發(fā)明也提供了治療自身免疫疾病的方法，包括給予患這種自身免疫疾病的對象有效量的本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物，或呈遞至少一種所述多肽的多個細(xì)胞或顆粒。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物，或呈遞至少一種所述多肽的多個細(xì)胞或顆粒在制備治療自身免疫疾病的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供了治療自身免疫疾病的方法，包括給予患這種自身免疫疾病的對象有效量的與治療劑結(jié)合的本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物。在一相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供與治療劑結(jié)合的本發(fā)明多肽或其多價(jià)復(fù)合物在制備治療自身免疫疾病的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的治療或成像多肽通常以無菌藥物組合物的部分提供，該組合物通常包含藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可以是任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。可以單位劑型提供，通常裝在密封的容器中提供，也可作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒通常(雖然不是必須)裝有使用說明書。試劑盒可裝有多個所述單位劑型。可改進(jìn)藥物組合物以適應(yīng)于通過任何合適的途徑給予，例如胃腸外、透皮或通過吸入，優(yōu)選胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)或最優(yōu)選靜脈內(nèi))途徑?？赏ㄟ^藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法制備這種組合物，例如通過在無菌條件下混合活性成分與一種或多種載體或賦形劑。本發(fā)明物種的劑量可依據(jù)待治療的疾病或病癥，待治療個體的年齡和狀況等而在寬廣界限內(nèi)變動，醫(yī)師將最終確定所使用的合適劑量。本發(fā)明多肽或多價(jià)復(fù)合物可以基本上純的形式，或作為純化或分離的制品提供。例如，其可以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸、插入所述核酸的載體和含有所述載體的細(xì)胞提供了其它實(shí)施方式。編碼本發(fā)明多肽的核酸可以是經(jīng)改進(jìn)適于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)的核酸。提供這種核酸優(yōu)化服務(wù)的公司有許多，例如德國的GeneArt。本發(fā)明也提供鑒定對給定I類pMHC具有結(jié)合特性的給定ILT分子高親和力變體的方法，其特征在于所述多肽對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1pM和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC分子的解離速率(k。ff)為2S—1或更慢，所述多肽與SEQIDNO:7有至少45%相同性和/或55%相似性，并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO:3，所述方法包括(a)制備ILT分子文庫，與相應(yīng)的野生型ILT分子相比，所述ILT分子在氨基酸序列中含有一個或多個突變；和(b)在適合突變ILT分子與I類pMHC耙標(biāo)結(jié)合的條件下，使所述突變的ILT分子與I類pMHC靶標(biāo)接觸；和(C)檢測相互作用的KD和/或k。ff;禾口(d)選擇具有所需結(jié)合特征的一種或多種多肽。ILT多肽和/或ILT-樣多肽的噬菌體展示提供了制備適用于上述方法的多肽文庫的一種方法。制備本發(fā)明多肽的方法是最后一方面，包括(i)用摻有編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和(ii)在適合表達(dá)本發(fā)明多肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和(iii)回收所表達(dá)的多肽。提供了該方面的具體實(shí)施方式，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌(五.co/0細(xì)胞或酵母菌細(xì)胞，例如巴斯德畢赤酵母(尸/c/由戸Won;y)細(xì)胞。本文的實(shí)施例l-3和7-8分別提供了在大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中制備本發(fā)明多肽的詳細(xì)方法。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征與已作了必要修正的其它各方面一樣。本文述及的現(xiàn)有技術(shù)文件按照法律所允許的最大程度納入。實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下文參考了附圖，其中圖la提供了野生型人ILT-2的全長氨基酸序列(SEQIDNo:1)。突出表示的氨基酸顯示該多肽殘基不同于野生型人ILT-2同種型1的相應(yīng)殘基。下劃線標(biāo)出了跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸。圖lb提供了編碼圖la所示氨基酸序列的野生型人ILT-2的全長DNA序列(SEQIDNo:2)。該DNA序列對應(yīng)于所給出的NCIMB核苷酸登錄號為NM—006669的序列。圖2a和2b分別提供了圖la和lb所示野生型ILT-2序列的可溶性二結(jié)構(gòu)域形式的氨基酸和DNA序列。這些截短的序列只含有/編碼ILT-2的胞外結(jié)構(gòu)域Dl和D2。(分別是SEQIDNo:3和SEQIDNO:4)圖3提供了插入基于pGMT7的載體以表達(dá)圖2a所示野生型ILT-2多肽的可溶性二結(jié)構(gòu)域形式的全長DNA序列。下劃線標(biāo)出了HindIII和Ndel限制性內(nèi)切酶識別序列。圖4a-4d(SEQIDNo:6-9)提供了可溶性二結(jié)構(gòu)域高親和力ILT-樣多肽的氨基酸序列。突出表示的殘基相對于圖2a已發(fā)生突變。圖5a-5d(SEQIDNO:10-13)分別提供了插入pGMT7衍生的載體以表達(dá)圖4a-4d所示可溶性二結(jié)構(gòu)域高親和力ILT-樣多肽的DNA序列。突出表示的密碼子相對于圖3a已發(fā)生突變，下劃線標(biāo)出了HindIII禾口Ndel限制性內(nèi)切酶識別序列。圖6提供了可插入圖5a-5d所示DNA序列的pGMT衍生載體的DNA序列。圖7提供了可插入圖5a-5d所示DNA序列的pGMT衍生載體的質(zhì)粒圖譜。圖8a提供了可溶性二結(jié)構(gòu)域(c20)高親和力ILT-樣多肽的氨基酸序列。圖8b提供了可溶性二結(jié)構(gòu)域(c50)高親和力ILT-樣多肽的氨基酸序列。圖8c提供了在其C-末端添加了半胱氨酸殘基的可溶性二結(jié)構(gòu)域(c50)高親和力ILT-樣多肽的氨基酸序列。圖9a提供了在其5'端添加了半胱氨酸編碼密碼子的可溶性二結(jié)構(gòu)域(c20)高親和力ILT-樣多肽的DNA序列。該DNA序列已為在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)作了優(yōu)化，并摻入了用下劃線標(biāo)出的S加i/和A^/限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。圖9b提供了圖9a所示DNA序列編碼的在其C-末端添加了半胱氨酸殘基的可溶性二結(jié)構(gòu)域(c20)高親和力ILT-樣多肽的氨基酸序列。圖10提供了為巴斯德畢赤酵母表達(dá)的可溶性二結(jié)構(gòu)域(c20)高親和力ILT-樣多肽與I類MHC相互作用制作的Biacore應(yīng)答曲線。圖11提供了為可溶性二結(jié)構(gòu)域(c20)高親和力ILT-樣多肽二聚體與Tax-HLA-A*0201相互作用制作的Biacore應(yīng)答曲線。圖12提供了為可溶性二構(gòu)域(c20)高親和力ILT-樣多肽四聚體與Tax-HLA-A*0201相互作用制作的Biacore應(yīng)答曲線。圖13a-13bh提供了其它二結(jié)構(gòu)域高親和力ILT-樣多肽的氨基酸序列。圖14提供了顯示高親和力(c50)ILT-樣單體和二聚體抑制CTL激活的ELISPOT數(shù)據(jù)。圖15提供了顯示高親和力(c50)ILT-樣單體、二聚體和四聚體抑制CTL激活的ELISPOT數(shù)據(jù)。實(shí)應(yīng)樹/-劍吝奮夯結(jié)椅凝7浙2游W薪絲,主，/i:r-2分^圖3(SEQIDNO:5)提供了用于表達(dá)只含有結(jié)構(gòu)域Dl和D2的可溶性野生型ILT-2的DNA序列?？捎啥鄠€承包研究公司(contractresearchcompany)從頭合成這些DNA序列，例如GeneArt(德國)。該DNA序列中引入了限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(yVA/和幼'mi///)，從而促進(jìn)這些DNA序列連接入基于pGMT7的表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有用于在大腸桿菌菌株BL21-DE3(pLysS)中高水平表達(dá)的T7啟動子(Pan等，Biotechniques(2000)29(6):1234-8)。該DNA序列連接入用M/e/和歷^////切割的pGMT7載體(該載體的DNA序列見圖6，該載體的質(zhì)粒圖譜見圖7)。導(dǎo)入編碼^搭性舒生，/IT-2多欣游DA^游A,劍性^/坊艨說劍位點(diǎn)敲/-CATATGAAGCTT體采用快速DNA連接試劑盒(rapidDNAligationkit，Roche)，根據(jù)廠商的使用說明書連接切割的ILT-2DNA和切割的載體。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌菌株XLl-藍(lán)細(xì)胞，將其接種于含有100mg/ml氨芐西林的LB/瓊脂平板上。37t:培育過夜后，挑選單菌落，37'C在10ml含有]00mg/ml氨芐西林的LB中搖動生長過夜。采用Miniprep試劑盒(Qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，采用自動化DNA測序儀(LarkTechnologies)測序插入的片段。圖2a顯示了由圖2b所示DNA序列產(chǎn)生的可溶性野生型ILT-2多肽的氨基酸序列。實(shí)嚴(yán)樹2-敘備^,絲野主壟幾r-2多嚴(yán)游毐襲浙力變體可將如實(shí)施例1所述產(chǎn)生的可溶性野生型ILT-2多肽用作模板，由該模板可產(chǎn)生對I類pMHC分子的親和力提高和/或解離速率降低的本發(fā)明多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知可通過定點(diǎn)誘變將產(chǎn)生這些突變鏈所需的必需密碼子變化導(dǎo)入編碼該可溶性野生型ILT-2多肽的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定點(diǎn)誘變試劑盒)。簡言之，通過使用摻入所需的一個或多個密碼子變化的引物以及將含有編碼可溶性野生型ILT-2多肽的DNA的質(zhì)粒作為誘變模板來實(shí)現(xiàn)采用以下條件進(jìn)行誘變50ng質(zhì)粒模板、1pl的10mMdNTP、由廠商提供的5pl10XPfuDNA聚合酶緩沖液、25pmol正向引物、25pmol反向引物、1plpfuDNA聚合酶，總體積50^。95t:進(jìn)行2分鐘的初始變性步驟，然后進(jìn)行25輪如下反應(yīng)變性(95。C，10秒)、退火(55。C，10秒)和延伸(72t:，8分鐘)。用Dpnl限制性內(nèi)切酶消化所得產(chǎn)物以去除模板質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株XLl-藍(lán)。測序驗(yàn)證誘變。圖4a-4d(SEQIDNo:6-9)和圖13a-13bh(SEQIDNO:21-80)列出了對YLSGANLNL(SEQIDNO:15)-HLA-A*0201復(fù)合物顯示有高親和力的突變ILT-樣多肽的氨基序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可通過定點(diǎn)誘變將產(chǎn)生這些突變多肽所需的必需密碼子變化導(dǎo)入編碼該可溶性野生型ILT-2多肽的DNA中(QuickChange,Stratagene的定點(diǎn)誘變試劑盒)。3-〃了溶絲多嚴(yán)游表這、重界#,辨眾將實(shí)施例1或2中制備的含有ILT多肽(基因)的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株rosettaDE3pLysS，37。C在TYP培養(yǎng)基(含100|ig/ml氨芐西林、15Mg/ml氯霉素)中培養(yǎng)具有氨芐西林/氯霉素抗性的單菌落7小時，然后用0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)15小時后用BeckmanJ-6B以4000rpm離心30分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物重懸在緩沖液中，在MilsonixXL2020超聲波儀中用標(biāo)準(zhǔn)的12mm直徑探頭對重懸的細(xì)胞進(jìn)行1分鐘的超聲破碎，總共超聲約10分鐘。用BeckmanJ2-21離心機(jī)以4000rpm離心10分鐘回收包涵體沉淀物。然后用去污劑洗滌三次以去除細(xì)胞碎片和膜組分。每次用Triton緩沖液(50mM丁ris-HCl、0.5%Triton-XlOO、200mMNaCl、10mMNaEDTA、0.1%O/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0)均漿包涵體沉淀物，然后用BeckmanJ2-21離心機(jī)以4000rpm離心15分鐘使其沉淀。然后用如下緩沖液進(jìn)行類似洗滌去除去污劑禾口鹽:50mMTris-HCl、lmMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0。最后，將包涵體分成60mg的等分，-7(TC冷凍。用6M鹽酸胍溶解，用紫外分光光度計(jì)定量測定包涵體蛋白產(chǎn)率。從冷凍儲備物融化約60mg其中溶有ILT多肽的包涵體，用15ml胍溶液(6M鹽酸胍、lOmM醋酸鈉、10mMEDTA)稀釋以確保鏈完全變性。然后將含有完全還原并變性的ILT多肽的胍溶液注入1升以下重折疊緩沖液中100mMTrispH8.5、400mML-精氨酸、2mMEDTA、5mM還原性胱亞胺(Cystaeimine)、0.5mM2-巰基乙胺、5M尿素。加入氧化還原對(2-巰基乙胺和胱胺(其終濃度分別為6.6mM和3.7mM))，約5分鐘后加入變性的ILT多肽。將溶液靜置30分鐘。5°C±3°C，在Spectrapor1膜(Spect誦;產(chǎn)品編號132670)中用10L10mMTrispH8.1透析重折疊的ILT多肽18-20個小時。然后將透析緩沖液換為新鮮的10mMTrispH8.1(10L)，繼續(xù)在5'C士3。C下再透析20-22小時。將透析的重折疊蛋白加載到POROS50HQ陰離子交換柱上，然后用Akta純化儀(Pharmacia)以50倍以上柱體積的0-500mMNaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)來分離可溶性ILT多肽與降解產(chǎn)物和雜質(zhì)。將峰組分儲存于4'C，采用考馬斯染色的SDS-PAGE進(jìn)行分析，然后合并和濃縮。最后，采用在HBS-EP緩沖液(IOmMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3.5mMEDTA、0.05%乙基苯基聚乙二醇p40(nonidetp40))中預(yù)平衡的Superdex200HR凝膠過濾柱純化和表征可溶性ILT多肽。合并、濃縮在相對分子量約為27kDa洗脫的峰，然后用Biacore表面等離振子共振分析來表征。實(shí)潘,"-5/"co"表^"箏庫嚴(yán)f關(guān)嚴(yán)表/f^^絲/Lr對pM/ZC游錄合用表面等離振子共振生物傳感器(Biacore300()tm)來分析可溶性ILT分子與I類pMHC的結(jié)合。制備以半定向方式固定于鏈霉親和素包被的結(jié)合表面的可溶性生物素化pMHC(如下所述)有助于該分析并可同時有效測試可溶性ILT分子與多達(dá)4種不同pMHC(固定于不同流動小室)的結(jié)合。注射pMHC易于操控固定的I類分子的精確水平。由含有組成型亞單位蛋白和合成肽的細(xì)菌表達(dá)包涵體體外重折疊加載有CEA衍生的YLSGANLNL(SEQIDNO:15)肽的可溶性生物素化I類HLA-A*0201，然后純化并在體外進(jìn)行酶生物素化(O，Callaghan箏(1999)^"a/.Aoc/zem.266:9-15)。所表達(dá)的MHC重鏈具有C末端生物素化標(biāo)簽，其在適合的構(gòu)建物中替代了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。獲得的包涵體表達(dá)水平約為75mg/升細(xì)菌培養(yǎng)液。還在大腸桿菌中將合適構(gòu)建體的MHC輕鏈或(52-微球蛋白表達(dá)為包涵體，其水平約為500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)液。裂解大腸桿菌細(xì)胞，將包涵體純化到約80%的純度。包涵體的蛋白質(zhì)在6M鹽酸胍、50mMTrispH8.1、100mMNaCl、10mMDTT、10mMEDTA中變性，在低于5'C將變性的蛋白一次脈沖加入重折疊緩沖液，以30mg/升重鏈、30mg/升p2m的濃度在0.4ML-精氨酸-HCl、100mMTrispH8.1、3.7mM胱胺、6.6mM(3-巰基乙胺、MHC負(fù)載所需的4mg/ml肽中重折疊。重折疊在4'C時進(jìn)行至少1小時方能完成。用10倍體積的10mMTrispH8.1進(jìn)行透析來更換緩沖液。需更換緩沖液2次以充分降低溶液的離子強(qiáng)度。然后用1.5pm的醋酸纖維素濾膜過濾蛋白質(zhì)溶液，加載到POROS50HQ陰離子交換柱上(8ml的床體積)。用線性0-500mMNaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。以約250mMNaCl洗脫可溶性生物素化的HLA-A2-肽復(fù)合物，收集峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)，然后在冰上冷藏這些組分。采用以10mMTrispH8.1、5mMNaCl平衡的Pharmacia快速脫鹽柱，將生物素化標(biāo)記的pMHC的緩沖液更換為10mMTrispH8.1、5mMNaCl。洗脫后立即將含蛋白質(zhì)的諸組分置于冰上冷藏，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化試齊l」1mM生物素、5mMATP(緩沖至pH8)、7.5mMMgCb禾n5|tig/mlBirA酶(根據(jù)O，Callaghan#(1999)J,w/.266:9-15進(jìn)行純化)。然后室溫培育該混合物過夜。采用凝膠過濾層析純化生物素化的pMHC。用經(jīng)過濾的PBS預(yù)平衡PharmaciaSuperdex75HR10/30柱，然后加載1ml生物素化反應(yīng)混合物，用PBS以0.5ml/分鐘展開柱。生物素化的pMHC在約15ml時以單峰洗脫。合并含蛋白質(zhì)的諸組分，在冰上冷藏，然后加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結(jié)合分析法(PerBio)測定蛋白質(zhì)濃度，將生物素化pMHC的等份試樣冷凍于-20。C。采用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)法固定鏈霉親和素。該固定化的pMHC與可溶性T-細(xì)胞受體和共同受體(coreceptor)CD8aot以及ILT分子均能結(jié)合，可利用這些相互作用確保固定的pMHC正確重折疊。在Biacore3000TM表面等離振子共振(SPR)生物傳感器上分析含可溶性ILT分子與CEA衍生YLSGANLNL(SEQIDNO:15)-HLA—A承0201(其產(chǎn)生如上所述)之間的相互作用。在一流動小室中，SPR檢測到傳感器表面附近以響應(yīng)單元(RU)表示的折光率發(fā)生變化，該原理可用于檢測受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動力學(xué)參數(shù)。通過生物素標(biāo)簽結(jié)合將pMHC復(fù)合物固定在流動小室中制成檢測流動小室。然后使可溶性ILT以恒定的流速通過不同流動小室的表面，檢測該情況下的SPR響應(yīng)以進(jìn)行測試。檢/，^衛(wèi)錄合常教制備了可溶性ILT分子的連續(xù)稀釋液，以5pl/分鐘的恒定流速注入兩個不同的流動小室；一個流動小室用約500RU的特異性-HLA-A^201復(fù)合物包被，第二個小室用作空白對照。利用對照小室的測定值標(biāo)準(zhǔn)化對各濃度的響應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)響應(yīng)對ILT樣品的濃度作圖，擬合成雙曲線(hyperbola)以計(jì)算平衡纟吉合常數(shù)，KD。(Price&Dwek，PrinciplesandProblemsinPhysicalChemistryforBiochemists(《生物化學(xué)家的物理化學(xué)原理和問題》)，第二版，1979，ClarendonPress,牛津)。/i/f/動力學(xué)參教通過試驗(yàn)檢測解離速率常數(shù)Kd和結(jié)合速率常數(shù)Ka來測定高親和力可溶性ILT的Kd。平衡常數(shù)kd計(jì)算為kd/ka。將高親和力ILT-樣分子注射流過兩個不同小室，一個用約300RU的CEA衍生的YLSGANLNL(SEQIDNO:15)-HLA-A*0201復(fù)合物包被，另一個用作空白對照。流速設(shè)置為50pl/分鐘。通常以約3HM的濃度注入250pl的ILT多肽。然后使緩沖液流過直到響應(yīng)回復(fù)到基線。用Biaevaluation軟件計(jì)算動力學(xué)參數(shù)。也將解離相擬合為單指數(shù)衰變方程式從而能計(jì)算半衰期。錄菜采用上述方法分析野生型ILT-2的可溶性變體和CEA衍生的YLSGANLNL-HLA-A*0201復(fù)合物之間的相互作用，顯示KD約為6)LiM。具有圖4a-4d(SEQIDNo:6-9)和圖13a-13bh(SEQIDNO:21-80)所示氨基酸序列的ILT-樣分子的Ko為小于或等于1和/或2S"或更慢。實(shí)應(yīng)樹5-^#絲pMi/C/CDS源互/，賴,劍游肌aco"表厭箏葸嚴(yán)^用表面等離振子共振(surfaceplasmonresonance)生物傳感器(Biacore3000)分析可溶性ILT介導(dǎo)pMHC/CD8相互作用的抑制。制備可溶性pMHC(如下所述)和生物素化的可溶性CD8aa(也如下所述)有助于該分析。以半定向方式將該生物素化的可溶性CD8acc分子固定于鏈霉親和素包被的結(jié)合表面"Biacore芯片"，從而能有效測試可溶性pMHC復(fù)合物與固定的可溶性CD8cxa的結(jié)合。注射生物素化的可溶性CD8aa分子能易于對固定的CD8分子進(jìn)行精確水平的操作。采用基本上如(Garboczi等，(1992)尸A^S園893429-3433)所述的方法制備加載有CEA衍生的YLSGANLNL(SEQIDNO:15)肽的可溶性HLA-A*0201pMHC。體外重折疊來自含有組成型亞單位蛋白和合成肽的細(xì)菌表達(dá)包涵體中的可溶性pMHC分子，然后純化。還在大腸桿菌中將合適構(gòu)建體的MHC輕鏈或P2-微球蛋白表達(dá)為包涵體，其水平約為500mg/升細(xì)菌培養(yǎng)液。裂解大腸桿菌細(xì)胞，純化包涵體，除省去生物素化步驟之外采用實(shí)施例4所詳述的方法重折疊和純化過度表達(dá)的蛋白質(zhì)。如EP1024822的實(shí)施例1和6所述制備生物素化的可溶性CD8分子。簡言之，含有C-末端生物素化標(biāo)簽的可溶性CDSa在大腸桿菌中表達(dá)為包涵體，然后純化和重折疊以產(chǎn)生能通過酶法生物素化的含標(biāo)簽序列的CD8aa同二聚體。(Schatz，(1993)所Wec/mo/ogy7V:ril:1138-43)。然后利用BirA酶生物素化標(biāo)記的CD8a分子(O'Callaghan等，勘"/腸由m266(1):9-15(1999)。生物素化試劑為1mM生物素、5mMATP(緩沖至pH8)、7.5mMMgCl2和5jag/mlBirA酶(按照O'Callaghan等，(1999)^"a/.S/oc/zem.266:9-15純化)。室溫培育混合物過夜。將生物素化的sCD8aa固定在Biacore鏈霉親和素包被的芯片表面，導(dǎo)致折光率改變1000響應(yīng)單位。這種固定的CD8aa能與可注射入可溶相中的可溶性pMHC復(fù)合物結(jié)合。如下所示分析ILT分子抑制Biacore3000tm表面等寓振子共振(SPR)生物傳感器上pMHC/CD8相互作用的能力SPR檢測流動小室內(nèi)接近傳感器表面以響應(yīng)單位(RU)表示的折光率變化，該原理可用于檢測受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動力學(xué)參數(shù)。通過將可溶性生物素化的CD8aa分子固定到上述鏈霉親和素包被的芯片上來制備芯片。制備野生型ILT或高親和力ILT-樣分子的連續(xù)稀釋液，在有合適濃度的可溶性YLSGANLNL(SEQIDNO:15)-HLA-A*0201存在下，以5pl/分鐘的恒定流速注射流過包被有1000RU生物素化CD8aa的流動小室。抑制CD8aa/pMHC相互作用的SPR應(yīng)答產(chǎn)生了劑量應(yīng)答曲線，利用該曲線計(jì)算所測試的該多肽對此相互作用的IC5Q值。6-多i,身裙^性^7褙?cái)⒔z游比袞對于該項(xiàng)應(yīng)用，可通過以下網(wǎng)址獲得產(chǎn)生相同性和相似性數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)比較算法http:〃fasta.bioch.virginia.edu/fasta—www/cgi/search—frm2.cgi利用該網(wǎng)址上得到的"FASTA:蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNA:DNA"程序進(jìn)行這些比較。使用以下(默認(rèn))設(shè)置Ktup:Kt叩=2評分矩陣Blosum50Gap:-10Ext:-2為進(jìn)行所需的比較，將圖4b中以單字母密碼子表示的可溶性ILT-2片段氨基酸序列(SEQIDNO:7)作為第一(查詢)序列輸入，將與之比較的氨基酸序列作為第二(文庫)序列輸入。然后，可執(zhí)行該算法，得到所比較序列對的相同性和相似性百分比。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可用于此分析的FASTA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)比較有許多來源。實(shí)嚴(yán)樹7—勞y備^f表達(dá)^)^絲贏,榮浙力c20/丄r-存多,游已箭德華恭縻母載體圖9a(SEQIDNO:19)提供了用于在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)只含有結(jié)構(gòu)域Dl和D2的可溶性c20高親和力ILT-樣多肽的DNA序列。可由承包研究公司，例如GeneArt(德國)從頭合成為畢赤酵母表達(dá)而優(yōu)化的該DNA序列。將編碼半胱氨酸的密碼子加入該DNA的3'引物端以在表達(dá)的ILT-樣多肽的C-末端上提供"標(biāo)簽"，從而促進(jìn)多聚化(如果需要的話)。將限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(^flB/和7Vo/7)引入該DNA序列以促進(jìn)該DNA序列連接入pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒。(Invitrogen)導(dǎo)乂編碼^溶絲葛菜,力c20/ZT存多it游DA^4游A,虔y性/^坊艨択，位^f5VwS/-tacgtaiVo"-gcggccgc遂接采用快速DNA連接試劑盒(Roche)，將編碼高親和力ILT-樣多肽的DNA序列連接入用S""S/和Wo"限制性內(nèi)切酶切割的pPIC9K載體(Invitrogen)。微f譜將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)XLl-藍(lán)(Stratagene,Country),將其接種于含有100mg/ml卡那霉素的LB/瓊脂平板上。37。C培育過夜后，挑選單菌落，37。C在100ml含有100mg/ml卡那霉素的LB中搖動生長過夜。利用Midiprep試劑盒(Qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，利用自動化DNA測序儀(LarkTechnologies)測序插入的片段。圖9b(SEQIDNO:20)顯示了由圖9a所示DNA序列(SEQIDNO:19)編碼的二結(jié)構(gòu)域高親和力ILT-樣(c20)多肽的氨基酸序列。實(shí)嚴(yán)樹s-在fi,銀德華漆^母^表這,錄化^,絲驀榮,力/丄r-存多l(xiāng)如下所述，將如實(shí)施例7中所述制備的含有親和力ILT-樣多肽的編碼DNA的巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母菌株GS115(Invitrogen，美國)利用PichiaEasyCompKit(Invitrogen)將GS115巴斯德畢赤酵母細(xì)胞制成感受態(tài)。該試劑盒利用PEG1000將這些細(xì)胞制備成化學(xué)感受態(tài)。利用SalI使含有LIT-樣多肽DNA的載體線性化，按照Invitrogen手冊所述轉(zhuǎn)化入GS115菌株。用RDB瓊脂平板(Irwitrogen)培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有高親和力ILT-樣多肽的編碼DNA的轉(zhuǎn)化體。RDB瓊脂不含組氨酸，從而確保只有成功轉(zhuǎn)化了pPIC9K質(zhì)粒的酵母細(xì)胞能生長。pPIC9K質(zhì)粒通過提供能使其在His-培養(yǎng)基上生長的一拷貝HIS4基因賦予在組氨酸—瓊脂上生長的能力。從瓊脂平板上挑出單菌落，3(TC用BMGY培養(yǎng)基(Invitrogen)培養(yǎng)過夜，然后誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。通過離心(spinning)細(xì)胞(2000Xg，10分鐘)并重懸在200mlBMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Invitrogen)中來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)后6天，以2000Xg離心30分鐘收集細(xì)胞。采用切向流過濾(tangentialflowfiltration)(Sartorious10kDa截?cái)嘀?將上清液濃縮至10ml，利用SEC(S200HRGEHealthcare)純化。將諸峰組分儲存于4"C，采用考馬斯染色的SDS-PAGE進(jìn)行分析，然后合并和濃縮。最后，采用在HBS-EP緩沖液(10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3.5mMEDTA、0.05%乙基苯基聚乙二醇p40)中預(yù)平衡的Superdex200HR凝膠過濾柱純化和表征可溶性高親和力ILT樣多肽。合并、濃縮在相對分子量約為27kDa洗脫的峰，然后用實(shí)施例4所詳述的方法通過Biacore表面等離振子共振分析來表征。錄菜通過實(shí)施例4基于Biacore的方法測定到巴斯德畢赤酵母表達(dá)的高親和力c20ILT-樣多肽對I類MHC的Ko約為100-150nM。利用畢赤酵母產(chǎn)生的高親和力c20ILT-樣多肽得到的Biacore曲線見圖10。該結(jié)果與大腸桿菌產(chǎn)生的相應(yīng)高親和力c20ILT-樣多肽測定的約為25-85nM的Kd可比。9-#歷^^^/-/^G-M/荽頭二覆化幾r-祥多,采用實(shí)施例l-3所詳述的方法制備在C-末端含有額外的半胱氨酸殘基的可溶性c50高親和力ILT-樣多肽。(該多肽的氨基酸序列見圖8b(SEQIDNO:17))。利用不分叉的雙功能馬來酰亞胺-PEG(MAL-PEG-MAL，分子量3.4KD，NOFCorporation,日本)交聯(lián)ILT-樣多肽。該接頭末端上的馬來酰亞胺基團(tuán)賦予該接頭游離巰基結(jié)合特異性。在交聯(lián)前，先用還原劑0.1mMDTT預(yù)處理(室溫，過夜)ILT-樣多肽再交聯(lián)，從而釋放該可溶性ILT-樣多肽上的游離半胱氨酸。利用低濃度的該還原劑選擇性還原該暴露的C-末端半胱氨酸殘基。然后用PBS緩沖液通過凝膠過濾層析(Superdex75)再次純化該可溶性ILT-樣多肽。然后用10kDa截?cái)嘀档碾x心薄膜濃縮儀(centrifugalmembraneconcentrator)(VivaScience，Satorius)再次濃縮該ILT-樣多肽。以約2:l(蛋白質(zhì)比交聯(lián)劑)的摩爾比分步加入MAL-PEG-MAL(10mM，DMF配制)，然后室溫培育兩小時來實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。然后利用以PBS預(yù)平衡的Superdex75HR10/30凝膠過濾柱純化產(chǎn)物。交聯(lián)后觀察到3個峰，其中一個峰符合完整的"單體"ILT-樣多肽的位置，(其它)的符合較高分子量的物質(zhì)。通過SDS-PAGE進(jìn)一步分析諸峰中的物質(zhì)。用不含DTT(非還原性)或含15mMDTT(還原性)的標(biāo)準(zhǔn)SDS樣品緩沖液(BioRad)預(yù)處理三個峰的樣品，進(jìn)行梯度4-20。/。PAGE(電泳)，用考馬斯藍(lán)染色。在非還原性條件下，三個峰中的物質(zhì)分別顯示為交聯(lián)(ILT-PEG-ILT)物質(zhì)、中間物質(zhì)(ILT—PEG)和未修飾的ILT-2。采用實(shí)施例4詳述的基于Biacore的方法驗(yàn)證這些可溶性高親和力c50ILT-樣多肽二聚體與I類pMHC結(jié)合的能力。該可溶性高親和力c50ILT-樣二聚體顯示的解離半衰期約為30-86分鐘。通過比較，Biacore方法測定相應(yīng)的可溶性c50ILT-2單體多肽的KD約為6秒。這清楚地證明二聚化提高了親和力。圖11提供了可溶性高親和力c50ILT-樣多肽二聚體與Tax-HLA-A*0201相互作用的Biacore曲線。該Biacore曲線也加有用于計(jì)算該特定運(yùn)行的解離半衰期的回歸線。(86分鐘)實(shí)嚴(yán)夠70-/L『-2多it游，褒眾利用四聚馬來酰亞胺-PEG(4臂MAL-PEG，分子量20KD，ShearwaterCorporation)四聚化在C-末端含有額外半胱氨酸殘基的可溶性高親和力c50ILT-樣多肽。該接頭末端上的馬來酰亞胺基團(tuán)賦予該接頭游離巰基結(jié)合特異性。交聯(lián)前，先用還原劑0.1mMDTT預(yù)處理(室溫，過夜)可溶性高親和力c50ILT-樣多肽，從而釋放該可溶性ILT-2多肽上的游離半胱氨酸。利用低濃度的該還原劑選擇性還原暴露的C-末端半胱氨酸殘基。然后用PBS緩沖液通過凝膠過濾層析(Superdex75)再次純化該可溶性高親和力c50ILT-樣多肽。然后用10kDa截?cái)嘀档碾x心薄膜濃縮儀(VivaScience,Satorius)再次濃縮該可溶性高親和力c50ILT-樣多肽。以約4:l(蛋白質(zhì)比交聯(lián)劑)的摩爾比分步加入四臂MAL-PEG-(lOmM，DMF配制)，然后室溫培育兩小時分鐘來實(shí)現(xiàn)四聚化。然后利用以PBS預(yù)平衡的Superdex75HR10/30凝膠過濾柱純化產(chǎn)物。通過SDS-PAGE進(jìn)一步分析洗脫的諸組分。用不含DTT(非還原性)或含15mMDTT(還原性)的標(biāo)準(zhǔn)SDS樣品緩沖液(BioRad)預(yù)處理這些組分的樣品，進(jìn)行梯度4-20。/。PAGE(電泳)，用考馬斯藍(lán)染色。SDSPAGE凝膠(電泳)顯示四聚可溶性高親和力c50ILT-樣多肽物質(zhì)約占存在的蛋白質(zhì)的50%。采用實(shí)施例4詳述的基于Biacore的方法驗(yàn)證這些四聚體與I類pMHC結(jié)合的能力。這些可溶性c50ILT-樣四聚體與Tax-HLA*0201的結(jié)合非常緊密，以致于不能測定該相互作用的解離表觀KD或半衰期。通過比較，Biacore方法測定相應(yīng)的可溶性c50ILT-2二聚體和單體多肽的相互作用解離半衰期分別是30-86分鐘和約為6秒。這清楚地證明四聚化提高了親和力。圖12提供了可溶性高親和力c50ILT-樣多肽四聚體與Tax-HLA*A020I相互作用的Biacore曲線。,仿驀襲浙力c^幾r-摔単體、二覆/^覆沐#^鄰翁，應(yīng)毒絲r激應(yīng)「ctt^激活游el/s尸or試邀以下方法提供了評估可溶性高親和力c50ILT-樣多肽單體和多價(jià)復(fù)合物抑制CD8共同受體介導(dǎo)的T細(xì)胞激活的手段。試驗(yàn)培養(yǎng)基10。/。FCS(熱滅活的，Gibco,目錄號10108-165)，88%RPMI1640(Gibco，目錄號42401-018)，1。/。谷氨酰胺(Gibco，目錄號25030-024)和1%青霉素/鏈霉素(Gibco，目錄號15070-063)。洗滌緩沖液0.01MPBS/0.05。/。吐溫20(將Sigma，目錄號P-3563的1袋含吐溫20的磷酸緩沖鹽水，pH7.4溶解于1升蒸餾水得到最終的組合物0.01MPBS、0.138MNaCl、0,0027MKC1、0.05%吐溫20)。PBS(Gibco,目錄號10010-015)。DiacloneEliSpot試劑盒(IDS)EliSpot試劑盒裝有需要的所有其它試劑，即捕捉和檢測抗體，脫脂奶粉、BSA、鏈霉親和素-堿性磷酸、BCIP/NBT溶液(人IFN-yPVDFEli-spot20x96孑L與平板(IDS目錄號DC-856.051.020,DC-856.000.000)。以下方法基于隨各試劑盒提供的廠商使用說明書，但有少許改進(jìn)。方法每平板用10ml無菌PBS稀釋100pl捕捉抗體。將100pl稀釋的捕捉抗體等份加入各孔，4"C靜置過夜，或室溫靜置2小時。然后用450pl洗滌緩沖液，Ultrawash96-孔板清洗器(ThermoLifeSciences)洗滌各平板三次以除去過量的捕捉抗體。然后將100^12%脫脂奶加入各孔。(將隨EliSpot試劑盒提供的一小瓶脫脂奶粉溶解于50ml無菌PBS)。然后，室溫培育各平板2小時，再用450pl洗滌緩沖液，Ultrawash96-孔板清洗器(ThermoLifeSciences)洗滌各平板三次。使用胰蛋白酶使Mel624和Mel526靶細(xì)胞脫離它們的組織培養(yǎng)瓶，在試驗(yàn)培養(yǎng)液中離心(280Xg，IO分鐘)洗滌一次，以lX106/ml重懸在同樣的培養(yǎng)液中。然后將50pl該混懸液加入試驗(yàn)平板得到的靶細(xì)胞總數(shù)為50,000個細(xì)胞/孔。離心(280Xg，10分鐘)收集MART-1特異性T細(xì)胞克隆(KA/C5)(效應(yīng)細(xì)胞系)，以lX10Vml重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)液中，當(dāng)將50pl加入試驗(yàn)平板時得到500個細(xì)胞/孔。用試驗(yàn)培養(yǎng)液將可溶性高親和力c50ILT-樣多肽單體、二聚體和四聚體稀釋成3X濃度，當(dāng)將50jil以150Ml的終體積加入平板時得到1X終濃度。測試的ILT-2單體的濃度范圍是10pM-0.03pM。測試的ILT-2二聚體和四聚體的濃度范圍是1pM-0.003pM。然后制備含有以下各物質(zhì)的孔，(各孔中最終反應(yīng)體積是100/f/試存/7耵麼序勿A」50plMel624或Mel526耙細(xì)胞50pl所需濃度的ILT-樣單體、四聚體或二聚體。50plT細(xì)胞克隆效應(yīng)細(xì)胞。微鄉(xiāng)50pl靶細(xì)胞50pl最高濃度的ILT-樣單體、二聚體或四聚體50pl試驗(yàn)培養(yǎng)液或50pl效應(yīng)細(xì)胞50pl最高濃度的ILT-樣單體、二聚體或四聚體50pl試驗(yàn)培養(yǎng)液50(ilMel624或Mel526耙細(xì)胞50pl效應(yīng)細(xì)胞50pi試驗(yàn)培養(yǎng)液或力顯示CDS銀.嫁絲50piMel624或Mel526耙細(xì)胞50pi效應(yīng)細(xì)胞含有100|ig/mlHB230抗CD8抗體的50(il(溶液)37°C/5%C02培育各平板。然后用洗滌緩沖液洗滌各平板六次，再輕拍出多余的緩沖液。然后向隨ELISPOT試劑盒提供的各檢測抗體小瓶中加入550卩l(xiāng)蒸餾水以制備稀釋溶液。然后每平板再用10mlPBS/1%BSA稀釋100^稀釋的檢測抗體溶液，將lOOpl稀釋的檢測抗體溶液等份加入各孔。室溫培育各平板90分鐘。然后用洗漆緩沖液洗滌各板三次(用450^洗滌緩沖液，Ultrawash96-孔平板清洗器(ThermoLifeSciences)洗滌三次)，拍干。每板再用10mlPBS/1%BSA稀釋10pl鏈霉親和素-堿性磷酸酶，向各孔加入lOOnl稀釋的鏈霉親和素，室溫培育1小時。然后用450^1洗滌緩沖液再洗漆各板三次，拍干。將100pl提供BCIP/NBT的溶液加入各孔，用箔片覆蓋各板，靜置顯影5-15分鐘。在此期間常規(guī)檢測各板上斑點(diǎn)形成來確定何時終止反應(yīng)。然后用自來水徹底洗滌各板，分析(takeapart)前搖晃，靜置于工作臺上干燥。一旦干燥，用ELISPOT讀數(shù)計(jì)(AutoimmuneDiagnotistika，德國)對各板讀數(shù)。各孔中顯示的斑點(diǎn)數(shù)目與激活的T細(xì)胞數(shù)目成正比。因此，含有可溶性高親和力c50ILT-樣多肽單體、二聚體或四聚體的孔中斑點(diǎn)數(shù)目的任何減少表明CD8共同受體介導(dǎo)的CTL激活受抑制。錄菜如圖14所示，單體和二聚體形式的高親和力c50ILT-2多肽能有效抑制CTL激活。高親和力c50ILT-樣二聚體抑制CTL激活遠(yuǎn)比相應(yīng)的單體有效。高親和力c50ILT-樣四聚體甚至更有效。(參見圖15)。從圖15所示數(shù)據(jù)計(jì)算的單體、二聚體和四聚體ILT-樣多肽抑制CTL的ICso值分別是800nM、16.2nM和0.7nM。權(quán)利要求1.一種對給定的I類pMHC具有結(jié)合特性的多肽，其特征在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1μM和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC的解離速率(koff)為2S-1或更慢，所述多肽與SEQIDNO7有至少45％相同性和/或55％相似性，并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO3。2.如權(quán)利要求l所述的多肽，其特征在于，其是一種突變的人ILT分子。3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于，采用表面等離振子共振檢測所述Kd和/或k。ff。4.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，對應(yīng)于SEQIDNO:3的氨基酸IOW、19Q、20G、21S、42K、47W、50R、661、77Y、78Y、79G、80S、81D、82T、83A、84G、85R、87E、99A、1011、102K、141E、146L、147N、1591、168S、172W、174R和188L的一個或多個氨基酸發(fā)生突變。5.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有以下一個或多個突變10W—L、19Q—M、19Q—L、19Q—V、20G—D、20G—M、20G—Q、20G—F、20G一S、20G"E、20G—R、21S—Q、21S—R、21S—A、2IS—S、42K—R、47W—Q、50R—L、66L—V、77Y—V、77Y—M、77Y—I、77Y—Q、78Y—Q、78Y—I、78Y—G、79G—Q、79G—Y、79G—W、79G—R、79G~>V、80S—R、80S—T、80S—G、81D—G、81D—Q、81D—L、81D—V、82T—G、82T—E、83A—S、83A—G、83A—R、84G—L、84G—Q、84G—A、85R~>W、87E—A、99A—I、99A—Y、1011—L、1011—K、1011—Q、101—V、102K—Q、102K—A、102K—R、141E—G、141E—D、146L—D、147N—S、1591—E、168S—G、172W—R、174R—W或188L—D。6.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有對應(yīng)于19Q—M和21S—Q的突變。7.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—D、21S—Q、99A—V和168S—G的突變。8.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有對應(yīng)于19Q—L、20G—M和21S—Q的突變。9.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—Q、21S—R、42K—R和146L一S的突變。10.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有對應(yīng)于19Q—M、20G—D、21S—Q、83A—S、84G—Q、85R—W、87E—A禾P99A—V的突變。11.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，其中對應(yīng)于135C或145C中一個或二者的氨基酸突變?yōu)镾。12.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，其所含的氨基酸至少對應(yīng)于SEQIDNO:3的氨基酸1-195。13.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQIDNO:6-9或21-61中任一條構(gòu)成或包含其中任一條。14.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQIDNo:16構(gòu)成或包含SEQIDNo:16。15.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有一個或多個突變，與缺乏所述突變的相應(yīng)多肽相比，這些突變增強(qiáng)該多肽的溶解性。16.如權(quán)利要求15所述的多肽，其特征在于，其中至少一個與溶劑接觸的疏水性氨基酸被帶電荷的氨基酸取代。17.如權(quán)利要求15或16所述的多肽，其特征在于，所述突變位于該多肽C-末端6個氨基酸內(nèi)。18.如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，對應(yīng)于SEQIDNO:3的196L和/或198L的氨基酸分別突變?yōu)?96D和198D。19.如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，采用SEQIDNO:3的編號方法，所述多肽含有對應(yīng)于19Q~>M、20G—D、21S—Q、83A—S、84G—Q、85R—W、87E—A、99A—V、196L—D和198L—D的突變。20.如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQIDNo:63-80中任一條構(gòu)成或包含其中任一條。21.如權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQIDNo:17或62構(gòu)成，或包含SEQIDNo:17或62。22.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，在所述多肽的C-末端上含有"標(biāo)簽"。23.如權(quán)利要求22所述的多肽，其特征在于，所述標(biāo)簽是半胱氨酸殘基。24.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽與至少一條聚亞垸基二醇鏈連接。25.如權(quán)利要求24所述的多肽，其特征在于，所述一條或多條聚亞垸基二醇鏈與所述多肽連接。26.如權(quán)利要求24或25所述的多肽，其特征在于，所述一條或多條聚亞垸基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復(fù)單位。27.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽與治療劑相連。28.如權(quán)利要求27所述的多肽，其特征在于，所述多肽與治療劑共價(jià)連接。29.如權(quán)利要求28所述的多肽，其特征在于，所述治療劑與所述多肽的C-末端共價(jià)連接。30.如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述治療劑是免疫效應(yīng)分子。31.如權(quán)利要求30所述的多肽，其特征在于，所述免疫效應(yīng)分子是細(xì)胞因子。32.如權(quán)利要求31所述的多肽，其特征在于，所述免疫效應(yīng)分子是IL-4、IL-10或IL-13。33.—種含有至少兩個如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述多肽的多價(jià)復(fù)合物，所述多價(jià)復(fù)合物對給定的I類pMHC的KD小于或等于1pM和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC的解離速率(k。ff)為2S—1或更慢。34.如權(quán)利要求33所述的多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，所述多肽通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列相連。35.如權(quán)利要求33所述的多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，聚合物鏈或肽接頭序列在各多肽中不位于該多肽的I類pMHC結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基之間延伸。36.如權(quán)利要求34或35所述的多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，所述多肽通過聚亞烷基二醇鏈或衍生自人多聚化結(jié)構(gòu)域的肽接頭相連。37.如權(quán)利要求36所述的多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，在所述聚亞垸基二醇鏈及其與所述復(fù)合物的多肽的連接點(diǎn)之間具有二價(jià)亞烷基間隔基團(tuán)。38.如權(quán)利要求36或37所述的多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，所述聚亞垸基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復(fù)單位。39.如權(quán)利要求33-38中任一項(xiàng)所述的多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，其是二聚體或四聚體。40.—種含有至少兩個如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述多肽的多價(jià)復(fù)合物，其中(i)至少一條所述多肽與如權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的治療劑相連。41.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽或多價(jià)復(fù)合物，其特征在于，其是可溶的。42.—種編碼如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述多肽的分離的核酸。43.如權(quán)利要求42所述分離的編碼核酸，其特征在于，其適應(yīng)于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)。44.—種摻有如權(quán)利要求42或43所述核酸的載體。45.—種呈遞至少一條如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述多肽的分離的細(xì)胞或顆粒。46.—種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述多肽，或如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述多價(jià)復(fù)合物，或如權(quán)利要求45所述多個細(xì)胞或顆粒，連同藥學(xué)上可接受的載體。47.如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的多肽，或如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述的多價(jià)復(fù)合物，或如權(quán)利要求45所述的多個細(xì)胞或顆粒在制備治療自身免疫疾病的藥物中的用途，所述藥物適于胃腸外給藥。48.如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的多肽，或如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述的多價(jià)復(fù)合物，或如權(quán)利要求45所述的多個細(xì)胞或顆粒的治療性用途。49.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述多肽，或如權(quán)利要求40所述多價(jià)復(fù)合物，連同藥學(xué)上可接受的載體。50.如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述的多肽，或如權(quán)利要求40所述的多價(jià)復(fù)合物在制備治療自身免疫疾病的藥物中的用途，所述藥物適于胃腸外給藥。51.如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述的多肽，或如權(quán)利要求40所述的多價(jià)復(fù)合物的治療性用途。52.—種治療自身免疫疾病的方法，包括給予患有這種自身免疫疾病的對象有效量的如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述多肽、或如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述多價(jià)復(fù)合物、或如權(quán)利要求45所述多個細(xì)胞或顆粒。53.如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述多肽、或如權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)所述多價(jià)復(fù)合物、或如權(quán)利要求45所述多個細(xì)胞或顆粒在制備用于治療自身免疫疾病的組合物中的用途。54.—種治療自身免疫疾病的方法，包括給予患有這種自身免疫疾病的對象有效量的如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述多肽或如權(quán)利要求40所述多價(jià)復(fù)合物。55.如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述多肽或如權(quán)利要求40所述多價(jià)復(fù)合物在制備用于治療自身免疫疾病的組合物中的用途。56.—種鑒定對給定的I類pMHC具有結(jié)合特性的給定ILT分子高親和力變體的方法，其特征在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的KD小于或等于1和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC分子的解離速率(k。ff)為2S—1或更慢，所述多肽與SEQIDNO:7有至少45%相同性和/或55%相似性，并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO:3，所述方法包括(i)制備ILT分子文庫，與相應(yīng)的野生型ILT分子相比，所述ILT分子在氨基酸序列中含有一個或多個突變；和(ii)在適合突變的ILT分子與I類pMHC靶標(biāo)結(jié)合的條件下，使所述突變的ILT分子與I類pMHC耙標(biāo)接觸；和(iii)檢測相互作用的KD和/或k。ff;和(iv)選擇具有所需結(jié)合特征的一種或多種多肽。57.—種制備如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述多肽的方法，包括(i)用如權(quán)利要求43所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和(ii)在適合表達(dá)如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述多肽的條件下，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞；禾口(iii)回收所表達(dá)的多肽。58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。59.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。60.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供對某給定的I類pMHC具有結(jié)合特性的多肽，其特征在于，所述多肽對所述給定的I類pMHC的K_D小于或等于1μM和/或?qū)λ鼋o定的I類pMHC分子的解離速率(k_off)為2S^-1或更慢，所述多肽與SEQIDNO7有至少45％相同性和/或55％相似性并且所述多肽對CD8與該給定pMHC結(jié)合的抑制程度高于多肽SEQIDNO3。這種多肽可單獨(dú)或與治療劑相連用于抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。文檔編號C07K14/735GK101268100SQ200680018069公開日2008年9月17日申請日期2006年5月19日優(yōu)先權(quán)日2005年5月25日發(fā)明者B·K·雅各布森,R·K·莫伊西,懿李申請人:麥迪金有限公司