專利名稱：10－苯基氫化異吲哚酮類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)(保藏編號是CCTCC M205049)制備10-苯基氫化異吲哚酮類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術(shù)：
10-苯基取代的氫化異吲哚酮類化合物已有一些文獻報道，該類化合物顯示了多種生物活性，如對哺乳動物細胞的生長有顯著的抑制作用，顯示HIV-1蛋白激酶抑制活性，抗菌抗腫瘤活性等。該類化合物最重要的生物活性是能夠與肌動蛋白結(jié)合從而改變其聚合反應，并且已經(jīng)成為研究肌動結(jié)合蛋白的工具藥，被稱為細胞松弛劑。
到目前為止已發(fā)現(xiàn)該類化合物80余種，該類化合物的結(jié)構(gòu)特征是均具有氫化異吲哚酮母核，而10位為苯基取代的占絕大多數(shù)，少數(shù)為苯并吲哚基，另外該類化合物結(jié)構(gòu)中C9處與C8側(cè)鏈形成不同的含氧大環(huán)，所包含的大環(huán)多為11、13和14元環(huán)。如Espada，A.Rivera-Sagredo，J.M.de la Fuente，et al.New Cytochalasins from the Fungus Xylaria hyposylon.Tetra，1997，53(18)6485-6492；Yunjiang F.，John W.B.，Anthony L.J.，et al.Three novelcytochalsins X，Y and Z from Pseudeurotium zonatum.J.Nat.Prod.2002，65，1274-1277.Yuzo F.，Hiroko T.，Masakatu I.and Hiromitsu N.，Zygosporin D and two new cytochalsinsproduced by the fungus Metarrhizium anisopliae.J.Nat.Prod.2000，63，132-135；另外也有12、15和16元環(huán)的報道，如Malcolm S.B.，Toshihiro H.，and Yoshinori A.，Cytochalasins froma Daldinia sp.of fungus.Phytochemistry，1996，41(3)821-828.Evidente，A.et al.，Tetrahedron，1992，48，6317-6324；但迄今尚未見該類化合物C9與C8側(cè)鏈為開環(huán)結(jié)構(gòu)的報道。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)(保藏編號是CCTCC M205049)液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細胞壞死活性，遂對其活性成分進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了四個新的開環(huán)的10-苯基氫化異吲哚酮類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見對該化合物的化學結(jié)構(gòu)及細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)獨特的具有細胞增殖抑制以及直接殺傷癌細胞等抗腫瘤活性的新化合物。
本發(fā)明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
本發(fā)明首次從綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的10-苯基氫化異吲哚酮類化合物，如式I、式II所示 式I 式II其結(jié)構(gòu)特征是其中式I、式II R1、R3、R4和R5為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2為氫、烴基、羥基或?；?。
本發(fā)明的式I、式II化合物優(yōu)選其中化合物1中R1R2均為氫，R3和R5為羥基，R4為甲基；化合物2中R1R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基，R5為羰基。所述的式II化合物3中R1R2均為氫，R3和R5為羥基，R4為甲基；化合物4中R1R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基，R5為羰基。
上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物是由海洋來源的綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)的液體發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-丙酮5∶5的洗脫物，再經(jīng)正相硅膠柱層析，氯仿-甲醇9∶1洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水60∶40洗脫得式I化合物1和化合物2、式II化合物3和化合物4。
本發(fā)明采用MTT法測試了化合物1，2，3，4對P388和A-549細胞株的抗腫瘤活性。實驗證實，這4個化合物對這兩種腫瘤細胞均有增殖抑制作用。
因此本發(fā)明的式I、式II化合物可用作細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑。
式I、式II化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
式I、式II化合物還可作為抑制細胞增殖的低分子生物探針用于生命科學研究，作為探針應用時，式I、式II化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應用。
本發(fā)明的式I、式II化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到；也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學修飾方法合成獲得。
需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I、式II化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為生產(chǎn)菌用于制備式I、式II化合物。
本發(fā)明的實施例中列舉了利用綺麗穗霉KLA03株制備優(yōu)選的本發(fā)明式I、式II化合物的實例。
該真菌KLA03株由從青島近海海泥樣品中分離，并經(jīng)分類學研究鑒定為綺麗穗霉Spicaria elegans。該菌株已于2005年5月26日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號CCTCC M205049)。該綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)CCTCC M205049株具有如下微生物菌學特征(見表1)表1 007菌株的微生物菌學特征

需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I、式II化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)10-苯基取代的氫化異吲哚酮類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I、式II化合物。
具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物1-4的化學結(jié)構(gòu)分別是(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯數(shù)字是化學結(jié)構(gòu)中碳原子的標位) 式I 式II式I中化合物1的R1R2均為氫，R3和R5為羥基，R4為甲基；化合物2的R1R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基，R5為羰基。式II中化合物3的R1R2均為氫，R3和R5為羥基，R4為甲基；化合物4的R1R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基，R5為羰基。
實施例1 化合物1-4的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1 發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegansKLA03)(保藏編號為CCTCC M 205049)適量，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
取斜面培養(yǎng)4天的綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)適量，接種到裝有120mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的500mL錐型瓶中，在28℃、120轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時，獲得綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)的種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按10％接種量分別接種于裝有300毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的1000mL三角燒瓶中，進行為期25天24℃的靜置生產(chǎn)發(fā)酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
2 浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共15.0克。
3 化合物的分離精制浸膏(15.0克)用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶劑溶解后，加70克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，分為30個流份。Fr-12(2克，石油醚-丙酮5∶5洗脫物)，再經(jīng)正相硅膠柱層析，氯仿-甲醇9∶1洗脫產(chǎn)物再經(jīng)HPLC，以甲醇-水6∶4洗脫得化合物1(16mg)2(11mg)3(30mg)和4(23mg)。
化合物1無色固體，mp 84～85℃，[α]D20+58.0°(c 0.08，MeOH)，分子式C25H36NO5，HRESI-MS m/z430.2596[M+H]+，計算值430.2593.UVλmaxnm in MeOH220，278.IR νmaxcm-1(KBr)3344，2966，2924，1696，1458，1374，1072，974，673，.1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表1，2。
化合物2無色固體，mp 94～95℃，[α]D20+114.8°(c 0.08，MeOH)，分子式C25H33NO5，HRESI-MS m/z428.2434[M+H]+，計算值428.2437。UVλmaxnm in MeOH220，278.1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表1，2。
化合物3無色固體，mp 134-135℃，[α]D20+43.2°(c 0.08，MeOH)，分子式C25H35NO5，HRESI-MS m/z412.2488[M-H2O+H]+，計算值412.2477。UVλmaxnm in MeOH220，278.IRνmaxcm-1(KBr)3368，2906，1688，1458，1447，1082，983，758，691.1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表1，2。
化合物4無色固體，mp 170～171℃，[α]D20+80.8°(c 0.16，MeOH)，分子式C25H33NO5，HRESI-MS m/z428.2437[M+H]+，計算值428.2399。UVλmaxnm in MeOH220，278.IR νmaxcm-1(KBr)3323，2892，1712，1454，1348，1155，976，764，698.1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表1，2。
表1 化合物1-4的1H(600MHz)

aMeasured in MeOD；bMeasured in CDCl3
表2 化合物1-4的13C NMR數(shù)據(jù)(150MHz)

aMeasured in MeOD；bMeasured in CDCl3實施例2 抗腫瘤活性的測試1 實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的純品化合物1-4。準確稱取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測試。
細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用P388和A-549細胞系。各種細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發(fā)明采用MTT法，測試評價了被測試樣品對癌細胞增殖的抑制活性?；罴毎€粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑為藍紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通過酶標儀測定其吸收度求得。由于formazan的量與活細胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細胞的數(shù)目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。
活性測試時，取對數(shù)生長期的P388和A-549細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升5×104個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，在37℃下培養(yǎng)24小時后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養(yǎng)4小時，移出150μL培養(yǎng)液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR％＝(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100％式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR％)。
2 實驗結(jié)果化合物1-4的細胞增殖抑制活性表3.化合物1-4對P388和A-549細胞的抑制率

3 結(jié)論化合物1-4對包括人在內(nèi)的哺乳動物來源的癌細胞具有抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的式I、式II化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現(xiàn)象本質(zhì)的生命科學實驗研究中。
權(quán)利要求
1.式I或式II化合物 式I 式II其中式I、式II R1、R3、R4和R5為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2為氫、烴基、羥基或?；?。
2.權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物，其中式I化合物為化合物1，其中R1R2均為氫，R3和R5為羥基，R4為甲基；或化合物2，其中R1R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基，R5為羰基；式II化合物為化合物3，其中R1R2均為氫，R3和R5為羥基，R4為甲基；或化合物4，其中R1R2均為氫，R3為羥基，R4為甲基，R5為羰基。
3.權(quán)利要求2所述式I或式II化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)，獲取含有上述式I、式II化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物1和化合物2、式II化合物3和化合物4。
4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進行梯度洗脫，石油醚-丙酮5∶5的洗脫物，再經(jīng)正相硅膠柱層析，氯仿-甲醇9∶1洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水60∶40洗脫得式I、式II化合物1，2，3，4。
5.權(quán)利要求4所述的制備方法，其中所述10-苯基氫化異吲哚酮類化合物的生產(chǎn)菌是綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)CCTCC M205049。
6.權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物在制備細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞殺傷劑中的用途。
7.權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物在制備抑制腫瘤細胞增殖藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
9.綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)，其保藏號為CCTCC M205049。
10.權(quán)利要求9所述的菌株用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及10－苯基氫化異吲哚酮類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明用從海洋樣品中分離得到的綺麗穗霉KLA03(Spicaria elegans KLA03)生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的上述類型的化合物。經(jīng)實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號C07D209/40GK1830960SQ20051007988
公開日2006年9月13日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者顧謙群, 劉睿, 朱偉明, 劉紅兵, 方玉春, 朱天驕, 范國濤 申請人:中國海洋大學