專利名稱：放線菌素d的類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的化合物，具體講是一類放線菌素D的類似物，以及這類化合物的制備方法。
背景技術(shù)：
放線菌素D(Actinomycin D，AMD，亦稱更生霉素)，是國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)藥物品種之一，在臨床廣泛用于治療多種惡性腫瘤，如小兒腎母細(xì)胞瘤(Wilm’s Tumor)、妊娠絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、何杰金氏惡性淋巴瘤(Hodgkin’s disease)等多種惡性腫瘤，有顯著的療效。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)放線菌素D有抗HIV病毒作用，并對(duì)艾滋病患者易感染的Kaposi’s腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用。
放線菌素D結(jié)構(gòu)如下式所示，分子內(nèi)含有兩個(gè)環(huán)五肽和平面結(jié)構(gòu)的吩噁嗪酮，其中環(huán)五肽中2位氨基酸(Aa2)為D型纈氨酸(D-Valine，D-Val)，5位氨基酸(Aa5)為L(zhǎng)型N甲基纈氨酸(L-MeVal)，1位、3位、4位分別是蘇氨酸(Threonine，Thr)、脯氨酸(Proline，Pro)和N甲基甘氨酸(Sarcosine，Sar)。其結(jié)構(gòu)參見下式 放線菌素D通過(guò)與DNA結(jié)合，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程從而表達(dá)一系列的生物活性，放線菌素D與DNA結(jié)合的機(jī)理是目前研究熱點(diǎn)之一，也為該類新藥設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。
但是，放線菌素D很強(qiáng)的毒性大大限制了應(yīng)用范圍，放線菌素D對(duì)增殖期細(xì)胞的毒性與非增殖細(xì)胞毒性的差別說(shuō)明其選擇性的毒性并非完全由RNA的合成被抑制而引起。藥理學(xué)研究表明放線菌素D在體內(nèi)代謝緩慢，在宿主細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生積累，也會(huì)直接導(dǎo)致累積毒性，這些都限制了該藥物的應(yīng)用范圍。
為解決放線菌D過(guò)強(qiáng)的毒性，現(xiàn)有技術(shù)中采用了多種方法對(duì)其進(jìn)行改造，例如在吩噁嗪酮8位進(jìn)行N取代(J.Am.Chem.Soc.，1994，1164154)；吩噁嗪酮7位氨基取代類似物(J.Med.Chem.，1983，26448；J.Med.Chem.，1988，311540等)；吩噁嗪酮2位氨基進(jìn)行修飾改造或引入自由基(Chem.Ber.，1967，1001051；J.Med.Chem.，1979，221051等)；環(huán)五肽2、3、4、5位氨基酸分別替換和修飾的類似物(J.Med.Chem.，1991，941297；Biochemistry，1996，3513240等)。通過(guò)這些技術(shù)措施得到的類似物中，有一些表現(xiàn)出較好的生物活性，偶爾也有一些毒性有所降低，但是作為藥物來(lái)說(shuō)，所得產(chǎn)物的毒性仍然較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一類新的經(jīng)改造的放線菌素D類似物，預(yù)期這類的化合物具有更好的藥物活性或者更低的毒性。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種前述新化合物的制備方法。
本發(fā)明的化合物參見下式 其式中的環(huán)五肽上的2位氨基酸(Aa2)為D型苯丙氨酸，或者為D型N甲基纈氨酸，或者為D型N甲基苯丙氨酸，而5位氨基酸(Aa5)為N甲基氨基酸。
更為具體的講本發(fā)明的化合物，環(huán)五肽上2位氨基酸Aa2為D型苯丙氨酸(D-Phenylalanine，D-Phe)時(shí)，5位氨基酸Aa5可以是D型N甲基纈氨酸(D-MeVal)，或者是D型N甲基苯丙氨酸(D-MePhe)，或者是L型N甲基苯丙氨酸(L-MePhe)，或者是D型N甲基亮氨酸(D-MeLeu)，或者是L型N甲基亮氨酸(L-MeLeu)，或者是D型N甲基丙氨酸(D-MeAla)，或者是L型N甲基丙氨酸(L-MeAla)，或者是L型N甲基絲氨酸(L-MeSer)，或者是L型N甲基酪氨酸(L-MeTyr)。
當(dāng)環(huán)五肽上2位氨基酸Aa2是D-MeVal時(shí)，其5位氨基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
當(dāng)環(huán)五肽上2位氨基酸Aa2是D-MePhe時(shí)，其5位氨基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
本發(fā)明的化合物的制備方法是將化合物N-芐氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯溶于甲醇中，用10％鈀碳催化氫化，脫去Z保護(hù)基后，與N-芐氧羰基-脯氨酸(Z-Pro)通過(guò)DCC法縮合得到二肽，再經(jīng)過(guò)催化氫化脫去Z保護(hù)基后，與2位氨基酸Aa2通過(guò)DCC法縮合得到三肽，再經(jīng)過(guò)催化氫化脫去Z保護(hù)基后與N-芐氧羰基-蘇氨酸(Z-Thr)用DCC/HOBt活化酯法縮合得到四肽；再將四肽與Aa5用DCC法縮合反應(yīng)得到線性五肽，再用三氟乙酸脫除五肽N端BOC和C端OtBu保護(hù)后，用三乙胺將體系調(diào)為中性，用BOP-Cl作為縮合劑在二氯甲烷DCM中反應(yīng)得到環(huán)五肽，再經(jīng)催化氫化脫除Z-Thr的Z保護(hù)基后，用DCC/HOBt活化酯法與3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酸(BMNBA)縮合，產(chǎn)物再經(jīng)催化氫化后，在磷酸緩沖液中用K3Fe(CN)6氧化得到終產(chǎn)物。
在本發(fā)明的放線菌D的類似物的制備方法中，在生成環(huán)五肽的反應(yīng)中所采用二氯甲烷與溶質(zhì)的比例為0.8～1毫升∶1毫克，反應(yīng)溫度保持在25-29℃，這樣可以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。
研究表明，放線菌素D與DNA發(fā)生作用，從而選擇性的抑制RNA的合成而表現(xiàn)出抗腫瘤活性。對(duì)放線菌素D與DNA作用過(guò)程的研究結(jié)果表明，放線菌素D吩噁嗪酮部分插入到DNA的5’-GC-3’堿基對(duì)中形成氫鍵，兩個(gè)環(huán)五肽位于DNA的小溝內(nèi)，通過(guò)疏水堆積作用與DNA小溝表面作用。環(huán)五肽中2位D-Val的側(cè)鏈異丙基指向環(huán)外側(cè)，并不與DNA作用，而當(dāng)D-Val被其它一些氨基酸如D-Phe替換后，氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)與DNA之間可通過(guò)某種相互作用(Side binding)而改變DNA結(jié)合的選擇性?；钚詫?shí)驗(yàn)表明，2位采用D-Phe替換后，對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄的抑制活性有顯著提高，而急性毒性相比母體有顯著下降。另外，α環(huán)與β環(huán)的2位D-Val之間形成了兩個(gè)環(huán)內(nèi)氫鍵，這兩個(gè)氫鍵降低了1位Thr的柔性，進(jìn)而限制了兩個(gè)環(huán)五肽的構(gòu)象。而Thr的這種柔性是與DNA的鳥嘌呤形成復(fù)合物所必需的，因此用N甲基化的氨基酸D-MeVal、D-MePhe等替換D-Val，破壞或減弱α環(huán)與β環(huán)D-Val之間的氫鍵作用，可以提高環(huán)五肽的自由度，預(yù)計(jì)能夠提高與DNA的結(jié)合作用。
環(huán)五肽5位氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的方向、體積和極性也直接影響DNA的結(jié)合選擇性，在DNA小溝中，嘌吟堿基的體積要大于嘧啶堿基，GC堿基對(duì)的親水性要大于AT堿基對(duì)，這些決定了5位氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)、側(cè)鏈基團(tuán)的構(gòu)型(L型與D型側(cè)鏈所指方向不同)、親水性還是疏水性都將決定藥物與DNA結(jié)合的選擇性。當(dāng)5位N甲基纈氨酸(L-MeVal)被D-MeVal替換后，由于側(cè)鏈基團(tuán)的朝向變化而改變了結(jié)合活性，同樣用D-MePhe替換后，D-MePhe的側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)與DNA小溝表面疏水區(qū)域更易結(jié)合而改變了與DNA的結(jié)合活性，在生物活性中表現(xiàn)出DNA轉(zhuǎn)錄的抑制活性的顯著提高，5位D-MePhe放線菌素D類似物，體外抗腫瘤活性六倍于臨床使用藥物放線菌素D母體，而毒性只有母體的五分之一。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)小鼠移植P-388淋巴瘤的抑制率達(dá)到80.0％以上，小鼠存活時(shí)間較放線菌素D母體明顯延長(zhǎng)。對(duì)移植肝腹水瘤的抑制率達(dá)到了56.6％；對(duì)RNA合成的抑制率達(dá)90.8％；K562腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)藥物處理后呈現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài)，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到63.5％。免疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)對(duì)癌基因和抑癌基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成的類似物不同程度的抑制bcl-2，Pan ras和C-erbB-2的mRNA和蛋白的表達(dá)，而抑癌基因p53的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)。
本發(fā)明所涉及的類似物在不改變類似物整體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，同時(shí)在環(huán)五肽2、5位進(jìn)行替換，改變了藥物環(huán)五肽中2位與5位氨基酸位點(diǎn)的微觀結(jié)構(gòu)2位D-Phe替換以增加與DNA之間的結(jié)合強(qiáng)度及選擇性；2位N甲基氨基酸替換以降低肽環(huán)的剛性；5位用不同種類、不同構(gòu)型的N甲基氨基酸替換以提高DNA結(jié)合的選擇性，預(yù)計(jì)能夠有效地降低毒性并提高抗腫瘤活性。本發(fā)明的類似物的初步抗腫瘤活性已證實(shí)，類似物的體外抗腫瘤活性接近或優(yōu)于AMD，如[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD對(duì)體外腫瘤細(xì)胞HL-60的抑制活性明顯優(yōu)于放線菌素D。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD的合成I取化合物N-芐氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯0.63g(2.26mmol)溶于6ml無(wú)水甲醇(MeOH)中，加入80mg10％Pd/C，加氫攪拌2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮，向殘?jiān)屑尤隯-Pro 0.535g(2.15mmol)，用干燥的二氯甲烷(DCM)溶解并冷卻到-10℃，加入0.44g(2.15mmol)DCC的二氯甲烷溶液，在-10℃反應(yīng)2小時(shí)后，室溫反應(yīng)過(guò)夜。過(guò)濾掉反應(yīng)生成的DCU，濃縮濾液，殘?jiān)苡谝宜嵋阴?EtOAc)，依次用10％檸檬酸水溶液，10％碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液，飽和氯化鈉(NaCl)水溶液洗滌，并用無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶石油醚PE2∶1)，得到無(wú)色油狀產(chǎn)物N-芐氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯
II取化合物N-芐氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯2.87g(7.63mmol)溶于50ml無(wú)水MeOH中，加入300mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮，向殘?jiān)屑尤隯-D-Phe 3.38g(11.30mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入2.34g(11.34mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應(yīng)2小時(shí)后，室溫反應(yīng)過(guò)夜。后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到無(wú)色油狀產(chǎn)物N-芐氧羰基-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；III取化合物N-芐氧羰基-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯300mg(0.57mmol)溶于10ml無(wú)水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)三肽。Z-Thr 170mg，(0.67mmol)與HOBt 102mg(0.75mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入152mg(0.74mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應(yīng)15分鐘后，室溫反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)三肽中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc)，得到白色粉末狀的N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；Ⅳ取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯561.7mg(0.90mmol)與Boc-D-MeVal 270.3mg(1.17mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入241.4mg(1.17mmol)DCC的DCM溶液，以及二甲基氨基吡啶(DMAP)55mg(0.45mmol)，室溫反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末狀N-叔丁氧羰基-D-N甲基纈氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-D-N甲基纈氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯683.7mg(0.82mmol)溶于3ml TFA中，在0℃攪拌4小時(shí)，蒸除TFA，用無(wú)水乙醚沉淀出產(chǎn)物的TFA鹽，用50ml無(wú)水DCM溶解后，于0℃加TEA調(diào)pH至7，用500ml DCM稀釋反應(yīng)體系，加入BOP-Cl 313mg(1.23mmol)，27-29℃反應(yīng)5天，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基纈氨酰內(nèi)酯；VI取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基纈氨酰內(nèi)酯30mg(0.045mmol)溶于10ml無(wú)水MeOH中，加入10mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)環(huán)五肽。BMNBA 16mg(0.055mmol)與HOBt 8.3mg(0.061mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入12mg(0.058mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應(yīng)15分鐘后，室溫避光反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)環(huán)五肽中，室溫避光反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末狀的3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基纈氨酰內(nèi)酯；VII取化合物3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基纈氨酰內(nèi)酯33mg(0.041mmol)溶于9ml無(wú)水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，避光氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濾液加至等體積的含有39.62mg(0.12mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩沖液中，空氣中攪拌反應(yīng)20分鐘，用水稀釋反應(yīng)體系，EtOAc萃取產(chǎn)物，產(chǎn)物用飽和NaHCO3溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 5∶1)，得到紅色固體[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD，[α]D20＝-43(c＝0.295，MeOH)；1H NMR(CDCl3，400M)8.66(2H，d，NH)，8.11(2H，dd，NH)，7.56(1H，d，8-H)，7.27(1H，d，7-H)，2.95(3H，s，N-CH3)，2.93(3H，s，N-CH3)，2.82(3H，s，N-CH3)，2.76(3H，s，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.24(3H，s，4-CH3)，1.26(3H，d，Thr-CH3)，1.17(3H，d，Thr-CH3)，0.95(3H，d，MeVal-CH3)，0.86(3H，d，MeVal-CH3)；ESI-MSm/z1351.4(M+H)，1373.4(M+Na+)；高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)m/z1373.6166(M+Na+)，C70H86N12O16Na，計(jì)算值1373.6182；實(shí)施例2[D-Phe2，D-MePhe5]2AMD的合成本實(shí)施例中反應(yīng)步驟I至III和合成過(guò)程與實(shí)施例1相同；IV取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯423mg(0.68mmol)與Boc-D-MeVal 264.8mg(0.95mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入195.5mg(0.95mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP82.7mg(0.68mmol)，室溫反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾掉反應(yīng)生成的DCU，濃縮濾液，殘?jiān)苡贓tOAc，依次用10％檸檬酸水溶液，10％NaHCO3溶液，飽和NaCl洗滌，并用無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯937.8mg(1.06mmol)溶于4ml TFA中，在0℃攪拌4小時(shí)，蒸除TFA，用無(wú)水乙醚沉淀出產(chǎn)物的TFA鹽，用50ml無(wú)水DCM溶解后，于0℃加TEA調(diào)pH至7，用600ml DCM稀釋反應(yīng)體系，加入BOP-Cl 404.7mg(1.59mmol)，27-29℃反應(yīng)5天，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰內(nèi)酯；VI取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰內(nèi)酯409.2mg(0.58mmol)溶于10ml無(wú)水MeOH中，加入30mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)環(huán)五肽。BMNBA 214.7mg(0.75mmol)與HOBt 101mg(0.75mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入154.2mg(0.75mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應(yīng)15分鐘后，室溫避光反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)環(huán)五肽中，室溫避光反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰內(nèi)酯；VII取化合物3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-D-N甲基苯丙氨酰內(nèi)酯247.2mg(0.29mmol)溶于10ml無(wú)水MeOH中，加入30mg 10％Pd/C，避光氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濾液加至等體積的含有279.8mg(0.85mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩沖液中，空氣中攪拌反應(yīng)20分鐘，用水稀釋反應(yīng)體系，EtOAc萃取產(chǎn)物，產(chǎn)物用飽和NaHCO3水溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 5∶1)，得到紅色固體[D-Phe2，D-MePhe5]2AMD，[α]D20＝-40°(c0.226，MeOH)；1H NMR8.71(2H，d，NH)，8.24(2H，dd，NH)，7.56(1H，d，8-H)，7.12(1H，d，7-H)，2.83(3H，s，N-CH3)，2.82(3H，s，N-CH3)，2.71(3H，s，N-CH3)，2.69(3H，s，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.24(3H，s，4-CH3)，1.30(3H，d，Thr-CH3)，1.19(3H，d，Thr-CH3)；高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)m/z1447.6344(MH+)，C78H87N12O16，計(jì)算值1447.6363。
實(shí)施例3[D-MeVal2]2AMD的合成本實(shí)施例中反應(yīng)步驟I和合成過(guò)程與實(shí)施例1相同；II取化合物N-芐氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯1.90g(5.05mmol)溶于25ml無(wú)水MeOH中，加入212mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮，向殘?jiān)屑尤隯-D-MeVal 1.47g(5.56mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入1.15g(5.56mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應(yīng)2小時(shí)后，室溫反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾掉反應(yīng)生成的DCU，濃縮濾液，殘?jiān)苡贓tOAc，依次用10％檸檬酸水溶液，10％NaHCO3溶液，飽和NaCl洗滌，并用無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到無(wú)色油狀產(chǎn)物N-芐氧羰基-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；III取化合物N-芐氧羰基-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯3.80g(7.77mmol)溶于50ml無(wú)水MeOH中，加入310mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)三肽。Z-Thr 2.16g(8.53mmol)與HOBt 1.21g(8.97mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入1.85g(8.96mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應(yīng)15分鐘后，室溫反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)三肽中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc)，得到白色粉末N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；IV取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯182.9mg(0.31mmol)與Boc-L-MeVal 78.5mg(0.34mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入66.0mg(0.32mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP 18.9mg(0.15mmol)，室溫反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯176.7mg(0.22mmol)溶于3ml TFA中，在0℃攪拌4小時(shí)，蒸除TFA，用無(wú)水乙醚沉淀出產(chǎn)物的TFA鹽，用50ml無(wú)水DCM中溶解后，于0℃加TEA調(diào)pH至7，用200ml DCM稀釋反應(yīng)體系，加入BOP-Cl 112.0mg(0.44mmol)，25-29℃反應(yīng)5天，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 10∶1)，得到白色粉末N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯；VI取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯25.2mg(0.04mmol)溶于5ml無(wú)水MeOH中，加入5mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)環(huán)五肽。BMNBA 12mg(0.044mmol)與HOBt 7.0mg(0.051mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入9.5mg(0.046mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應(yīng)15分鐘后，室溫避光反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)環(huán)五肽中，室溫避光反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯；VII取化合物3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-N甲基纈氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯15mg(0.02mmol)溶于6ml無(wú)水MeOH中，加入15mg 10％Pd/C，避光氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濾液加至等體積的含有20mg(0.06mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩沖液中，空氣中攪拌反應(yīng)20分鐘，用水稀釋反應(yīng)體系，EtOAc萃取產(chǎn)物，產(chǎn)物用飽和NaHCO3水溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到紅色固體[D-MeVal2]2AMD，[α]D20＝-244°(c0.5，MeOH)；1H NMR6.35(1H，d，8-H)，6.20(1H，d，7-H)，2.95(6H，d，N-CH3)，2.85(6H，d，N-CH3)，2.62(6H，d，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.30(3H，s，4-CH3)，1.25(6H，m，Thr-CH3)，0.64-0.92(24H，m，Val-CH3)；高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)m/z1283.6665(MH+)，C64H91N12O16，計(jì)算值1283.6676。
實(shí)施例4[D-MePhe2]2AMD的合成本實(shí)施例中反應(yīng)步驟I和合成過(guò)程與實(shí)施例1相同；II取化合物N-芐氧羰基-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯1.01g(2.69mmol)溶于20ml無(wú)水MeOH中，加入100mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮，向殘?jiān)屑尤隯-D-MePhe1.17g(3.73mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入0.77g(3.73mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應(yīng)2小時(shí)后，室溫反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾掉反應(yīng)生成的DCU，濃縮濾液，殘?jiān)苡贓tOAc，依次用10％檸檬酸水溶液，10％NaHCO3溶液，飽和NaCl洗滌，并用無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色固體產(chǎn)物N-芐氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；III取化合物N-芐氧羰基-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯932.3mg(1.74mmol)溶于30ml無(wú)水MeOH中，加入70mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)三肽。Z-Thr 658.9mg(2.60mmol)與HOBt 351.6mg(2.60mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入536.5mg(2.60mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應(yīng)15分鐘后，室溫反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)三肽中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc)，得到白色粉末N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；IV取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯636.7mg(1.00mmol)與Boc-L-MeVal 343.5mg(1.49mmol)，用干燥的DCM溶解并冷卻到-10℃，加入306.3mg(1.48mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP72.6mg，(0.60mmol)，室溫反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨酰-N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酸叔丁酯151.2mg(0.18mmol)溶于2ml TFA中，在0℃攪拌4小時(shí)，蒸除TFA，用無(wú)水乙醚沉淀出產(chǎn)物的TFA鹽，用30ml無(wú)水DCM中溶解后，于0℃加TEA調(diào)pH至7，用200ml DCM稀釋反應(yīng)體系，加入BOP-Cl 67.9mg(0.27mmol)，25-29℃反應(yīng)5天，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 10∶1)，得到白色粉末N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯；VI取化合物N-芐氧羰基-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯80.3mg(0.12mmol)溶于10ml無(wú)水MeOH中，加入10mg 10％Pd/C，氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濃縮得到脫保護(hù)環(huán)五肽。BMNBA 51.0mg，(0.18mmol)與HOBt 24.0mg(0.18mmol)溶于DCM中，并加入少量DMF至HOBt溶解，將反應(yīng)液冷卻到-10℃，加入36.7mg(0.18mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應(yīng)15分鐘后，室溫避光反應(yīng)一小時(shí)，將反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入脫保護(hù)環(huán)五肽中，室溫避光反應(yīng)過(guò)夜，后處理過(guò)程同上，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯；VII取化合物3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酰-蘇氨酰-D-N甲基苯丙氨酰-脯氨酰-N甲基甘氨酰-N甲基纈氨酰內(nèi)酯46.2mg(0.057mmol)溶于8ml無(wú)水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，避光氫化2小時(shí)后過(guò)濾，濾液加至等體積的含有54.5mg(0.17mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩沖液中，空氣中攪拌反應(yīng)20分鐘，用水稀釋反應(yīng)體系，EtOAc萃取產(chǎn)物，產(chǎn)物用飽和NaHCO3水溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(EtOAc∶MeOH 5∶1)，得到紅色固體[D-MePhe2]2AMD，1H NMR7.54(1H，d，8-H)，7.72(1H，d，7-H)，7.26(10H，s，Phe-ArH)，3.09(6H，d，N-CH3)，3.00(6H，d，N-CH3)，2.80(6H，d，N-CH3)，2.56(3H，s，6-CH3)，2.27(3H，s，4-CH3)，1.25(6H，d，Thr-CH3)，0.88-0.99(12H，m，Val-CH3)；質(zhì)譜(ESI-MS)m/z1379.6549(MH+)，C72H91N12O16，計(jì)算值1379.6676。
本發(fā)明的其他類似物的全合成過(guò)程與以上實(shí)施例相同并能得到類似的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.如下式的放線菌素D的類似物， 其特征是環(huán)五肽上的2位氨基酸Aa2為D型苯丙氨酸，或者為D型N甲基纈氨酸，或者為D型N甲基苯丙氨酸，而5位氨基酸Aa5為N甲基氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的放線菌D的類似物，其特征在于環(huán)五肽上的2位氨基酸Aa2為D型苯丙氨酸(D-Phe)，而5位氨基酸Aa5可以是D型N甲基纈氨酸(D-MeVal)，或者是D型N甲基苯丙氨酸(D-MePhe)，或者是L型N甲基苯丙氨酸(L-MePhe)，或者是D型N甲基亮氨酸(D-MeLeu)，或者是L型N甲基亮氨酸(L-MeLeu)，或者是D型N甲基丙氨酸(D-MeAla)，或者是L型N甲基丙氨酸(L-MeAla)，或者是L型N甲基絲氨酸(L-MeSer)，或者是L型N甲基酪氨酸(L-MeTyr)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的放線菌D的類似物，其特征在于環(huán)五肽上的2位的氨基酸Aa2為D-MeVal，而5位氨基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的放線菌D的類似物，其特征在于環(huán)五肽上的2位的氨基酸Aa2是D-MePhe，5位的氨基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
5.放線菌素D的類似物的制備方法，其特征是將化合物N-芐氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯溶于甲醇中，用10％鈀碳催化氫化，脫去Z保護(hù)基后，與N-芐氧羰基-脯氨酸(Z-Pro)通過(guò)DCC縮合得到二肽，再經(jīng)過(guò)催化氫化脫去Z保護(hù)基后，與2位氨基酸Aa2通過(guò)DCC縮合得到三肽，再經(jīng)過(guò)催化氫化脫去Z保護(hù)基后與N-芐氧羰基-蘇氨酸(Z-Thr)用DCC/HOBt活化酯法縮合得到四肽；再將四肽與Aa5用DCC縮合，并用DMAP催化反應(yīng)得到線性五肽，再用三氟乙酸脫除五肽N端BOC和C端OtBu保護(hù)后，用三乙胺將體系調(diào)為中性，用BOP-Cl作為縮合劑在二氯甲烷(DCM)中反應(yīng)得到環(huán)五肽，再經(jīng)催化氫化脫除Z-Thr的Z保護(hù)基后，用DCC/HOBt活化酯法與3-芐氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酸(BMNBA)縮合，產(chǎn)物再經(jīng)催化氫化后，在磷酸緩沖液中用K3Fe(CN)6氧化得到終產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的放線菌D的類似物的制備方法，其特征在于生成環(huán)五肽的反應(yīng)中所采用二氯甲烷與溶質(zhì)的比例為0.8～1毫升∶1毫克，反應(yīng)溫度保持在25-29℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類新的化合物，具體講是一類放線菌素D的類似物，以及這類化合物的制備方法。本發(fā)明的化合物參見前式。
文檔編號(hào)C07K7/64GK1563080SQ20041002609
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者王銳, 張邦治, 倪京滿 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)