專利名稱：優(yōu)化的Fc變體及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的優(yōu)化的Fc變體，產(chǎn)生它們的工程改造(engineering)方法，以及它們的應(yīng)用，具體而言用于治療目的。
背景技術(shù)：
抗體是結(jié)合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠的大多數(shù)哺乳動物中，抗體由配對的多肽重鏈和多肽輕鏈構(gòu)成。每條鏈由分離的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域組成，因此上述蛋白通稱免疫球蛋白。每條鏈由兩個不同的區(qū)組成，稱為可變區(qū)及恒定區(qū)。在抗體間輕鏈和重鏈可變區(qū)顯示了明顯的序列多樣性，并負責結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示了較少的序列多樣性，并負責結(jié)合許多天然蛋白以引發(fā)重要的生化反應(yīng)。在人類中有五種不同類型的抗體，包括IgA(其包括亞類IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。盡管在V區(qū)可能存在微小的差異，但是在這些類型的抗體間區(qū)別特征是它們的恒定區(qū)。

圖1顯示了IgG1抗體，在此用于舉例說明免疫球蛋白的大致結(jié)構(gòu)特征，IgG抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由四個相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，從N-末端到C-末端依次為VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分別稱為重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)γ1結(jié)構(gòu)域、恒定區(qū)γ2結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)γ3結(jié)構(gòu)域。IgG輕鏈由兩個相連的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，從N-末端到C-末端依次為VL-CL，分別稱為輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?？贵w的可變區(qū)含有該分子的抗原結(jié)合決定基，并因此決定了抗體對其靶抗原的特異性。因為其與同一類型中其它抗體序列差別最明顯，所以命名為可變區(qū)。大多數(shù)序列可變性存在于互補決定區(qū)(CDRs)?？偣灿?個CDRs，每條重鏈和輕鏈各有3個，命名為VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3。在CDRs外的可變區(qū)稱為骨架(FR)區(qū)。盡管不像CDRs一樣變化眾多，但是在不同抗體間FR區(qū)存在序列可變性。總的來說，抗體的結(jié)構(gòu)特征提供了穩(wěn)定的支架(FR區(qū))，在其上真正的抗原結(jié)合多樣性(CDRs)能得到暴露，通過免疫系統(tǒng)以獲得對廣泛抗原的特異性?？色@得來自多種不同生物體可變區(qū)片段的許多高分辨率結(jié)構(gòu)，一些可變區(qū)是非結(jié)合狀態(tài)的，一些與抗原形成復(fù)合物?？贵w可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特征得到充分鑒定(Morea等.，1997，Biophys Chem 689-16；Morea等.，2000，Methods 20267-279)，抗體的保守特征已用于發(fā)展許多抗體工程技術(shù)(Maynard等.，2000，Annu Rev Biomed Eng 2339-376)。例如，可將來自一種抗體，如鼠抗體的CDRs移植入另一種抗體的骨架區(qū)，如人抗體。在本領(lǐng)域稱為“人源化”的該過程能從非人抗體中能產(chǎn)生具更低免疫原性的抗體治療劑。存在著包含可變區(qū)的片段，其缺少抗體其它區(qū)域，包括諸如包含VH-Cγ1和VH-GL的抗原結(jié)合片段(Fab)、包含VH和VL的可變區(qū)片段(Fv)、包含在同一鏈中連接在一起的VH和VL的單鏈可變區(qū)片段(scFv)以及多種其它可變區(qū)片段(Little等.，2000，Immunol Today 21364-370)?？贵w的Fc區(qū)與許多Fc受體及配體相互作用，行使一系列重要的功能，稱為效應(yīng)器功能。如圖1所示，IgG Fc區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域Cγ2、Cγ3和進入Cγ2的N-末端鉸鏈。對于IgG類而言，一類重要的Fc受體家族是Fcγ受體(FcγRs)。這些受體介導(dǎo)抗體與免疫系統(tǒng)的細胞臂之間的識別(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12181-220；Ravetch等.，2001，Annu Rev Immunol 19275-290)。在人類中，該蛋白質(zhì)家族包含F(xiàn)cγRI(CD64)，包括同種型(isoform)FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同種型FcγRIIa(包含同種異型(allotype)H131和R131)、FcγRIIb(包含F(xiàn)cγRIIb-1和FcγRIIb-2)以及FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同種型FcγRIIIa(包含同種異型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同種異型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等，2002，Immunol Lett 8257-65)。這些受體通常具有介導(dǎo)與Fc結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和可介導(dǎo)某些細胞內(nèi)信號事件的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受體在不同的免疫細胞中表達，包括單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、朗罕氏細胞，自然殺傷(NK)細胞以及γγT細胞。Fc/FcγR復(fù)合物的形成招募這些效應(yīng)細胞至結(jié)合抗原的位點，通常導(dǎo)致細胞內(nèi)信號事件以及隨后重要的免疫應(yīng)答發(fā)生，諸如釋放炎癥介質(zhì)、B細胞活化、細胞內(nèi)吞作用、吞噬作用及細胞毒性攻擊。介導(dǎo)細胞毒性和吞噬細胞效應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細胞的一種可能機制。在細胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達FcγRs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致靶細胞溶胞作用，稱為抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)(antibody dependentcell-mediated cytotoxicity)(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12181-220；Ghetie等.，2000，Annu Rev Immunol 18739-766；Ravetch等.，2001，Annu Rev Immunol 19275-290)。在細胞介導(dǎo)反應(yīng)中表達FcγRs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致對靶細胞的吞噬作用，稱為抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞吞噬作用(ADCP)(antibody dependentcell-mediated phagocytosis)。已解出人FcγRs的胞外結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu)，包括FcγRIIa(pdb登記號1H9V)(Sondermann等.，2001，J Mol Biol 309737-749)(pdb登記號1FCG)(Maxwell等.，1999，Nat Struct Biol 6437-442)，F(xiàn)cγRIIb(pdb登記號2FCB)(Sondermann等.，1999，Embo J 181095-1103)；以及FcγRIIIb(pdb登記號1E4J)(Sondermann等.，2000，Nature 406267-273.)。所有FcγRs結(jié)合Fc上相同區(qū)域，位于Cγ2結(jié)構(gòu)域的N-末端和前述鉸鏈區(qū)，如圖2所示。該相互作用可很容易地通過結(jié)構(gòu)來鑒定(Sondermann等.，2001，J Mol Biol 309737-749)，并已解出與人FcγRIIIb胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fc的數(shù)種結(jié)構(gòu)(pdb登記號1E4K)(Sondermann等.，2000，Nature 406267-273.)(pdb登記號1IIS和1IIX)(Radaev等.，2001，J Biol Chem 27616469-16477)，也解出人IgE Fc/Fc□RI□復(fù)合物結(jié)構(gòu)(pdb登記號1F6A)(Garman等.，2000，Nature 406259-266)。不同IgG亞類對FcγRs具有不同親和力，IgG1和IgG3一般較IgG2和IgG4能更充分地與受體結(jié)合(Jefferis等.，2002，Immunol Lett 8257-65)。所有FcγRs結(jié)合IgG Fc上相同的區(qū)域，亦具有不同的親和力高親和力受體FcγRI對IgG具有10-8M-1的Kd，反之低親和力受體FcγRII和FcγRIII通常分別以10-6和10-5M-1的Kd結(jié)合。FcγRIIIa與FcγRIIIb胞外結(jié)構(gòu)域具有96％同一性，但是FcγRIIIb沒有胞內(nèi)信號域。此外，盡管FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫復(fù)合物觸發(fā)激活作用的正調(diào)節(jié)物，通過具有含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域而得到鑒定，但是FcγRIIb含有免疫受體酪氨酸抑制基序列(ITIM)并因此而具有抑制性。因此，前者稱為激活性受體而FcγRIIb稱為抑制性受體。在不同的免疫細胞中受體也具有不同的表達譜和表達水平。然而，在人蛋白質(zhì)組中另一種復(fù)雜性水平是存在著許多FcγR多態(tài)性。與臨床意義特別相關(guān)的多態(tài)性是V158/F158 FcγRIIIa。人IgG1與V158同種異型的結(jié)合較與F158同種異型的結(jié)合具更高親和力。不同親和力以及推測其對ADCC和/或ADCP的影響已顯示了是抗-CD20抗體利妥昔單抗(Rituxan_，IDEC Pharmaceuticals Corporation的注冊商標)功效的重要決定因素。具有V158同種異型的患者對利妥昔單抗治療響應(yīng)良好；然而，具有低親和力F158同種異型的患者響應(yīng)不良(Cartron等，2002，Blood 99754-758)。大約10-20％的人是V158/V158純合子，45％是V158/F158雜合子，以及35-45％的人是F158/F158純合子(Lehrnbecher等.，1999，Blood 944220-4232；Cartron等.，2002，Blood 99754-758)。因此80-90％的人是不良應(yīng)答者，它們具有至少一個F158 FcγRIIIa等位基因。圖1顯示了Fc上重疊但分離的位點，其作為與補體蛋白C1q作用的界面。同樣地，F(xiàn)c/FcγR結(jié)合介導(dǎo)了ADCC，F(xiàn)c/C1q結(jié)合介導(dǎo)了補體依賴性細胞毒作用(CDC)。C1q與絲氨酸蛋白酶C1r形成復(fù)合物，再與C1s形成C1復(fù)合物。雖然C1q與兩種IgGs的結(jié)合就足以激活補體級聯(lián)，但是其能結(jié)合6種抗體。類似于Fc與FcγRs的相互作用，不同IgG亞類對C1q具有不同親和力，IgG1和IgG3一般較IgG2和IgG4能更充分地與FcγRs結(jié)合(Jefferis等.，2002，Immunol Lett 8257-65)。當前沒有獲得Fc/C1q復(fù)合物結(jié)構(gòu)；但是，誘變研究已將人IgG上與C1q的結(jié)合位點定位于包含殘基D270、K322、K326、P329和P331，以及E333的區(qū)域(Idusogie等.，2000，J Immunol1644178-4184；Idusogie等，2001，J Immunol 1662571-2575)。圖1顯示了Fc上Cγ2和Cγ3結(jié)構(gòu)域之間的位點，其介導(dǎo)與新生受體FcRn的相互作用，它們的結(jié)合使胞吞的抗體從內(nèi)涵體再循環(huán)回血液中(Raghavan等.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12181-220；Ghetie等.，2000，Annu Rev Immunol 18739-766)。該過程結(jié)合基于較大尺寸的全長分子不被腎濾過，產(chǎn)生了有利的抗體血清半衰期，該半衰期變化范圍從一周到三周。在抗體轉(zhuǎn)運中Fc與FcRn的結(jié)合也扮演著關(guān)鍵角色。Fc上結(jié)合FcRn的結(jié)合位點也是細菌蛋白A和G的結(jié)合位點。通過在蛋白純化過程中使用蛋白A或蛋白G親和層析，這些蛋白質(zhì)的牢固結(jié)合通常用作為純化抗體的手段。因此，對于抗體的臨床性能及其純化而言，F(xiàn)c上該區(qū)域的保真度具有重要作用。已獲得的大鼠Fc/FcRn復(fù)合物結(jié)構(gòu)(Martin等.，2001，Mol Cell 7867-877)，以及Fc與蛋白A和G的復(fù)合物結(jié)構(gòu)(Deisenhofer，1981，Biochemistry 202361-2370；Sauer-Eriksson等.，1995，Structure 3265-278；Tashiro等.，1995，Curr Opin Struct Biol 5471-481)提供了對Fc與這些蛋白相互作用的了解。在Fc區(qū)起關(guān)鍵作用的是存在于N297的保守的N-糖基化，如圖1所示。對于抗體而言，該糖，或有時稱為寡糖的，扮演著關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能角色，并且是使用哺乳動物表達系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的主要原因之一。雖然不應(yīng)限制于一種理論，但據(jù)信該糖結(jié)構(gòu)上的用途可穩(wěn)定或增溶Fc，決定Cγ3與Cγ2結(jié)構(gòu)域間特定角度或柔性程度，阻止兩個Cγ2結(jié)構(gòu)域橫越中心軸的相互聚集，或這些的組合。Fc與FcγR以及C1q的有效結(jié)合需要這種修飾，N297糖組成的改變或消除影響這些蛋白的結(jié)合(Umana等.，1999，NatBiotechnol 17176-180；Davies等.，2001，Biotechnol Bioeng 74288-294；Mimura等，2001，J Biol Chem 27645539-45547.；Radaev等.，2001，J BiolChem 27616478-16483；Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Shields等.，2002，J Biol Chem 27726733-26740；Simmons等.，2002，JImmunol Methods 263133-147)。然而，即使與FcγRs有任何特異性接觸，該糖的參與也少(Radaev等.，2001，J Biol Chem 27616469-16477)，表明在介導(dǎo)Fc/FcγR結(jié)合中N297糖的功能角色可能是通過在決定Fc構(gòu)象中其所扮演的結(jié)構(gòu)角色來實現(xiàn)的。該結(jié)論通過所收集到的四個不同F(xiàn)c糖型的晶體結(jié)構(gòu)而得到支持，這些結(jié)構(gòu)顯示了寡糖影響了Cγ2構(gòu)象并因此影響Fc/FcγR界面(Krapp等.，2003，J Mol Biol 325979-989)。上述所討論的抗體特征—特異于靶，能介導(dǎo)免疫效應(yīng)機制及在血清中的長半衰期—使得抗體可有效地用于治療。單克隆抗體可用于治療多種疾病，包括癌癥、炎癥和心血管病。目前已有超過10種抗體產(chǎn)品上市，并有數(shù)百種產(chǎn)品正在開發(fā)中。除抗體外，在研究和治療中發(fā)現(xiàn)Fc融合體這類抗體樣蛋白用途廣泛(Chamow等.，1996，Trends Biotechnol 1452-60；Ashkenazi等，1997，Curr Opin Immunol 9195-200)。Fc融合體是一種蛋白質(zhì)，其中一個或多個多肽可操作地連接Fc。Fc融合體使抗體的Fc區(qū)與受體的靶結(jié)合區(qū)、配體或一些其它蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并因此有利于其效應(yīng)器功能和藥物代謝動力學。后者的角色是用于介導(dǎo)靶識別，并因而在功能上與抗體可變區(qū)相似。因為Fc融合體與抗體在結(jié)構(gòu)和功能上重疊，所以在本發(fā)明中對于抗體的討論可直接擴展至Fc融合體。盡管具有這樣廣泛的用途，對于臨床使用而言，抗體并不是優(yōu)化的?？贵w的兩個主要缺點是它們并不理想的抗癌效力和它們過分苛求的生產(chǎn)必備條件。本發(fā)明解決了這些缺陷。存在許多可能的抗體破壞腫瘤細胞機制，包括通過阻斷必需的生長途徑以抗增殖、導(dǎo)致細胞凋亡的胞內(nèi)信號、增強的下調(diào)作用和/或受體的轉(zhuǎn)換(turnover)、CDC、ADCC、ADCP以及啟動獲得性免疫應(yīng)答(adaptiveimmune response)(Cragg等.，1999，Curr Opin Immunol 11541-547；Glennie等.，2000，Immunol Today 21403-410)。抗腫瘤效力可基于這些機制的組合，而且在臨床治療中它們各自的重要性依腫瘤的不同而不同。盡管是抗腫瘤武器的兵工廠，但是抗體作為抗癌劑的效果卻并不令人滿意，具體而言是它們的高成本?；颊吣[瘤響應(yīng)數(shù)據(jù)顯示了相對于常規(guī)的單一試劑細胞毒素化學療法而言，在治療成功率上單克隆抗體僅提供了很少的改善。舉例來說，在全部復(fù)發(fā)的低度非霍奇金淋巴瘤患者中只有一半對抗-CD20抗體利妥昔單抗響應(yīng)(McLaughlin等.，1998，J Clin Oncol 162825-2833)。在166個臨床患者中，6％顯示了完全響應(yīng)，42％顯示了部分響應(yīng)，中值響應(yīng)持續(xù)時間大約為12個月。曲妥單抗(Herceptin_，Genentech的注冊商標)，一種用于治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的抗-HER2/neu抗體，具有較低的療效。對222個受試患者使用曲妥單抗的總響應(yīng)率僅有15％，其中8個完全響應(yīng)，26個部分響應(yīng)，中值響應(yīng)持續(xù)時間和存活時間為9-13個月(Cobleigh等.，1999，J Clin Oncol 172639-2648)。目前對于抗癌治療而言，在死亡率上任何小的改善都意味著成功。因此，特別需要增強抗體破壞靶癌細胞的能力。一種用于增強抗體抗腫瘤效力的有希望的方法是通過增加它們介導(dǎo)諸如ADCC、ADCP和CDC的細胞毒性效應(yīng)器功能的能力。對于抗體抗癌活性而言，F(xiàn)cγR-介導(dǎo)的效應(yīng)器功能的重要性已在小鼠中得到證實(Clynes等.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95652-656；Clynes等.，2000，NatMed 6443-446)，并在基于細胞的測定中證實了與靶細胞毒性相關(guān)的Fc與特定FcγRs之間相互作用的親和力(Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Presta等.，2002，Biochem Soc Trans 30487-490；Shields等.，2002，J Biol Chem 27726733-26740)。此外，已觀察到人臨床療效與它們的同種異型-FcγRIIIa的高親和力多態(tài)型(V158)或低親和力多態(tài)型(F158)之間的相互關(guān)系(Cartron等.，2002，Blood 99754-758)。綜合起來，這些數(shù)據(jù)暗示了對于與特定FcγRs結(jié)合而言，在患者體內(nèi)具有Fc區(qū)優(yōu)化的抗體能更好地介導(dǎo)效應(yīng)器功能并因此能更有效地破壞癌細胞。在激活與抑制受體之間的平衡要得到重點考慮，并應(yīng)由Fc產(chǎn)生最佳的效應(yīng)器功能，對諸如FcγRI、FcγRIIa/c以及FcγRIIIa的激活受體而言應(yīng)具有增強的親和力，還應(yīng)減少對抑制性受體FcγRIIb的親和力。此外，因為FcγRs能介導(dǎo)抗原攝入和通過抗原呈遞細胞的加工過程，所以增強Fc/FcγR親和力也能改善抗體治療能力以引發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。具有不同目的的誘變研究已用于Fc，通常對丙氨酸進行取代(稱為丙氨酸掃描)或通過序列同源性取代指導(dǎo)操作(Duncan等.，1988，Nature332563-564；Lund等.，1991，J Immunol 1472657-2662；Lund等.，1992，Mol Immunol 2953-59；Jefferis等，1995，Immunol Lett 44111-117；Lund等.，1995，F(xiàn)aseb J 9115-119；Jefferis等.，1996，Immunol Lett 54101-104；Lund等，1996，J Immunol 1574963-4969；Armour等，1999，Eur J Immunol 292613-2624；Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Jefferis等.，2002，Immunol Lett 8257-65)(US 5,624,821；US 5,885,573；PCT WO 00/42072；PCTWO 99/58572)。大多數(shù)取代減少或消除了與FcγRs的結(jié)合。另一方面，在獲得具有更高FcγR親和力的Fc變體方面已取得了一些成功(參見例如US5,624,821和PCT WO 00/42072)。例如，Winter及其同事在小鼠IgG2b抗體的235位上用人氨基酸進行取代(谷氨酸到亮氨酸突變)，該小鼠抗體與人FcγRI的結(jié)合增加了100倍(Duncan等.，1988，Nature 332563-564)(US5,624,821)。Shields等使用丙氨酸掃描誘變來定位對FcγR結(jié)合起重要作用的Fc殘基，然后通過用非丙氨酸突變對所選定的殘基進行取代(Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604；Presta等.，2002，Biochem Soc Trans 30487-490)(PCT WO 00/42072)。該研究公開了一些突變，包括S298A、E333A和K334A，顯示了與激活受體FcγRIIIa增強的結(jié)合以及減少了與抑制性受體FcγRIIb的結(jié)合。組合這些突變以獲得雙重和三重突變的變體，在結(jié)合方面其顯示了累加的改善。在該研究中所公開的最好的變體是S298A/E333A/K334A三重突變體，其與F158 FcγRIIIa的結(jié)合大約增加了1.7倍，與FcγRIIb的結(jié)合減少了5倍，且ADCC增加了2.1倍。使用工程改造后的糖型(engineered glycoform)也已實現(xiàn)了Fc對FcγR增強的親和力，該糖型產(chǎn)生自工程改造的或變異的細胞系中抗體的表達(Umana等.，1999，Nat Biotechnol 17176-180；Davies等，2001，BiotechnolBioeng 74288-294；Shields等.，2002，J Biol Chem 27726733-26740；Shinkawa等.，2003，J Biol Chem 2783466-3473)。該方法產(chǎn)生了實質(zhì)上增加的抗體與FcγRIIIa結(jié)合并介導(dǎo)ADCC的能力。盡管在實踐中存在諸如在大規(guī)模生產(chǎn)條件下表達菌株生長效率的局限性，用于增強Fc/FcγR親和力以及效應(yīng)器功能的該方法仍然是有前途的。實際上，對于優(yōu)化效應(yīng)器功能來說，將這些可選的糖型技術(shù)與本發(fā)明的Fc變體結(jié)合可提供累加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)。盡管需要更強的效應(yīng)器功能，對于某些抗體治療劑而言，減少或消除效應(yīng)器功能也許是其所需的。通常認為治療性抗體其作用機理包括阻斷或拮抗但不殺死具有靶抗原的細胞。這樣的話耗盡靶細胞并不是所需的并認為存在著副作用。例如，抗CD4抗體阻斷T細胞上CD4受體的能力使其能有效地抗炎，甚至它們招募FcγR受體的能力也可指導(dǎo)免疫系統(tǒng)攻擊靶細胞，導(dǎo)致T細胞損耗(Reddy等.，2000，J Immunol 1641925-1933)。對于稱為放射綴合物的放射標記的抗體以及稱為免疫毒素的綴合毒素的抗體而言，效應(yīng)器功能也許是一道難題。這些藥物可用于破壞癌細胞，但是通過Fc與FcγR相互作用所招募的免疫細胞使得健康的免疫細胞接近致死性的負載物(放射物或毒素)，導(dǎo)致正常淋巴組織連同靶癌細胞一起損耗(Hutchins等.，1995，Proc Natl Acad Sci USA 9211980-11984；White等.，2001，AnnuRev Med 52125-145)。通過使用IgG同種型有可能解決該問題，該IgG同種型無法充分地招募補體或效應(yīng)細胞，例如IgG2及IgG4。可選的解決方案是開發(fā)能減少或消除結(jié)合能力的Fc變體(Alegre等.，1994，Transplantation571537-1543；Hutchins等.，1995，Proc Natl Acad Sci USA 9211980-11984；Armour等.，1999，Eur J Immunol 292613-2624；Reddy等.，2000，JImmunol 1641925-1933；Xu等.，2000，Cell Immunol 20016-26；Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604)(US 6,194,551；US 5,885,573；PCT WO99/58572)。對于減少或消除效應(yīng)器功能而言，主要的考慮是其它重要的抗體特性不被干擾。應(yīng)改造Fc變體，以不僅消除與FcγRs和/或C1q的結(jié)合，而且還能保持抗體的穩(wěn)定性、可溶性和結(jié)構(gòu)的整體性(integrity)，以及能保持與諸如FcRn和蛋白A及G的其它重要Fc配體相互作用的能力。本發(fā)明解決了抗體的另一個主要缺點，即它們過分苛求的生產(chǎn)必備條件(Garber，2001，Nat Biotechnol 19184-185；Dove，2002，Nat Biotechnol20777-779)?？贵w應(yīng)當在哺乳動物細胞中表達，且目前市售抗體與其它高度需求的生物治療藥物基本上耗盡了所有可用的制造能力。有數(shù)百種生物制劑正在開發(fā)中，其中大多數(shù)是抗體，迫切需要更有效及更便宜的生產(chǎn)方法。不足的抗體制造能力具有三方面的下游效應(yīng)。首先，對于生產(chǎn)者而言顯著增加了產(chǎn)品成本，即傳遞給患者的成本。其次，其阻礙了批準的抗體產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)，限制了患者高度需求的治療劑的可用性。最后，因為臨床試驗需要大量還無利可圖的蛋白質(zhì)，所以不足的供給阻止了抗體市場化的成長過程。已研究用于嘗試解決該問題的可選的生產(chǎn)方法。正尋求將轉(zhuǎn)基因植物和動物作為可能的更便宜及更高產(chǎn)的系統(tǒng)(Chadd等.，2001，Curr OpinBiotechnol 12188-194)。然而，該表達系統(tǒng)可產(chǎn)生明顯不同于人糖蛋白的糖基化型(glycosylation patterns)。其可導(dǎo)致效應(yīng)器功能減少或甚至缺失，因為如上所討論，該糖結(jié)構(gòu)能顯著地影響FcγR和補體的結(jié)合。非人糖型潛在的巨大問題可能是免疫原性；對于免疫系統(tǒng)來說，糖是抗原性的關(guān)鍵來源，并且非人糖型的存在具有相當大的引發(fā)抗體中和治療的機率，或更嚴重地引起有害的免疫反應(yīng)。因此，通過轉(zhuǎn)基因植物和動物生產(chǎn)的抗體的療效和安全性仍無法確定。細菌表達是另一種引人注目的解決抗體生產(chǎn)難題的方案。在諸如大腸桿菌的細菌中表達提供了一種用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的節(jié)省成本和高效的方法。對于諸如抗體等復(fù)合物蛋白質(zhì)而言，在細菌表達中存在許多障礙，包括這些復(fù)合物分子的折疊和組裝、正確形成二硫鍵以及缺乏糖基化時的溶解性、穩(wěn)定性和功能性，因為在細菌中表達的蛋白質(zhì)不被糖基化。已成功地在大腸桿菌中表達出能結(jié)合抗原的全長非糖基化抗體(Simmons等.，2002，J Immunol Methods 263133-147)，因此在缺乏真核侶伴蛋白手段下，細菌性表達抗體的折疊、組裝和正確形成二硫鍵可能發(fā)生。然而，用于治療的細菌性表達抗體的最終功效仍為缺乏糖基化而困擾，其導(dǎo)致缺乏效應(yīng)器功能并可導(dǎo)致不良的穩(wěn)定性和溶解性。對于在高濃度下需要長期臨床使用的劑型而言，很可能存在更多問題。對于上述可選的生產(chǎn)方法而言，具有有利溶解特性(solutionproperty)以及介導(dǎo)效應(yīng)器功能的能力的非糖基化(aglycosylated)Fc將有效地使之成為可能。通過克服非糖基化Fc結(jié)構(gòu)和功能上的缺點，抗體可在細菌中以及轉(zhuǎn)基因植物和動物中生產(chǎn)，具有減少的免疫原性危險，以及在諸如癌癥的臨床應(yīng)用中具有所需細胞毒性的效應(yīng)器功能。本發(fā)明描述了利用蛋白質(zhì)工程方法來開發(fā)具有效應(yīng)器功能的穩(wěn)定、可溶的Fc變體。當前，在本領(lǐng)域中并不存在這樣的Fc變體?？傊?，需要具有增強的治療特性的抗體。設(shè)計優(yōu)化或增強的Fc變體是符合該需求的有前途的方法。雖然，設(shè)計具有所需特性的Fc變體的真正障礙在于預(yù)測無數(shù)可能性中的哪些氨基酸修飾可實現(xiàn)所需目的，和對于抗體而言效率低的生產(chǎn)和篩選方法。實際上，對于不完全成功的現(xiàn)有技術(shù)而言，其基本前提之一是使用類似于Fc設(shè)計的方法，因此更多地涉及諸如丙氨酸掃描的嘗試(hit-or-miss)方法或使用不同的表達菌株來產(chǎn)生糖型。在這些研究中，可進行完全或部分隨機的Fc修飾希望能獲得具有有利特性的變體。本發(fā)明提供了多種工程方法，其中許多基于更完善和更有效的技術(shù)，可用于克服這些障礙以便開發(fā)對于所需特性優(yōu)化的Fc變體。所述的工程方法提供了指導(dǎo)Fc修飾的設(shè)計策略、用于設(shè)計有利Fc變體的計算篩選方法、用于確定對試驗研究有用的抗體的文庫產(chǎn)生方法以及用于確定具有有利特性Fc變體的一系實驗生產(chǎn)和篩選方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了Fc變體，其許多與治療相關(guān)的特性得到優(yōu)化。本發(fā)明的一個目的是提供新的Fc位置，在該位置上氨基酸修飾可用于產(chǎn)生優(yōu)化的Fc變體。所述Fc位置包括240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328和332，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明描述在任一所述新的Fc位置上的任何氨基酸修飾，以便產(chǎn)生優(yōu)化的Fc變體。本發(fā)明的另一個目的是提供計算篩選的Fc變體。計算篩選的Fc變體是一種通過在本文中所描述的計算篩選計算所預(yù)測的變體，對于優(yōu)化所需特性而言，計算篩選較隨機方法具有更有效的替力?？梢?，計算篩選可作為試驗篩選的前奏或替代品，因此所述的計算篩選的Fc變體被認為是新的。本發(fā)明的另一個目的是提供使用一種或多種本文所述的實驗方法鑒定的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種取代，選自L234D、L234E、L234N，L234Q、L234T、L234H、L234Y、L2341、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239T、S239H、S239Y、V240I、V240A、V240T、V240M、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264Y、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266I、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A、P329F、A330L、A330Y、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、I332D、I332E、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自V264L、V264I、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W、F241W/F243W/V262A/V264A、F241L/V262I、F243L/V264I、F243L/V262I/V264W、F241Y/F243Y/V262T/V264T、F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、I332E、L328M/I332E、P244H、P245A、P247V、W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、V264I/I332E、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E、F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、A327N、S267Q/A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、A330Y、I332D、N297S、N297D、N297S/I332E、N297D/I332E、N297E/I332E、D265Y/N297D/I332E、D265Y/N297D/T299L/I332E、D265F/N297E/I332E、L328I/I332E、L328Q/I332E、I332N、I332Q、V264T、V264F、V240I、V263I、V266I、T299A、T299S、T299V、N325Q、N325L、N325I、S239D、S239N、S239F、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332D、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234D、L234E、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239T、S239H、S239Y、V240A、V240T、V240M、V263A、V263T、V263M、V264M、V264Y、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、L328D/I332E、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328H/I332E、L3281/I332E、L328A、I332T、I332H、I332Y、I332A、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E、S239D/N297D/I332E、S239E/N297D/I332E、S239D/D265V/N297D/I332E、S239D/D265I/N297D/I332E、S239D/D265L/N297D/I332E、S239D/D265F/N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、S239D/D265T/N297D/I332E、V264E/N297D/I332E、Y296D/N297D/I332E、Y296E/N297D/I332E、Y296N/N297D/I332E、Y296Q/N297D/I332E、Y296H/N297D/I332E、Y296T/N297D/I332E、N297D/T299V/I332E、N297D/T299I/I332E、N297D/T299L/I332E、N297D/T299F/I332E、N297D/T299H/I332E、N297D/T299E/I332E、N297D/A330Y/I332E、N297D/S298A/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和S239D/V264I/A330L/I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明的另一個目的是提供與一種或多種FcγRs的結(jié)合具有更強親和力的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對FcγR的親和力增加超過1倍。在一個可選的實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對FcγR的親和力增加超過5倍。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽對FcγR的親和力增加在5倍至300倍之間。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和325，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，選自L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q和N325T，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和S239D/V264I/A330L/I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明的另一個目的是提供具有FcγRIIIa-倍數(shù)FcγRIIb-倍數(shù)比率大于1∶1的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體具有FcγRIIIa-倍數(shù)FcγRIIb-倍數(shù)比率大于11∶1。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體具有在11∶1至86∶1之間的FcγRIIIa-倍數(shù)FcγRIIb-倍數(shù)比率。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所位于的位置選自234、235、239、240、264、296、330和I332，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，選自L234Y、L234I、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、V240M、V264I、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A330I、I332D和I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自I332E、V264I/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、Y296Q、A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L234I、L235I、V240A、V240M、V264Y、A330I、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和S239D/V264I/A330L/I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明的另一個目的是提供在存在效應(yīng)細胞條件下能更有效地介導(dǎo)效應(yīng)器功能的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽更能介導(dǎo)ADCC。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽介導(dǎo)ADCC增加超過5倍。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體較親本Fc多肽介導(dǎo)ADCC增加5-50倍。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和325，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，選自L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q和N325T，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V2641/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和S239D/V264I/A330L/I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明的另一個目的是提供與一種或多種FcγRs的結(jié)合具有較弱親和力的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330和332，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含一種氨基酸取代，所在位點選自L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239H、S239Y、V240A、V240T、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、328E、L328N、L328Q、L328F、L328H、L328A、P329F、A330L、A330V、A330F、A330R、A330H、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自V264L、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W、F241W/F243W/V262A/V264A、F241L/V262I、F243L/V262I/V264W、F241Y/F243Y/V262T/V264T、F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、P244H、P245A、P247V、W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、A327N、S267Q/A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、N297S、N297D、N297S/I332E、I332N、I332Q、V264F、V263I、T299A、T299S、T299V、N325Q、N325L、N325I、S239N、S239F、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239H、S239Y、V240A、V263T、V263M、V264M、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、N325A、N325V、N325H、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328H/I332E、L328A、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明的另一個目的是提供在存在效應(yīng)細胞條件下能更低效地介導(dǎo)ADCC的Fc變體。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330和332，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239H、S239Y、V240A、V240T、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243L、F243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、A298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、W313F、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325V、N325H、A327N、A327L、L328M、328E、L328N、L328Q、L328F、L328H、L328A、P329F、A330L、A330V、A330F、A330R、A330H、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自V264L、F241W、F241L、F243W、F243L、F241L/F243L/V262I/V264I、F241W/F243W、F241W/F243W/V262A/V264A、F241L/V262I、F243L/V262I/V264W、F241Y/F243Y/V262T/V264T、F241E/F243 R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R、L328M、L328E、L328F、P244H、P245A、P247V、W313F、P244H/P245A/P247V、P247G、F241E/F243R/V262E/V264R/I332E、F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E、D265G、D265N、S239E/D265G、S239E/D265N、S239E/D265Q、Y296E、Y296Q、T299I、A327N、S267Q/A327S、S267L/A327S、A327L、P329F、A330L、N297S、N297D、N297S/I332E、I332N、I332Q、V264F、V263I、T299A、T299S、T299V、N325Q、N325L、N325I、S239N、S239F、S239N/I332N、S239N/I332Q、S239Q/I332N、S239Q/I332Q、Y296D、Y296N、L234D、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234V、L234F、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235V、L235F、S239H、S239Y、V240A、V263T、V263M、V264M、V266A、V266T、V266M、E269H、E269Y、E269F、E269R、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、A298H、T299H、A330V、A330F、A330R、A330H、N325D、N325E、N325A、N325V、N325H、L328E/I332E、L328N/I332E、L328Q/I332E、L328H/I332E、L328A、I332T、I332H、I332Y和I332A，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式
本發(fā)明的另一個目的是提供相對于親本Fc多肽的非糖型具有改良的功能和/或溶解特性的Fc變體。本文中改良的功能性包括但不限于與Fc配體的結(jié)合親和力。本文中改良的溶解特性包括但不限于穩(wěn)定性和溶解性。在一個實施方案中，所述非糖基化Fc變體較糖基化親本Fc多肽與FcγR的結(jié)合所具有的親和力是可比的或更大。在一個可選的實施方案中，所述Fc變體與FcγR的結(jié)合所具有的親和力是在親本Fc多肽糖基化型的0.4-倍范圍內(nèi)。在一個實施方案中，所述Fc變體包含至少一種氨基酸取代，該取代所在位置選自239、241、243、262、264、265、296、297、330和332，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體包含一種氨基酸取代，選自S239D、S239E、F241Y、F243Y、V262T、V264T、V264E、D265Y、D265H、Y296N、N297D、A330Y和I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述Fc變體選自N297D/I332E、F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E、S239D/N297D/I332E、S239E/N297D/I332E、S239D/D265Y/N297D/I332E、S239D/D265H/N297D/I332E、V264E/N297D/I332E、Y296N/N297D/I332E和N297D/A330Y/I332E，其中Fc區(qū)中殘基編號方式是Kabat的EU標引方式。本發(fā)明也提供了用于設(shè)計優(yōu)化的Fc變體的方法。本發(fā)明的一個目的是提供可用于指導(dǎo)Fc優(yōu)化的設(shè)計策略。本發(fā)明的另一個目的是提供可用于設(shè)計Fc變體的計算篩選方法。本發(fā)明的另一個目的是提供產(chǎn)生用于實驗測試文庫的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供用于獲得優(yōu)化的Fc變體的實驗生產(chǎn)和篩選方法。本發(fā)明提供了編碼本文所述Fc變體的分離的核酸。本發(fā)明提供了包含所述核酸的載體，任選地，可操作地連接調(diào)控序列。本發(fā)明提供了包含該載體的宿主細胞，以及用于生產(chǎn)和任選地回收該Fc變體的方法。本發(fā)明提供了包含本文所公開的Fc變體的新抗體及Fc融合體。所述新抗體及Fc融合體可在治療產(chǎn)品中使用。本發(fā)明提供了包含抗體及Fc融合體以及生理學上或藥學上可接受的載體或稀釋劑的組合物，所述抗體及Fc融合體包含本文所述的Fc變體。本發(fā)明提供了包含本文所公開的Fc變體的抗體及Fc融合體的治療與診斷用途。
附圖簡述
圖1.抗體結(jié)構(gòu)與功能。顯示的是全長人IgG1抗體的模型，模型使用了來自pdb登記號1CE1(James等.，1999，J Mol Biol 289293-301)的人源化Fab結(jié)構(gòu)和來自pdb登記號1DN2(DeLano等.，2000，Science 2871279-1283)的人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)。未顯示連接Fab和Fc區(qū)的柔性鉸鏈。IgG1是異二聚體的同二聚體，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。標記了抗體包含的Ig結(jié)構(gòu)域，對于輕鏈而言包括VL和CL，對于重鏈而言包括VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。標記了Fc區(qū)。標記了相關(guān)蛋白的結(jié)合位點，包括可變區(qū)中的抗原結(jié)合位點，以及Fc區(qū)中FcγRs、FcRn、C1q和蛋白A和G的結(jié)合位點。圖2.Fc/FcγRIIIb復(fù)合物結(jié)構(gòu)1IIS。Fc顯示為灰色飄帶圖，F(xiàn)cγRIIIb顯示為黑色飄帶圖。N297糖顯示為黑色棒狀。圖3.阿侖單抗(alemtuzumab)(Campath_，Ilex Pharmaceuticals LP的注冊商標)抗體的重鏈氨基酸序列，闡明了位置編號順序(在氨基酸序列上的2行)和依照Kabat的EU標引方式的位置編號(在氨基酸序列下的2行)。Ig結(jié)構(gòu)域VH1、Cγ1、鉸鏈、Cγ2和Cγ3大致的起點也標記于上述連續(xù)編號中。已觀察到許多Fc位點上的多態(tài)性，包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此此處顯示的序列與現(xiàn)有技術(shù)序列之間可能存在著微小的差異。圖4.定位在Fc/FcγRIIIb復(fù)合物結(jié)構(gòu)111S上的實驗文庫殘基。Fc顯示為灰色飄帶圖，F(xiàn)cγRIIIb顯示為黑色飄帶圖。實驗文庫殘基顯示為黑色球狀和棒狀。N297糖顯示為黑色棒狀。圖5.人IgG1 Fc序列，顯示了與Fc變體實驗文庫設(shè)計相關(guān)的位點。該序列包括鉸鏈區(qū)、Cγ2結(jié)構(gòu)域和Cγ3結(jié)構(gòu)域。殘基編號依照Kabat的EU標引方式。與實驗文庫相關(guān)的位點加下劃線。因為觀察到許多Fc位點上的多態(tài)性突變，所以此處顯示的序列與文獻序列之間可能存在著微小的差異。圖6.293T細胞中阿侖單抗的Fc變體和野生型(WT)蛋白的表達。含有阿侖單抗重鏈基因(野生型或變體)的質(zhì)粒與含有阿侖單抗輕鏈基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染5天后收獲培養(yǎng)液。對于每個轉(zhuǎn)染的樣品而言，在SDS-PAGE凝膠上加載10ul培養(yǎng)液進行蛋白質(zhì)印跡分析(Western analysis)。用于蛋白質(zhì)印跡的探針是過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG(Jackson Immuno-Research，產(chǎn)品目錄#109-035-088)。WT野生型阿侖單抗；1-10阿侖單抗變體。H和L分別表示抗體重鏈和輕鏈。圖7.使用蛋白A層析純化阿侖單抗。在293T細胞中表達野生型阿侖單抗蛋白，轉(zhuǎn)染5天后收獲培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液用PBS稀釋到1∶1，并用蛋白A(Pierce，產(chǎn)品目錄#20334)純化。O純化前原始樣品；FT流出液；E洗脫液；C濃縮的最終樣品。左圖顯示了Simple藍染色的SDS-PAGE凝膠，右圖顯示了使用過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG標記的蛋白質(zhì)印跡。圖8.去糖基化抗體的產(chǎn)生。在293T細胞中表達阿侖單抗的野生型和變體，并用蛋白A層析純化?？贵w與肽-N-糖苷酶(PNGase F)在37℃溫育24小時。對于每個抗體來說，平行進行模擬處理樣品(-PNGase F)的試驗。WT野生型阿侖單抗；#15、#16、#17、#18、#22分別為阿侖單抗變體F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R、F241E/F243Y/V262T/V264R和I332E。相對于模擬處理的樣品，PNGase F處理的樣品遷移更快，代表了去糖基化重鏈。圖9.表達自293T細胞的阿侖單抗與其抗原的結(jié)合。融合有GST的CD52肽抗原在IPTG誘導(dǎo)下表達自大腸桿菌BL21(DE3)。未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的樣品都繼續(xù)跑SDS-PAGE凝膠，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。對于蛋白質(zhì)印跡來說，來自Sotec(□-CD52，Sotec)的阿侖單抗(終濃度為2.5ng/ul)或經(jīng)轉(zhuǎn)染的29T細胞(Campath，Xencor)的培養(yǎng)液(阿侖單抗終濃度約為0.1-0.2ng/ul)作為一抗，過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG作為二抗。M預(yù)染色的標記物；U未誘導(dǎo)GST-CD52的樣品；I誘導(dǎo)GST-CD52的樣品。圖10.人V158 FcγRIIIa胞外區(qū)的表達和純化。標記的FcγRIIIa轉(zhuǎn)染入293T細胞中，3天后收獲含有分泌的FcγRIIIa的培養(yǎng)液并用親和層析純化。1培養(yǎng)液；2流出液；3洗滌液；4-8連續(xù)的洗脫液。simple藍染色的SDS-PAGE凝膠和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果都得到顯示。對于蛋白質(zhì)印跡而言，膜用抗-GST抗體探針探測。圖11.使用實施例2所述的AlphaScreenTM分析法確定實驗文庫選擇的阿侖單抗Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。在存在競爭性抗體(Fc變體或野生型阿侖單抗)情況下，當發(fā)光信號減少時觀察到特征性抑制曲線。磷酸鹽緩沖液(PBS)單獨作為陰性對照。這些數(shù)據(jù)對最大和最小發(fā)光信號歸一化，所述最大和最小發(fā)光信號分別提供自低和高濃度競爭性抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。這些擬合提供了每個抗體的IC50s，野生型和S239D用點線說明。圖12.AlphaScreenTM分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人FcγRIIb的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖13.AlphaScreenTM分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人Val158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖14.AlphaScreenTM分析法測量了在背景利妥昔單抗(rituximab)中選擇的Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖15.AlphaScreenTM分析法測量了在背景曲妥單抗(trastuzumab)中選擇的Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖16a-16b.AlphaScreenTM分析法比較了選擇的阿侖單抗Fc變體與人V158 FcγRIIIa(圖16a)及人FcγRIIb(圖16b)的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖17.AlphaScreenTM分析法測量了在背景曲妥單抗中選擇的Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。圖18.AlphaScreenTM分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人R131 FcγRIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。圖19a和19b.AlphaScreenTM分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型(one site competition model)的擬合。PBS作為陰性對照。圖20.AlphaScreenTM分析法顯示了非糖基化阿侖單抗Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖21.AlphaScreenTM分析法比較了選擇的阿侖單抗Fc變體糖基化型(實心符號，實線)及非糖基化型(空心符號，打點的線)與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。圖22a-22b.AlphaScreenTM分析法顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與人FcγRIIIa的V158(圖22a)及F158(圖22b)同種異型的結(jié)合。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖23a-23d.圖23a和23b顯示了選擇的阿侖單抗Fc變體與V158FcγRIIIa(圖23a)及F158 FcγRIIIa(圖23b)結(jié)合的SPR Kd′s與AlphaScreenTMIC50′s之間的相關(guān)性。圖23c和23d顯示了對于選擇的阿侖單抗Fc變體與V158 FcγRIIIa(圖23c)及F158 FcγRIIIa(圖23d)結(jié)合而言，SPR與AlphaScreenTM測定的較野生型改良的倍數(shù)的結(jié)果之間的相關(guān)性。結(jié)合數(shù)據(jù)列于表62中。通過數(shù)據(jù)的線代表了數(shù)據(jù)的線性擬合，r2值表示這些擬合的顯著性。圖24a-24b.在背景阿侖單抗中選擇的Fc變體基于細胞的ADCC測定。使用基于DELFIA EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer，MA)測量ADCC，描述于實施例7，使用DoHH-2淋巴靶細胞和50倍過量的人PBMCs。圖24a是顯示了用于指示10ng/ml阿侖單抗抗體的原始熒光數(shù)據(jù)的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體條件下細胞毒性的基礎(chǔ)水平。對于指明的阿侖單抗抗體而言，圖24b顯示了ADCC對抗體濃度的劑量依賴性，對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對S形劑量-響應(yīng)模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖25a-25b.在背景利妥昔單抗中選擇的Fc變體基于細胞的ADCC測定。使用DELFIA_EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer，MA)測量ADCC，描述于實施例7，使用WIL2-S淋巴靶細胞和50倍過量的人PBMCs。圖25a是顯示了用于指示1ng/ml利妥昔單抗抗體的原始熒光數(shù)據(jù)的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體條件下細胞毒性的基礎(chǔ)水平。對于指明的利妥昔單抗抗體而言，圖25b顯示了ADCC對抗體濃度的劑量依賴性，對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對S形劑量-響應(yīng)模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖26a-26c.在背景曲妥單抗中選擇的Fc變體基于細胞的ADCC測定。使用DELFIA_EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer，MA)測量ADCC，描述于實施例7，使用BT474和Sk-Br-3乳腺癌靶細胞和50倍過量的人PBMCs。圖26a是顯示了用于指示1ng/ml曲妥單抗抗體的原始熒光數(shù)據(jù)的條形圖。PBMC條顯示了在缺乏抗體的條件下細胞毒性的基礎(chǔ)水平。對于指明的曲妥單抗抗體而言，圖26b和26c顯示了ADCC對抗體濃度的劑量依賴，對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對S形劑量-響應(yīng)模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖27a-27b.選擇的Fc變體介導(dǎo)結(jié)合和激活補體的能力。圖27a顯示AlphaScreenTM分析法測量的選擇的阿侖單抗Fc變體與C1q的結(jié)合。數(shù)據(jù)對最大和最小發(fā)光信號歸一化，所述最大和最小發(fā)光信號分別提供自低和高濃度競爭性抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖27b顯示了基于細胞測定法測量的選擇的利妥昔單抗Fc變體介導(dǎo)CDC的能力。使用Amar藍(Amar Blue)來監(jiān)測人血清補體(Quidel，San Diego，CA)對Fc變體和野生型利妥昔單抗調(diào)理的WIL2-S淋巴細胞的溶胞作用而實現(xiàn)CDC測定。對于指明的利妥昔單抗抗體而言，顯示了補體介導(dǎo)的溶胞作用對抗體濃度的劑量依賴性，對最小和最大熒光信號歸一化，所述最小和最大熒光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。曲線代表了數(shù)據(jù)對S形劑量-響應(yīng)模型的擬合，所述擬合使用了非線性回歸。圖28.AlphaScreenTM分析法測量的選擇的阿侖單抗Fc變體與細菌蛋白A的結(jié)合，描述于實施例9。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖29.AlphaScreenTM分析法測量的選擇的阿侖單抗Fc變體與小鼠FcγRIII的結(jié)合，描述于實施例10。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖30.AlphaScreenTM分析法測量的選擇的曲妥單抗Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合，所述曲妥單抗Fc變體在293T和CHO細胞中表達，描述于實施例11。歸一化數(shù)據(jù)，曲線代表數(shù)據(jù)對單位點競爭性模型的擬合。PBS作為陰性對照。圖31a-31c.顯示了改良的抗-CD20抗體的序列。利妥昔單抗的輕鏈和重鏈序列分別呈現(xiàn)于圖31a和圖31b中，獲得自US 5,736,137的翻譯的序列3。圖31b中相關(guān)位置用粗體表示，包括S239、V240、V2641、N297、S298、A330和I332。圖31c顯示了改良的抗-CD20抗體重鏈序列，具有粗體X1、X2、X3、X4、X5、X6和Z1所指定的可變區(qū)位置。序列下的表格提供了對于那些位置而言可能的取代。改良的抗-CD20抗體序列包含至少一種非野生型氨基酸，可能的取代選自對X1、X2、X3、X4、X5和X6的取代。這些改良的抗-CD20抗體序列也可包含Z1的取代。這些位置依照Kabat的EU標記方式編號，因此并不相應(yīng)于序列中連續(xù)的順序。
發(fā)明詳述
為了能更徹底地理解發(fā)明，以下列出一些定義。上述定義意在包含語法等同成分。本文中使用的“ADCC”或“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用”意指細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達FcγRs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結(jié)合抗體并隨后引起對靶細胞的溶胞作用。本文中使用的“ADCP”或“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞吞噬作用”意指細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達FcγRs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結(jié)合抗體并隨后引起對靶細胞的吞噬作用。本文中的“氨基酸修飾”意指多肽序列中氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中優(yōu)選的氨基酸修飾是取代。**TT
本文中“抗體”意指由基本上為公認的免疫球蛋白基因的全部或部分所編碼的一種或多種多肽組成的蛋白質(zhì)。所述公認的免疫球蛋白基因，例如在人中，包括kappa(□)κ、lambda(□)λ和重鏈基因座，其中包含了無數(shù)的可變區(qū)基因，以及分別編碼IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同種型的恒定區(qū)基因mu(□)μ、delta(□)δ、gamma(□)γ、sigma(□)σ、alpha(□)α。本文中的抗體意指包括全長抗體和抗體片段，和來自任意生物體可稱為天然抗體的，工程抗體，或為試驗、治療目的或其它如下所進一步規(guī)定的目的而重組產(chǎn)生的抗體。因此，“抗體”包括多克隆和單克隆抗體(mAb)。制備和純化單克隆及多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域所公知，描述于如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual中(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)。如本文所概述，“抗體”明確地包括本文中所描述的Fc變體，“全長”抗體包括本文中描述的Fc變體片段，以及本文中描述的與其它蛋白質(zhì)融合的Fc變體。在一些實施方案中，抗體可以是中和性的、或抑制性的、或刺激性的抗體，在優(yōu)選的實施方案中，如本文所描述，與親本抗體(如，當非天然存在變體用作為本文中的計算分析的出發(fā)點時)相比時，或與原始的野生型抗體相比時，通過變體抗體與受體親和力的增加來測定刺激活性。因此，本文中“中和(neutralization)”、“中和(neutralize)”、“中和(neutralizing)”以及語法等同成分意指抑制或減少抗體的生物效應(yīng)，在一些情況下通過與抗原結(jié)合(如競爭性地)消除或減弱結(jié)合的生物效應(yīng)，或通過結(jié)合以導(dǎo)致結(jié)合的生物效應(yīng)減弱。術(shù)語“抗體”包括抗體片段，為本領(lǐng)域所公知，諸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc或抗體的抗原結(jié)合的其它亞序列，例如，單鏈抗體(例如Fv)、嵌合抗體等，或通過修飾完整抗體或使用重組DNA技術(shù)重新合成的那些抗體而產(chǎn)生的抗體片段。具體優(yōu)選的是如本文所述的Fc變體。術(shù)語“抗體”還包含能做為激動劑或拮抗劑抗體的多克隆抗體和單克隆抗體(mAbs)。如本文所概述，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合Fc受體。本文中“特異性結(jié)合”意指具有結(jié)合常數(shù)至少為10-4-10-6M-1，優(yōu)選為10-7-10-9M-1的LC抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化的。使用通用的單克隆抗體技術(shù)，人們可制備事實上抗已得到鑒定的任意靶抗原的人源化抗體[Stein，Trends Biotechnol.1588-90(1997)]。非人(如，鼠)抗體的人源化型是免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如as Fv，F(xiàn)c，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或其它抗體的抗原結(jié)合序列)的嵌合分子，所述片段含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受者的抗體)，其中接受者的互補決定區(qū)(CDR)的殘基為來自諸如具有所需特異性、親和力以及能力的小鼠、大鼠或兔的非人物種(供體的抗體)CDR的殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)殘基為相應(yīng)的非人殘基所取代。人源化抗體也可包含既不在接受者抗體中也不在被引入的CDR或骨架區(qū)序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。一般而言，人源化的抗體可包含至少一個、以及通常為兩個可變區(qū)的基本上全部的結(jié)構(gòu)，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些CDR區(qū)，全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體最好也包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)[Jones等.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等.，Nature 332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.BIOL.2593-596(1992)]。人源化非人抗體的方法為本領(lǐng)域眾所周知。一般而言，人源化抗體引入了一個或多個非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為引入殘基(import residues)，其一般來自引入的可變區(qū)。采用Winter與其同事的方法[Jones等.，同上；Riechmann等.，同上；以及Verhoeyen等.，Science，2391534-1536(1988)]，通過用嚙齒動物CDRs或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列，人源化可基本上得到完成。人源化小鼠單克隆抗體的其它實例也為本領(lǐng)域所公知，例如，結(jié)合人蛋白C[O′Connor等.，Protein Eng.11321-8(1998)]，白介素2受體[Queen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.8610029-33(1989])，以及人表皮生長因子受體2的抗體[Carter等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894285-9(1992)]。因此，上述人源化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中基本上小于完整的人可變區(qū)已為來自非人物種的相應(yīng)序列所取代。實際中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基和可能有一些FR殘基為來自嚙齒動物抗體中的相似位點所取代。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是基于人序列的，因此人序列被用作為“堿基”序列，抗諸如大鼠、小鼠和猴子的序列。為確定與原序列或結(jié)構(gòu)的同源性，前體或親本Fc的氨基酸序列與本文所列的人Fc序列直接比較。在序列比對后，使用一種或多種本文所述的同源性比對程序(例如在物種之間使用保守殘基)來確定與人Fc原序列中特定氨基酸等價的殘基，為維持比對的進行應(yīng)考慮到必需的插入和缺失(即，避免通過任意的缺失或插入而排除保守殘基)。保守殘基的排列優(yōu)選上述殘基應(yīng)100％保守。然而，大于75％或少至50％的保守殘基的比對也足夠用于確定等價殘基(在本文中有時稱為“相應(yīng)的殘基”)。對于已通過X-射線結(jié)晶學測定三維結(jié)構(gòu)的Fc片段而言，等價殘基也可通過確定三維結(jié)構(gòu)水平上的同源性而得到確定。等價殘基確定為親本或前體特定氨基酸殘基的兩個或更多個主鏈原子的原子坐標(N對N，CA對CA，C對C以及O對O)在比對后處于0.13nm范圍內(nèi)以及優(yōu)選在0.1nm內(nèi)的那些。在最佳模型已定向并定位以給出Fc變體片段非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標的最大重疊后，比對得到實現(xiàn)。明確地包括于“抗體”定義范圍內(nèi)的是非糖基化抗體。本文使用的“非糖基化抗體”意指在Fc區(qū)297位缺少糖附著的抗體，其中編號方式依照Kabat的EU系統(tǒng)。非糖基化的抗體可以是去糖基化的抗體，其是一種Fc糖已去除的抗體，例如以化學或酶的方法去除?？蛇x地，所述非糖基化抗體可以是非糖基化或未糖基化的抗體，其是一種無Fc糖表達的抗體，例如通過突變一種或多種編碼糖基化型的殘基或通過在諸如細菌的不將糖附著到蛋白質(zhì)上的生物體中表達。明確地包括于“抗體”定義范圍內(nèi)的是含有Fc變體部分的全長抗體。本文中“全長抗體”意指構(gòu)成抗體的天然生物學類型的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)。舉例來說，在包括人和小鼠的大多數(shù)哺乳動物中，IgG類的全長抗體是一種四聚體并由相同的兩對兩條免疫球蛋白鏈組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VL和CL，每條重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在一些哺乳動物中，例如在駱駝(camel)和美洲駝(llamas)中，IgG抗體可僅由兩條重鏈組成，每條重鏈包含一個附著在Fc區(qū)上的可變區(qū)。本文中使用的“IgG”意指屬于抗體類的多肽，其基本上為公認的免疫球蛋白γ基因所編碼。在人中，該類包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，該類包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。本文中使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20種天然存在的氨基酸之一或任一非天然類似物，它們可位于特別規(guī)定的位置。本文中“蛋白質(zhì)”意指至少兩個共價連接的氨基酸，其包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽和肽。蛋白質(zhì)可由天然存在的氨基酸和肽鍵構(gòu)成，或由合成的肽模擬物結(jié)構(gòu)構(gòu)成，該肽模擬物即“類似物”，特別是當將LC肽施用于患者時，如類肽(peptoid)(參見，Simon等.，PNAS USA 89(20)9367(1992))。因此本文中使用的“氨基酸”或“肽殘基”意指天然存在和合成的氨基酸。舉例來說，對于本發(fā)明目的而言，高苯基丙氨酸、瓜氨酸和降亮氨酸被認為是用于本發(fā)明目的的氨基酸?！鞍被帷币舶ㄖT如脯氨酸和羥脯氨酸的亞氨基酸殘基。側(cè)鏈可以是(R)或(S)構(gòu)型。在優(yōu)選的實施方案中，氨基酸以(S)或L-構(gòu)型存在。如果使用非天然存在的側(cè)鏈，可使用非氨基酸取代，例如以阻止或延遲體內(nèi)降解。本文中“計算篩選方法(computational screening method)”意指用于設(shè)計蛋白質(zhì)中一種或多種突變的任何方法，其中所述方法使用了計算機來評估可能的氨基酸側(cè)鏈取代相互之間和/或與蛋白質(zhì)的其它部分相互作用的能量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，能量評估涉及能量計算，能量計算涉及一些對一種或多種氨基酸修飾的打分方法。所述方法可涉及物理或化學能項(energy term)，或可涉及基于已有知識-、統(tǒng)計學-、序列的能項等。所述計算由在本文中稱為“計算篩選計算(computational screening calculations)”的計算篩選方法組成。本文中使用的“效應(yīng)器功能”意指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體相互作用產(chǎn)生的生化反應(yīng)。效應(yīng)器功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。本文中使用的“效應(yīng)細胞”意指表達一種或多種Fc受體并介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)器功能的免疫系統(tǒng)細胞。效應(yīng)細胞包括但不限于單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、朗罕氏細胞，自然殺傷(NK)細胞以及灃T細胞，以及可來自任何生物體包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。本文中“文庫”意指任意形式的一組Fc變體，包括但不限于一列核酸或氨基酸序列，一列在可變位置的核酸或氨基酸取代，包含編碼庫序列的核酸的物理文庫，或包含F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)的物理文庫，所述Fc變體蛋白質(zhì)以純化或未純化的形式存在。本文中使用的“Fc”、“Fc區(qū)”、“Fc多肽”等意指于本文定義的抗體，其包括包含除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域第一恒定區(qū)外的抗體恒定區(qū)的多肽。因此，F(xiàn)c指IgA、IgD和IgG免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的最后兩個恒定區(qū)，IgE和IgM免疫球蛋白的最后三個恒定區(qū)，和這些結(jié)構(gòu)域的N-末端連接的柔性鉸鏈。對于IgA和IgM而言，可包括J鏈。對于IgG來說，如圖1所示，F(xiàn)c包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之間的鉸鏈。盡管Fc區(qū)的邊界可改變，人IgG重鏈Fc區(qū)通常規(guī)定為在其羧基末端包含殘基C226或P230，其中編號方式依照Kabat的EU標引方式。Fc可指分離的該區(qū)域，或在上下文的抗體、抗體片段或Fc融合體中的該區(qū)域。Fc可以是抗體、Fc融合體，或包含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選的是Fc變體，其是非天然存在的Fc變體。本文中使用的“Fc融合體”意指其中一個或更多個多肽可操作地連接Fc的蛋白質(zhì)。在本文中Fc融合體與現(xiàn)有技術(shù)中所使用的術(shù)語“免疫粘合素”、“Ig融合體”、“Ig嵌合體”以及“受體球蛋白”(有時加破折號)(Chamow等.，1996，Trends Biotechnol 1452-60；Ashkenazi等.，1997，Curr OpinImmunol 9195-200)的含義是相同的。Fc融合體將免疫球蛋白Fc區(qū)與融合伴侶(fusion partner)結(jié)合，一般而言，所述融合伴侶可以是任何蛋白質(zhì)，包括但不限于，受體的靶結(jié)合區(qū)、粘合素分子、配體、酶或某些其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。Fc融合體非Fc-部分的作用是介導(dǎo)靶結(jié)合，因此其功能類似于抗體的可變區(qū)。本文中使用的“Fcγ受體”或“FcγR”意指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且基本上為FcγR基因所編碼的蛋白質(zhì)家族的任何成員。在人類中，該家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包含亞類FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包含F(xiàn)cγRIIa(包括同種異型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包含但不限于發(fā)FcγRIIIa(包括同種異型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同種異型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等.，2002，Immunol Lett 8257-65)，也包括任何未被發(fā)現(xiàn)的人FcγRs或FcγR亞類或同種異型。FcγR可來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠FcγRs包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)以及FcγRIII-2(CD16-2)，也包括任何未被發(fā)現(xiàn)的小鼠FcγRs或FcγR亞類或同種異型。本文中使用的“Fc配體”意指來自任何生物體的一種分子，優(yōu)選一種多肽，其與抗體的Fc區(qū)結(jié)合以形成Fc-配體復(fù)合物。Fc配體包括但不限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖結(jié)合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G以及病毒FcγR。Fc配體可包括未被發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合Fc的分子。本文中使用的“IgG”意指一種屬于抗體類的多肽，其基本上為公認的免疫球蛋白γ基因所編碼。在人類中，該類包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，該類包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。本文中“免疫球蛋白(Ig)”意指由基本上為免疫球蛋白基因所編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白包括但不限于抗體。免疫球蛋白可具有許多結(jié)構(gòu)型，包括但不限于全長抗體、抗體片段和單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本文中“免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域”意指為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域技術(shù)人員所確定的作為分離的結(jié)構(gòu)實體而存在的免疫球蛋白的區(qū)域。Ig結(jié)構(gòu)域通常具有特征性的□-多層(sandwich)折疊拓撲結(jié)構(gòu)?？贵wIgG類中已知的Ig結(jié)構(gòu)域VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL以及CL。本文中使用的“親本多肽”或“前體多肽”(包括Fc親本或前體)意指一種隨后被修飾以產(chǎn)生變體的多肽。所述親本多肽可以是天然存在多肽，或天然存在多肽的變體或工程型。親本多肽可指該多肽自身、包含該親本多肽的組合物或編碼其的氨基酸序列。因此，本文中使用的“親本Fc多肽”意指未修飾的Fc多肽，其可修飾以產(chǎn)生變體，在本文中使用的“親本抗體”意指未修飾的抗體，其可修飾以產(chǎn)生抗體變體。如上所概述，F(xiàn)c分子的某些位置可得到改變。本文中使用的“位置”意指在蛋白質(zhì)序列中的位置。位置可按順序編號，或依據(jù)已確定的方式編號，例如Kabat的EU標引方式。舉例來說，位置297是人抗體IgG1中的一個位置。如上所述，一般通過與其它親本序列比對確定相應(yīng)的位置。本文中使用的“殘基”意指在蛋白質(zhì)中的位置以及與之相關(guān)的氨基酸同一性。例如，Daragine 297(也稱為N297)是在人抗體IgG1中的一種殘基。本文中使用的“靶抗原”意指與給定抗體可變區(qū)特異性結(jié)合的分子。靶抗原可以是蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)或其它化合物。本文中使用的“靶細胞”意指表達靶抗原的細胞。本文中使用的“可變區(qū)”意指包含一個或多個基本上為任一Vκ、Vλ和/或VH基因所編碼的Ig結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)域，所述的V□κ、V□λ和/或VH基因分別構(gòu)成了免疫球蛋白κ、λ和重鏈的基因座。本文中使用的“變體多肽”意指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親本多肽序列的多肽序列。變體多肽可指多肽自身、包含該多肽的組合物或編碼其的氨基序列。優(yōu)選地，與親本多肽相比該變體多肽具有至少一個氨基酸修飾，如與親本多肽相比約1到約10個氨基酸修飾，以及優(yōu)選約1到約5個氨基酸修飾。本文中該變體多肽序列與親本多肽序列優(yōu)選具有至少約80％的同源性，最優(yōu)選至少約90％的同源性，更優(yōu)選至少約95％的同源性。因此，本文中使用的“Fc變體”意指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親本Fc序列的Fc序列。Fc變體可以僅包含F(xiàn)c區(qū)，或可存在于上下文的抗體、Fc融合體或其它基本上由Fc編碼的多肽中。Fc變體可指Fc多肽自身、包含該Fc變體多肽的組合物或編碼其的氨基酸序列。對于本發(fā)明中討論的所有位置而言，免疫球蛋白重鏈的編號方式依照EU標引方式(Kabat等.，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版.，United States Public Health Svice，National Institutes ofHealth，Bethesda)。“Kabat的EU標引方式”指人IgG1 EU抗體的殘基編號方式。本發(fā)明的Fc變體可對不同的特性進行優(yōu)化?？蓛?yōu)化的特性包括但不限于對FcγR增強或減少的親和力。在一個優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)化本發(fā)明的Fc變體對人激活的FcγR、優(yōu)選FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb，最優(yōu)選FcγRIIIa具有增強的親和力。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)化Fc變體對人抑制性受體FcγRIIb具有減少的親和力。這些優(yōu)選的實施方案預(yù)期能提供在人中具有增強治療特性的抗體和Fc融合體，例如增強的效應(yīng)器功能以及更強的抗癌效力。在一個可選的實施方案中，優(yōu)化本發(fā)明的Fc變體以對人FcγR，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb具有減少或消除的親和力。這些實施方案預(yù)期能提供在人中具有增強治療特性的抗體和Fc融合體，例如減少的效應(yīng)器功能以及減少的毒性。優(yōu)選的實施方案包含優(yōu)化結(jié)合人FcγR的Fc，另一方面，在可選的實施方案中本發(fā)明的Fc變體對于來自非人生物體的FcγRs具有增強或減少的親和力，非人生物體包括但不限于小鼠、大鼠、兔子和猴子。對與非人FcγR的結(jié)合進行優(yōu)化的Fc變體可用于試驗?zāi)康摹Ｅe例來說，對于不同疾病而言，所獲得的小鼠模型能夠測試諸如有效性、毒性和藥物代謝動力學的特定候選藥物特性。在本領(lǐng)域中公知一種稱為異種移植術(shù)的方法可將癌細胞移植或注射如小鼠中以模擬人癌癥。對包含對一種或多種小鼠FcγRs優(yōu)化的Fc變體的抗體或Fc融合體進行測試可提供與該抗體或Fc融合體有效性、其作用機理等相關(guān)的有價值的信息。本發(fā)明的Fc變體也可優(yōu)化以增強非糖基化型的功能性和/或溶解性。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的非糖基化Fc變體較親本Fc多肽的非糖基化型對Fc配體的結(jié)合具有更大的親和力。所述Fc配體包括但不限于FcγRs、C1q、FcRn以及蛋白A和G，且可來自任何來源包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子或猴子，優(yōu)選人。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，該優(yōu)化的Fc變體較親本Fc多肽的非糖基化型可更穩(wěn)定和/或更易溶解。得到改造或預(yù)測顯示任一上述優(yōu)化特性的Fc變體在本文中稱為“優(yōu)化的Fc變體”。本發(fā)明的Fc變體可來自不同來源的親本Fc多肽。該親本Fc多肽可基本上為一種或多種Fc基因所編碼，所述Fc基因來自任意生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、駱駝、美洲駝、單峰駱駝、猴子，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人和小鼠。在一個優(yōu)選的實施方案中，該親本Fc多肽包含抗體，稱為親本抗體。所述親本抗體可以是完全人抗體，例如獲得自使用轉(zhuǎn)基因小鼠(Bruggemann等.，1997，Curr Opin Biotechnol 8455-458)或人抗體文庫外加選擇方法所產(chǎn)生的抗體(Griffiths等.，1998，Curr OpinBiotechnol 9102-108)。所述親本抗體勿需天然存在。舉例來說，該親本抗體可以是工程抗體，包括但不限于嵌合抗體和人源化抗體(Clark，2000，Immunol Today 21397-402)。所述親本抗體可以是基本上為一種或多種天然抗體基因所編碼的抗體的工程變體。在一個實施方案中，該親本抗體已得到親和力成熟，所述技術(shù)為本領(lǐng)域所公知?？蛇x地，該抗體可以用某些其它方法進行修飾，例如于2003年3月3日提交的USSN 10/339788中所描述的方法。本發(fā)明的Fc變體可基本上為屬于任一抗體類型的免疫球蛋白基因所編碼。在一個優(yōu)選的實施方案中，在抗體或Fc融合體中使用的本發(fā)明的Fc變體包含屬于抗體IgG類型的序列，該IgG類型包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一個可選的實施方案中，在抗體或Fc融合體中使用的本發(fā)明的Fc變體包含屬于抗體IgA(包括亞類IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG或IgM類型的序列。本發(fā)明的Fc變體可包含超過一條的蛋白鏈。換句話說，在抗體或Fc融合體中使用的本發(fā)明的Fc變體是單體或寡聚體，包括同-或異-寡聚體。本發(fā)明的Fc變體可以與其它Fc變體結(jié)合，包括但不限于改變了效應(yīng)器功能的變體。在抗體或Fc融合體中上述結(jié)合可提供附加的、協(xié)同的或新的特性。在一個實施方案中，本發(fā)明的Fc變體可以與其它已知的Fc變體結(jié)合(Duncan等，1988，Nature 332563-564；Lund等，1991，J Immunol1472657-2662；Lund等.，1992，Mol Immunol 2953-59；Alegre等.，1994，Transplantation 571537-1543；Hutchins等.，1995，Proc Natl Acad Sci USA9211980-11984；Jefferis等.，1995，Immunol Lett 44111-117；Lund等.，1995，F(xiàn)aseb J 9115-119；Jefferis等.，1996，Immunol Lett 54101-104；Lund等.，1996，J Immunol 1574963-4969；Armour等.，1999，Eur J Immunol 292613-2624；Idusogie等.，2000，J Immunol 1644178-4184；Reddy等.，JImmunol 2000，1641925-1933；Xu等.，2000，Cell Immunol 20016-26；Idusogie等.，2001，J Immunol 1662571-2575；Shields等，2001，J Biol Chem2766591-6604；Jefferis等.，2002，Immunol Lett 8257-65；Presta等.，2002，Biochem Soc Trans 30487-490)(US 5,624,821；US 5,885,573；US 6,194,551；PCT WO 00/42072；PCT WO 99/58572)。在一個可選的實施方案中，本發(fā)明的Fc變體摻入到包含一種或多種工程糖型的抗體或Fc融合體中。本文中使用的“工程糖型(engineerd glycoform)”意指與Fc多肽共價連接的糖組合物，其中所達糖組合物在化學特性上與親本Fc多肽不同。工程糖型可用于不同用途，包括但不限于增強或減少效應(yīng)器功能?？赏ㄟ^任何方法產(chǎn)生工程糖型，例如通過使用工程的或變體表達菌株，通過與一種或多種酶共表達，例如□1-4-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)，通過在不同生物體或來自不同生物體的細胞系中表達Fc多肽，或通過在Fc多肽得到表達后修飾糖類。用于產(chǎn)生工程糖型的方法為本領(lǐng)域所公知，包括但不限于( 等.，1999，Nat Biotechnol 17176-180；Davies等，2001，Biotechnol Bioeng 74288-294；Shields等.，2002，J Biol Chem 27726733-26740；Shinkawa等.，2003，J Biol Chem 2783466-3473)US 6,602,684；USSN 10/277,370；USSN10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/29246A1；PCT WO02/31140A1；PCT WO 02/30954A1；PoteligentTM技術(shù)(Biowa，INC.，Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技術(shù)(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland))。工程糖型通常指不同的糖或寡糖；因此Fc多肽，例如抗體或Fc融合體可包含工程糖型?？蛇x地，工程糖型可指包含不同糖或寡糖的Fc多肽。因而，本發(fā)明的Fc變體與其它Fc修飾的組合，以及與未被發(fā)現(xiàn)的Fc修飾的組合預(yù)期可達到產(chǎn)生新的具有優(yōu)化特性的抗體或Fc融合體的目的。本發(fā)明的Fc變體可供抗體使用。本文中使用的“本發(fā)明的抗體”意指包含本發(fā)明Fc變體的抗體。實際上，本發(fā)明可供包含F(xiàn)c的任何蛋白質(zhì)使用，因此本發(fā)明的Fc變體的應(yīng)用不限于抗體。本發(fā)明Fc變體可供Fc融合體使用。本文中使用的“本發(fā)明的Fc融合體”指的是包含本發(fā)明Fc變體的Fc融合體。Fc融合體可包含可操作地與細胞因子、可溶性受體結(jié)構(gòu)域、粘附分子、配體、酶、肽或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接的本發(fā)明Fc變體，對Fc融合體的描述包括但不限于US 5,843,725；US 6,018,026；US6,291,212；US 6,291,646；US 6,300,099；US 6,323,323；PCT WO 00/24782；以及(Chamow等.，1996，Trends Bitechnol 1452-60；Ashkenazi等.，1997，Curr Opin Immunol 9195-200)。事實上本發(fā)明的抗體和融合體可靶向于任何抗原，包括但不限于如下所列的蛋白質(zhì)、屬于下列蛋白質(zhì)的亞基、結(jié)構(gòu)域、基序和表位CD2；CD3，CD3E，CD4，CD11，CD11A，CD14，CD16，CD18，CD19，CD20，CD22，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD32，CD33(p67蛋白)，CD38，CD40，CD40L，CD52，CD54，CD56，CD80，CD147，GD3，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，IL-23，α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素；TNF-α，TNFβ2，TNFc，TNFαβ，TNF-RI，TNF-RII，F(xiàn)asL，CD27L，CD30L，4-1BBL，TRAIL，RANKL，TWEAK，APRIL，BAFF，LIGHT，VEGI，OX40L，TRAIL受體-1，A1腺苷受體，淋巴毒素β受體，TACI，BAFF-R，EPO；LFA-3，ICAM-1，ICAM-3，EPCAM，β1-整聯(lián)蛋白、β2-整聯(lián)蛋白、α4/β7-整聯(lián)蛋白、α2-整聯(lián)蛋白、α3-整聯(lián)蛋白、α4-整聯(lián)蛋白、α5-整聯(lián)蛋白、α6-整聯(lián)蛋白、αv-整聯(lián)蛋白、αVβ3-整聯(lián)蛋白、FGFR-3，角質(zhì)化細胞生長因子、VLA-1，VLA-4，L-選擇蛋白，抗獨特型抗體(anti-id)，E-選擇蛋白，HLA，HLA-DR，CTLA-4，T細胞受體，B7-1，B7-2，VNR整聯(lián)蛋白(VNR integrin)，TGF-β1，TGF-β2，嗜酸細胞活化趨化因子1，BLyS(B-淋巴細胞刺激物)，補體C5，IGE，因子VII，CD64，CBL，NCA 90，EGFR(ErbB-1)，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB-4)，組織因子，VEGF，VEGFR，內(nèi)皮素受體，VLA-4，半抗原NP-加帽或NIP-加帽蛋白，T細胞受體α/β，E-選擇蛋白，地高辛，胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸類PLAP堿性磷酸酶，鐵傳遞蛋白受體，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEM，粘蛋白MUC1，MUC18，類肝素酶(heparanase)I，人心臟肌球蛋白，腫瘤相關(guān)糖蛋白-72(TAG-72)，腫瘤相關(guān)抗原CA125，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)，癌相關(guān)抗原，Gcoprotein IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，表達Lewis Y相關(guān)糖的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen expressing Lewis Y relatedcarbohydrate)，人巨細胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白，HIV GP120，HCMV，呼吸合胞病毒RSVF，RSVF Fgp，VNR整聯(lián)蛋白，IL-8，細胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗原，Hep B GP120，CMV，gpIIbIIIa，HIV IIIB GP120 V3環(huán)，呼吸合胞病毒(RSV)Fgp，單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解上述列出的靶不僅指特定的蛋白質(zhì)及生物分子，而且還指包含它們的生化途徑或各種途徑。例如，當提及的CTLA-4作為靶抗原時，意味著配體和受體組成了T細胞共刺激途徑，包括CTLA-4、B7-1、B7-2、CD28，并且任何其它未被發(fā)現(xiàn)的配體或受體也是靶對象。因此本文中使用的靶不僅指特定的生物分子，也指與所述靶以及所述靶所屬的生化途徑的成員相互作用的一組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當進一步理解任一上述的靶抗原、配體或它們相應(yīng)的生化途徑能可操作地與本發(fā)明的Fc變體連接以便產(chǎn)生Fc融合體。因此，舉例來說，靶向EGFR的Fc融合體能通過可操作地將Fc變體與EGF、TGF□或任何其它已發(fā)現(xiàn)或未被發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合EGFR的配體連接而得到構(gòu)建。因此，本發(fā)明的Fc變體能可操作地與EGFR連接以便產(chǎn)生能結(jié)合EGF、TGF□或任何其它已發(fā)現(xiàn)或未被發(fā)現(xiàn)的可結(jié)合EGFR的配體的Fc融合體。因而，事實上任何多肽，無論是配體、受體或一些其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括但不限于上述靶和組成它們相應(yīng)的生化途徑的蛋白質(zhì)，能可操作地與本發(fā)明的Fc變體連接以便開發(fā)Fc融合體。在臨床試驗或在開發(fā)研制中批準使用的許多抗體和Fc融合體都可受益于本發(fā)明的Fc變體。所述抗體和Fc融合體在本文中稱為“臨床產(chǎn)物和候選物”。因此在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Fc變體可供一系列臨床產(chǎn)物和候選物使用。例如，靶向CD20的許多抗體可受益于本發(fā)明Fc變體。例如本發(fā)明的Fc變體可供抗體使用，所述抗體基本上類似于利妥昔單抗(Rituxan_IDEC/Genentech/Roche)(參見，例如US 5,736,137)，一種批準用于治療非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗CD20抗體；HuMax-CD20，一種目前正由Genmab開發(fā)的抗CD20抗體，一種描述于US 5,500,362的抗CD20抗體，AME-133(Applied Molecular Evolution)，hA20(Immunomedics，Inc.)，以及HumaLYM(Intracel)。許多抗體，其靶向表皮生長因子受體家族成員，包括EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)，可受益于本發(fā)明的Fc變體。例如本發(fā)明的Fc變體可供抗體使用，所述抗體基本上類似于曲妥單抗(Herceptin_，Genentech)(參見，例如US 5,677,171)，一種批準用于治療乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗體；目前正由Genentech開發(fā)的pertuzumab(rhuMab-2C4，OmnitagrTM)；一種描述于US 4,753,894的抗Her2抗體；西妥昔單抗(Erbitux_，Imclone)(US 4,943,533；PCT WO 96/40210)，一種在臨床試驗中用于治療多種癌癥的嵌合抗EGFR抗體；目前正由Abgenix/Immunex/Amgen開發(fā)的ABX-EGF(US 6,235,883)；目前正由Genmab開發(fā)的HuMax-EGFr(USSN 10/172,317)；425、EMD55900、EMD62000和EMD72000(Merck KgaA)(US 5558864；Murthy等.1987，Arch BiochemBiophys.252(2)549-60；Rodeck等.，1987，J Cell BiochemI.35(4)315-20；Kettleborough等.，1991，Protein Eng.4(7)；773-83)；ICR62(institute of CancerResearch)(PCT WO 95/20045；Modjtahedi等.，1993，J.Cell Biophys.1993，22(1-3)129-46；Modjtahedi等.，1993，Br J Cancer.1993，67(2)247-53；Modjtahedi等，1996，Br J Cancer，73(2)228-35；Modjtahedi等，2003，Int JCancer，105(2)273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences，Canada and Centrode Immunologia Molecular，Cuba)(US 5,891,996；US 6,506,883；Mateo等，1997，Immunotechnology，3(1)71-81)；mAb-806(Ludwig Institue for CancerResearch，Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth等.2003，Proc Natl Acad Sci USA.100(2)639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX，National CancerInstitute)(PCT WO 0162931A2)；以及SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Fc變體可供阿侖單抗(Campath_，Millenium)使用，阿侖單抗是一種目前已批準用于治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病的人源化單克隆抗體。本發(fā)明的Fc變體可供多種抗體或Fc融合體使用，所述抗體或Fc融合體基本上類似于其它臨床產(chǎn)物和候選物，包括但不限于莫羅單抗(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3_)，一種由OrthoBiotech/Johnson&Johnson開發(fā)的抗CD3抗體，替伊莫單抗(ibritumomabtiaxetan)(Zevalin_)，一種由IDEC/Schering AG開發(fā)的抗CD20抗體，吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg_)一種由Celltech/Wyeth開發(fā)的抗CD33(p67蛋白)抗體，alefacept(Amevive_)，一種由Biogen開發(fā)的抗LFA-3 Fc融合體，由Centocor/Lilly開發(fā)的阿昔單抗(abciximab)(ReoPro_)，由Novartis開發(fā)的巴利昔單抗(basiliximab)(Simulect_)，由Medlmmune開發(fā)的帕利珠單抗(palivizumab)(Synagi_)，英夫利昔單抗(infliximab)(Remicade_)，一種由Centocor開發(fā)的抗TNFα抗體，阿達木單抗(adalimumab)(Humira_)，一種由Abbott開發(fā)的抗TNFα抗體，HumicadeTM，一種由Celtech開發(fā)的抗TNFα抗體，依那西普(etanercept)(Enbrel_)，一種由Immunex/Amgen開發(fā)的抗TNFαFc融合體，ABX-CBL，一種正由Abgenix開發(fā)的抗CD147抗體，ABX-IL8，一種正由Abgenix開發(fā)的抗IL8抗體，ABX-MA1，一種正由Abgenix開發(fā)的抗MUC18抗體，Pemtumomab(R1549，90Y-muHMFG1)，一種正由Antisoma開發(fā)的抗MUC1抗體，Therex(R1550)，一種正由Antisoma開發(fā)的抗MUC1抗體，正由Antisoma開發(fā)的AngioMab(AS1405)，正由Antisoma開發(fā)的HuBC-1，正由Antisoma開發(fā)的Thioplatin(AS1407)，Antegren_(那他珠單抗)，一種正由Biogen開發(fā)的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗體，VLA-1單抗，一種正由Biogen開發(fā)中的抗VLA-1整聯(lián)蛋白抗體，LTBR單抗，一種正由Biogen開發(fā)的抗淋巴毒素β受體(LTBR)抗體，CAT-152，一種正由Cambridge Antibody Technology開發(fā)的抗TGF□2抗體，J695，一種正由Cambridge Antibody Technology和Abbott開發(fā)的抗IL-2抗體，CAT-192，一種正由Cambridge Antibody Technology和Genzyme開發(fā)的抗TGF□1抗體，CAT-213，一種正由Cambridge AntibodyTechnology開發(fā)的抗嗜酸細胞活化趨化因子1抗體，LymphoStat-BTM，一種正由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences INC開發(fā)的抗Blys抗體，TRAIL-R1mAb，一種正由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences，INC開發(fā)的抗TRAIL-R1抗體，AvastinTM(貝伐單抗，rhuMAb-VEGF)，一種正由Genentech開發(fā)的抗VEGF抗體，一種正由Genentech開發(fā)的抗HER受體家族抗體，抗組織因子(ATF)，一種正由Genentech開發(fā)的抗組織因子抗體，XolairTM(Omalizumab)，一種正由Genentech開發(fā)的抗IgE抗體，RaptivaTM(Efalizumab)，一種正由Genentech和Xoma開發(fā)的抗CD11a抗體，正由Genentech和Millenium Pharmaceuticals開發(fā)的MLN-02抗體(以前稱為LDP-02)，HuMax CD4，一種正由Genmab開發(fā)的抗CD4抗體，HuMax-IL15，一種正由Genmab和Amgen開發(fā)的抗IL15抗體，正由Genmab和Medarex開發(fā)的HuMax-布洛芬(Inflam)，HuMax-Cancer，一種正由Genmab和Medarex以及Oxford GcoSciences開發(fā)的抗類肝素酶I抗體，正由Genmab和Amgen開發(fā)的HuMax-Lymphoma，正由Genmab開發(fā)的HuMax-TAC，IDEC-131，一種正由IDEC Pharmaceuticals開發(fā)的抗CD40L抗體，IDEC-151(克立昔單抗)，一種正由IDECPharmaceuticals開發(fā)的抗CD4抗體，IDEC-114，一種正由IDECPharmaceuticals開發(fā)的抗CD80抗體，IDEC-152，一種正由IDECPharmaceuticals開發(fā)的抗CD23抗體，正由IDEC Pharmaceuticals開發(fā)的抗巨噬細胞移動因子(MIF)抗體，BEC2，一種正由Imclone開發(fā)的抗獨特型抗體，IMC-1C11，一種正由Imclone開發(fā)的抗KDR抗體，DC101，一種正由Imclone開發(fā)的抗flk-1抗體，正由Imclone開發(fā)的抗VE鈣粘蛋白抗體，CEA-CideTM(labetuzumab)，一種正由Immunomedics開發(fā)的抗癌胚抗原(CEA)抗體，LymphoCideTM(依帕珠單抗)，一種正由Immunomedics開發(fā)的抗CD22抗體，正由Immunomedics開發(fā)的AFP-Cide，正由Immunomedics開發(fā)的MyelomaCide，正由Immunomedics開發(fā)的LkoCide，正由Immunomedics開發(fā)的ProstaCide，MDX-010，一種正由Medarex開發(fā)的抗CTLA4抗體，MDX-060，一種正由Medarex開發(fā)的抗CD30抗體，正由Medarex開發(fā)的MDX-070，正由Medarex開發(fā)的MDX-018，OsidemTM(IDM-1)，一種正由Medarex和Immuno-Designed Molecules開發(fā)的抗Her2抗體，HuMaXTM-CD4，一種正由Medarex和Genmab開發(fā)的抗CD4抗體，HuMax-IL15，一種正由Medarex和Genmab開發(fā)的抗IL-15抗體，CNTO 148，一種正由Medarex和Centocor/J&J開發(fā)的抗TNF□抗體，CNTO 1275，一種正由Centocor/J&J開發(fā)的抗細胞因子抗體，MOR101和MOR102，正由MorphoSys開發(fā)的抗細胞間粘附因子-1(ICAM-1)(CD54)抗體，MOR201，一種正由MorphoSys開發(fā)的抗成纖維細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗體，Nuvion(visilizumab)，一種正由Protein Design Labs開發(fā)的抗CD3抗體，HuZAFTM，一種正由ProteinDesign Labs開發(fā)的抗γ干擾素抗體，正由Protein Design Labs開發(fā)的抗□5□1整聯(lián)蛋白抗體，正由Protein Design Labs開發(fā)的抗IL-12，ING-1，一種正由Xoma開發(fā)的抗Ep-CAM抗體，以及MLN01，一種正由Xoma開發(fā)的抗β2整聯(lián)蛋白抗體。應(yīng)用Fc變體于上述抗體及Fc融合體的臨床產(chǎn)物和候選物中不應(yīng)受它們明確組成所約束。本發(fā)明的Fc變體可摻入到上述臨床候選物和產(chǎn)物中，或摻入到基本上與它們類似的抗體和Fc融合體中。本發(fā)明的Fc變體可摻入到上述臨床候選物和產(chǎn)物的人源化的、親和力成熟的、工程的或以一些其它方法修飾的型式中。此外，無需使用上述臨床產(chǎn)物和候選物的完整多肽來構(gòu)建摻入本發(fā)明的Fc變體的新的抗體或Fc融合體；例如僅使用臨床產(chǎn)物或候選物抗體的可變區(qū)，基本上相似的可變區(qū)，或可變區(qū)的人源化的、親和力成熟的、工程的或修飾的型式。在另一個實施方案中，本發(fā)明的Fc變體可供抗體或Fc融合體使用，所述抗體或Fc融合體能結(jié)合上述臨床產(chǎn)物和候選物之一的相同表位、抗原、配體或受體。本發(fā)明的Fc變體可供不同抗體和Fc融合體使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體是一種治療、診斷或研究試劑，優(yōu)選是一種治療試劑?？蛇x地，本發(fā)明的抗體和Fc融合體可用于農(nóng)業(yè)或工業(yè)用途。在一個可選的實施方案中，本發(fā)明的Fc變體組成可用實驗方法篩選的文庫。該文庫可以是一列核苷酸或氨基酸序列，或可以是編碼文庫序列的核酸或多肽的物理組合物。Fc變體可供單克隆或多克隆抗體組合物使用。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體可用于殺死具有靶抗原的靶細胞，例如癌細胞。在一個可選的實施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體用于阻斷、拮抗(antagonize)或激動(agonize)靶抗原，例如用于拮抗細胞因子或細胞因子受體。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體用于阻斷、拮抗或?qū)拱锌乖⑺谰哂性摪锌乖陌屑毎?。本發(fā)明的Fc變體可用于不同的治療目的。在一個優(yōu)選的實施方案中，施用Fc變體蛋白質(zhì)于患者以治療與抗體相關(guān)的病癥。對于本發(fā)明的目的而言，“患者”包括人和其它動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人。因此本發(fā)明的抗體和Fc融合體可用于治療人和牲畜。在優(yōu)選的實施方案中，患者是哺乳動物，在最優(yōu)選的實施方案中，患者是人。本發(fā)明中術(shù)語“治療”意指對于疾病或病癥包括治療性處理，也包括預(yù)防性或抑制性方法。因此，舉例來說，在疾病發(fā)作前成功施用抗體或Fc融合體以產(chǎn)生疾病治療作用。如其它實例，在疾病臨床表現(xiàn)后成功施用優(yōu)化的抗體或Fc融合體以抗疾病癥狀，包含了疾病的治療?！爸委煛币舶诩膊“l(fā)作后施用優(yōu)化的抗體或Fc融合體蛋白質(zhì)以便根除疾病。在發(fā)作以及臨床癥狀發(fā)生后成功地施用試劑，有可能消除臨床癥狀并改善疾病，包含了治療該疾病。那些“需要治療的”包括已經(jīng)患有疾病或病癥的哺乳動物，也包括那些易患疾病或病癥的那些，包括疾病或病癥要得到預(yù)防的那些。本文中“抗體相關(guān)的病癥”或“抗體應(yīng)答的病癥”或“病癥”或“疾病”意指通過施用包含本發(fā)明的抗體或Fc融合體的藥物組合物可得到改善的病癥?？贵w相關(guān)的病癥包括但不限于自身免疫性疾病、免疫性疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、和包括癌癥的腫瘤性以及瘤形成疾病。本文中“癌癥”和“癌性的”指的是或描述為哺乳動物中的生理狀態(tài)，其一般通過未調(diào)節(jié)的細胞生長得到鑒定。癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間皮瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、腺瘤、黑素瘤以及非白血性白血病或淋巴惡性腫瘤。上述癌癥更具體的實例包括鱗狀細胞癌(如，鱗狀上皮細胞癌)、肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌以及肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤，也包括頭癌和頸癌。此外，本發(fā)明的Fc變體可用于治療的病癥包括但不限于充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤瘡、濕疹、心肌炎和其它心肌病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細胞增生以及骨髓基質(zhì)瘤；骨質(zhì)丟失；變形性骨炎(paget’sdisease)、破骨細胞瘤；多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、失用型骨質(zhì)減少；營養(yǎng)不良、牙周病、家族性脾性貧血、朗罕氏細胞組織細胞增多病、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、皮質(zhì)醇增多癥、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多發(fā)性骨纖維性發(fā)育不良、牙周再建以及骨折；肉樣瘤病；多發(fā)性骨髓瘤；溶骨癌(osteolytic bone cancers)、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛治療和體液惡性高鈣血癥、強直性脊椎炎和其它脊椎關(guān)節(jié)??；移植排斥、病毒感染、血液瘤以及類瘤形成病癥例如何杰金氏淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(Burkitt′s淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞性白血病、蕈樣肉芽腫病、外套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌漫性巨大B細胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細胞性白血病以及淋巴漿細胞性白血病)、淋巴細胞前體細胞腫瘤、包括B細胞急性成淋巴細胞性非白血性白血病/淋巴瘤、也T細胞急性成淋巴細胞性非白血性白血病/淋巴瘤，胸腺瘤、成熟T和NK細胞腫瘤，包括外周T細胞非白血性白血病、成熟T細胞非白血性白血病/T細胞淋巴瘤以及大顆粒狀淋巴細胞性白血病、朗罕氏細胞組織細胞增多癥、諸如急性骨髓性粒細胞性白血病的骨髓瘤形成，包括成熟的急性骨髓性白血病(AML)、分化的急性骨髓性白血病、急性前髓細胞性白血病、急性骨髓單核細胞性白血病、和急性單核細胞性白血病、脊髓發(fā)育不良綜合征、慢性骨髓增生病，包括慢性髓細胞性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，如腦腫瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、星細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、室管膜細胞瘤和視網(wǎng)膜成神經(jīng)細胞瘤)、實體瘤(鼻咽癌、基底細胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波氏肉瘤、睪丸癌、子宮、陰道或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、以及血管系統(tǒng)腫瘤(血管肉瘤和hemagiopericytoma)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、脊椎關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸疾病(IBD)、敗血癥和敗血癥性休克、節(jié)段性回腸炎、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰島移植排斥(allogenic islet graft rejection)、血液惡性腫瘤諸如多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、腫瘤相關(guān)的炎癥、周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘性病。在一個實施方案中，將本發(fā)明的抗體或Fc變體施用于患病的患者，所述疾病涉及蛋白質(zhì)的不適當表達。在本發(fā)明范圍內(nèi)，其意指包括以異常蛋白質(zhì)為特征的疾病和病癥，例如基于改變蛋白質(zhì)存在的數(shù)量、存在突變蛋白質(zhì)，或兩者的疾病或病癥。蛋白質(zhì)過量可基于任何原因，包括但不限于在分子水平上過表達、在作用部位出現(xiàn)持續(xù)很久或蓄積、或相對于正常增加了蛋白質(zhì)活性。以蛋白質(zhì)減少為特征的疾病和病癥也包括在該定義內(nèi)。所述減少可基于任何原因，包括但不限于在分子水平上減少的表達、在作用部位出現(xiàn)減小或減少、蛋白質(zhì)的突變體形式、或相對于正常減少了蛋白質(zhì)活性。上述相對于蛋白質(zhì)正常表達、出現(xiàn)或活性的蛋白質(zhì)過多或減少可得到測定，所述的測定在開發(fā)和/或臨床試驗本發(fā)明的抗體和Fc變體中可扮演一個重要角色。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體僅作為治療活性劑施用于患者?？蛇x地，本發(fā)明的抗體或Fc融合體與一種或多種其它治療劑聯(lián)合施用，包括但不限于細胞毒素劑、化學治療劑、細胞活素類、生長抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管生成劑、保心藥或其它治療劑。上述分子以合適的化合物形式和量存在，以有效地用于預(yù)期目的。有經(jīng)驗的醫(yī)師可憑經(jīng)驗確定其它用于本文治療劑的合適劑量。本發(fā)明的抗體和Fc融合體可伴隨一種或多種其它治療方案施用。舉例來說，本發(fā)明的抗體或Fc融合體隨同化學療法、放射療法或兩者一起施用于患者。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體可聯(lián)合一種或多種可能包含或可能不包含本發(fā)明Fc變體的抗體或Fc融合體施用。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體與化學治療劑一起施用。本文中使用的“化學治療劑”意指在癌癥治療中使用的化合物?；瘜W治療劑的實例包括但不限于諸如硫替派和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)的烷基化劑；諸如白消安、英丙舒凡和嗪消安的烷基磺酸鹽類；諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥多巴(meturedopa)和烏瑞多巴(uredopa)的氮丙啶類；乙烯亞胺類和甲基蜜胺類(methylamelamines)包括六甲密胺、三亞胺嗪、trietylenephosphoramide、三亞乙基硫化磷酰胺和trimethylolomelamine；氮芥類諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷雌氮芥、異磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氧氮芥鹽酸化物、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥；諸如卡氮芥、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀的硝脲類；諸如aclacinomysins、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、刺孢霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、派來霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅比多星、鏈黑霉素、鏈唑霉素，殺結(jié)核菌素、烏苯美司、新制癌菌素、佐柔比星的抗生素；諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代謝物；諸如二甲葉酸、氨甲葉酸、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特的葉酸類似物；諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤的嘌呤類似物；諸如鹽酸環(huán)胞苷、氮雜胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU的嘧啶類似物；諸如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯的雄激素；諸如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦的抗腎上腺素；諸如frolinic acid的葉酸補充劑；乙酰葡醛酸內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基戊酮酸；安吖啶；bestrabucil；比山群；依達曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethyl hydrazide)；丙卡巴肼；PSK_；雷佐生；施佐非蘭；鍺螺胺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL_，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和紫杉萜(TAXOTERE_，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；諸如順鉑和卡鉑的鉑類似物；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；卡培他濱；胸腺嘧啶核苷酸合酶抑制劑(諸如拓優(yōu)得)；諸如celicoxib(CELBREX，MK-0966(VIOXX_)的cox-2抑制劑；以及任一上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。在腫瘤上產(chǎn)生調(diào)節(jié)或抑制激素結(jié)果的抗激素劑也包括于該定義中，諸如抗雌激素類包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羥泰米芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY 117018，奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素類諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任一上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物?；瘜W治療劑或其它細胞毒素劑可作為前藥施用。本文中使用的“前藥”意指藥學上活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，與母體藥物相比其對腫瘤細胞具有較小的細胞毒性，并且可被酶活化或轉(zhuǎn)化為更具活性的母體形式。參見，例如Wilman，1986，Biochemical Society Transactions，615th MeetingBelfast，14375-382；和Stella等.，″ProdrugsA Chemical Approach to TargetedDrug Delivery，″Directed Drug Delivery，Borchardt等.，(ed.)247-267，Humana Press，1985?？晒┍景l(fā)明使用的前藥包括但不限于含有磷酸鹽前藥、含有硫代硫酸鹽前藥、含有硫酸鹽前藥、含肽前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含有β-內(nèi)酰胺前藥、含有任選地取代的苯氧基乙酰胺前藥或含有任選地取代的苯乙酰胺前藥、5-氟胞嘧啶和其它的5-氟脲嘧啶前藥，上述前藥能轉(zhuǎn)化為更具活性的細胞毒性游離藥物。用于與本發(fā)明的抗體和Fc融合體一起使用并衍生自前藥形式的細胞毒性藥物的實例包括但不限于任一上述化學治療劑。本發(fā)明的抗體和Fc融合體可結(jié)合其它治療方案。例如，在一個實施方案中，要用抗體或Fc融合體治療的患者也可接受放射治療。放射治療可依據(jù)本領(lǐng)域所采用的和本領(lǐng)域技術(shù)員所公知的常規(guī)實驗設(shè)計進行。上述治療包括但不限于銫、銥、碘或鈷輻射。該放射治療可全身照射，或可對體內(nèi)或體表上特定部位或組織局部定向照射，該特定部位或組織例如肺、膀胱或前列腺。一般而言，放射治療每隔約1-2周時間以脈沖形式進行。然而，放射治療可間隔更長時間進行。例如，對患有頭癌和頸癌的患者進行放射治療可間隔約6-7周。任選地，放射治療可以單劑量或多劑量、連續(xù)劑量的形式進行。有經(jīng)驗的醫(yī)師可憑經(jīng)驗確定用于本文的放射治療的合適劑量。依照本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明的抗體或Fc融合體以及一種或多種其它抗癌療法用于治療離體癌細胞。應(yīng)當預(yù)計到上述離體治療可應(yīng)用于骨髓移植，以及具體地應(yīng)用于自體骨髓移植。舉例來說，如上所述在受體患者中可用抗體或Fc融合體與一種或多種其它抗癌療法治療含有癌細胞的細胞或組織，以在移植前排除或基本上排除癌細胞。當然，應(yīng)當預(yù)計到本發(fā)明的抗體和Fc融合體還可與諸如外科手術(shù)的其它治療技術(shù)聯(lián)合使用。在一個可選的實施方案中，本發(fā)明的抗體和Fc融合體與細胞因子一起施用。本文中使用的“細胞因子”意指一種細胞群所釋放的對其它細胞起細胞間介質(zhì)作用的蛋白質(zhì)的通稱。上述細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子以及傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括諸如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素的生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)的糖蛋白激素；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒氏抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；諸如NGF-β的神經(jīng)生長因子；血小板生長因子；諸如RGF-α和TGF-β的轉(zhuǎn)化生長因子(TGFs)；胰島素樣生長因子-I和II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；諸如α、β、γ-干擾素的干擾素；諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)、粒細胞巨噬細胞-CSF(CM-CSF)和粒細胞-CSF(G-CSF)的集落刺激因子(CSFs)；諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15的白介素(ILs)；諸如TNF-α或THF-β的腫瘤壞死因子；以及其它多肽因子，包括LIF和試劑盒配體(kitligand)(KL)。當在本文中使用時，術(shù)語細胞因子包括天然來源或重組細胞培養(yǎng)基來源的蛋白質(zhì)，以及天然序列細胞因子生物學上的活性等價物。其它許多治療劑可供與本發(fā)明的抗體和Fc融合體一起施用。在一個實施方案中，抗體或Fc融合體與抗血管生成劑一起施用。本文中使用的“抗血管生成劑”意指一種可阻斷或以某種程度干擾血管發(fā)育的化合物。例如，抗血管生成因子可以是一種小分子或蛋白質(zhì)，例如是一種抗體、Fc融合體或細胞因子，其能結(jié)合與血管發(fā)生有關(guān)的生長因子或生長因子受體。本文中優(yōu)選的抗血管生成因子是能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的一種抗體。在一個可選的實施方案中，抗體或Fc融合體與能誘導(dǎo)或增強獲得性免疫應(yīng)答的治療劑一起施用，例如一種能靶向CTLA-4的抗體。在一個可選的實施方案中，抗體或Fc融合體與酪氨酸激酶抑制劑一起施用。本文中使用的“酪氨酸激酶抑制劑”意指一種在某種程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。上述抑制劑的實例包括但不限于喹唑啉(quinazoline)，諸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，諸如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并(2，3-d)嘧啶；姜黃素(curcumin)(姜黃素，4，5-雙(4-氟代苯胺基)鄰苯二甲酰二胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制劑；PD-0183805(Warner-Lambert)；反義分子(如，與ErbB編碼核酸結(jié)合的那些)；喹啉(US5,804,396)；tryphostins(US 5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；諸如C1-1033(Pfizer)的全ErbB抑制劑；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊馬替尼(STI571，Gleevec_；Novartis)；PK1166(Novartis)；GW2016(GLAXO SmithKline)；C1-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或如在下列任一專利申請中所述的抑制劑US 5,804,396；PCT WO 99/09016(American Cyanimid)；PCTWO 98/43960(American Cyanamid)；PCT WO 97/38983(Warner-Lambert)；PCT WO 99/06378(Warner-Lambert)；PCT WO 99/06396(Warner-Lambert)；PCT WO 96/30347(Pfizer，Inc)；PCT WO 96/33978(AstraZeneca)；PCTWO96/3397(AstraZeneca)；PCT WO 96/33980(AstraZeneca)，gefitinib(IRESSATM，ZD1839，AstraZeneca)，和OSI-774(TarcevaTM，OSIPharmaceuticals/Genentech)。在一個可選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體與另外的治療化合物偶聯(lián)或可操作地連接。所述治療化合物可以是一種細胞毒素劑、化學治療劑、毒素、放射性同位素、細胞因子或其它治療活性劑。可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備抗體或Fc融合體與細胞毒素劑的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)劑諸如N-琥珀酰-3-(2-聯(lián)硫基吡啶)-丙酸鹽(SPDP)、琥珀酰-4-(N-maleimidomethyl)環(huán)己烷-1-羧酸鹽、巰醇亞胺(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如二甲基己二亞酰胺化氯化氫)、活化酯類(諸如二琥珀酰辛二酸鹽)、醛類(諸如戊二醛)、二疊氮基化合物(諸如二(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)、二重氮基衍生物(諸如二-(對-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸鹽類(諸如tolyene 2，6-二異氰酸鹽)以及雙活化氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可根據(jù)Vitetta等.，1971，Science 2381098中所述方法制備蓖麻毒素免疫毒素。碳14標記的1-異硫代氰氧基芐基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的典型的螯合劑(cheating agent)。參見PCT WO 94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒類藥物的可裂解接頭。舉例來說，可使用對酸敏感的接頭、對肽酶敏感的接頭、二甲基接頭或含有二硫化物的接頭(Chari等.，1992，CancerResearch 52127-131)?？蛇x地，所述抗體或Fc融合體可操作地與治療劑連接，如通過重組技術(shù)或肽合成。如上已描述了用于偶聯(lián)到本發(fā)明抗體和Fc融合體上的化學治療劑。在一個可選的實施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯(lián)到或可操作地連接到毒素上，包括但不限于小分子毒素和細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。小分子毒素包括但不限于刺孢毒素(calicheamicin)、美登素(US 5,208,020)、trichothene和CC1065。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯(lián)到一種或多種美登素分子上(如，每抗體分子約1-10個美登素分子)。例如，美登素也可轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，其可還原為May-SH3并與修飾的抗體或Fc融合體反應(yīng)(Chari等.，1992，Cancer Research 52127-131)以產(chǎn)生美登素-抗體或美登素-Fc融合體偶聯(lián)物。另一種感興趣的偶聯(lián)反應(yīng)包含將抗體或Fc融合體偶聯(lián)到一種或多種刺孢毒素分子上。所述刺孢毒素抗生素家族在亞皮摩爾濃度下能產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂物?？墒褂玫拇替叨舅氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ11、□21、□3、N-乙酰基-γ11、PSAG和Θ11，(Hinman等.，1993，Cancer Research 533336-3342；Lode等.，1998，Cancer Research 582925-2928)(US 5,714,586；US 5,712,374；US 5,264,586；US 5,773,001)。多拉司他汀(Dolastatin)10類似物，----如可供本發(fā)明Fc變體偶聯(lián)使用的auristatin E(AE)和monomethylauristatin E(MMAE)(Doronina等.，2003，Nat Biotechnol 21(7)778-84；Francisco等.，2003 Blood 102(4)1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美國商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制物、白樹毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素以及單端孢霉烯族毒素。參見，例如，PCT WO 93/21232。本發(fā)明也涉及一種本發(fā)明的抗體或Fc融合體與具有溶核活性的化合物形成的偶聯(lián)物或融合體，所述化合物例如核糖核酸酶或諸如脫氧核糖核酸酶(Dnase)的DNA核酸內(nèi)切酶。在一個可選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體可偶聯(lián)或可操作地連接放射性同位素以形成放射性偶聯(lián)物。許多放射性同位素可用于產(chǎn)生抗體和Fc融合體的放射性偶聯(lián)物。實例包括但不限于，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或Fc融合體可偶聯(lián)“受體”(諸如鏈霉抗生物素蛋白)用作為腫瘤前靶(pretargeting)，其中所述抗體-受體或Fc融合體-受體偶聯(lián)物施用于患者，接著使用清除劑從循環(huán)系統(tǒng)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用偶聯(lián)細胞毒素劑(如，放射性核苷酸)的“配體”(如，抗生物素蛋白)。在一個可選的實施方案中，所述抗體或Fc融合體偶聯(lián)或可操作地連接于酶以便進行抗體依賴性酶介導(dǎo)前藥療法(ADEPT)。ADEPT可通過將所述抗體或Fc融合體與前藥激活酶偶聯(lián)或可操作地連接而進行，該前藥激活酶可轉(zhuǎn)化前藥(如，肽?；瘜W治療劑，參見PCT WO81/01145)為活化的抗癌藥物。參見，例如PCT WO 88/07378和US4,975,278。用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括任何能以使得前藥轉(zhuǎn)化為更具活性、細胞毒性形式的這樣一種方式激活前藥的酶。用于本發(fā)明方法中的酶包括但不限于用于將含有磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有硫酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于將無毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶以及組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)的蛋白酶，其可用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物(freedrug)；D-丙氨?；入拿?，用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代物的前藥；諸如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶的糖裂解酶，用于將糖基化前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；β-內(nèi)酰胺酶，用于將α-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將在其胺的氮原子處分別用苯氧基乙?；虮揭阴；〈苌乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物?？蛇x地，在本領(lǐng)域中也已知為“抗體酶(abzymes)”的具有酶活性的抗體可用于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)化為活性的游離藥(參見，例如Massey，1987，Nature 328457-458)。可制備抗體-抗體酶和Fc融合體-抗體酶偶聯(lián)物用于遞送抗體酶至腫瘤細胞群中。應(yīng)當預(yù)料到在本文中還有本發(fā)明抗體和Fc融合體的其它修飾。例如，所述抗體或Fc融合體可連接有多種非蛋白質(zhì)聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。應(yīng)當預(yù)料到用本發(fā)明抗體或Fc融合體與一種或多種治療活性劑配制的藥物組合物。通過將所述具有所需純度的抗體或Fc融合體與任選的藥學上可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合制備用于存儲的本發(fā)明的抗體和Fc融合體的劑型(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.，1980)，為凍干劑型或水溶液形式。可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑所使用的劑量或濃度對于接受者是無毒的，包括緩沖液諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯己雙銨、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、苯酚、丁基orbenzyl醇、諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯的烷基對羥基苯甲酸酯類、兒茶酚、雷瑣酚、環(huán)己醇、3-戊醇以及間甲酚)；低分子量(低于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；諸如聚乙烯吡咯酮的親水聚合物、諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸的氨基酸、單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精、諸如EDTA的螯合劑、諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇的糖類、甜味劑和其它調(diào)味劑、諸如微晶纖維素、乳糖、玉米及其它淀粉的充填劑、粘合劑、添加劑、著色劑、諸如鈉的成鹽反離子金屬復(fù)合物(如鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和/或諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)的非離子表面活性劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述包含本發(fā)明的抗體或Fc融合體的藥物組合物以水溶形式存在，諸如以藥學上可接受的鹽存在，其意指包括酸和堿加成鹽?！八帉W上可接受的酸加成鹽”指的是那些保持游離堿生物有效性且是非生物學或在其它方面不需要的鹽類，與諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的無機酸以及諸如乙酸、丙酸、羥乙酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、枸櫞酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等的有機酸所加成的?！八帉W上可接受的堿加成鹽”包括那些衍生自諸如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽等的無機堿類的那些。特別優(yōu)選的是銨、鉀、鈉、鈣和鎂鹽。衍生自藥學可接受的有機無毒堿類包括伯、仲和叔胺、取代的胺包括天然存在的取代的胺、環(huán)胺以及陽離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。用于體內(nèi)給藥的劑型優(yōu)選無菌的。通過無菌過濾膜或其它方法可容易地達到無菌目的。本文所公開的抗體和Fc融合體也可配制為免疫脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一種小的囊狀體，包含不同類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑，用于遞送治療劑予哺乳動物。通過諸如描述于Epstein等.，1985，Proc Natl Acad SciUSA，823688；Hwang等.，1980，Proc Natl Acad Sci USA，774030；US4,485,045；US 4,544,545；和PCT WO 97/38731中的本領(lǐng)域公知方法可制備含有所述抗體或Fc融合體的脂質(zhì)體。具有增強的循環(huán)時間的脂質(zhì)體公開于US 5,013,556。脂質(zhì)體的組分通常以雙分子層的形式排列，類似于生物膜的脂質(zhì)排列方式。可將包含卵磷脂、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法制備得到特別有用的脂質(zhì)體。通過具有確定孔徑的過濾器將脂質(zhì)體擠出以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。化學治療劑或其它治療活性劑可任選地包含于脂質(zhì)體中(Gabizon等.，1989，JNational Cancer Inst 811484)。抗體、Fc融合體和其它治療活性劑也可包被于微膠囊中，通過包括但不限于凝聚技術(shù)、界面聚合法(例如使用羥甲基豆素或明膠微膠囊或聚(甲基丙烯酸酯)微膠囊)、膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微膠囊、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)以及粗乳狀液(macroemulsion)的方法制備得到。上述技術(shù)公開于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.，1980?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑合適的實例包括固相疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)以成型制品的形式存在，如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和鬩一γ乙基-谷氨酸酯的共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)的可降解乳酸-乙醇酸共聚物、聚-D-(-)-3-羥基丁酸以及ProLease_，(可從Alkermes購得)，其是一種由所需生物活性分子摻入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基質(zhì)組成的基于微球體的遞藥系統(tǒng)。在制劑中本發(fā)明的治療活性抗體或Fc融合體的濃度可從約0.1變化為100重量％。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或Fc融合體的濃度在0.003-1.0摩爾的范圍內(nèi)。為了治療患者，可給予本發(fā)明的抗體或Fc融合體的治療有效劑量。本文中“治療有效劑量”意指對于其所施用的能產(chǎn)生效果的劑量。精確的劑量將依賴于治療的目的，并可為本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用公知技術(shù)所確定。劑量范圍可為0.01-100mg/kg體重或更大，例如0.1、1、10或50mg/kg體重，優(yōu)選1-10mg/kg。如本領(lǐng)域所公知，對于抗體或Fc融合體降解、全身性或局部性遞藥和新蛋白酶合成速率，以及年齡、體重、大致健康狀況、性別、飲食、給藥時間、藥物相互作用以及病癥的嚴重程度而言，調(diào)整可以是必須的，并可由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員通過常規(guī)的實驗方法來確定。包含本發(fā)明抗體或Fc融合體的藥物組合物優(yōu)選以無菌水溶液形式施用，可以多種方法進行，包括但不限于經(jīng)口、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、耳內(nèi)(intraotically)、經(jīng)皮、局部(如凝膠劑、油膏劑、洗劑、霜劑等)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)(如，AERx_吸入技術(shù)，購自Aradigm，或InhanceTM肺遞藥系統(tǒng)，購自Inhale Therapeutics)、經(jīng)陰道、腸胃外、經(jīng)直腸或眼內(nèi)施用。在一些實例中，例如對于治療創(chuàng)傷、炎癥等而言，所述抗體或Fc融合體可直接以溶液或噴霧劑的形式應(yīng)用。如本領(lǐng)域所公知，可依據(jù)導(dǎo)入方式相應(yīng)地配制所述藥物組合物。
工程方法[122]本發(fā)明提供了可用于產(chǎn)生Fc變體的工程方法。阻礙先前Fc工程嘗試的主要障礙在于僅有隨機修飾已成為可能，部分是由于無效的工程策略及方法，以及由于抗體生產(chǎn)和篩選的低通量特性。本發(fā)明描述了能克服這些缺陷的工程方法。涉及多種設(shè)計策略、計算篩選方法、文庫產(chǎn)生方法和實驗生產(chǎn)和篩選方法。這些策略、途徑、技術(shù)和方法可單獨應(yīng)用或以不同的組合方式應(yīng)用以設(shè)計優(yōu)化的Fc變體。
設(shè)計策略[123]產(chǎn)生對所需特性優(yōu)化的Fc變體的最有效方法是針對目的指導(dǎo)工程研究計劃。因此，本發(fā)明教導(dǎo)了可用于設(shè)計優(yōu)化的Fc變體的設(shè)計策略。設(shè)計策略的使用意在指導(dǎo)Fc工程改造，但基于用于設(shè)計Fc變體的設(shè)計策略，并不意在將其限制為特定的優(yōu)化特性。初一想，其可能看來像是違反直覺，然而其有效性是得自可確定蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和功能的微妙相互作用的龐大的復(fù)雜性。盡管可盡力預(yù)測對于設(shè)計目的而言重要的蛋白質(zhì)位置、殘基、相互作用等，但是時常地關(guān)鍵的某些因素卻無法預(yù)測。通常無法預(yù)測對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性以及功能的影響是否是有利的或不利的。然而卻有無數(shù)的對蛋白質(zhì)有損或有害的氨基酸修飾存在。因此通常地，最好的工程方法來自產(chǎn)生可通常聚焦于設(shè)計目的而不導(dǎo)致有害效應(yīng)的蛋白質(zhì)變體。因此，設(shè)計策略主要的目標在于產(chǎn)生特性多樣性(quality diversity)。在一個過分簡單化的水平(simplistic level)上，其可被認為是人們所偏愛的可能性的疊加。例如，對如下所述的Fc糖或特定的結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域夾角的微擾，對于產(chǎn)生優(yōu)化的Fc變體而言是有效的設(shè)計策略，盡管事實上無法充分理解糖和結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域夾角如何決定Fc的特性。減少有害氨基酸數(shù)量的修飾即為篩選，即通過特性多樣性篩選，這些設(shè)計策略可具有實用性。因此本發(fā)明中所教導(dǎo)的設(shè)計策略的真實價值在于它們能直接將工程研究計劃應(yīng)用于產(chǎn)生有價值的Fc變體。在實驗后可確定任一所產(chǎn)生變體的特定價值。提供了一種用于設(shè)計Fc變體的設(shè)計策略，其中在Fc與所述的Fc配體的界面上通過設(shè)計氨基酸修飾改變了Fc與一些Fc配體的相互作用。本文中Fc配體可包括但不限于FcγRs、C1q、FcRn、蛋白A或G等。通過在能量方面探查位于對結(jié)合界面產(chǎn)生影響的Fc位置的有利取代，可設(shè)計變體，對新的界面構(gòu)象采樣，其中一些與Fc配體的結(jié)合可得到改善，一些與Fc配體的結(jié)合減少了，以及一些可具有其它有利特性。上述新的界面構(gòu)象起因可能在于，例如，形成該界面的殘基與Fc配體的直接作用，或由于諸如側(cè)鏈或主鏈構(gòu)象微擾的氨基酸修飾所引起的間接作用?？蛇x擇據(jù)信在確定界面的構(gòu)象中扮演重要角色的位置為可變位置。例如，可選擇這樣一組殘基作為可變位置，該殘基與Fc配體直接接觸的任意殘基在一定距離范圍內(nèi)，例如5埃(A)，優(yōu)選1-10A。提供了一種用于產(chǎn)生Fc變體的額外設(shè)計策略，其中在N297的Fc糖構(gòu)象得到優(yōu)化。在上下文中使用的優(yōu)化意在包括N297糖構(gòu)象和組成的改變，其產(chǎn)生了所需特性，例如增加或減少了對FcγR的親和力。通過所觀察到的糖結(jié)構(gòu)和構(gòu)象顯著地影響了Fc/FcγR以及Fc/C1q結(jié)合，支持了上述策略(Umana等.，1999，Nat Biotechnol 17176-180；Davies等.，2001，Biotechnol Bioeng 74288-294；Mimura等.，2001，J Biol Chem 27645539-45547.；Radaev等，2001，J Biol Chem 27616478-16483；Shields等.，2002，J Biol Chem 27726733-26740；Shinkawa等.，2003，J Biol Chem 2783466-3473)。但是，該糖并不具體接觸FcγRs。通過在能量方面探查對糖有影響的位置上的有利取代，可設(shè)計變體的特性多樣性，對新的糖類構(gòu)象采樣，其中一些改善了與一種或多種Fc配體的結(jié)合，但另一些減少了。雖然大多數(shù)接近Fc/糖界面的突變似乎改變了糖構(gòu)象，但是已顯示了一些突變改變了糖基化組合物(Lund等.，1996，J Immunol 1574963-4969；Jefferis等.，2002，Immunol Lett 8257-65)。提供了另一種用于產(chǎn)生Fc變體的設(shè)計策略，其中Cγ2和Cγ3結(jié)構(gòu)域之間的夾角得到優(yōu)化。在上下文中使用的優(yōu)化意在描述Cγ2-Cγ3結(jié)構(gòu)域夾角的構(gòu)象改變，其產(chǎn)生了所需特性，例如增加或減少了對FcγR的親和力。所述夾角是Fc/FcγR親和力的重要決定因素(Radaev等.，2001，J BiolChem 27616478-16483)，且許多Fc/FcγR界面遠端的突變通過調(diào)節(jié)該夾角而影響了結(jié)合的可能性(Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604)。通過在能量方面探查在確定Cγ2-Cγ3夾角以及相對于彼此之間的結(jié)構(gòu)域柔性中似乎扮演著一種關(guān)鍵角色的有利取代位置，可設(shè)計變體的特性多樣性，對新的夾角和柔性水平采樣，對于所需Fc特性而言其中一些得到了優(yōu)化。提供了另一種用于產(chǎn)生Fc變體的設(shè)計策略，其中再改造Fc以消除對糖基化的結(jié)構(gòu)與功能依賴性。該設(shè)計策略包括在缺乏N297糖的條件下優(yōu)化Fc結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和/或Fc功能(例如Fc對一種或多種Fc配體的親和力)。在一種方法中，暴露于溶劑的位置在缺乏糖基化的條件下得到改造，使它們穩(wěn)定、在結(jié)構(gòu)上與Fc結(jié)構(gòu)相容、且不具有聚集的傾向。在抗體中Cγ2僅是未配對的Ig結(jié)構(gòu)域(參見圖1)。因此N297糖覆蓋了通常作為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)與其它Ig結(jié)構(gòu)域相互作用界面的暴露的疏水區(qū)，維持了Fc穩(wěn)定性以及結(jié)構(gòu)整體性，并阻止了Cγ2結(jié)構(gòu)域越過中心軸的聚集。用于優(yōu)化非糖基化Fc的方法可包括但不限于設(shè)計通過摻入在內(nèi)部面向Cγ2-Cγ2二聚體軸的極性和/或荷電的殘基以增強非糖基化Fc穩(wěn)定性和/或溶解性的氨基酸修飾，以及通過設(shè)計直接增加非糖基化Fc/FcγR界面或非糖基化Fc與其它一些Fc配體的界面的氨基酸修飾。提供了另一種用于設(shè)計Fc變體的設(shè)計策略，其中Cγ2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象得到優(yōu)化。在上下文中使用的優(yōu)化意在描述Cγ2結(jié)構(gòu)域夾角的構(gòu)象改變，其產(chǎn)生了所需特性，例如增加或減少了對FcγR的親和力。通過在能量方面探查對Cγ2構(gòu)象發(fā)生影響的Cγ2位置上的有利取代，可設(shè)計變體的特性多樣性，對新的Cγ2構(gòu)象采樣，其中一些可達到設(shè)計目的。上述新的Cγ2構(gòu)象起因可能在于，例如，通過對變體采樣所得的可選的主鏈構(gòu)象?？蛇x擇如任意位置的可變位置，據(jù)信在確定C□2結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性、柔性、功能等的過程中其扮演著一種重要角色。例如，Cγ2疏水核心殘基，其是部分或全部地與溶劑隔絕的Cγ2殘基，可得到再改造?？蛇x地，可考慮非核心(noncore)殘基，或認為對決定主鏈結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或柔性重要的殘基。提供了另一種用于Fc優(yōu)化的設(shè)計策略，其中通過調(diào)節(jié)Fc與所述Fc配體之間的靜電作用的修飾改變了與FcγR、補體或其它一些Fc配體的結(jié)合。上述修飾可認為是對Fc的整體靜電特性的優(yōu)化，并包括了用荷電氨基酸取代中性氨基酸、用中性氨基酸取代荷電氨基酸或用帶相反電荷(即反向電荷)的氨基酸取代荷電氨基酸。上述修飾可用于影響Fc和一種或多種Fc配體之間的結(jié)合親和力的改變，所述Fc配體例如FcγRs。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用用于計算靜電勢的多種眾所周知的方法之一來選擇可影響結(jié)合的靜電取代位置。在最簡單的實施方案中，庫侖定律用于產(chǎn)生作為在蛋白質(zhì)中該位置功能的靜電勢。另外的實施方案包括了使用德拜-休克爾標度(Debye-Huckel scaling)來計算離子強度的影響，以及在更復(fù)雜的實施方案中使用諸如泊松-玻耳茲曼(Poisson-Boltzmann)計算。上述靜電計算可使位置突出并暗示了可達到設(shè)計目的的特定氨基酸修飾。在某些情況下，可預(yù)計這些取代對結(jié)合不同的Fc配體具有不同的影響，例如可增強與激活性的FcγRs的結(jié)合，或減少對抑制性FcγRs的結(jié)合親和力。
計算篩選[130]在數(shù)量龐大的可能發(fā)生的修飾中預(yù)測何種氨基酸修飾能達到所需目的的過程中，主要障礙是很難獲得有價值的Fc變體。實際上，對先前已失敗的產(chǎn)生具有重要臨床價值Fc變體的Fc工程嘗試而言，一個主要的原因是迄今為止Fc工程方法都與嘗試(hit-or-miss)方法相關(guān)。本發(fā)明提供了使Fc變體定量和系統(tǒng)工程改造成為可能的計算篩選(computational screening)方法。這些方法通常使用原子水平打分函數(shù)、側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體采樣(side chainrotamer sampling)以及先進的優(yōu)化方法以精確獲取蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系。計算篩選通過對產(chǎn)生的龐大多樣性過濾使探查靶位置完整序列區(qū)的可能性能夠?qū)崿F(xiàn)。對于允許激活性Fc優(yōu)化以達到所需目的的穩(wěn)定的、合適的折疊以及功能性序列而言，計算篩選變體文庫可有效地使之富集。因為重疊序列約束了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和功能，而在文庫中大量候選物卻占據(jù)著“無用的”序列區(qū)。舉例來說，大部分序列區(qū)編碼未折疊、錯誤折疊、無完全折疊、部分折疊或聚集的蛋白質(zhì)。其對于Fc工程特別相關(guān)，因為Ig結(jié)構(gòu)域是小β片層結(jié)構(gòu)，已證實其的工程是非常必需的(Quinn等.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 918747-8751；Richardson等.，2002，Proc Natl Acad Sci USA 992754-2759)。甚至看上去在β片層表面上無害的取代都能導(dǎo)致嚴重的堆積沖突，明顯地破壞了折疊平衡(Smith等.，1995，Science 270980-982)；順便提及，丙氨酸是一種最不利的β片層構(gòu)成者Minor等.，1994，Nature 371264-267)。β片屋穩(wěn)定性和特異性的決定因素是處于極大數(shù)量的微妙相互作用之間的一種微妙平衡。計算篩選能夠產(chǎn)生主要由有效序列區(qū)組成的文庫，并因此增加了鑒定對設(shè)計目的優(yōu)化的蛋白質(zhì)的機率。事實上計算篩選產(chǎn)生了增加的命中率，從而減少了應(yīng)用實驗方法篩選的變體數(shù)量。Fc工程的另外障礙是需要有效設(shè)計具相互關(guān)系或聯(lián)系的突變。例如，迄今為止所觀察到的具有最大Fc/FcγR親和力增加的是S298A/E333A/K334A，可通過將三種分別在丙氨酸掃描中得到的較好突變結(jié)合而獲得之(Shields等.，2001，J Biol Chem 2766591-6604)。計算篩選在一次試驗中就能產(chǎn)生上述三重變體而無須進行三次單獨的試驗，此外還能測試在那些位置所有20種氨基酸而不僅是丙氨酸的功能性。計算篩選可通過將組合問題減少到實驗上所能處理的數(shù)量以處理上述復(fù)雜性。從廣義上看，計算篩選具有四個步驟1)選擇并制備蛋白質(zhì)模板結(jié)構(gòu)，2)選擇可變位置、在那些位置應(yīng)當考慮的氨基酸和/或選擇旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體以模擬所考慮的氨基酸，3)計算能量，以及4)優(yōu)化組合。該計算篩選更詳細過程描述如下。將蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)作為起點(starting point)。鑒定要被優(yōu)化的位置，其可以是完整蛋白序列或其子集(subset(s))。在每個位置上選擇所考慮的氨基酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，每個被考慮的氨基酸可為具有稱為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的容許(allowed)構(gòu)象的離散集合所代表。計算所考慮的每個氨基酸與其它所考慮的每個氨基酸之間、以及其與蛋白質(zhì)的其余部分，包括與該蛋白質(zhì)主鏈和不變殘基之間相互作用能量。在一個優(yōu)選的實施方案中，計算所考慮的每個氨基酸側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體與其它所考慮的每個氨基酸側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體(amino acid side chain rotamer)之間、以及其與蛋白質(zhì)的其余部分，包括與該蛋白質(zhì)主鏈和不變殘基之間相互作用能量。接著用一或更多組合搜索算法來鑒定具有最低能量的序列和/或具有低能量的序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，所用的計算篩選方法基本上類似于Protein Design Automation_(PDA_)技術(shù)，該技術(shù)描述于US 6,188,965；US6,269,312；US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN10/218,102；PCT WO 98/07254；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所用的計算篩選方法基本上類似于SequencePrediction AlgorithmTM(SPATM)技術(shù)，該技術(shù)描述于(Raha等.，2000，ProteinSci 91106-1119)、USSN 09/877,695和USSN 10/071,859中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所用的計算篩選方法描述于2003年3月3日提交的，標題為“抗體優(yōu)化”的USSN 10/339788中。在一些實施方案中，可使用不同計算篩選方法的組合，包括PDA_技術(shù)與SPATM技術(shù)的組合，也包括這些計算方法與其它設(shè)計工具的組合。同樣地，這些計算方法可同時使用或以任一次序順序使用。模板結(jié)構(gòu)作為計算篩選計算的輸入量。本文中“模板結(jié)構(gòu)”意指要被優(yōu)化的蛋白質(zhì)的部分或全部結(jié)構(gòu)坐標。所述模板結(jié)構(gòu)可以是任何三維結(jié)構(gòu)(即，一組蛋白質(zhì)原子的三維坐標)已公知或可計算、估計、模擬、創(chuàng)造或測定的蛋白質(zhì)。使用包括但不限于X-射線晶體學技術(shù)、核磁共振(NMR)技術(shù)、從頭建模法以及同源建模法可測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。如果對于沒有用實驗方法解出結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而言優(yōu)化是所需的，那么可產(chǎn)生一種合適的結(jié)構(gòu)模型以作為計算篩選計算的模板。用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)同源模型的方法為本領(lǐng)域所公知，這些方法可供本發(fā)明使用。參見例如，Luo，等.2002，ProteinSci 111218-1226，Lehmann和Wyss，2001，Curr Opin Biotechnol 12(4)371-5.；Lehmann等.，2000，Biochim Biophys Acta 1543(2)408-415；Rath和Davidson，2000，Protein Sci，9(12)2457-69；Lehmann等.，2000，Protein Eng13(1)49-57；Desjarlais和Berg，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90(6)2256-60；Desjarlais和Berg，1992，Proteins 12(2)101-4；Henikoff和Henikoff，2000，Adv Protein Chem 5473-97；Henikoff和Henikoff，1994，J Mol Biol 243(4)574-8；Morea等，2000，Methods 20267-269。使用對接(docking)方法也可獲得蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)合物?？勺鳛槟０褰Y(jié)構(gòu)的合適的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括但不限于，所有那些在Protein Data Base中所發(fā)現(xiàn)的，該Protein Data Base數(shù)據(jù)庫為Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB，原來稱為Brookhaven National Lab)所編輯和維護。所述模板結(jié)構(gòu)可以是天然存在或工程蛋白質(zhì)的。所述模板結(jié)構(gòu)也可以是基本上為來自任意生物體的蛋白質(zhì)所編碼的蛋白質(zhì)的，所述任意生物體優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。所述模板結(jié)構(gòu)可包含許多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)型的任意一種。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述模板結(jié)構(gòu)包含F(xiàn)c區(qū)或Fc結(jié)構(gòu)域或Fc片段。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，所述模板結(jié)構(gòu)包含結(jié)合有一種或多種Fc配體的Fc或Fc結(jié)構(gòu)域或Fc片段，優(yōu)選為Fc/FcγR復(fù)合體。模板結(jié)構(gòu)中的Fc可糖基化或不糖基化。所述模板結(jié)構(gòu)可包含多于一條的蛋白鏈。所述模板結(jié)構(gòu)可額外含有非蛋白質(zhì)組分，包括但不限于小分子、底物、輔因子、金屬、水分子、輔基、聚合物以及糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述模板結(jié)構(gòu)是多個或一組模板蛋白質(zhì)，例如諸如獲得自NMR的一組結(jié)構(gòu)?？蛇x地，所述一組模板結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生自一組相關(guān)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)，或人工創(chuàng)建的結(jié)構(gòu)集合。所述組合物和模板結(jié)構(gòu)的來源基于工程目的。舉例來說，對于增加人Fc/FcγR親和力而言，人Fc/FcγR復(fù)合體結(jié)構(gòu)或其衍生物可作為模板結(jié)構(gòu)?？蛇x地，非組合的Fc結(jié)構(gòu)可作為模板結(jié)構(gòu)。如果所述目的是為了增加人Fc對小鼠FcγR的親和力，則模板結(jié)構(gòu)可以是與小鼠FcγR結(jié)合的人Fc結(jié)構(gòu)或模型。在設(shè)計計算前可修飾或改變所述模板結(jié)構(gòu)。用于制備模板結(jié)構(gòu)的許多方法描述于US 6,188,965；US 6,269,312；US 6,403,312；USSN09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 09/877,695；USSN 10/071,859，USSN10/218,102；PCT WO 98/07254；PCT WO 01/40091以及PCT WO 02/25588中。舉例來說，在一個優(yōu)選的實施方案中，如果其不包括在所述結(jié)構(gòu)中，則可添加額外的氫原子。在一個可選的實施方案中，對結(jié)構(gòu)進行能量最小化以釋放張力(strain)，包括基于范德華沖突(clashes)、不利鍵角以及不利鍵長的張力。可選地，所述模板結(jié)構(gòu)可用其它方法改變，諸如手動地改變，包括受控或隨機微擾。也可在計算篩選后的步驟中進行模板修飾，包括能量計算以及組合優(yōu)化步驟。在一個可選的實施方案中，所述模板結(jié)構(gòu)在計算篩選計算前或過程中不被修飾。一旦獲得模板結(jié)構(gòu)，可變位置就被選定。本文中“可變位置”意指在計算篩選計算中氨基酸同一性允許得到改變的位置。如本領(lǐng)域所公知，僅在某些可變位置上允許考慮氨基酸修飾，可減少計算的復(fù)雜性并使計算篩選能更直接適應(yīng)設(shè)計目的。在計算篩選中一種或多種殘基可位于可變位置。選定作為可變位置的位置可以是有助于或推測有助于要優(yōu)化的蛋白質(zhì)特性的那些，所述蛋白質(zhì)特性例如對FcγR的Fc親和力、Fc穩(wěn)定性、Fc溶解性等等。可變位置上的殘基對特定的蛋白質(zhì)特性可有利亦可不利。例如，位于Fc/FcγR界面處的殘基與介導(dǎo)結(jié)合相關(guān)，因此該位置在設(shè)計計算中可改變旨在提高Fc/FcγR親和力。如另一實例，具有暴露疏水側(cè)鏈的殘基可能是導(dǎo)致不利聚集的原因，因此在設(shè)計計算中該位置可改變旨在增加溶解性?？勺兾恢每梢允桥c作為特定蛋白質(zhì)特性決定因素的相互作用直接相關(guān)的那些位置。例如，F(xiàn)c的Fc□R結(jié)合位點可規(guī)定為包括能接觸特定FcγR的所有殘基。本文中“接觸”意指在Fc殘基的至少一個原子與所結(jié)合的FcγR的至少一個原子之間的某些化學相互作用，所具有的化學相互作用包括但不限于范德華相互作用、氫鍵相互作用、靜電相互作用以及疏水相互作用。在一個可選的實施方案中，可變位置可包括與蛋白質(zhì)性質(zhì)間接相關(guān)的那些位置，即上述位置可鄰近于已知或推測有助于Fc性質(zhì)的殘基。例如，F(xiàn)c的FcγR結(jié)合位點可規(guī)定為包括所有位于特定距離內(nèi)的Fc殘基，例如4-10AFcγR范德華接觸內(nèi)的任一Fc殘基。因此在該情況下，不但可選擇直接與FcγR接觸的殘基作為可變位置，也可選擇與接觸FcγR的殘基接觸并因此間接影響結(jié)合的那些作為可變位置。所述特定位置的選定依賴于所要采用的設(shè)計策略。在模板結(jié)構(gòu)中一個或多個不是可變的位置可以是漂浮的(floated)。本文中“漂浮位置“意指在計算篩選計算中于此允許改變氨基酸構(gòu)象而非氨基酸同一性的位置。在一個實施方案中，所述漂浮位置可具有親本氨基酸同一性。例如，漂浮位置可位于與可變位置殘基具有極小距離內(nèi)的位置，例如5A。在一個可選的實施方案中，漂浮位置可具有非親本氨基酸同一性。舉例來說，當目的是為了評估特定突變的能量或結(jié)構(gòu)結(jié)果時，上述實施方案可供本發(fā)明。既不是可變的位置也不是漂浮的位置的那些位置稱為固定的(fixed)位置。本文中“固定位置”意指在計算篩選計算中于此氨基酸同一性和構(gòu)象保持不變的位置?？梢允枪潭ǖ奈恢冒ㄅc所要優(yōu)化的性質(zhì)不相關(guān)的已知或推測的殘基。在該情況下，推測通過改變這些位置，幾乎不會或完全不會獲得所要優(yōu)化的性質(zhì)。固定位置也可包括已知或推測該處殘基對維持固有的折疊、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和/或生物學功能起重要作用的位置。例如，對于與特定Fc配體相互作用的殘基或編碼糖基化位點的殘基而言，位置可以是固定的以便確保與Fc配體的結(jié)合及適當?shù)奶腔髯圆皇芪_。同樣地，如果穩(wěn)定性得到優(yōu)化，其可有益于使直接或間接與諸如Fc□R的Fc配體相互作用的位置固定，使得結(jié)合不受微擾。固定位置也可包括結(jié)構(gòu)上重要的殘基，諸如二硫鍵中的半胱氨酸，對于決定主鏈構(gòu)象而言起關(guān)鍵作用的殘基，如脯氨酸或甘氨酸，關(guān)鍵的氫鍵結(jié)合殘基以及形成有利堆積相互作用的殘基。在計算篩選中下一個步驟是在每個特定可變位置選擇一組考慮認為可能的氨基酸同一性。在可變位置的該組可能的氨基酸在本文中稱為“考慮的氨基酸”。本文中使用的“氨基酸”指20種天然氨基酸和任何非天然或合成類似物的組。在一個實施方案中，考慮到所有20種天然氨基酸?？蛇x地，在給定的可變位置上也考慮氨基酸的子集或甚至僅考慮一種氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)員應(yīng)當理解，在可變位置上僅考慮特定氨基酸的同一性有利于計算，因為其減少了搜尋的組合復(fù)雜性。此外，在可變位置上僅考慮特定氨基酸可適用于針對特定設(shè)計策略的計算。例如，對于優(yōu)化非糖基化Fc穩(wěn)定性而言，在糖基化不存在情況下暴露于溶劑的非極性Fc殘基處僅允許考慮極性氨基酸是有利于計算的。非天然氨基酸，包括合成的氨基酸以及天然氨基酸的類似物，也可以是考慮的氨基酸。例如參見，Chiri等.，2003，Science，301(5635)964-7；和Chin等.，2003，Chem Biol.10(6)511-9。許多方法可單獨或組合地使用以選擇在每個位置上應(yīng)當考慮的氨基酸。舉例來說，可基于暴露于溶劑的程度來選擇在給定可變位置處考慮的氨基酸組。疏水或非極性氨基酸通常位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部或核內(nèi)(core)，其難以接近或幾乎難以接近溶劑。因此在核內(nèi)可變位置，有利之處在于可僅考慮或主要考慮非極性氨基酸，諸如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。親水或極性氨基酸通常位于蛋白質(zhì)的外部或表面，其具有顯著程度的溶劑可及性。因此在可變表面位置，有利之處在于可僅考慮或主要考慮極性氨基酸，諸如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸以及組氨酸。某些位置是部分暴露或部分埋藏的，無法明確是蛋白質(zhì)核內(nèi)或表面位置，在某種意義上作為位于核內(nèi)與表面殘基之間的邊界殘基。因此在上述可變邊界位置，有利之處在于可同時考慮非極性和極性氨基酸，諸如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸?？赏ㄟ^蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域技術(shù)人員主觀評價或圖像檢查(visual inspection)模板結(jié)構(gòu)來確定可變位置處溶劑暴露的程度，或可通過使用本領(lǐng)域公知的多種算法進行之。通過計算方法，諸如計算溶劑可及表面區(qū)域或使用評估相對于溶劑可及表面的C□-C□向量方向的算法，可輔助或完全決定可變位置所要考慮的氨基酸類型的選擇，上述計算方法概述于US 6,188,965；6,269,312；US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 10/218,102；PCT WO 98/07254；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中。在一個實施方案，每個可變位置可明確地分類為核內(nèi)、表面或邊界位置，或是基本上類似于核內(nèi)(core)、表面或邊界的分類。在一個可選的實施方案中，允許在可變位置通過假設(shè)驅(qū)動一組氨基酸的選擇。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域的技術(shù)人員通過主觀評價或圖像檢查模板結(jié)構(gòu)，所以應(yīng)當考慮在可變位置所假設(shè)的氨基酸類型。例如，如果推測在可變位置氫鍵相互作用有利，則可考慮具有形成氫鍵能力的極性殘基，即使該位置位于核內(nèi)。同樣地，如果猜測在可變位置疏水堆積相互作用有利，則可考慮具有形成有利堆積相互作用的非極性殘基，即使該位置在表面上。其它通過假設(shè)驅(qū)動方法的實例可涉及主鏈柔性或蛋白質(zhì)折疊的結(jié)果。本領(lǐng)域公知某些殘基，例如脯氨酸、甘氨酸以及半胱氨酸在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性中起重要作用。較所有其它氨基酸而言，甘氨酸能加強主鏈柔性，脯氨酸對主鏈的約束超過了所有其它氨基酸，以及半胱氨酸可形成二硫鍵。因此，包括一種或多種這些氨基酸類型可有利于實現(xiàn)所需的設(shè)計目的。可選地，從所考慮的氨基酸列表中排除一種或多種這些氨基酸類型也是有利于實現(xiàn)所需的設(shè)計目的。在一個可選的實施方案中，氨基酸的子集可被選擇以使覆蓋范圍最大化。在該情況下，在可變位置可考慮具有類似于模板結(jié)構(gòu)中氨基酸性質(zhì)的額外氨基酸。例如，如果模板結(jié)構(gòu)中可變位置的所述殘基是大疏水殘基。則在該位置可考慮額外的大疏水氨基酸?？蛇x地，氨基酸的子集可被選擇以使多樣性最大化。在該情況下，在可變位置可考慮具有不同于模板結(jié)構(gòu)中那些氨基酸性質(zhì)的氨基酸。例如，如果模板結(jié)構(gòu)中可變位置的所述殘基是大疏水殘基，則可考慮小疏水性、極性等的氨基酸。本領(lǐng)域公知在設(shè)計計算過程中，一些計算篩選方法僅需要確定所考慮氨基酸的同一性。即，不需要關(guān)于所述氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象或可能構(gòu)象的信息。其它優(yōu)選的方法利用了一組離散的側(cè)鏈構(gòu)象，稱為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，其對于每個氨基酸而言是要考慮的。因此，在每個可變和漂浮位置可考慮一組旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體可獲得自公開的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(參見例如，Lovel等.，2000，ProteinsStructure Function and Genetics 40389-408；Dunbrack和Cohen，1997，Protein Science 61661-1681；Demaeyer等.，1997，F(xiàn)olding and Design 253-66；Tuffery等.，1991，J Biomol Struct Dyn 81267-1289，Ponder和Richards，1987，J Mol Biol 193775-791)。本領(lǐng)域公知旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫可以是不依賴于主鏈的或依賴于主鏈的。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體也可獲得自分子力學或從頭計算，以及使用其它方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了一種柔性旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體模型(參見Mendes等.，1999，ProteinsStructure，F(xiàn)unction，and Genetics 37530-543)。同樣地，可使用人工產(chǎn)生的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，或?qū)τ诿總€氨基酸和/或可變位置擴大所設(shè)置的選擇。在一個實施方案中，至少一種不是能量低的構(gòu)象包括于旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體列中。在一個可選的實施方案中，模板結(jié)構(gòu)中可變位置殘基的所述旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體包括于該可變位置許可的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體列中。在一個可選的實施方案中，僅提供了在可變位置所考慮的每個氨基酸的同一性，在設(shè)計計算過程中并不使用每個氨基酸的特定構(gòu)象態(tài)。即，對于計算篩選而言，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的使用不是必需的。實驗信息可用于指導(dǎo)可變位置的選擇和/或在可變位置所考慮的氨基酸的選擇。本領(lǐng)域公知誘變實驗通常用于確定在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中某些殘基的作用，例如，哪幾個蛋白質(zhì)殘基在決定穩(wěn)定性中起作用，或哪幾個殘基構(gòu)成了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的界面。獲得自上述實驗的數(shù)據(jù)在本發(fā)明中是有用的。例如，對于增加Fc/FcγR親和力而言，可變位置可包括其上突變已顯示能影響結(jié)合的可變的所有位置。同樣地，上述實驗的結(jié)果可用于指導(dǎo)在可變位置所容許的氨基酸類型的選擇。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些類型的氨基酸取代是有利的，可考慮相似類型的那些氨基酸。在一個實施方案中，在可變位置可考慮額外氨基酸，其具有類似于那些實驗中發(fā)現(xiàn)是有利的氨基酸的性質(zhì)。舉例來說，如果在Fc/FcγR界面可變位置的根據(jù)實驗突變?yōu)榇笫杷畾埢徽J為是有利的話，那么在計算篩選中，使用者可選擇在該位置包括額外的大疏水氨基酸。本領(lǐng)域公知展示和其它選擇技術(shù)可結(jié)合隨機誘變以產(chǎn)生一列或多列對所選定特性有利的氨基酸取代。獲得自上述實驗工作中的上述一列或數(shù)列氨基酸取代可供本發(fā)明使用。例如，在上述實驗中所發(fā)現(xiàn)的不變位置在計算篩選計算中可排除作為可變位置，反之發(fā)現(xiàn)能更容易接受突變或能順利響應(yīng)突變的位置可選擇作為可變位置。同樣地，來自上述實驗的結(jié)果可用于指導(dǎo)在可變位置所容許的氨基酸類型的選擇。例如，如果某些類型的氨基酸在實驗淘選中出現(xiàn)更頻繁，可考慮那些氨基酸的相似類型。在一個實施方案中，在可變位置可考慮額外的氨基酸，其具有類似于那些實驗中發(fā)現(xiàn)是有利的氨基酸的性質(zhì)。例如，如果在位于Fc/FcγR界面的可變位置所選擇的突變被發(fā)現(xiàn)是不荷電的極性氨基酸，使用者可選擇在該位置上包括額外的不荷電的極性氨基酸，或可能包括荷電的極性氨基酸。序列信息也可用于指導(dǎo)可變位置的選擇和/或在可變位置所考慮的氨基酸的選擇。本領(lǐng)域公知一些蛋白質(zhì)具有共同的結(jié)構(gòu)骨架(scaffold)以及在序列上是同源的。該信息可用于獲得對蛋白質(zhì)家族中特定位置的了解。本領(lǐng)域公知序列比對通常用于確定哪幾個蛋白質(zhì)殘基是保守的以及哪幾個是非保守的。換言之，通過蛋白質(zhì)序列的比較和對比比對，可觀察到位置上的可變性程度，亦可觀察到位置上天然出現(xiàn)的氨基酸類型。獲得自上述分析的數(shù)據(jù)在本發(fā)明中是有用的。使用序列信息來選擇可變位置及在可變位置所考慮的氨基酸的好處具有幾方面。對于可變位置的選擇而言，使用序列信息主要的優(yōu)點在于可獲得對哪幾個位置是更能容許突變以及哪幾個位置是較少容許突變的了解。因此序列信息可幫助確保特性多樣性，即對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性等無害的突變在計算上被采樣。所述相同的優(yōu)點適用于在可變位置使用序列信息來選擇所考慮的氨基酸類型。即，出現(xiàn)在蛋白質(zhì)序列比對中的氨基酸組可視為根據(jù)進化預(yù)篩選的，對于與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性、功能等的相容性而言，其較隨機篩選的具有更高機率。因此更高的特性多樣性在計算上被采樣。在可變位置使用序列信息來選擇所考慮的氨基酸類型的第二種好處是某些比對可提供較隨機序列可具有較小免疫原性的序列。舉例來說，如果在給定可變位置所考慮的氨基酸是在人蛋白質(zhì)序列比對中在該位置所出現(xiàn)的氨基酸組，則那些氨基酸可視為根據(jù)性質(zhì)(nature)預(yù)篩選的，如果所述優(yōu)化的蛋白質(zhì)用作為人治療劑，則那些氨基酸用于不產(chǎn)生或產(chǎn)生低的免疫應(yīng)答。序列的來源可廣泛多變，包括一種或多種已知的數(shù)據(jù)庫，包括但不限于Kabat數(shù)據(jù)庫(Johnson和Wu，2001，Nucleic Acids Res 29205-206；Johnson和Wu，2000，Nucleic Acids Res 28214-218)、IMGT數(shù)據(jù)庫(IMGT，theinternational ImMunoGeneTics information system_；Lefranc等.，1999，Nucleic Acids Res 27209-212；Ruiz等.，2000 Nucleic Acids Re.28219-221；Lefranc等.，2001，Nucleic Acids Res 29207-209；Lefranc等.，2003，NucleicAcids Res 31307-310)和VBASE、SwissProt、GenBank和Entrez、以及EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)序列信息可獲得自、編譯自和/或產(chǎn)生自來自任意生物體的天然存在的蛋白質(zhì)的序列比對，所述生物體包括但不限于哺乳動物。蛋白質(zhì)序列信息可獲得自私人編譯的數(shù)據(jù)庫。在本領(lǐng)域中公知眾多基于序列的比對程序和方法，所有的這些程序和方法可供本發(fā)明使用以產(chǎn)生包含F(xiàn)c和Fc配體的蛋白質(zhì)的序列比對。一旦進行了比對，序列信息可用于指導(dǎo)可變位置的選擇。上述序列信息可固有地或以其它方式涉及所給定位置的可變性。本文中的可變性應(yīng)區(qū)別于可變位置?？勺冃灾冈谛蛄斜葘χ性谒o定位置出現(xiàn)的氨基酸類型顯示出的變化程度?？勺兾恢?，再次重申，是使用者所選擇的在計算篩選計算過程中以改變氨基酸同一性的位置。可變性可為生物信息學領(lǐng)域的技術(shù)人員所定性確定。也有為本領(lǐng)域所公知的定量確定可變性的方法，其可供本發(fā)明使用。最優(yōu)選的實施方案測量了信息熵(Information Entropy)或香農(nóng)熵(Shannon Entropy)。可變位置可基于獲得自密切相關(guān)的蛋白質(zhì)序列或較不密切相關(guān)的序列的序列信息以選擇。使用序列信息來選擇可變位置可廣泛地供本發(fā)明使用。例如，如果在模板結(jié)構(gòu)中Fc/FcγR界面位置是色氨酸，且在比對中觀察到在多于90％的序列中色氨酸位于該位置，可能有益于該位置的固定。反之，如果發(fā)現(xiàn)另一個界面位置具有較高水平的可變性，例如如果在該位置觀察到五種不同的氨基酸，每種具有大約20％的頻率，則該位置可被選擇作為可變位置。在另一個實施方案中，對排列的蛋白質(zhì)序列的圖像檢查可取代或有助于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的圖像檢查。序列信息也可用于在可變位置指導(dǎo)所考慮的氨基酸的選擇。上述序列信息可涉及在給定的位置一個氨基酸、多個氨基酸或氨基酸類型(例如極性或非極性、荷電或不荷電)固有地或以其它方式出現(xiàn)的頻率的多少。在一個實施方案中，在可變位置所考慮的氨基酸組可包含在比對中在該位置所觀察到的氨基酸組。因此，在計算篩選計算中所述位置特異性比對信息可直接用于產(chǎn)生在可變位置上所考慮的氨基酸列。上述策略為本領(lǐng)域眾所周知；參見例如Lehmann和Wyss，2001，Curr OpinBiotechnol 12(4)371-5；Lehmann等.，2000，Biochim Biophys Acta 1543(2)408-415；Rath和Davidson，2000，Protein Sci，9(12)2457-69；Lehmann等.，2000，Protein Eng 13(1)49-57；Desjarlais和Berg，1993，Proc Natl Acad SciUSA 90(6)2256-60；Desjarlais和Berg，1992，Proteins 12(2)101-4；Henikoff和Henikoff，2000，Adv Protein Chem 5473-97；Henikoff和Henikoff，1994，JMol Biol 243(4)574-8。在一個可選的實施方案中，在一個或多個可變位置所考慮的氨基酸組可包含于比對中最頻繁觀察到的氨基酸組。因此，特定標準應(yīng)用于在確定是否氨基酸或氨基酸類型的頻率能證明其包含于該氨基酸組中，所述氨基酸組為可變位置上所考慮的。本領(lǐng)域公知在比對中使用統(tǒng)計學方法來計算在任一位置序列多樣性以及在某一位置每個氨基酸出現(xiàn)的頻率或概率，可對序列比對分析。接著，上述數(shù)據(jù)可用于確定哪幾種氨基酸類型要考慮。在最簡單的實施方案中，通過對一個比對位置所觀察到的一種氨基酸次數(shù)的數(shù)量計數(shù)，然后除以該比對中的序列的總數(shù)而計算出這些出現(xiàn)頻率。在其它的實施方案中，通過多種可能的機制對每個序列、位置或氨基酸對計數(shù)程序的貢獻進行權(quán)重(weighted)。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)在所述比對中相對于其它序列的其多樣性權(quán)重進行每個比對序列對頻率統(tǒng)計的貢獻的權(quán)重。用于實現(xiàn)該目的的常用策略是Henikoff和Henikoff(Henikoff和Henikoff，2000，Adv Protein Chem 5473-97；Henikoff和Henikoff，1994，J Mol Biol 243574-8)所推薦的序列權(quán)重系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述每個序列對所述統(tǒng)計表的貢獻依賴于其對靶序列的相似性程度，即所使用的模板結(jié)構(gòu)，使得對該靶序列具有更高相似性的序列得到更高的權(quán)重。相似性測量方法的實例包括，但不限于，序列同一性、BLOSUM相似性打分、PAM矩陣相似性打分和BLAST打分。在一個可選的實施方案中，所述每個序列對統(tǒng)計表的貢獻依賴于其已知的物理或功能特性。這些特性包括但不限于熱和化學穩(wěn)定性、活性的貢獻以及溶解性。舉例來說，當優(yōu)化非糖基化Fc的溶解性時，在比對中的那些序列應(yīng)當是已知最能溶解的(例如參見Ewert等.，2003，J Mol Biol 325531-553)，可對所計算的頻率貢獻更多。在序列比對中無論什么標準在可變位置用于選擇所考慮的氨基酸組，使用序列信息來選擇考慮的氨基酸可廣泛地應(yīng)用于本發(fā)明中。例如，通過置換暴露的非極性表面殘基以優(yōu)化Fc溶解性，所考慮的氨基酸可被選擇作為氨基酸組，或那些符合某一標準的氨基酸的子集，就是在蛋白質(zhì)序列比對中在該位置所觀察到的。作為另一個實例，可主觀地對源自序列比對的一列氨基酸添加或刪除一個或多個氨基酸以最大化覆蓋范圍。例如，在可變位置可考慮具有類似于那些在序列比對中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的性質(zhì)的額外氨基酸。例如，如果在序列比對中觀察到已知的或推測能結(jié)合FcγR的Fc位置具有不荷電的極性氨基酸，則在計算篩選計算中使用者可選擇在該位置以包括額外不荷電的極性氨基酸，或荷電的極性氨基酸。在一個實施方案中，將序列比對信息與能量計算組合，討論如下。例如，擬能量(pseudo energies)可源自產(chǎn)生打分函數(shù)的序列信息。使用基于序列的打分函數(shù)可明顯有助于減少計算的復(fù)雜性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解單獨使用基于序列的打分函數(shù)可能是不適當?shù)?，因為在突變之間序列信息通常顯示易誤解的相互關(guān)系，在實際上可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)上的不一致。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，單獨使用基于結(jié)構(gòu)的能量計算方法或與基于序列的打分函數(shù)組合使用。即，優(yōu)選的實施方案并不單獨依賴于序列比對信息作為分析步驟。能量計算涉及氨基酸修飾打分方法。通過一種或多種打分函數(shù)，相互作用的能量得到測量。多種打分函數(shù)可供本發(fā)明用于計算能量。打分函數(shù)可包括許多勢(potentials)，在本文中稱為打分函數(shù)的能項，包括但不限于范德華勢、氫鍵勢、原子溶劑化勢或其它溶劑化勢、二級結(jié)構(gòu)傾向勢、靜電勢、扭角勢和熵勢。至少一種能項被用于對每個可變或漂浮位置打分，盡管取決于所述位置、所考慮的氨基酸以及其它需要考慮的事項，所述能項可能不同。在一個實施方案中，利用了使用一種能項的打分函數(shù)。在最優(yōu)選的實施方案中，使用含有多于一種能項的打分函數(shù)計算能量，例如描述范德華、溶劑化、靜電和氫鍵相互作用的能項，以及它們的組合。在額外的實施方案中，額外的能項包括但不限于熵項、扭角能以及基于已知的能量。在US 6,188,965；US 6,269,312；US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 09/877,695；USSN 10/071,859，USSN 10/218,102；PCT WO 98/07254；PCT WO 01/40091以及PCT WO 02/25588中描述了多種打分函數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，打分函數(shù)無需受限于物理化學能項。例如，基于所知的勢可供本發(fā)明的計算篩選方法學應(yīng)用。上述基于所知的勢可源自蛋白質(zhì)序列和/或結(jié)構(gòu)統(tǒng)計，包括但不限于穿織(threading)勢、參考能量、擬能量、基于同源性的能量以及源自序列比對的序列偏移。在一個優(yōu)選的實施方案中，一種打分函數(shù)得到改良以包括用于免疫原性的模型，諸如源自肽與MHC(主要組織相容性復(fù)合體)結(jié)合數(shù)據(jù)的函數(shù)，其可用于鑒定潛在的免疫原性序列(參見例如USSN 09/903,378；USSN 10/039,170；USSN 60/222,697USSN 10/339788；PCT WO 01/21823和PCT WO02/00165)。在一個實施方案中，序列比對信息能用于對氨基酸取代物打分。舉例來說，不管所述蛋白質(zhì)的來源是否是人類、猴子、小鼠或其它，蛋白質(zhì)序列的比較結(jié)果在本發(fā)明的計算篩選方法學中可用于提示氨基酸突變或?qū)Π被嵬蛔兇蚍?。在一個實施方案中，本領(lǐng)域公知在計算分析過程中一種或多種打分函數(shù)可得到優(yōu)化或“訓(xùn)練”，接著使用優(yōu)化的系統(tǒng)再運行分析過程。上述改變的打分函數(shù)可獲得自例如，通過使用實驗數(shù)據(jù)訓(xùn)練的打分函數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，許多力場，其由一種或多種能項組成，可作為打分函數(shù)。力場包括但不限于從頭(ab inito)力場或量子力場、半經(jīng)驗(semi-empirical)力場以及分子力場?；谝阎幕蚴褂媒y(tǒng)計學方法的打分函數(shù)可供本發(fā)明使用。這些方法可用于評估序列和三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的匹配，并因此對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保真度而言，可用于對氨基酸取代打分。在一個實施方案中，通過分別計算突變序列打分的分子動力學計算可用于計算篩選序列。可用多種方式來表示氨基酸以便進行有效的能量計算。在一個優(yōu)選的實施方案中，所考慮的氨基酸表示為如前所述的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，在每個可變以及漂浮位置上計算每個可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體與其它可變以及漂浮異構(gòu)體、固定位置殘基、以及主鏈結(jié)構(gòu)和任何非蛋白質(zhì)原子的相互作用的能量(或分數(shù))。在一個優(yōu)選的實施方案中，對每個可變和漂浮位置上每條側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的兩組相互作用能量在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和固定原子之間的相互作用能量(“單重”能量)，以及在可變和漂浮位置旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體與在每個其它可變和漂浮位置上的所有其它可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體之間的相互作用能量(“雙重”能量)進行計算。在一個可選的實施方案中，對于固定位置以及可變和漂浮位置計算單重和雙重能量。在一個可選的實施方案中，所考慮的氨基酸并不表示為旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。計算篩選的一個重要組成部分是鑒定一種或多種具有有利分數(shù)的序列，即具有低能量的序列。從極大數(shù)量的可能性中確定一組低能量序列是非同尋常的，組合優(yōu)化算法可用于解決該難題。對于組合優(yōu)化算法而言，通過調(diào)查在典型的計算篩選計算中所考慮的可能性的數(shù)量來闡明其所需要的。對于所給定的設(shè)計問題而言，旋轉(zhuǎn)構(gòu)象集合(rotamer sets)的離散(discrete)特性容許對可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體序列進行簡單計算。主鏈長度n與m(每個位置可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體數(shù))組合可具有mn條可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體序列，具有隨著序列長度而指數(shù)式增長的數(shù)量。對于特別簡單計算而言，有可能去檢查每條可能的序列以便鑒定最優(yōu)序列和/或一種或多種有利序列。然而，對于典型的設(shè)計問題而言，可能序列的數(shù)量(高達1080或更多)是足夠大的，以致很難對每條可能序列進行檢查。然后，多種組合優(yōu)化算法可用于鑒定優(yōu)化序列和/或一種或多種有利序列。組合優(yōu)化算法可分為兩類(1)如果它們收斂(converge)的話，能保證返回全局極小值能量構(gòu)型的那些，和(2)并不能保證返回全局極小值能量構(gòu)型，但總是能返回溶液構(gòu)型的那些。第一類算法的實例包括但不限于死端消除法(Dead-End Elimination)(DEE)和分支與邊界法(Branch&Bound)(B&B)(包括分支(Branch)和終止(Terminate))(Gordon和Mayo，1999，Structure Fold Des 71089-98)。第二類算法的實例包括但不限于蒙特卡羅法(Monte Carlo)(MC)、自洽平均法(self-consistent mean field)(SCMF)、玻耳茲曼采樣法(Boltzmannsampling)(Metropolis等.，1953，J Chem Phys 211087)、模擬退火法(Kirkpatrick等.，1983，Science，220671-680)、遺傳算法(GA)以及快速和精確側(cè)鏈拓樸學及能量精化(FASTER)(Desmet，等.，2002，Proteins，4831-43)。一種組合優(yōu)化算法可單獨使用或與其它組合優(yōu)化算法共同使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，適用于組合優(yōu)化算法的策略用于尋找全局極小值能量構(gòu)型(global minimum energy configuration)。在一個可選的實施方案中，所述策略用于尋找一種或多種低能量或有利序列。在一個可選的實施方案中，所述策略用于尋找全局極小值能量構(gòu)型，接著用于尋找一種或多種低能量或有利序列。例如，概述于USSN 6,269,312，優(yōu)選的實施方案利用了死端消除(DEE)法和蒙特卡羅法。在其它實施方案中，在其它搜索方法中使用禁忌搜索算法(tabu search algorithms)或?qū)⑵渑c死端消除法(DEE)和/或蒙特卡羅法組合(參見Modern Heuristic Search Methods，V.J.Rayward-Smith等編輯，1996，John WILEY&Sons Ltd.；USSN 10/218,102；和PCT WO 02/25588)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，可使用遺傳算法；參見例如USSN 09/877,695和USSN 10/071,859。作為另外的實例，其更充分地描述于US 6,188,965；US 6,269,312；US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 10/218,102；PCT WO 98/07254；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中，可達到全局(global)最優(yōu)值，接著進一步對可能出現(xiàn)的進行計算處理，其產(chǎn)生了額外的優(yōu)化序列。在最簡單的實施方案中，設(shè)計計算無需組合。即，在單個可變位置能量計算單獨用于評估氨基酸取代。對于其它計算而言，優(yōu)選在多于一個的可變位置上評估氨基酸取代。在一個優(yōu)選的實施方案中，在組合優(yōu)化前計算所有可能的相互作用能。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，在組合優(yōu)化過程中視需要可進行能量計算。
文庫產(chǎn)生[156]本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生文庫的方法，所述文庫可隨后用實驗方法篩選以挑選優(yōu)化的Fc變體。本文中使用的“文庫”意指一種或多種Fc變體的組。文庫可指以任何形式存在的變體組。在一個實施方案中，所述文庫是一列核酸或氨基酸序列，或在可變位置的一列核酸或氨基酸取代物。例如，如下用于說明本發(fā)明的實例提供了在可變位置的氨基酸取代物的文庫。在一個實施方案中，文庫是至少一種序列的一列(a list)，所述序列是對所需特性優(yōu)化的Fc變體。例如參見，F(xiàn)ilikov等.，2002，Protein Sci 111452-1461和Luo等.，2002，Protein Sci 111218-1226。在一個可選的實施方案中，文庫可確定為組合的列，意指對于每個可變位置產(chǎn)生一列氨基酸取代物，暗示每個取代物要與在所有其它可變位置上所有其它設(shè)計的取代物組合。在該情況下，在所有可變位置的所有可能性的組合的擴大產(chǎn)生了大的清楚定義的文庫。文庫可指多肽的物理組合物，所述多肽包含F(xiàn)c區(qū)或一些結(jié)構(gòu)域或該Fc區(qū)片段。因此文庫可指以純化或未純化形式存在的抗體或Fc融合體的物理組合物。文庫可指編碼該文庫序列的核酸的物理組合物。所述核酸可以是編碼該文庫成員的基因、具有任意可操作連接的核酸的編碼該文庫成員的基因、或編碼該文庫成員和任意其它可操作地連接的調(diào)節(jié)序列、可選標記、融合構(gòu)建體和/或其它元件的表達載體。例如，所述文庫可以是一組編碼Fc文庫成員的哺乳動物表達載體，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物可隨后通過實驗方法得到表達、純化及篩選。作為另一個實例，所述文庫可以是展示文庫。上述文庫可以，例如，包含一組編碼可操作地連接有一些融合伴侶的文庫成員的表達載體，所述融合伴侶能實現(xiàn)噬菌體展示、核糖體展示、酵母展示、細菌表面展示等等?？墒褂幂敵鲂蛄谢騺碜杂嬎愫Y選的序列產(chǎn)生所述文庫。如上所討論，計算產(chǎn)生的文庫明顯具有更多的穩(wěn)定性、正確折疊以及相對于隨機產(chǎn)生的文庫更多的功能序列。因此，計算篩選增加了對所述設(shè)計目的優(yōu)化的蛋白質(zhì)的鑒別機率。文庫中的序列組通常，但不總是，明顯地不同于親本序列，盡管在一些例子中所述文庫優(yōu)選含有親本序列。本領(lǐng)域公知具有多種可使文庫源自計算篩選計算輸出的方法。例如，描述于US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 10/218,102；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中的產(chǎn)生文庫的方法可供本發(fā)明使用。在一個實施方案中，序列分數(shù)在一定范圍內(nèi)的全局最優(yōu)化序列(global optimum sequence)可包括于文庫中。例如，所有序列都在10kcal/mol內(nèi)的最低能量序列可作為文庫。在一個可選的實施方案中，可以使用序列分數(shù)在一定范圍內(nèi)的一種或多種局部極小值序列(local minima sequence)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述文庫序列獲得自過濾組(filtered set)。通過多種方法可產(chǎn)生上述列或組，為本領(lǐng)域所公知，例如使用諸如蒙特卡羅、B&B或SCMF的算法。例如，在過濾組中上限為103或上限為105的序列可包含在所述文庫?？蛇x地，通過所有突變組合所限定的序列總數(shù)可用于終止文庫的評判標準。對于重組序列的總數(shù)而言，優(yōu)選值范圍在10-1020，特別優(yōu)選值范圍在100-109?？蛇x地，當預(yù)先確定每個位置突變數(shù)達到時可強迫終止。在一些實施方案中，并不進行終止的序列包括在文庫中。在一些情況下其是所需的，例如以評估產(chǎn)生文庫的方法，以提供對照或比較，或?qū)︻~外序列空間采樣。例如，在文庫中可包括親本序列，即使其沒有進行終止(cutoff)。聚類算法(Clustering algorithms)可用于將來自計算篩選方法的序列分類為具有代表性的組。舉例來說，描述于USSN 10/218,102和PCT WO02/25588的聚類方法及其應(yīng)用可供本發(fā)明使用。例如通過相似性可定義具有代表性的組。相似性的測量包括，但不限于對序列相似性和能量相似性的測量。因此計算篩選的輸出序列可在局部極小值(local minima)周圍聚類，在本文中稱為序列的聚類組(clastered set)。例如，封閉序列空間的序列組可與其它組區(qū)分。在一個實施方案中，通過在文庫中包括了一些、大多數(shù)或所有的序列，在一聚類組或其子集范圍內(nèi)覆蓋范圍可最大化，所述序列組成一種或多種序列聚類組。例如，通過在這些組所在文庫的范圍內(nèi)包括大多數(shù)的序列，有利于在一、二或三最低能量聚類組范圍內(nèi)最大化覆蓋范圍。在一個可選的實施方案中，通過在文庫范圍內(nèi)僅包括在每一聚類組范圍內(nèi)的序列子集，可對貫穿于序列聚類組多樣性采樣。例如，通過在文庫中包括來自每個聚類組的最低能量序列，可對所有或大多數(shù)聚類組廣泛地采樣。序列信息可用于指導(dǎo)用于文庫產(chǎn)生的過濾計算篩選結(jié)果。如所討論的，通過比較和對比蛋白質(zhì)序列的比對，在位置上的可變性程度以及可自發(fā)出現(xiàn)在該位置的氨基酸類型可得到觀察。在本發(fā)明中獲得自上述分析的數(shù)據(jù)是有用的。已討論了使用序列信息的好處，那些好處可同樣地適用于指導(dǎo)文庫產(chǎn)生的序列信息的使用。序列比對中出現(xiàn)的氨基酸組可視為通過進化預(yù)篩選的，對于與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性、功能以及免疫原性的相容性而言，其較隨機的具有更高機率。已討論了序列來源的多樣性，以及用于產(chǎn)生序列比對的方法，其可用在以序列信息來指導(dǎo)文庫的產(chǎn)生。同樣地，如上所討論，在比對中各種標準可應(yīng)用于確定某些殘基的重要性或權(quán)重。這些方法也可供用序列信息來指導(dǎo)文庫的產(chǎn)生。使用序列信息從計算篩選結(jié)果中指導(dǎo)文庫產(chǎn)生可供本發(fā)明廣泛使用。在一個實施方案中，序列信息用于從計算篩選輸出中過濾序列。換言之，一些取代從計算輸出(computational output)中減去以產(chǎn)生文庫。例如所產(chǎn)生的計算篩選計算或各種計算的輸出可被過濾使得該文庫僅包括符合某些標準的那些氨基酸，或那些氨基酸的子集，例如在序列比對中在該位置上所觀察到的。在一個可選的實施方案中，序列信息用于將序列添加到計算篩選輸出中。即，序列信息用于指導(dǎo)額外氨基酸的選擇，所述氨基酸被添加到計算輸出中以產(chǎn)生文庫。例如，對于給定位置而言，來自計算篩選計算的氨基酸輸出組可得到擴大以包括一種或多種氨基酸，所述氨基酸在蛋白質(zhì)序列比對中在該位置被觀察到。在一個可選的實施方案中，基于序列比對信息，一種或多種氨基酸可添加到或從計算篩選序列輸出中減去以便最大化覆蓋范圍或多樣性。舉例來說，具有類似于那些在序列比對中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸的性質(zhì)的額外的氨基酸可添加入文庫中。例如，如果在序列比對中觀察到位置上具有不荷電極性氨基酸，在該位置的額外的不荷電極性氨基酸可包括于該文庫中。可對文庫處理以進一步產(chǎn)生隨后文庫。因此，來自計算篩選計算的輸出可視為初級文庫(primary library)。所述初級文庫可與來自其它計算或其它文庫的其它初級文庫組合，使用隨后的計算、序列信息或其它分析或?qū)嶒炋幚硪援a(chǎn)生隨后文庫，在本文中稱為二級文庫。從所述描述中應(yīng)當理解，上述討論的使用序列信息以指導(dǎo)或過濾文庫自身是從初級文庫產(chǎn)生二級文庫的一種方法。在文庫范圍內(nèi)，二級文庫的產(chǎn)生給使用者以對參數(shù)更多的控制。能使實驗篩選更有效率，并可容許來自實驗結(jié)果的反饋以更容易得到解釋，提供了更有效的設(shè)計/實驗循環(huán)。許多方法可用于從初級文庫產(chǎn)生二級文庫。例如USSN10/218,102和PCT WO 02/25588中所描述的用于產(chǎn)生二級文庫的方法可供本發(fā)明使用。通常出現(xiàn)在初級文庫中的一些選擇步驟以一些方式進行處理。例如，在一個實施方案中，出現(xiàn)了選擇步驟，在該步驟中一些組的初級序列被選擇以形成二級文庫。在一個可選的實施方案中，選擇步驟是計算步驟，通常還包括一個選擇步驟，其中一些初級文庫的子集被選擇并接著進行進一步的計算分析，包括進一步的計算篩選和諸如“在計算機環(huán)境中”改組或重組的技術(shù)(參見，例如US 5,830,721；US 5,811,238；US 5,605,793和US5,837,458、易錯PCR，例如使用修飾的核苷酸；包括使用多個盒式的已知誘變技術(shù)；以及DNA改組(Crameri等.，1998，Nature 391288-291；Coco等.，2001，Nat Biotechnol 19354-9；Coco等.，2002，Nat Biotechnol，201246-50)，異源DNA采樣(US 5,939,250)；ITCHY(Ostermeier等.，1999，Nat Biotechnol171205-1209)；StEP(Zhao等.，1998，Nat Biotechnol 16258-261)，GSSM(US 6,171,820和US 5,965,408)；體內(nèi)同源重組，連接酶輔助基因裝配，末端互補PCR，前融合(profusion)(Roberts和Szostak，1997，Proc Natl Acad SciUSA 9412297-12302)；酵母/細菌表面展示(Lu等.，1995，Biotechnology 13366-372)；Seed和Aruffo，1987，Proc Natl Acad Sci USA 84(10)3365-3369；Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15553-557)。在一個可選的實施方案中，出現(xiàn)的選擇步驟是一種實驗步驟，例如如下的任一文庫篩選步驟，其中一些初級文庫的子集被選擇并接著用實驗方法重新組合，例如使用一種如下討論的定向進化(directed evolution)方法，以形成二級文庫。在一個優(yōu)選的實施方案中，如US 6,403,312所概述的產(chǎn)生并處理初級文庫。二級和隨后文庫的產(chǎn)生可供本發(fā)明廣泛使用。在一個實施方案中，不同的初級文庫可組合產(chǎn)生二級或隨后文庫。在另一個實施方案中，二級文庫可通過在高度突變或高度保守的位置對序列多樣性采樣而產(chǎn)生?？煞治鲈摮跫壩膸煲源_定在模板蛋白質(zhì)中哪些氨基酸位置具有高突變頻率，以及哪些位置具有低突變頻率。例如，在計算篩選中顯示了大量突變多樣性的蛋白質(zhì)中的位置在后一輪設(shè)計計算中可得到固定。當在第一輪時，同樣大小的過濾組在第一文庫中很大程度上保守的位置上將顯示多樣性?？蛇x地，二級文庫可通過在具有眾多突變的位置上改變氨基酸而產(chǎn)生，但是使突變頻率不超過某水平的位置保持不變。該討論并不意味著約束文庫的產(chǎn)生，即初級文庫隨后產(chǎn)生二級文庫。應(yīng)當理解，初級和二級文庫可進一步得到處理以產(chǎn)生三級文庫、四級文庫等?？梢?，文庫產(chǎn)生是一種迭代過程。例如，將多種額外步驟應(yīng)用于一種或多種二級文庫可構(gòu)建三級文庫；例如，可進行進一步計算處理，二級文庫可得到重組，或不同二級文庫的子集可得到組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，可通過組合二級文庫產(chǎn)生三級文庫。舉例來說，分析了蛋白質(zhì)不同部分的初級和/或二級文庫可組合產(chǎn)生三級文庫，該文庫處理蛋白質(zhì)的組合的部分。在一個可選的實施方案中，來自初級文庫的變體可與來自另一個初級文庫的變體組合以提供組合的三級文庫，具有較創(chuàng)建一個極長過濾組更低的計算成本。這些組合可用于，例如，分析大的蛋白質(zhì)，特別是大的多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，F(xiàn)c就是一個實例。因此將對上述二級文庫產(chǎn)生的描述應(yīng)用于產(chǎn)生初級文庫之后的任意文庫，最后結(jié)果是得到最終文庫，該文庫可用實驗方法篩選以獲得對設(shè)計目的而言優(yōu)化的蛋白質(zhì)變體。這些實例并不意在將二級文庫的產(chǎn)生限制于要針對任何特定應(yīng)用或本發(fā)明操作理論。反而，這些實例意在舉例說明二級文庫，以及諸如三級文庫等的隨后文庫的產(chǎn)生，其可廣泛地用于計算篩選方法學中，用于產(chǎn)生文庫。
實驗生產(chǎn)和篩選[164]本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)和篩選Fc變體文庫的方法。所述的方法無意將本發(fā)明限制于任何特定應(yīng)用或操作理論。反而，所提供的方法意在舉例說明通常一種或多種Fc變體或一種或多種Fc變體文庫可用實驗方法產(chǎn)生并篩選以獲得最優(yōu)化的Fc變體。Fc變體可在任意背景中得到生產(chǎn)和篩選，無論Fc區(qū)、結(jié)構(gòu)域或其片段，或包含F(xiàn)c的更大的多肽是否在本文中明確定義為抗體或Fc融合體。用于抗體分子生物學、表達、純化以及篩選的常規(guī)方法描述于Antibody Engineering，Duebel和Kontermann編輯，Springer-Verlag，Heidelberg，2001；以及Hayhurst和Georgiou，2001，Curr OpinChem Biol 5683-689；Maynard和Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2339-76中。在本發(fā)明的一個實施方案中，文庫序列用于創(chuàng)建編碼序列成員的核酸，接著所述核酸可克隆入宿主細胞，如果需要的話，表達并分析。因此，編碼每個成員蛋白質(zhì)序列的核酸，特別是DNA可得到制備。使用眾所周知的方法完成這些實驗。例如，描述于Molecular Cloning-A LaboratoryManual，第3版.(Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)，以及Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons)的多種方法可供本發(fā)明使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解對于包含大量序列的文庫而言，恰當序列的產(chǎn)生可能花費巨大并且耗費時間。因此，有多種技術(shù)可用于有效產(chǎn)生本發(fā)明的文庫?？晒┍景l(fā)明使用的上述方法描述于或引用于US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN 10/218,102；PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588中。上述方法包括但不限于基因裝配方法、基于PCR的方法和使用PCR變化形式的方法、基于連接酶鏈式反應(yīng)的方法、諸如那些用于改組合成的匯集寡核苷酸的方法(pooled oligomethod)、易錯擴增方法和使用具有隨機突變寡聚物的方法、經(jīng)典的定位誘變方法、盒式突變以及其它擴增和基因合成方法。本領(lǐng)域公知有多種商業(yè)上可獲得的試劑盒以及用于基因裝配、誘變、載體亞克隆等等的方法，上述商品可供本發(fā)明使用以產(chǎn)生編碼文庫Fc變體成員的核酸。通過培養(yǎng)用核酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞，優(yōu)選用含有編碼Fc變體的核酸的表達載體轉(zhuǎn)化，在合適條件下誘導(dǎo)或引發(fā)蛋白質(zhì)的表達可生產(chǎn)本發(fā)明的Fc變體。所述適于表達的條件可隨著表達載體和宿主細胞的選擇而變化，并可容易地為本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實驗方法而確定。可使用許多合適的宿主細胞，包括但不限于哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞以及酵母。例如，多種可供本發(fā)明使用的細胞系描述于ATCC_細胞系目錄，可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。在一個優(yōu)選的實施方案中，在哺乳動物表達系統(tǒng)中表達Fc變體，包括在該系統(tǒng)中使用諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的病毒將表達構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動物細胞?？墒褂萌魏尾溉閯游锛毎?，特別優(yōu)選人、小鼠、大鼠、倉鼠以及靈長類動物細胞。合適的細胞也包括已知的研究細胞，包括但不限于Jurkat T細胞、NIH3T3、CHO、COS和293細胞。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，文庫蛋白質(zhì)可在細菌細胞中得到表達。細菌表達系統(tǒng)為本領(lǐng)域所眾所周知，包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌、乳脂鏈球菌(Streptococcuscremoris)和鏈鎖狀球菌(Streptococcus lividans)。在可選的實施方案中，F(xiàn)c變體在昆蟲細胞或酵母細胞中產(chǎn)生。在一個可選的實施方案中，使用無細胞翻譯系統(tǒng)在體外表達Fc變體。體外翻譯系統(tǒng)源自原核細胞(例如，大腸桿菌)和真核細胞(如，小麥胚(wheat germ)、兔網(wǎng)織紅細胞)，所述細胞可獲得并可基于表達水平以及感興趣蛋白質(zhì)的功能而得到選擇。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，體外翻譯是一些展示技術(shù)所必需的，例如核糖體展示。此外，F(xiàn)c變體可通過化學合成方法產(chǎn)生。編碼本發(fā)明Fc變體的核酸可摻入表達載體中以便表達蛋白質(zhì)。許多表達載體可用于蛋白質(zhì)表達。表達載體可包含染色體外自主復(fù)制載體或整合入宿主基因組的載體。應(yīng)構(gòu)建與宿主細胞類型相容的表達載體。因此可供本發(fā)明使用的表達載體包括但不限于能使蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞、酵母以及體外系統(tǒng)中表達的那些。本領(lǐng)域公知多種表達載體可從商業(yè)上或以其它方式獲得，可供本發(fā)明用于表達Fc變體蛋白。表達載體通常包含與控制或調(diào)節(jié)序列、可選標記、任意融合伴侶和/或額外元件可操作地連接的蛋白質(zhì)。本文中“可操作地連接”意指所述核酸與其它核酸序列以功能關(guān)系放置。一般來說，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸可操作地連接于編碼Fc變體的核酸的這些表達載體，其通常適于宿主細胞使用以表達蛋白質(zhì)。一般而言，所述轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列可包括啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強子或激活子序列。本領(lǐng)域也公知，表達載體通常含有選擇基因或標記以容許對含有表達載體的轉(zhuǎn)化宿主細胞選擇。選擇基因為本領(lǐng)域眾所周知并可隨著所使用的宿主細胞而改變。Fc變體能可操作地連接于融合伴侶，使所表達的蛋白質(zhì)的靶向、純化、篩選、展示等能夠?qū)崿F(xiàn)。融合伴侶可通過接頭序列與Fc變體序列連接。所述接頭序列通常包含較少數(shù)量的氨基酸，一般少于10，盡管也可使用更長的接頭。一般地，所選擇的接頭序列應(yīng)具有柔性并能抗降解。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，許多序列可用作為接頭。例如，常用的接頭序列包含氨基酸序列GGGGS。融合伴侶可具有靶向作用或可以是信號序列，將Fc變體蛋白質(zhì)與任一相關(guān)的融合伴侶送往所需的細胞位置或細胞外介質(zhì)。本領(lǐng)域公知某些信號序列可將蛋白質(zhì)靶向分泌到培養(yǎng)基或位于細胞的內(nèi)外膜之間的壁膜間隙。融合伴侶也可以是編碼使純化和/或篩選可能的肽或蛋白質(zhì)的序列。上述融合伴侶包括但不限于多組氨酸標簽(His標簽)(例如H6和H10或其它用于固定化金屬親和層析(IMAC)系統(tǒng)(如，Ni+2親和柱)的標簽)GST融合體、MBP融合體、Strep標簽、細菌酶BirA的BSP生物素化靶序列以及靶向抗體的附加表位(例如c-myc標簽、flag標簽等等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解上述標記可用于純化、篩選、或兩者。例如，F(xiàn)c變體可通過使用His標簽將其固定在Ni+2親和柱上而得到純化，接著在純化后同樣的His標簽可用于將抗體固定在Ni+2包被的培養(yǎng)板上，以進行ELISA或其它結(jié)合測定(如下所述)。融合伴侶可使利用選擇方法篩選Fc變體成為可能(參見如下)。能用于多種選擇方法的融合伴侶為本領(lǐng)域眾所周知，所有這些融合伴侶都可供本發(fā)明使用。舉例來說，通過將Fc變體文庫的成員融合到基因III蛋白質(zhì)上，噬菌體展示能得到使用(Kay等.，Phage display of peptidesand proteinsa laboratory manual，Academic Press，San Diego，CA，1996；Lowman等，1991，Biochemistry 3010832-10838；Smith，1985，Science 2281315-1317)。融合伴侶能使Fc變體得到標記。可選地，融合伴侶可結(jié)合表達載體上的特定序列，能使該融合伴侶和相關(guān)的Fc變體與編碼它們的核酸共價或非共價連接。例如，USSN 09/642,574；USSN 10/080,376；USSN09/792,630；USSN 10/023,208；USSN 09/792,626；USSN 10/082,671；USSN09/953,351；USSN 10/097,100；USSN 60/366,658；PCT WO 00/22906；PCTWO 01/49058；PCT WO 02/04852；PCT WO 02/04853；PCT WO 02/08023；PCT WO 01/28702；和PCT WO 02/07466描述了這樣的融合伴侶和技術(shù)，其可供本發(fā)明使用。本領(lǐng)域眾所周知向宿主細胞中導(dǎo)入外源核酸的方法，所述方法可隨著所使用的宿主細胞而變化。技術(shù)包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、氯化鈣處理、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒或噬菌體感染、在脂質(zhì)體中多核苷酸的膠囊化(encapsulation)、以及直接將DNA微注射入細胞核。就哺乳動物而言，轉(zhuǎn)染可以是瞬時的或穩(wěn)定的。在一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)在表達后得到純化或分離。以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法可分離或純化蛋白質(zhì)。標準的純化方法包括色譜技術(shù)，包括離子交換、疏水相互作用、親和力、大小或凝膠過濾、以及反相，在大氣壓或高壓下使用諸如FPLC和HPLC的系統(tǒng)進行。純化方法還包括電泳、免疫學技術(shù)、沉淀、透析以及色譜聚焦技術(shù)。超濾和滲濾技術(shù)與蛋白質(zhì)濃縮也是有用的。本領(lǐng)域眾所周知許多天然蛋白質(zhì)結(jié)合Fc和抗體，這些蛋白質(zhì)可供本發(fā)明用于純化Fc變體。例如，細菌蛋白A和G結(jié)合Fc區(qū)。同樣地，細菌蛋白L結(jié)合某些抗體的Fab區(qū)，當然抗體的靶抗原也能結(jié)合Fab區(qū)。通過特定的融合伴侶純化通常能得到實施。例如，如果采用GST融合，則Fc變體蛋白質(zhì)可使用谷胱甘肽樹脂進行純化，如果使用His標簽，則可使用Ni+2親和層析，或如果使用flag標簽，則可使用固定化抗-flag抗體。關(guān)于適合的純化技術(shù)的常規(guī)指導(dǎo)，參見ProteinPurificationPrinciples and Practice，第3版.，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994。所需的純化程度可基于Fc變體的篩選或用途而變化。在一些情況下無需要純化。例如在一個實施方案中，如果Fc變體被分泌，可直接從培養(yǎng)基中篩選。本領(lǐng)域眾所周知，一些選擇方法并不包括蛋白質(zhì)的純化。因此，舉例來說，如果Fc變體文庫制成噬菌體展示文庫，則不需要進行蛋白質(zhì)純化。Fc變體可使用多種方法篩選，包括但不限于使用體外分析法、體內(nèi)和基于細胞分析法以及選擇技術(shù)的那些。在篩選程序中可利用自動化和高通量篩選技術(shù)。可使用融合伴侶或標記進行篩選。如上已討論了融合伴侶的使用。本文中“標記的”意指本發(fā)明的Fc變體具有一種或多種附在其上使篩選中的檢測成為可能的元件、同位素或化合物。一般而言，標記分成三類a)免疫標記，可以是摻入作為融合伴侶的表位，該表位被抗體識別，b)同位素標記，可以是放射性同位素或重同位素，以及c)小分子標記，可包括熒光和比色染料，或諸如生物素的使其它標記方法運作的分子。標記可以摻入化合物中任何位置，并可在蛋白質(zhì)表達過程中在體外或體內(nèi)摻入。在一個優(yōu)選的實施方案中，在體外分析法中Fc變體的功能和/或生物物理特性得到篩選。對于篩選感興趣的特性而言，體外分析法可給予廣闊的動態(tài)范圍?？珊Y選的Fc變體特性包括但不限于穩(wěn)定性、溶解性和對Fc配體的親和力，例如對Fc□Rs的?？赏瑫r或分別篩選多種特性。取決于測定所需，蛋白質(zhì)可以是純化的或未純化的。在一個實施方案中，所述篩選是用于Fc變體與蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子的結(jié)合的定性或定量的結(jié)合測定，這些非蛋白質(zhì)分子已知或視為結(jié)合Fc變體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述篩選是用于測量抗體或Fc融合體的靶抗原結(jié)合的結(jié)合測定。在一個可選地優(yōu)選的實施方案中，所述篩選是用于Fc變體與Fc配體結(jié)合的測定，F(xiàn)c配體包括但不限于Fc□Rs家族、新生受體FcRn、補體蛋白C1q、以及細菌蛋白A和G。所述Fc配體可來自任何生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子?？墒褂枚喾N本領(lǐng)域公知的方法進行結(jié)合分析，包括但不限于基于FRET(熒光能量共振轉(zhuǎn)移)和BRET(生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移)的分析法、AlphaScreenTM(增強發(fā)光均質(zhì)鄰近分析法(Amplified luminescent proximityhomogeneous Assay))、閃爍鄰近分析法(Scintillation proximity Assay)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、SPR(表面胞質(zhì)團共振(Surface plasmonResonance)，也已知為BIACORE_)、等溫滴定量熱法(isothermal titrationcalorimetry)、差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry)、凝膠電泳以及包括凝膠過濾的色譜法。這些方法和其它方法可利用某些Fc變體的融合伴侶或標記?？墒褂枚喾N檢測方法進行測定，包括但不限于發(fā)色的、熒光的、發(fā)光的或同位素標記。Fc變體蛋白質(zhì)的生物物理特性，例如穩(wěn)定性和溶解性，通過使用多種本領(lǐng)域已知的方法可得到篩選。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性通過測量在折疊和非折疊狀態(tài)之間的熱力學平衡可得到確定。例如，使用化學變性劑、加熱或pH方法，本發(fā)明的Fc變體蛋白質(zhì)可以解折疊，該轉(zhuǎn)換可使用包括但不限于圓二色譜法、熒光光譜法、吸收光譜法、NMR波譜法、熱量測定法以及蛋白質(zhì)水解法的方法來監(jiān)測。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，通過使用這些技術(shù)和其它技術(shù)，折疊和解折疊轉(zhuǎn)換的動力學參數(shù)也可得到監(jiān)測。通過使用許多本領(lǐng)域公知的方法，F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)的溶解性和總體結(jié)構(gòu)完整性可得到定量或定性測定?？晒┍景l(fā)明用于鑒定Fc變體蛋白質(zhì)生物物理特性的方法包括凝膠電泳、諸如大小排阻層析和反相高效層析的色譜法、質(zhì)譜法、紫外吸收光譜分析法、熒光光譜法、圓二色譜法、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、超速離心分析法、動態(tài)光散射法、蛋白質(zhì)水解法以及交聯(lián)法、濁度測量法、過濾阻滯分析法(filter retardation assays)、免疫分析法、熒光染料結(jié)合分析法、蛋白質(zhì)染色法、顯微鏡法以及通過ELISA或其它結(jié)合分析法對聚集的檢測。使用X-射線晶體學技術(shù)分析結(jié)構(gòu)，也可使用NMR波譜法。在一個實施方案中，通過在規(guī)定的某一段時間后測定溶液蛋白質(zhì)量，可測定穩(wěn)定性和/或溶解性。在該測定中，蛋白質(zhì)可以暴露于或可以不暴露于某些極端條件下，例如提高溫度、低pH或存在變性劑。因為行使功能通常需要穩(wěn)定、可溶和/或適當折疊/結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，前述的功能和結(jié)合分析法也提供了用于執(zhí)行上述測量的方法。例如，包含F(xiàn)c變體的溶液可對其與靶抗原的結(jié)合能力進行測定，接著在極端溫度下暴露一段或多段規(guī)定的時間，然后再測定與抗原的結(jié)合。因為預(yù)期解折疊和聚集的蛋白質(zhì)無法結(jié)合抗原，所以保留的活性量提供了對Fc變體的穩(wěn)定性和溶解性的量度。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用一種或多種基于細胞或體內(nèi)分析法對文庫進行篩選。對于上述分析法，純化的或未純化的Fc變體蛋白質(zhì)通常作為外源物添加，使得細胞暴露于屬于文庫的單個變體或變體庫。這些分析法通常，但并不總是，基于包含F(xiàn)c變體的抗體或Fc融合體的功能；即抗體或Fc融合體結(jié)合靶抗原和介導(dǎo)某些生化反應(yīng)的能力，例如效應(yīng)器功能、配體/受體結(jié)合抑制、細胞凋亡等等。上述分析法通常包括監(jiān)測細胞對抗體或Fc融合體的應(yīng)答，例如細胞生存、細胞死亡、細胞形態(tài)學變化或諸如天然基因或報道基因細胞表達的轉(zhuǎn)錄激活。例如，上述分析法可測量Fc變體引發(fā)ADCC、ADCP或CDC的能力。對于某些分析法而言，可能需要添加除靶細胞之外的額外的細胞或組分，例如血清組分或諸如外周血單個核細胞(PBMCs)、NK細胞、巨噬細胞等的效應(yīng)細胞。上述額外的細胞可來自任何生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。抗體和Fc融合體可引發(fā)表達了所述抗體靶抗原的某些細胞系的細胞凋亡，或它們可通過已添加到該分析中的免疫細胞介導(dǎo)對靶細胞的攻擊。用于監(jiān)測細胞死亡或生存能力的方法為本領(lǐng)域所公知，包括使用染料、免疫化學、細胞化學和放射性試劑。例如，半胱天冬酶染色分析法能測定細胞凋亡，攝取或釋放放射性底物或諸如alamar藍的熒光染料能監(jiān)測細胞生長或激活。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了基于EuTDA的DELFIA_細胞毒性測定法(Perkin Elmer，MA)?？蛇x地，可通過測量一種或多種天然胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，例如乳酸脫氫酶的釋放，以監(jiān)測死亡或損傷的靶細胞。在基于細胞的測定法中轉(zhuǎn)錄激活也可用作為分析功能的方法。在該情況下，通過對可能是增量調(diào)節(jié)的天然基因或蛋白質(zhì)的分析以監(jiān)測應(yīng)答，例如可測定某些白細胞介素的釋放，或可選地通過報道構(gòu)建體讀出結(jié)果。基于細胞的測定法也可包括對細胞形態(tài)學改變的測定，該形態(tài)學改變作為Fc變體存在的應(yīng)答。用于上述測定法的細胞類型可以是原核或真核的，可采用本領(lǐng)域公知的多種細胞系?？蛇x地，使用已轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染編碼所述Fc變體核酸的細胞，可進行基于細胞的篩選。即，F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)并不作為外源物添加到細胞中。例如，在一個實施方案中，所述基于細胞的篩選使用了細胞表面展示?？墒褂萌诤习閭H以使Fc變體在細胞表面得到展示(Witrrup，2001，Curr OpinBiotechnol，12395-399)?？晒┍景l(fā)明使用的細胞表面展示方法包括但不限于在細菌(Georgiou等.，1997，Nat Biotechnol 1529-34；Georgiou等.，1993，Trends Biotechnol 116-10；Lee等.，2000，Nat Biotechnol 18645-648；Jun等.，1998，Nat Biotechnol 16576-80)、酵母(Boder和Wittrup，2000，MethodsEnzymol 328430-44；Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15553-557)以及哺乳動物細胞(Whitehorn等，1995，Bio/technology 131215-1219)上展示。在一個可選的實施方案中，F(xiàn)c變體蛋白質(zhì)并不在細胞表面展示，反而在細胞內(nèi)或在某些其它細胞區(qū)室中被篩選。例如，周質(zhì)表達和細胞計數(shù)篩選(Chen等.，2001，Nat Biotechnol 19537-542)、蛋白質(zhì)片段互補測定(Johnsson和Varshavsky，1994，Proc Natl Acad Sci USA 9110340-10344.；Pelletier等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 9512141-12146)以及酵母雙雜交篩選(Fields和Song，1989，Nature 340245-246)可供本發(fā)明使用。可選地，如果多肽包含所述Fc變體，例如抗體或Fc融合體，可賦予細胞一些可選擇的生長有利條件，所述特性可用于對Fc變體篩選或選擇。本領(lǐng)域公知，篩選方法的子集是對文庫的有利成員進行選擇的那些。所述方法在本文中稱為“選擇方法”，這些方法可供本發(fā)明用于篩選Fc變體文庫。當使用選擇方法篩選文庫時，僅有那些有利的文庫成員，即符合某些篩選標準，得到增殖、分離和/或觀察。應(yīng)當理解，因為僅有最恰當?shù)淖凅w得到觀察，所以通過單獨測定文庫成員的適合度(fitness)的方法，能使大于該方法可篩選的那些的文庫得到篩選。通過任何方法、技術(shù)，或共價或非共價地連接的融合伴侶、具有其基因型的Fc變體的表型(即具有編碼其核酸的Fc變體的功能)，能使選擇得到實施。例如通過將文庫成員與基因III蛋白質(zhì)融合，能使噬菌體展示用作選擇方法?？梢姡凅w蛋白質(zhì)的選擇或分離符合某些標準，例如對FcγR的結(jié)合親和力，也用于選擇或分離編碼其的核酸。一旦分離了，所述編碼Fc變體的基因可接著被擴增。該分離和擴增過程，稱為淘選(panning)，可重復(fù)進行，容許有利的Fc變體在文庫中得到富集。最后對附在其上的核酸進行測序的核酸可供基因鑒定使用。本領(lǐng)域公知的多種選擇方法可供本發(fā)明用于篩選Fc變體文庫。這些方法包括但不限于噬菌體展示(Phage display of peptides and proteinsalaboratory manual，Kay等.，1996，Academic Press，San Diego，CA，1996；Lowman等.，1991，Biochemistry 3010832-10838；Smith，1985，Science 2281315-1317)和其衍生的方法，諸如選擇性噬菌體感染(Malmborg等.，1997，JMol Biol 273544-551)、選擇性感染噬菌體(Krebber等.，1997，J Mol Biol268619-630)以及延遲感染性淘選(Benhar等，2000，J Mol Biol 301893-904)、細胞表面展示(Witrrup，2001，Curr Opin Biotechnol，12395-399)、如在細菌(Georgiou等，1997，Nat Biotechnol 1529-34；Georgiou等，1993，Trends Biotechnol 116-10；Lee等，2000，Nat Biotechnol 18645-648；Jun等.，1998，Nat Biotechnol 16576-80)、酵母(Boder和Wittrup，2000，MethodsEnzymol 328430-44；Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15553-557)和哺乳動物細胞(Whitehorn等.，1995，Bio/technology 131215-1219)上展示、以及體外展示技術(shù)(Amstutz等.，2001，Curr Opin Biotechnol 12400-405)，如多核糖體展示(Mattheakis等.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 919022-9026)、核糖體展示(Hanes等.，1997，Proc Natl Acad Sci USA 944937-4942)、mRNA展示(Roberts和Szostak，1997，Proc Natl Acad Sci USA 9412297-12302；Nemoto等.，1997，F(xiàn)EBS Lett 414405-408)和核糖體失活展示系統(tǒng)(Zhou等，2002，J Am Chem Soc 124，538-543)。其它可供本發(fā)明使用的選擇方法包括不限于展示的方法，諸如體內(nèi)方法，包括但不限于周質(zhì)表達和細胞計數(shù)篩選(cytometric screening)(Chen等，2001，Nat Biotechnol 19537-542)、蛋白質(zhì)片段互補測定(Johnsson和Varshavsky，1994，Proc Natl Acad Sci USA 9110340-10344；Pelletier等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 9512141-12146)和在選擇模式中使用的(Visintin等，1999，Proc Natl Acad Sci USA 9611723-11728)酵母雙雜交篩選(Fields和Song，1989，Nature 340245-246)。在一個可選的實施方案中，可通過在表達載體上結(jié)合有特定序列的融合伴侶使選擇能夠進行，因此能使該融合伴侶和相關(guān)的Fc變體文庫成員與編碼它們的核酸共價或非共價連接。例如，USSN 09/642,574；USSN 10/080,376；USSN 09/792,630；USSN 10/023,208；USSN 09/792,626；USSN 10/082,671；USSN 09/953,351；USSN 10/097,100；USSN 60/366,658；PCT WO 00/22906；PCT WO 01/49058；PCT WO 02/04852；PCT WO 02/04853；PCT WO 02/08023；PCT WO 01/28702；和PCT WO02/07466中描述了上述可供本發(fā)明使用的融合伴侶和技術(shù)。在一個可選的實施方案中，如果諸如抗體或Fc融合體的包含F(xiàn)c變體的多肽表達可賦予細胞一些生長、復(fù)制或生存的優(yōu)點，則可進行體內(nèi)選擇。稱為“定向進化(directed evolution)”方法的選擇方法的子集是在選擇過程中包括有利序列雜交(mating)或傳代(breading)的那些，有時有新突變摻入。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，定向進化方法能使在文庫中最有利序列的鑒定更容易，并能增加所篩選的序列的多樣性。許多定向進化方法為本領(lǐng)域所公知，并可供本發(fā)明用于篩選Fc變體文庫，包括但不限于DNA改組(PCT WO 00/42561A3；PCT WO 01/70947A3)、外顯子改組(US6,365,377；Kolkman和Stemmer，2001，Nat Biotechnol 19423-428)、家族改組(Crameri等.，1998，Nature 391288-291；US 6,376,246)、RACHITTTM(Coco等.，2001，Nat Biotechnol 19354-359；PCT WO 02/06469)、STEP和隨機引發(fā)體外重組(Zhao等.，1998，Nat Biotechnol 16258-261；Shao等.，1998，Nucleic Acids Res 26681-683)、核酸外切酶介導(dǎo)的基因裝配(US 6,352,842；US 6,361,974)、基因定位飽和誘變(Gene Site Saturation)MutagenesisTM(US6,358,709)、基因重裝配(Gene ReassemblyTM)(US 6,358,709)、SCRATCHY(Lutz等.，2001，Proc Natl Acad Sci USA 9811248-11253)、DNA斷裂法(DNAfragmentation method)(Kikuchi等.，Gene 236159-167)、單鏈DNA改組(Kikuchi等.，2000，Gene 243133-137)以及AMEsystemTM定向進化蛋白質(zhì)工程技術(shù)(應(yīng)用分子進化)(US US 5,824,514；US 5,817,483；US 5,814,476；US5,763,192；US 5,723,323)。在細胞、組織以及全生物體實驗中，包含本發(fā)明Fc變體的抗體和Fc融合體的生物學特性可得到鑒定。本領(lǐng)域公知，藥物常在動物中測試，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬和猴子，以便測定藥物對疾病或疾病模型的處理的有效性，或測定藥物的藥物代謝動力學、毒性以及其它特性。所述動物可稱為疾病模型。治療劑通常在小鼠中測試，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、異種移植小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠(包括敲進和敲除)。例如，預(yù)計作為抗癌治療劑的本發(fā)明的抗體或Fc融合體可在小鼠癌模型中測試，例如在異種移植小鼠中。在該方法中，腫瘤或腫瘤細胞系移植或注射入小鼠，隨后該小鼠用治療劑處理以測定抗體或Fc融合體減緩或抑制癌生長的能力。上述實驗方法可提供有意義的數(shù)據(jù)用于確定所述抗體或Fc融合體用作為治療劑的可能性。任何生物體，優(yōu)選哺乳動物，皆可用于測試。例如因為猴子與人的遺傳相似性，所以它們可以是合適的治療模型，并因此可用于測試本發(fā)明抗體和Fc融合體的有效性、毒性、藥物代謝動力學或其它特性。對于正式批準藥物而言，最終必需在人類中測試本發(fā)明的抗體和Fc融合體，因此當然要考慮這些實驗。因此本發(fā)明的抗體和Fc融合體可在人類中測試以確定它們的療效、毒性、藥物代謝動力學和/或其它臨床特性。
實施例[183]提供如下實施例以舉例說明本發(fā)明。這些實施例無意將本發(fā)明限制于任何特定應(yīng)用或操作理論。對于所有討論于本發(fā)明中的位置而言，編號方式依照Kabat的EU標引方式(Kabat等.，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，United States Public Health Svice，National Institutes of Health，Bethesda)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解該慣例由免疫球蛋白序列的特定區(qū)域中非連續(xù)編號方式組成，能夠得到免疫球蛋白家族保守位置的標準化參考。因此，通過EU標引方式規(guī)定的任何給定免疫球蛋白的位置無需與其連續(xù)序列對應(yīng)。圖3顯示了對于阿侖單抗抗體而言的連續(xù)的和EU標引的編號方案，以便更清楚地闡明該主題。也應(yīng)當指出在許多Fc位置上已觀察到多態(tài)性，包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此在本發(fā)明序列和科學文獻序列之間可能存在微小差別。實施例1.Fc文庫的計算篩選和設(shè)計進行計算篩選計算以設(shè)計優(yōu)化的Fc變體。在幾次計算/實驗循環(huán)中，對Fc變體進行計算篩選、構(gòu)建和實驗研究。對于每次連續(xù)循環(huán)而言，提供的實驗數(shù)據(jù)反饋入下一組計算篩選計算和文庫設(shè)計中。所有的計算篩選計算和文庫設(shè)計呈現(xiàn)于實施例1中。對于每組計算而言，提供了列出結(jié)果和提供有關(guān)信息和參數(shù)的表格。結(jié)合Fc□Rs胞外域的Fc的幾種不同結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)用于計算篩選計算?？晒_獲得的Fc/FcγR復(fù)合物結(jié)構(gòu)包括pdb登記號1E4K(Sondermann等.，2000，Nature 406267-273.)，以及pdb登記號1IIS和1IIX(Radaev等.，2001，J Biol Chem 27616469-16477)。Fc□RIIIb和FcγRIIIa的胞外區(qū)具有96％同一性，因此使用Fc/FcγRIIIb結(jié)構(gòu)與使用FcγRIIIa基本上等效。雖然如此，對于某些計算而言，通過在1IIS和1E4K結(jié)構(gòu)中對D129G突變模建(稱為D129G 1IIS和D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu))，構(gòu)建更精確的Fc/FcR□IIIa模板結(jié)構(gòu)。此外，使用標準方法，可獲得的Fc□R序列信息，前述的Fc/FcγR結(jié)構(gòu)，以及未結(jié)合復(fù)合物(pdb登記號1H9V)(Sondermann等.，2001，J Mol Biol 309737-749)(pdb登記號1FCG)(Maxwell等.，1999，NatStruct Biol 6437-442)、Fc□RIIb(pdb登記號2FCB)(Sondermann等.，1999，Embo J 181095-1103)和Fc□RIIIb(pdb登記號1E4J)(Sondermann等.，2000，Nature 406267-273.)的結(jié)構(gòu)信息，對與人FcγR11b、人F158 FcγRIIIa和小鼠FcγRIII胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fc結(jié)構(gòu)模建。通過圖像檢查前述Fc/FcγR和FcγR結(jié)構(gòu)，并使用溶劑可接觸性信息及序列信息，可變位置和在那些位置要被考慮的氨基酸得到選擇。對于確定在此處取代可提供激活性和抑制性受體之間區(qū)別的親和力的可變位置而言，F(xiàn)cs和FcγRs的序列信息是特別有用的。事實上，對所有的Cγ2位置都用計算方法進行篩選。Fc結(jié)構(gòu)是兩條重鏈的同型二聚體(在1IIS、1IIX和1E4K結(jié)構(gòu)中標記的鏈A和B)，每條鏈包括鉸鏈和C□2-C□3結(jié)構(gòu)域(顯示于圖2)。因為FcγR(在1IIS、1IIX和1E4K結(jié)構(gòu)中標記的鏈C)不對稱結(jié)合Fc同型二聚體，所以在設(shè)計計算中通常分別考慮每條鏈。對于某些計算而言，鄰近可變位置殘基的Fc和/或FcγR殘基是漂浮的，即在蛋白質(zhì)設(shè)計計算中容許氨基酸構(gòu)象改變，但不容許氨基酸同一性改變，以供構(gòu)象調(diào)整使用。在下表中列出了對每組計算相關(guān)的這些殘基。除非另有指示，所考慮的氨基酸通常屬于核內(nèi)(Core)、核內(nèi)XM(Core XM)、表面(Surface)、邊界(Boundary)、邊界XM(Boundary XM)或所有20種分類的任一種。這些分類定義如下核內(nèi)(Core)＝丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸；核內(nèi)XM(Core XM)＝丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；表面(Surface)＝丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸以及組氨酸；邊界(Boundary)＝丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸；邊界XM(BoundaryXM)＝邊界(Boundary)＝丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；所有20種＝所有20種天然存在的氨基酸。大多數(shù)計算依照兩種常規(guī)類型計算篩選方法之一進行。在一種方法中，在可變位置氨基酸的構(gòu)象表示為一組不受主鏈約束的側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，其來自Dunbrack&Cohen的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(Dunbrack等.，1997，Protein Sci 61661-1681)。通過使用含有描述范德華、溶劑化、靜電和氫鍵相互作用的項(term)的力場(force field)，以及使用死端消除(Dead EndElimination)(DEE)算法所確定的最優(yōu)(基態(tài))序列，在所選可變位置計算所考慮的氨基酸的所有可能組合的能量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，由于主要在打分函數(shù)(scoring function)中存在錯誤，外加蛋白質(zhì)中細小的構(gòu)象差異能導(dǎo)致明顯的穩(wěn)定性差異的事實，所以所預(yù)測的最低能量序列并不必然是真實的最低能量序列。但是，所預(yù)測的基態(tài)序列可能接近真實的基態(tài)，因此通過評估序列的能量(所述序列在序列空間和圍繞所預(yù)測基態(tài)的能量方面是接近的)，額外有利的多樣性可得到探查。為實現(xiàn)該目的并產(chǎn)生文庫序列多樣性，蒙特卡羅(Monte Carlo)(MC)算法可用于評估在所預(yù)測基態(tài)附近的1000個相似序列的能量。在序列中可變區(qū)位置由取代占據(jù)，這樣的序列在1000個序列的組中的數(shù)量值可反映該取代是如何有利。該計算篩選方法基本上類似于Protein Design Automation_(PDA_)技術(shù)，描述于US 6,188,965；US 6,269,312；US 6,403,312；USSN 09/782,004；USSN 09/927,790；USSN10/218,102；PCT WO 98/07254；PCT WO 01/40091；和PCT WO 02/25588，為便于描述，在所有實施例中稱為PDA_技術(shù)。列出這些計算結(jié)果的表格提供了在所指定鏈上的每個可變位置(欄1)、在每個可變位置上所考慮的氨基酸(欄2)、在每個可變位置上野生型(WT)Fc氨基酸同一性(欄3)、在DEE基態(tài)(ground state)序列中每個可變位置上氨基酸同一性(欄4)、以及在蒙特卡羅輸出中觀察到的氨基酸組和相應(yīng)的取代占據(jù)(欄5)。其它計算方法利用了遺傳算法(GA)來篩選低能量序列，對于序列被采樣的那些，在每輪“進化”過程中計算能量?？勺兒推∥恢?floatedposition)的氨基酸構(gòu)象表示為一組側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，所述側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體源自不受主鏈約束的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫，所述文庫使用了柔性旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體模型(Mendes等.，1999，Proteins 37530-543)。使用含有描述范德華、溶劑化(solvation)、靜電和氫鍵相互作用的項的力場計算能量。該計算產(chǎn)生了具有300個序列的列(list)，預(yù)測其應(yīng)具有低能量。為便于結(jié)果分析和文庫產(chǎn)生，使用最近鄰居單鍵分級聚類算法(nearest neighbor single linkage hierarchicalclustering algorithm)基于相似性分數(shù)將序列分為相關(guān)的組，所述300個輸出序列通過計算聚類分為10組相似序列(Diamond，1995，Acta Cryst D51127-135)。即，所有組內(nèi)序列是最相似于同組內(nèi)所有其它的序列，并較少相似于其它組中的序列。來自這些十個簇(cluster)的每一個中的最低能量序列用來代表每組，并作為結(jié)果呈現(xiàn)。該計算篩選方法基本上類似于SequencePrediction AlgorithmTM(SPATM)技術(shù)，描述于(Raha等.，2000，Protein Sci 91106-1119)；USSN 09/877,695；和USSN 10/071,859，為便于描述，在所有實施例中稱為SPATM技術(shù)。應(yīng)用計算篩選設(shè)計能量有利的相互作用，所述相互作用位于可變位置組的Fc/Fc□R界面，其介導(dǎo)或可能介導(dǎo)與Fc□R的結(jié)合。因為所述結(jié)合界面包括了在兩條不同鏈上的大量Fc殘基，并因為Fc□Rs不對稱地結(jié)合Fc，所以殘基分為不同的相互作用可變位置組，并設(shè)計為獨立的計算組。在許多情況下，選擇這些組作為將耦合的(coupled)殘基組，即一種或多種殘基的能量取決于與一種或多種其它殘基的同一性。可使用不同的模板結(jié)構(gòu)，在許多情況下，計算研究了在兩條鏈上的取代。對于大多數(shù)可變位置組而言，使用所描述的利用了PDA_和SPATM技術(shù)的計算篩選方法進行計算。這些計算的結(jié)果和有關(guān)參數(shù)以及信息列于如下表1-30。列出這些計算結(jié)果的表格提供了在所指定鏈上的每個可變位置(欄1)、在每個可變位置上所考慮的氨基酸(欄2)、在每個可變位置上的野生型(WT)Fc氨基酸同一性(欄3)、以及對于來自每個聚類組的最低能量序列而言在可變位置上的氨基酸同一性(欄4-13)。表1-59分為兩組，標記如下，PDA_和SPATM技術(shù)。PDA_表的欄4顯示了在PDA_運行過程中每個殘基在上限1000個序列中的出現(xiàn)頻率。因此，在表1的第一行，在位置328處，當使用邊界氨基酸作為該位置可變殘基組運行時，在上限1000個序列中L出現(xiàn)330次、M出現(xiàn)302次等。此外，包括在本發(fā)明組合物范圍內(nèi)的是在所列位置中具有任一所列氨基酸殘基的抗體，所述抗體可單獨或以任意組合存在(注意優(yōu)選的組合列于權(quán)利要求、說明書概述和附圖中)。一個優(yōu)選的組合是處于基態(tài)的所列位置中所列的氨基酸殘基(有時在本文中稱為“全局解(global solution)”，以區(qū)別于野生型)。同樣地，表格之間的殘基位置和在那些殘基位置上的特定氨基酸可進行組合。對于SPATM技術(shù)的表格而言，諸如表4、欄4是SPATM運行結(jié)果，其產(chǎn)生了在六個所列位置具有六個所列氨基酸的蛋白質(zhì)(例如，欄4是具有除239E、265G、267S、269Y、270T和299S外的野生型序列的單一蛋白質(zhì))。因此，每一個這些單獨的蛋白質(zhì)都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，在表格內(nèi)及表格間SPATM蛋白質(zhì)之間的組合也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，每張表顯示了糖的存在或不存在，但明確包括的是相反序列；如表1列出了非糖基化變體，但這些同樣的氨基酸改變可在糖基化變體上進行。而且，每張表列出了所使用的模板結(jié)構(gòu)，以及“漂浮的”殘基，例如，表2使用了PDA_運行漂浮的C120，C132和C134。
表1
PDA_技術(shù)，1IIS模板結(jié)構(gòu)；-糖表2
PDA_技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的120C，132C，134C表3
PDA_技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，133C，134C表4
SPATM技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的120C，122C，132C，133C，134C
表5
PDA_技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的119C，128C，157C表6
SPATM技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的119C，128C，157C表7
PDA_技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的88C，90C，113C，114C，116C，160C，161C表8
SPATM技術(shù)111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的88C，90C，113C，114C，116C，160C，161C
表9
SPATM技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)-糖；漂浮的120C，132C，134C表10
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的113C，116C，132C，155C，157C表11
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的113C，116C，132C，155C，157C表12
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C表13
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；+糖漂浮的120C
表14
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的90C，160C，161C表15
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的90C，160C，161C表16
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C表17
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的117C表18
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的87C，157C，158C
表19
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的87C，157C，158C表20
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的273A，275A，302A，323A，134C表21
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的273A，275A，302A，323A，134C表22
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的273B，275B，302B，323B，161C
表23
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的273B，275B，302B，323B，161C表24
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的273B，275B，302B，323B，131C表25
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的273B，275B，302B，323B，131C表26
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖漂浮的273A，275A，302A，323A，158C
表27
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；+糖；漂浮的273A，275A，302A，323A，158C[196]針對Fc變體設(shè)計進行計算篩選計算以優(yōu)化N297糖和Cγ2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。通過在與糖相互作用的位置上探查能量有利的取代，對新的、可能有利的糖構(gòu)象采樣，變體可得到改造。Fc殘基F241、F243、V262和V264介導(dǎo)Fc/糖相互作用并因此作為靶位置。這些設(shè)計計算的結(jié)果列于表28中。
表28
PDA_技術(shù)，111S模板結(jié)構(gòu)；-糖[197]針對Fc變體設(shè)計進行計算篩選計算以優(yōu)化Cγ3和Cγ2結(jié)構(gòu)域之間的夾角。位于Cγ2/Cγ3界面的殘基P244、P245、P247和W313似乎在決定Cγ2-Cγ3夾角和相對于彼此的結(jié)構(gòu)域柔性中扮演關(guān)鍵角色。通過在這些位置上掃描能量有利的取代，對新的、可能有利的夾角和柔性(flexibility)水平采樣，可設(shè)計變體。這些設(shè)計計算的結(jié)果列于表29中。
表29
PDA_技術(shù)，111S模板結(jié)構(gòu)；-糖[198]除了使用PDA_SPATM計算篩選方法的上述計算外，單獨使用靜電勢的額外計算被用于計算篩選Fc變體。使用庫侖定律和德拜-休克爾標度的計算顯示了Fc中的許多位置，對于該位置而言，氨基酸取代可對與一種或更多種FcγRs結(jié)合起有利作用，包括用荷負電氨基酸取代中性氨基酸可增強與FcγRIIIa結(jié)合的位置，以及用中性或荷負電氨基酸取代荷正電氨基酸可增強與FcγRIIIa結(jié)合的位置。這些結(jié)果列于表30中。
表30
庫侖定律和德拜-休克爾標度；111S模板結(jié)構(gòu)；+糖[199]進行計算篩選以優(yōu)化非糖基化Fc，即在缺少N297糖的條件下優(yōu)化Fc結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性和Fc/FcγR親和力。為了設(shè)計在非糖基化Fc模板結(jié)構(gòu)的背景下殘基297、鄰近297的殘基、位于Fc/FcγR界面的殘基以及位于Fc/糖界面的殘基的有利取代，進行設(shè)計計算。將可變位置分為相互作用可變位置的不同的組，并在使用不同模板結(jié)構(gòu)的分組計算中得到設(shè)計。對于許多可變位置組而言，使用PDA_SPATM計算篩選方法進行計算。這些計算的結(jié)果和有關(guān)信息列于下表31-53中。
表31
PDA_技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的122C，129C，132C，155C表32
SPATM技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的122C，129C，132C，155C
表33
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，128C，132C，155C表34
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，128C，132C，155C表35
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C，119C，125C，129C，152C表36
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C，119C，125C，129C，152C
表37
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，128C，132C，155C表38
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，128C，132C，155C表39
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C，119C，125C，129C，152C表40
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C，119C，125C，129C，152C
表41
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，132C，155C表42
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的120C，122C，128C，132C，155C表43
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C，119C，129C，152C表44
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的117C，119C，129C，152C表45
PDA_技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的299A，120C，122C，132C，155C
表46
SPATM技術(shù)；D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的299A，120C，122C，132C，155C表47
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖漂浮的299B，117C，119C，129C，152C表48
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的299B，117C，119C，129C，152C表49
PDA_技術(shù)D129G 111S模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的239A，265A，120C，122C，132C，155C表50
SPATM技術(shù)D129G 111S模板結(jié)構(gòu)-糖；漂浮的239A，265A，120C，122C，132C，155C
表51
PDA_技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的239B，265B，117C，119C，129C，152C表52
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；-糖；漂浮的239B，265B，117C，119C，129C，152C[200]進行計算篩選以優(yōu)化非糖基化Fc，在不存在糖基化的條件下通過在暴露于溶劑的殘基處設(shè)計有利的取代，使它們穩(wěn)定、保持Fc結(jié)構(gòu)以及不具有聚集趨勢。N297糖覆蓋了暴露的疏水部分(hydrophobic patch)，所述疏水部分通常是與其它Ig結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的界面，維持Fc的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性并阻止Cγ2結(jié)構(gòu)域橫越中心軸的聚集。用于設(shè)計的關(guān)鍵殘基是F241、F243、V262和V264，在Cγ2上它們位于該糖的背面，除了諸如L328、I332和I336的殘基外，它們是暴露的非極性殘基，向內(nèi)面向相對的Cγ2結(jié)構(gòu)域，在先前介紹的計算中考慮到了該情況。這些Cγ2殘基的重要性并不是依據(jù)在Cγ3結(jié)構(gòu)域中通過序列比對所得的相應(yīng)殘基而得到支持的，所述相應(yīng)的殘基介導(dǎo)兩個Cγ3結(jié)構(gòu)域之間的非極性相互作用或埋藏于Cγ3核內(nèi)。這些設(shè)計計算的結(jié)果列于表53中。
表53
PDA_技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)；-糖[201]在最后一組計算中，應(yīng)用SPATM計算篩選方法評估所有20種氨基酸對所有選定可變位置的取代。確定了所有20種氨基酸的能量最低旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體構(gòu)象，該能量定義為在該可變位置處該氨基酸取代的能量。因此這些計算提供了在每個可變位置處對于20種氨基酸每一種取代的能量。對于以糖基化和非糖基化Fc為目標的各種設(shè)計目的，包括Fc/FcγR親和力的優(yōu)化、Fc穩(wěn)定性、Fc溶解性、糖構(gòu)象以及鉸鏈構(gòu)象而言，這些數(shù)據(jù)是有用的。此外，因為這些計算提供了有利和不利取代的能量，所以它們可以指導(dǎo)取代，該取代可實現(xiàn)與激活性FcγRs和抑制性FcγRs的差異結(jié)合。使用不同的模板結(jié)構(gòu)，并計算兩條鏈上暴露的取代。1IIS模板結(jié)構(gòu)鏈A和B上這些計算結(jié)果和相關(guān)參數(shù)及信息列于下表54-59中。欄1列出了1IIS模板結(jié)構(gòu)鏈A和B上的可變位置。欄2列出了在每個可變位置的野生型氨基酸同一性。其余20欄提供了每種天然20種氨基酸的能量(顯示于頂行)。相對于能量最低取代，歸一化所有取代，能量最低取代設(shè)定為0能量。例如在表54中，對于鏈A上L235而言，絲氨酸是能量最低取代，L235A是0.9kcal/mol，穩(wěn)定性較L235S低。對于20-50kcal/mol之間的能量，極高的能量設(shè)定為20kcal/mol，對于高于50kcal/mol的能量，設(shè)定為50kcal/mol。有利的取代可考慮應(yīng)為每個位置的能量最低取代，以及與能量最低取代具有較小能量差異的取代，例如差異在1-2，1-3，1-5，或1-10kcal/mol范圍內(nèi)的取代。
表54
SPATM技術(shù)；111S模板結(jié)構(gòu)+糖原子，無漂浮位置表55
表55(續(xù))
表55(續(xù))
表55(續(xù))
表55(續(xù))
表55(續(xù))
SPATM技術(shù)111S模板結(jié)構(gòu)；-糖，無漂浮位置表56
SPATM技術(shù)D129G 1IIS模板結(jié)構(gòu)+糖表57
SPATM技術(shù)；D129G 1IIX模板結(jié)構(gòu)+糖表58
SPATM技術(shù)；D129G 1E4K模板結(jié)構(gòu)；+糖表59
SPATM技術(shù)；Fc/Fc□RIIb模型模板結(jié)構(gòu)；-糖對于實驗生產(chǎn)和篩選而言，用上表1-59中所列的設(shè)計計算結(jié)果來構(gòu)建一系列的Fc變體文庫。在逐輪計算和實驗篩選中實驗文庫得到設(shè)計。后繼Fc文庫的設(shè)計受益于在前文庫的反饋，因此通常包含了在先前篩選中顯示有利性質(zhì)的Fc變體的組合產(chǎn)物(combinations)。構(gòu)建并通過實驗測試的Fc變體的全部組示于表60中。在該表中，第1行列出了可變位置，下列行顯示了對于野生型氨基酸和Fc變體而言在那些可變位置的氨基酸。例如，變體18具有如下四個突變F241E、F243Y、V262T和V264R。組成該組Fc變體的可變位置殘基在結(jié)構(gòu)上闡明于圖3中，并表示為圖4中人IgG1背景下的Fc序列。
表60
表60(續(xù))
表60(續(xù))
表60(續(xù))
表60(續(xù))
表60(續(xù))
表60(續(xù))
表60(續(xù)) 實施例2Fc文庫的實驗生產(chǎn)和篩選涉及Fc變體的大多數(shù)實驗在抗癌抗體阿侖單抗(Campath_，IlexPharmaceuticals LP的注冊商標)中進行。阿侖單抗結(jié)合其靶抗原CD52中短線性表位(Hale等.，1990，Tissue Antigens 35118-127；Hale，1995，Immunotechnology 1175-187)。已選定阿侖單抗作為初級工程模板結(jié)構(gòu)，是因為其效力是部分基于其招募效應(yīng)細胞的能力(Dyer等.，1989，Blood731431-1439；Fridend等.，1991，Transplant Proc 232253-2254；Hale等.，1998，Blood 924581-4590；Glennie等.，2000，Immunol Today 21403-410)，并因為在生產(chǎn)和結(jié)合測定中使用其抗原是相對直觀的。為了在其它抗體背景下評估本發(fā)明優(yōu)化的Fc變體，在抗-CD20抗體利妥昔單抗(Rituxan_，IDECPharmaceuticals Corporation的注冊商標)和抗-Her2抗體曲妥單抗(Herceptin_，Genentech的注冊商標)中評估所選擇的Fc變體。對于篩選目的而言，使用阿侖單抗、利妥昔單抗和曲妥單抗并不意在將本發(fā)明限制為任何特定抗體。構(gòu)建阿侖單抗、利妥昔單抗和曲妥單抗的IgG1全長輕鏈(VL-CL)和重鏈(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)抗體基因，該構(gòu)建過程利用了合適的末端限制性位點以便于亞克隆。將該基因連接入哺乳動物表達載體pcDNA3.1Zeo(Invitrogen)中。pcDNA3.1Zeo中的VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3克隆作為Fc區(qū)誘變的模板。使用基于PCR的誘變技術(shù)將突變導(dǎo)入該克隆中。對Fc變體測序以證實該序列的保真度。將含有重鏈基因(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)(野生型或變體)的質(zhì)粒與含有輕鏈基因(VL-CL)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細胞中。轉(zhuǎn)染5天后收獲培養(yǎng)基。使用蛋白質(zhì)印跡篩選轉(zhuǎn)染瘤(transfectomas)的培養(yǎng)上清液以監(jiān)測免疫球蛋白表達，所述蛋白質(zhì)印跡使用了過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG(Jackson Immuno Research，目錄#109-305-088)。圖6顯示了野生型阿侖單抗和變體1-10在293T細胞中的表達。使用蛋白A親和層析(Pierce，目錄#20334)從上清液中純化抗體。圖7顯示了野生型阿侖單抗蛋白純化的結(jié)果?？贵wFc變體顯示了類似于野生型的表達和純化結(jié)果。對一些Fc變體去糖基化以便在無糖存在的條件下測定它們的溶解和功能特性。為獲得去糖基化抗體，純化的阿侖單抗抗體與肽-N-糖苷酶(PNGase F)在37℃下溫育24小時。圖8顯示的SDS PAGE凝膠證實了幾個Fc變體和野生型阿侖單抗的去糖基化結(jié)果。為了證實在這些條件下生產(chǎn)的阿侖單抗的功能保真度，抗原CD52肽融合至GST，在IPTG誘導(dǎo)下在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的樣品跑SDS PAGE凝膠。并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。為了進行蛋白質(zhì)印跡，將來自Sotec(終濃度2.5ng/u1)的阿侖單抗或轉(zhuǎn)染的293T細胞的培養(yǎng)基(阿侖單抗終濃度約為0.1-0.2ng/ul)作為一抗，將過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗人IgG作為二抗。圖9顯示了這些結(jié)果。結(jié)合靶抗原的能力證實了所表達的阿侖單抗的結(jié)構(gòu)和功能保真度。預(yù)計與野生型阿侖單抗具有相同可變區(qū)的Fc變體對抗原能保持相當?shù)慕Y(jié)合親和力。為了對Fc/FcγR結(jié)合進行篩選，表達并純化人V158 FcγRIIIa、人F158 FcγRIIIa、人FcγRIIb、人FcγRIIa和小鼠FcγRIII的胞外區(qū)。圖10呈現(xiàn)的SDS PAGE凝膠顯示了人V158 FcγRIIIa表達和純化的結(jié)果。通過對獲得自哺乳動物基因庫(Mammalian Gene Collection)(MGC22630)的克隆進行PCR得到該受體的胞外區(qū)。將該受體與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合以便篩選。將帶標簽的Fc□RIIIa轉(zhuǎn)染入293T細胞，3天后收獲并純化含有分泌Fc□RIIIa的培養(yǎng)基。為了進行蛋白質(zhì)印跡，用抗-GST抗體作為探針探查膜。使用AlphaScreenTM分析法(增強發(fā)光均質(zhì)鄰近分析法(ALPHA)，PerkinElmer，Wellesley，MA)，一種基于珠的非放射性發(fā)光鄰近分析法，對所有設(shè)計的Fc變體測量其與Fc□RIIIa和FcγRIIb的結(jié)合親和力。激光激發(fā)供體珠以激發(fā)氧，如果供體珠足夠接近受體珠，則產(chǎn)生化學發(fā)光反應(yīng)級聯(lián)，最終導(dǎo)致520-620nm處的熒光發(fā)射。AlphaScreenTM分析法作為一種競爭性分析法應(yīng)用于篩選Fc變體。通過標準方法生物素化的野生型阿侖單抗抗體用于附著在鏈霉抗生物素蛋白供體珠上，帶GST標簽的FcγR結(jié)合在谷胱甘肽螯合的受體珠上。在缺少競爭性Fc變體條件下，野生型抗體和FcγR相互作用并在520-620nm處產(chǎn)生信號。不帶標簽的Fc變體的添加與野生型競爭Fc/FcγR相互作用，減少了熒光數(shù)量從而實現(xiàn)相對結(jié)合親和力的測定。對所有Fc變體使用AlphaScreenTM分析法篩選能結(jié)合V158 FcγRIIIa的變體。所選擇的Fc變體接著篩選能結(jié)合FcγRIIb的變體，也篩選能結(jié)合其它FcγRs和Fc配體的變體。圖11顯示了所選擇的Fc變體與人V158 FcγRIIIa結(jié)合的AlphaScreenTM數(shù)據(jù)。結(jié)合數(shù)據(jù)對最大和最小發(fā)光信號歸一化，該最大和最小發(fā)光信號分別提供自低和高濃度競爭性抗體的基線。數(shù)據(jù)使用非線性回歸對單位點競爭模型擬合，這些擬合在該圖中通過曲線表現(xiàn)。對于每種抗體這些擬合提供了50％抑制濃度(IC50)(即達到50％抑制所需要的濃度)，通過圖11中點線說明，因此使得Fc變體的相對結(jié)合親和力能夠定量測定。于此，野生型阿侖單抗具有(4.63×10-9)x(2)＝9.2nM的IC50，而S239D具有(3.98×10-10)x(2)＝0.8nM的IC50。因此S239D阿侖單抗較野生型阿侖單抗對人V158 FcγRIIIa具有9.2nM/0.8nM＝11.64倍的更緊密的結(jié)合。對于所有Fc變體與人V158 FcγRIIIa的結(jié)合進行類似的計算。也篩選與人Fc□RIIb結(jié)合的所選擇的Fc變體，這些AlphaScreenTM結(jié)合數(shù)據(jù)的實例示于圖12中。表61呈現(xiàn)了通過AlphaScreenTM分析法所測定的Fc變體與人V158FcγRIIIa(欄3)及人FcγR11b(欄4)的結(jié)合相對于親本抗體增加的倍數(shù)或減少的倍數(shù)。對于這些數(shù)據(jù)來說，相對于野生型Fc，倍數(shù)大于1表示結(jié)合親和力增加，倍數(shù)小于1表示結(jié)合親和力減少。除標有星號(*)的那些外，其在曲妥單抗(trastuzumab)中測試，所有數(shù)據(jù)均獲得自在阿侖單抗背景下測試。
表61
表61(續(xù))
表61(續(xù))
表61(續(xù))
表61(續(xù)) 實施例3對FcγRs選擇性增強的結(jié)合許多具有優(yōu)化特性的有價值Fc變體獲得自FcγRIIIa及FcγRIIb篩選。表61提供了對FcγRIIIa結(jié)合更緊密的Fc變體，并因此作為候選物用于改良抗體和Fc融合體的效應(yīng)器功能。這些候選物包括了許多變體，所述變體包含了在239、264、330和332位的取代。圖13顯示了一些候選Fc變體的AlphaScreenTM結(jié)合數(shù)據(jù)。這些Fc變體中大多數(shù)提供了基本上較S298A/E333A/K334為多的FcγRIIIa結(jié)合增加。盡管大多數(shù)Fc變體在阿侖單抗背景中篩選，選擇的Fc變體也可在利妥昔單抗和曲妥單抗背景中篩選。在利妥昔單抗和曲妥單抗背景中，選擇的Fc變體與人V158 FcγRIIIa結(jié)合的AlphaScreenTM數(shù)據(jù)分別顯示于圖14和15中。結(jié)果表明Fc變體顯示了一致的結(jié)合增加，與抗體背景無關(guān)，因此本發(fā)明的Fc變體可廣泛應(yīng)用于抗體和Fc融合體。已獲得Fc變體，其顯示與FcγRIIIa結(jié)合較與FcγRIIb不同的增加。如所討論的，最優(yōu)的效應(yīng)器功能由Fc變體產(chǎn)生，其中對激活FcγRs的親和力大于對抑制性FcγRIIb的親和力。AlphaScreenTM數(shù)據(jù)直接比較了與FcγRIIIa及FcγRIIb的結(jié)合，對于兩種Fc變體而言，圖16a和16b中顯示了特異性曲線圖。在本文中稱為FcγRIIIa倍數(shù)∶FcγRIIb倍數(shù)比率(FcRIIIa-fold∶FcγRIIb-fold ratio)的概念，其在數(shù)量上定義為激活的FcγR的增加的倍數(shù)或減少的倍數(shù)(表61，欄3)除以抑制性FcγR增加的倍數(shù)或減少的倍數(shù)(表61，欄4)。該值提供于表61欄5。表61顯示了提供該特異性曲線圖的Fc變體具有高達86∶1的FcγRIIIa倍數(shù)∶FcγRIIb倍數(shù)比率。一些用于增強效應(yīng)器功能的本發(fā)明最有前景的Fc變體能大幅度增加對FcγRIIIa的親和力及有利的FcγRIIIa倍數(shù)∶FcγRIIb倍數(shù)比率。這些變體包括，例如，S239D/1332E(FcγRIIIa倍數(shù)＝56，F(xiàn)cγRIIIa倍數(shù)∶FcγRIIb倍數(shù)＝3)、S239D/A330Y/1332E(FcγRIIIa倍數(shù)＝130)、S239D/A330L/1332E(FcγRIIIa倍數(shù)＝139，F(xiàn)cγRIIIa倍數(shù)∶FcγRIIb倍數(shù)＝18)以及S239D/S298A/1332E(FcγRIIIa倍數(shù)＝295，F(xiàn)cγRIIIa倍數(shù)∶FcγRIIb倍數(shù)＝48)。圖17顯示了這些變體和其它Fc變體與人V158 FcRγIIIa的AlphaScreenTM結(jié)合數(shù)據(jù)。因為許多FcγRs有助于效應(yīng)器功能，所以另外篩選抗其它受體的Fc變體可值得進行。圖18顯示了選擇的Fc變體與人R131 FcγRIIa結(jié)合的AlphaScreenTM數(shù)據(jù)。可以看到，那些具有有利的結(jié)合增強作用和特征曲線的前述變體也顯示了與該激活受體增強的結(jié)合。使用FcγRIIIa、FcγRIIb和FcγIIc并不意在將實驗測試限制為這些特定的FcγRs；預(yù)計可用于篩選的其它FcγRs，包括但不限于如前所述的來自人、小鼠、大鼠、猴子等的FcγRI、FcγRII和FcγRIII的無數(shù)同種型和同種異型。總的來說，對于改良抗體和Fc融合體的效應(yīng)器功能而言，圖11-18和表61所提供的FcγR結(jié)合數(shù)據(jù)表明了在位置234、235、239、240、243、264、266、325、328、330和332上的許多取代是有價值的候選物。因為其中一些取代物的組合通常能導(dǎo)致疊加的或協(xié)同的結(jié)合改良，應(yīng)當預(yù)計到，迄今為止未探查過的表61中的Fc變體的組合也能提供有利的結(jié)果。因此表61中所有的Fc變體的組合應(yīng)當考慮。同樣地，表61中任一Fc變體與其它公開的或未公開的Fc變體的組合也能提供有利特性，且這些組合也應(yīng)當考慮。此外，從這些結(jié)果中應(yīng)當預(yù)計到，在位置234、235、239、240、243、264、266、325、328、330和332上的其它取代也可提供有利的結(jié)合增強作用和特征，因此在這些位置上不同于那些列于表61中的取代應(yīng)當考慮。實施例4對FcγRs減少的結(jié)合如所討論的，盡管需要更強的效應(yīng)器功能，但是對于某些抗體治療劑，所需的是減少或消除效應(yīng)器功能。表61中的幾個Fc變體基本上減少或消除了與FcγR的結(jié)合，因此可供其中不需要效應(yīng)器功能的抗體和Fc融合體使用。上述變體的某些實例的AlphaScreenTM結(jié)合數(shù)據(jù)顯示于圖19a和19b中。這些Fc變體以及它們在組合中的使用，可供在所需時用于消除效應(yīng)器功能，例如在作用機理涉及抑制或拮抗而不是殺死攜帶靶抗原的細胞的抗體和Fc融合體中。實施例5非糖基化Fc變體如所討論的，當前實驗的一個目的是為獲得優(yōu)化的非糖基化Fc變體。對于該目的而言，一些Fc變體提供了朝這一目標的顯著的進展。因為是在糖基化位點N297取代產(chǎn)生了非糖基化的Fc。盡管所有其它包含N297取代的Fc變體完全消除了與FcγR的結(jié)合，但N297D/I332E對FcγRIIIa仍具有顯著的結(jié)合親和力，顯示于表61并闡明于圖20中。由于缺少該變體的高分辨率結(jié)構(gòu)，因此該結(jié)果的確切原因尚不明了，盡管計算篩選預(yù)測暗示其可能是由于新的有利的Fc/FcγR相互作用與有利的靜電特性的組合。實際上，其它靜電學取代可預(yù)想用于非糖基化Fc的進一步優(yōu)化。表61顯示了其它非糖基化Fc變體，例如提供了結(jié)合增強作用的S239D/N297D/I332E和N297D/A330Y/I332E，其對FcγR111a的親和力分別為糖基化野生型阿侖單抗的0.28倍和0.43倍。應(yīng)當考慮這些變體與能增強與FcγR結(jié)合的其它Fc變體的組合，該組合目的在于獲得能結(jié)合一種或多種FcγRs的非糖基化Fc變體，該變體所具有親和力大約相當于或甚至更好于糖基化的親本Fc。在缺少糖的條件下，額外一組有價值的Fc變體提供了增強的穩(wěn)定性和溶解性。包含在位置241、243、262和264取代的Fc變體消除了與FγR的結(jié)合，所述位置并不介導(dǎo)與FγR的結(jié)合但決定糖和Fc之間的界面，推測是由于它們干擾了糖的構(gòu)象。但是，在去糖基化型中，F(xiàn)c變體F241E/F243R/V262E/V264R、F241E/F243Q/V262T/V264E、F241R/F243Q/V262T/V264R和F241E/F243Y/V262T/V264R較糖基化型顯示了與FcγRIIIa的較強結(jié)合，通過圖21中的AlphaScreenTM數(shù)據(jù)顯示了該結(jié)果。該結(jié)果表明對于非糖基化Fc的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、溶解性及功能而言，這些位置是關(guān)鍵位置。這些結(jié)果共同暗示了蛋白質(zhì)工程可用于在無糖的情況下恢復(fù)抗體和Fc融合體的有利功能和溶解特性，并為產(chǎn)生具有有利溶解特性和完整功能的包含在這些和其它Fc位置取代的非糖基化抗體和Fc融合體開辟了一條途徑。實施例6Fc變體對FcγRIIIa多態(tài)型的親和力如上所討論，F(xiàn)c介導(dǎo)的效應(yīng)器功能的一個重要參數(shù)是Fc對FcγRIIIa的V158和F158多態(tài)型的親和力。AlphaScreenTM數(shù)據(jù)比較了選擇的變體對兩種同種異型受體的結(jié)合，結(jié)果顯示于圖22a(V158 FcγRIIIa)和圖22b(F158FcγRIIIa)中?？梢钥吹剑凶凅w都改良了與兩種FcγRIIIa同種異型的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明那些具有增強效應(yīng)器功能的Fc變體可廣泛地應(yīng)用于全部患者群體中，對于最需要其的低應(yīng)答患者群體而言，臨床療效可潛在地最大增強。使用表面胞質(zhì)共振技術(shù)(SPR)(Biacore，Uppsala，Sweden)進一步研究這些Fc變體的FcγR結(jié)合親和力。SPR是一種非常靈敏的定量方法，可用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合親和力的測量，并已有效地用于測量Fc/FcγR的結(jié)合(Radaev等，2001，J Biol Chem 27616478-16483)。因此對AlphaScreenTM分析法而言，SPR提供了一種極好的互補結(jié)合分析法。帶有His標簽的V158 FcγRIIIa固定在SPR芯片上，接著一定濃度范圍的野生型和Fc變體阿侖單抗抗體流過該芯片。使用標準曲線擬合方法擬合數(shù)據(jù)獲得結(jié)合常數(shù)。表62呈現(xiàn)了使用SPR獲得的所淘選的Fc變體與V158 FcγR111a及F158 FcγRIIIa結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)，接著與獲得自AlphaScreenTM分析法的IC50比較。用每個變體的Kd和IC50除野生型阿侖單抗的Kd和IC50，獲得較野生型(倍數(shù))提高的倍數(shù)。
表62 SPR數(shù)據(jù)確證了通過AlphaScreenTM分析法所觀察到的對FcγR111a親和力的提高。S298A/E333A/K334A分別提高了1.7倍和4.7倍的Fc與V158及F158 FcγRIIIa的結(jié)合，I332E顯示了上述結(jié)合分別增加了2.2倍和10.1倍，以及V264I/I332E顯示了上述結(jié)合分別增加了4.0倍和14倍；因此表62進一步描述了V264I/I332E和I332E較S298A及S298A/E333A/K334A的優(yōu)越性。也值得注意的是V264I/1332E對F158 FcγRIIIa的親和力(52nM)優(yōu)于野生型對V158同種異型的親合力(68nM)，暗示該Fc變體以及那些對結(jié)合甚至具有更多提高的變體，可使抗體對低應(yīng)答患者群體的臨床療效能夠達到當前高應(yīng)答者所可能的水平。SPR和AlphaScreenTM結(jié)合測量法之間的相關(guān)性顯示于圖23a-23d中。對于與V158 FcγRIIIa及F158 FcγRIIIa結(jié)合而言，圖23a和23b分別顯示了Kd-IC50相關(guān)性，圖23c和23d分別顯示了對于給合V158 FcγRIIIa和F158 FcγRIIIa的改良倍數(shù)(fold-improvement)的相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)令人滿意地擬合為直線(r2＝0.9，r2＝0.84，r2＝0.98以及r2＝0.90)證明了AlphaScreenTM測量法的精確性，并確認其能用于測定Fc變體的相對Fc□R結(jié)合親和力。實施例7.Fc變體的ADCC為了測定對效應(yīng)器功能的影響，對選擇的Fc變體進行基于細胞的ADCC分析法。使用DELFIA_基于EuTDA的細胞毒性分析法(Perkin Elmer，MA)測量ADCC，純化的人外周血單個核細胞(PBMCs)作為效應(yīng)細胞。在密度為1×106細胞/毫升的靶細胞中加入BATDA，洗滌4次并接種入96孔培養(yǎng)板，密度為10,000細胞/毫升。接著使用Fc變體或野生型抗體在指示的終濃度下調(diào)理靶細胞。人PBMCs以所指示的靶細胞過量倍數(shù)添加，并在37℃溫育培養(yǎng)板4小時。共培養(yǎng)的細胞在500xg離心，上清液轉(zhuǎn)移至單獨的培養(yǎng)板上并與Eu溶液溫育，使用Packard Fusion閱讀儀(PackardBiosciences，IL)測量相對熒光單位。樣品以平行三份測量以提供誤差估計(n＝3，+/-S.D.)。對于V158或F158 FcγRIIIa同種異型而言，使用PCR證實PBMCs是同種異型的。使用DoHH-2淋巴瘤靶細胞對Fc變體及野生型阿侖單抗進行ADCC分析法。圖24a是條形圖，顯示了在10ng/ml抗體濃度這些蛋白質(zhì)的ADCC。結(jié)果顯示了與野生型阿侖單抗相比，阿侖單抗Fc變體I332E，V264I和I332E/V264I具有實質(zhì)上增強的ADCC，ADCC的增強與它們同F(xiàn)cγRIIIa的結(jié)合的改善成正比，所述的結(jié)合增強如AlphaScreenTM分析法和SPR所描述的。ADCC對抗體濃度的劑量依賴顯示于圖24b中。這些數(shù)據(jù)對最大和最小發(fā)光信號歸一化，該最大和最小發(fā)光信號分別提供自低和高濃度抗體的基線。數(shù)據(jù)使用非線性回歸對S形劑量-反應(yīng)模型擬合，在圖中表示為曲線。該擬合使半數(shù)有效濃度(EC50)(即50％有效需要的濃度)能夠測定，提供了每種Fc變體的ADCC相對增加量。對于這些結(jié)合數(shù)據(jù)而言，EC50s類似于獲得自AlphaScreenTM競爭數(shù)據(jù)的IC50，因此由這些數(shù)值所引出的結(jié)果類似于實施例2和圖11中所述的。在圖24b中，log(EC50)s，獲得自對數(shù)據(jù)的擬合，對于野生型、V264I/I332E以及S239D/I332E阿侖單抗而言，分別為0.99、0.60和0.49，因此它們各自的EC50s為9.9、4.0和3.0。因此，通過使用表達雜合的V158/F158 FcγRIIIa的PBMCs，V264I/I332E和S239E/I332E較野生型阿侖單抗分別提供了2.5倍和3.3倍的ADCC增加。這些數(shù)據(jù)總結(jié)于下表63中。
表63 為了確定這些ADCC增強作用是否能廣泛地應(yīng)用于抗體中，在利妥昔單抗和曲妥單抗背景中評估選擇的Fc變體。使用WIL2-S淋巴瘤靶細胞對利妥昔單抗的V264I/I332E、野生型以及S298A/D333A/K334A進行ADCC分析。圖25a所呈現(xiàn)的條形圖顯示了在1ng/ml抗體濃度這些蛋白質(zhì)的ADCC。結(jié)果表明相對于野生型利妥昔單抗，V264I/I332E利妥昔單抗提供了實質(zhì)上增強的ADCC，也高于S298A/D333A/K334A的ADCC，與AlphaScreenTM分析法和SPR所觀察到的對FcγRIIIa結(jié)合的改善結(jié)果一致。圖25b顯示了ADCC對抗體濃度的劑量依賴。獲得自這些數(shù)據(jù)擬合結(jié)果的EC50s以及相對的ADCC倍數(shù)提高提供于下表64中。可以看到，對于表達純合的F158/F158 FcγRIIIa的PBMCs而言，V264I/I332E利妥昔單抗較野生型EC50值增加了11.3倍。所觀察到的利妥昔單抗相對于阿侖單抗更多的增加很可能是由于使用純合的F158/F158 FcγRIIIa，而不是使用雜合的V158/F158 FcγRIIIa的PBMCs的緣故，也可能是由于使用不同的抗體和靶細胞系。
表64 使用兩種乳腺癌靶細胞系BT474和Sk-Br-3對曲妥單抗Fc變體和野生型進行ADCC分析。圖26a顯示的條形圖說明了在1ng/ml抗體濃度的ADCC。結(jié)果表明與野生型曲妥單抗比較，V264I和V264I/I332E曲妥單抗提供了實質(zhì)上增加的ADCC，ADCC的增加與它們同F(xiàn)cγRIIIa的結(jié)合的改善成正比，所述結(jié)合的改善如AlphaScreenTM分析法和SPR所描述的。圖26b顯示了ADCC對抗體濃度的劑量依賴。獲得自這些數(shù)據(jù)擬合結(jié)果的EC50s和相對的ADCC倍數(shù)提高提供于下表65中。對I332E曲妥單抗而言，當與A330L及A330Y組合時，觀察到ADCC顯著提高。
表65 對于曲妥單抗變體而言，圖26c顯示了在不同抗體濃度下另外一組劑量應(yīng)答ADCC數(shù)據(jù)。獲得自這些數(shù)據(jù)擬合結(jié)果的EC50s以及相對的ADCC倍數(shù)提高提供于下表66中。結(jié)果顯示相對于野生型曲妥單抗及S298A/E333A/K334A，曲妥單抗Fc變體S239D/I332E、S239D/S298A/I332E、S239D/A330Y/I332E以及S239D/A330L/I332E/提供了實質(zhì)上增加的ADCC，與AlphaScreenTM分析法和SPR所觀察到的對FcyR結(jié)合的數(shù)據(jù)結(jié)果一致。在迄今為止所觀察到的效應(yīng)器功能中，S239D/A330L/I332E曲妥單抗顯示了最大增加，對于表達純合的F158/F158 FcγRIIIa的PBMCs而言，其提供了較野生型在EC50方面大約50倍的增強。
表66 實施例8.通過Fc變體結(jié)合并激活補體補體蛋白C1q結(jié)合Fc上的位點，即鄰近FcγR結(jié)合位點的位點，因此需要謹慎地確定Fc變體是否能保持其招募并激活補體的能力。AlphaScreenTM分析法用于測量選擇的Fc變體與補體蛋白C1q的結(jié)合。使用如實施例2所描述的附著在鏈霉抗生物素蛋白供體珠上的生物素化野生型阿侖單抗抗體以及直接偶聯(lián)在受體珠上的C1q進行該分析。選擇的Fc變體的結(jié)合數(shù)據(jù)顯示于圖27a中，表明與C1q的結(jié)合未受損害。也對選擇的Fc變體執(zhí)行基于細胞的CDC分析法以調(diào)查Fc變體是否保持激活補體的能力。Amar藍用于監(jiān)測Fc變體和野生型利妥昔單抗調(diào)理的WIL2-S淋巴瘤細胞通過人血清補體(Quidel，SanDiego，CA)的溶解。結(jié)果顯示于圖27b中，對于所選擇的Fc變體而言，表明CDC未受損害。實施例9.Fc變體的蛋白A結(jié)合如所討論的，細菌蛋白A結(jié)合位于C□2和C□3結(jié)構(gòu)域之間的Fc區(qū)，因此通常用作抗體純化。AlphaScreenTM分析法用于測量選擇的Fc變體與蛋白A的結(jié)合，使用如實施例2所描述的附著在鏈霉抗生物素蛋白供體珠上的生物素化野生型阿侖單抗抗體以及直接偶聯(lián)在受體珠上的蛋白A進行該分析。所選擇的Fc變體的結(jié)合數(shù)據(jù)顯示于圖28中，表明Fc變體結(jié)合蛋白A的能力未受損害。這些結(jié)果暗示Fc變體對于結(jié)合相同于蛋白A的Fc位點的其它Fc配體的親和力也未受影響，所述其它Fc配體例如新生Fc受體FcRn和蛋白G。實施例10.Fc變體結(jié)合小鼠Fc□Rs的能力Fc對非人Fc□Rs的優(yōu)化可用于在動物模型中實驗測試Fc變體。例如，當在小鼠(例如裸鼠、SCID小鼠、異種移植小鼠和/或轉(zhuǎn)基因小鼠)中測試時，包含F(xiàn)c變體的抗體和Fc融合體可對一種或多種小鼠Fc□Rs優(yōu)化，可提供關(guān)于效力、作用機理等的有價值信息。為了評估是否本發(fā)明的Fc變體可用于上述實驗中，使用AlphaScreenTM分析法測量所挑選的Fc變體對于小鼠FcγRIII的親和力。使用如實施例2所描述的附著在鏈霉抗生物素蛋白供體珠上的生物素化野生型阿侖單抗抗體以及如實施例2所述的結(jié)合到谷胱甘肽螯合的受體珠的帶有GST標簽的小鼠FcγRIII進行AlphaScreenTM分析，表達和純化如實施例2所述。這些結(jié)合數(shù)據(jù)顯示于圖29中。結(jié)果顯示了某些能增強與人FcγRIIIa結(jié)合的Fc變體也能增強與小鼠FcγRIII的結(jié)合。該結(jié)果表明本發(fā)明的Fc變體，或?qū)Ψ侨薋cγRs優(yōu)化的其它Fc變體，可在動物模型的實驗中使用。實施例11.Fc變體在CHO細胞中表達的確認盡管在293T細胞中表達用于篩選目的本發(fā)明的Fc變體，但是抗體的大規(guī)模生產(chǎn)通常是通過在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中表達來進行。為了評估CHO表達的Fc變體的特性，如實施例2所述在CHO中表達并純化所選擇的Fc變體和野生型阿侖單抗。圖30顯示了比較CHO和293T表達的Fc變體及野生型阿侖單抗與人V158 FcγRIIIa結(jié)合的AlphaScreenTM數(shù)據(jù)。該結(jié)果表明無論在293T或CHO中表達，本發(fā)明的Fc變體顯示了相當?shù)腇cγR結(jié)合增強。實施例12.Fc變體的治療應(yīng)用許多描述于本發(fā)明中的Fc變體具有用于改善抗癌抗體療效的明顯效力。對于例證目的而言，許多本發(fā)明的Fc變體可摻入利妥昔單抗的序列中。描述于US 5,736,137的野生型利妥昔單抗的輕鏈和重鏈，提供于圖31a和32b中。改良的抗-CD20抗體序列提供于圖31c中。所述改良的抗-CD20抗體序列包含至少選自下組的非野生型氨基酸X1、X2、X3、X4、X5和X6。這些改良的抗-CD20抗體序列也包含Z1取代。于此使用的利妥昔單抗僅作為實例，并不意在將Fc變體的應(yīng)用限制于該抗體或任何其它特定的抗體或Fc融合體。本文中所有的參考文獻明確地引入作為參考。盡管如上已描述了用于例證目的的本發(fā)明的特定實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解可得到細節(jié)的無數(shù)變化而不背離如所附權(quán)利要求所描述的本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種包含F(xiàn)c變體部分的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區(qū)中包含至少一種氨基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調(diào)節(jié)與FcγR的結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述調(diào)節(jié)是所述抗體對所述FcγR親和力的增加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333和334組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述Fc變體在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328和332組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述Fc變體包含在位置332的取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中至少一種取代位于選自由239、264、297和330的位置，附帶條件是如果所述序列基本上是人的，所述取代不是S239A、V264A、N297A、N297Q、A330D、A330Q、A330K，或A330S。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327N、327L、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y和332A組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、264I、241W、241L、243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、243L/264I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、332E、328M/332E、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、264I/332E、241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Q/262T/264E/332E、241R/243Q/262T/264R/332E、241E/243Y/262T/264R/332E、298A/332E、239EI332E、239Q/332E、239E、265G、265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、329F、330L、330Y、332D、297S、297D、297S/332E、297D/332E、297E/332E、265Y/297D/332E、265Y/297D/299L/332E、265F/297E/332E、328I/332E、328Q/332E、332N、332Q、264T、264F、240I、263I、266I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239D、239N、239F、239D/332D、239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239N/332N、239NI332Q、239Q/332D、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235D、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、239T、239H、239Y、240A、240T、240M、263A、263T、263M、264M、264Y、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、299H、330V、330I、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325T、325V、325H、328D/332E、328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328V/332E、328T/332E、328H/332E、328I/332E、328A、332T、332H、332Y、332A、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239E/264I/298A/330Y/332E、239D/297D/332E、239E/297D/332E、239D/265V/297D/332E、239D/265I/297D/332E、239D/265L/297D/332E、239D/265F/297D/332E、239D/265Y/297D/332E、239D/265H/297D/332E、239D/265T/297D/332E、264E/297D/332E、296D/297D/332E、296E/297D/332E、296N/297D/332E、296Q/297D/332E、296H/297D/332E、296T/297D/332E、297D/299V/332E、297D/299I/332E、297D/299L/332E、297D/299F/332E、297D/299H/332E、297D/299E/332E、297D/330Y/332E、297D/298A/330YI332E、239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E和239D/264I/330L/332E組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置組成的組的位置，進一步包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、329、331、333、334和339組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述FcγR是FcγRIIIa。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體，其中所述FcγRIIIa是V158或F158FcγRIIIa的同種異型。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Fc變體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的，以及所述親和力較所述的親本Fc多肽高約5倍。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的，以及所述親和力較所述親本Fc多肽高約5-約300倍。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和325組成的組。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234E、234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、332Q和325T組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264I、243L/264I、328M、332E、328M/332E、264I/332E、298A/332E、239E/332E、239Q/332E、239E、330Y、332D、328I/332E、328Q/332E、264T、240I、266I、239D、239D/332D、239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239Q/332D、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234E、234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239T、240M、264Y、330I、325T、328D/332E、328V/332E、328T/332E、328I/332E、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E和239D/264I/330L/332E組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、322、326、329、331、333、334和339組成的組組成的組的位置，進一步包含至少一種取代。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的、小鼠的、大鼠的或猴子的。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中與一種或多種Fc配體的結(jié)合是未改變的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗體，其中所述Fc配體選自由Clq、FcRn、蛋白A和蛋白G組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中CDC不受影響。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中與一種或多種Fc配體的結(jié)合是改變的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述Fc變體具有的FcγRIIIa倍數(shù)FcγRIIb倍數(shù)比率大于1。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述Fc變體具有的FcγRIIIa倍數(shù)FcγRIIb倍數(shù)比率大于約11∶1。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的抗體，其中所述Fc變體具有的FcγRIIIa倍數(shù)FcγRIIb倍數(shù)比率在約11∶1-約86∶1。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、264、296、330和I332組成的組。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234Y、234I、235I、239D、239E、239N、239Q、240A、240M、264I、264Y、296Q、330L、330Y、330I、332D和332E組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的抗體，其中所述Fc變體選自由332E、264I/332E、239E/332E、239Q/332E、296Q、330L、330Y、332D、239D、239D/332E、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234Y、234I、235I、240A、240M、264Y、330I、239D/330L/332E、239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E和239D/264I/330L/332E組成的組。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、322、326、329、331、333、334和339組成的組的位置，進一步包含一種或多種取代。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中相對于親本Fc多肽所述Fc變體與至少一種FcγR的結(jié)合具有減少的親和力。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述FcγR是FcγRIIIa。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239E、239N、239Q、239F、239H、239Y、240A、240T、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325V、325H、327N、327L、328M、328E、328N、328Q、328F、328H、328A、329F、330L、330V、330F、330R、330H、332N、332Q、332T、332H、332Y和332A組成的組。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、241W、241L、243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Y/262T/264R/332E、265G、265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、329F、330L、297S、297D、297S/332E、332N、332Q、264F、263I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239N、239F、239N/332N、239N/332Q、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、234D、234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239H、239Y、240A、263T、263M、264M、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、299H、330V、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325V、325H、328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328H/332E、328A、332T、332H、332Y和332A組成的組。
34.一種包含親本Fc多肽變體的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區(qū)中包含至少一種氨基酸修飾，與親本Fc多肽比較其中所述Fc變體調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的抗體，其中所述效應(yīng)器功能是ADCC。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽改善。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽提高約5倍。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗體，其中所述Fc變體的ADCC較所述親本Fc多肽提高約5-約50倍。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由234、235、239、240、243、264、266、328、330、332和325組成的組。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234E、234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、332Q和325T組成的組。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264I、243L/264I、328M、332E、328M/332E、264I/332E、298A/332E、239E/332E、239Q/332E、239E、330Y、332D、328I/332E、328Q/332E、264T、240I、266I、239D、239D/332D、239D/332E、239D/332N、239D/332Q、239E/332D、239E/332N、239E/332Q、239N/332D、239N/332E、239Q/332D、330Y/332E、264I/330Y/332E、330L/332E、264I/330L/332E、234E、234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239T、240M、264Y、330I、325T、328D/332E、328V/332E、328T/332E、328I/332E、239E/264I/332E、239Q/264I/332E、239E/264I/330Y/332E、239D/330Y/332E、239N/330Y/332E、239D/330L/332E、239N/330L/332E、264I/298A/332E、239D/298A/332E、239N/298A/332E、239D/264I/332E、239D/264I/298A/332E和239D/264I/330L/332E組成的組。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的抗體，其中所述Fc變體在選自由256、270、290、298、312、322、326、329、331、333、334和339組成的組的位置，進一步包含至少一種取代。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的抗體，其中所述親本Fc多肽基本上是人的、小鼠的、大鼠的或猴子的。
44.根據(jù)權(quán)利要求35所述的抗體，與所述親本Fc多肽比較其中所述Fc變體減弱了ADCC。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的抗體，其中所述Fc變體包含至少一種取代，選自由234D、234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239E、239N、239Q、239F、239H、239Y、240A、240T、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、297S、297D、297E、298H、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325V、325H、327N、327L、328M、328E、328N、328Q、328F、328H、328A、329F、330L、330V、330F、330R、330H、332N、332Q、332T、332H、332Y和332A組成的組。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的抗體，其中所述Fc變體選自由264L、241W、241L、243W、243L、241L/243L/262I/264I、241W/243W、241W/243W/262A/264A、241L/262I、243L/262I/264W、241Y/243Y/262T/264T、241E/243R/262E/264R、241E/243Q/262T/264E、241R/243Q/262T/264R、241E/243Y/262T/264R、328M、328E、328F、244H、245A、247V、313F、244H/245A/247V、247G、241E/243R/262E/264R/332E、241E/243Y/262T/264R/332E、265G、265N、239E/265G、239E/265N、239E/265Q、296E、296Q、299I、327N、267Q/327S、267L/327S、327L、329F、330L、297S、297D、297S/332E、332N、332Q、264F、263I、299A、299S、299V、325Q、325L、325I、239N、239F、239N/332N、239N/332Q、239Q/332N、239Q/332Q、296D、296N、234D、234N、234Q、234T、234H、234V、234F、235N、235Q、235T、235H、235V、235F、239H、239Y、240A、263T、263M、264M、266A、266T、266M、269H、269Y、269F、269R、296S、296T、296L、296I、298H、299H、330V、330F、330R、330H、325D、325E、325A、325V、325H、328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328H/332E、328A、332T、332H、332Y和332A組成的組。
47.一種包含親本Fc多肽的非糖基化Fc變體的抗體，在所述的親本Fc多肽的Fc區(qū)中包含至少一種氨基酸修飾，相對于所述親本Fc多肽的非糖基化型，所述非糖基化Fc變體具有改善的穩(wěn)定性、溶解性或?qū)c配體的結(jié)合親和力。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的抗體，與親本Fc多肽的非糖基化型比較，所述非糖基化Fc變體具有改善的對Fc配體的結(jié)合親和力。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述Fc配體是FcγR。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述FcγR是FcγRIIIa。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述改善的結(jié)合親和力在親本Fc多肽的糖基化型的0.4倍范圍內(nèi)。
52.根據(jù)權(quán)利要求47所述的抗體，其中所述Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由239、241、243、262、264、265、296、297、330和332組成的組。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的抗體，其中所述Fc變體包含一種或多種取代，選自由239D、239E、241Y、243Y、262T、264T、264E、265Y、265H、296N、297D、330Y和332E組成的組。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的抗體，其中所述Fc變體選自由297D/332E、241Y/243Y/262T/264T/297D/332E、239D/297D/332E、239E/297D/332E、239D/265Y/297D/332E、239D/265H/297D/332E、264E/297D/332E、296N/297D/332E和297D/330Y/332E組成的組。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的抗體，其中所述非糖基化Fc變體部分在相應(yīng)于人序列位置的位置包含至少一種取代，所述人序列位置選自由256、270、290、298、312、322、326、329、331、333、334和339。
56.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，包含含有所述Fc變體的Fc融合體。
57.根據(jù)權(quán)利要求1或56所述的抗體，其中所述抗體進一步包含工程改造的糖型。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的抗體，其中所述工程改造的糖型改善了效應(yīng)器功能。
59.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體和藥學上可接受的載體。
60.一種治療需要所述治療的哺乳動物的方法，包含施用權(quán)利要求1的抗體。
61.一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由332D、332E、332N或332Q組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列位置，其中所述抗體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF組成的組。
62.一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由264I、264T或264Y組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR，EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF組成的組。
63.一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由239D、239E、239N、239Q或239T組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF組成的組。
64.一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由330Y、330L或330I組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF組成的組。
65.一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含至少一種取代，選自由240I或240M組成的組，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF組成的組。
66.一種包含F(xiàn)c變體的抗體，所述Fc變體包含一種取代，選自297D，其中所述位置相應(yīng)于人序列的位置，其中所述抗體或Fc融合體對靶抗原具有特異性，所述靶抗原選自由CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFα和VEGF組成的組。
67.一種根據(jù)權(quán)利要求61、62、63、64、65或66所述的抗體，其中所述Fc變體還包含取代298A。
全文摘要
本發(fā)明涉及優(yōu)化的Fc變體、產(chǎn)生它們的方法、以及包含優(yōu)化的Fc變體的抗體和Fc融合體。
文檔編號C07K16/28GK1705491SQ03825450
公開日2005年12月7日 申請日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者格雷戈里·A·拉扎爾, 阿瑟·J·奇里諾, 黨偉, 約翰·R·德斯賈萊斯, 斯蒂芬·K·多伯斯坦, 羅伯特·J·海斯, 希爾·B·卡基, 奧米德·韋法 申請人:贊科股份有限公司