專利名稱：一種體內(nèi)產(chǎn)生和運輸?shù)鞍椎姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體內(nèi)蛋白產(chǎn)生和運輸?shù)姆椒?。特別是涉及在紅細胞的前體細胞中產(chǎn)生蛋白以及利用紅細胞來傳輸?shù)鞍字裂髦械姆椒ā?br> 由于基因治療技術(shù)的飛速發(fā)展，利用基因療法來治愈或減輕遺傳病和后天獲得疾病的觀念已經(jīng)被人們所接受。研究人員已經(jīng)完成了必需的第一步轉(zhuǎn)入的基因在人體內(nèi)可被誘導(dǎo)產(chǎn)生功能。然而，迄今為止，在全世界有記載的2000多個進行基因治療實驗的患者中，尚無一人的健康狀況得到明顯改善。缺乏令人信服的治療效率反映出研究人員未完成的初步探索面臨一種困難的新技術(shù)，并且困難遠遠大于所預(yù)料的。
人細胞中獨立的基因是DNA的一段序列，在大多數(shù)情況下，其充當(dāng)產(chǎn)生特異性蛋白的藍圖。人體中所有的細胞在其細胞核染色體中都攜帶相同的基因。但是不同的細胞利用或表達不同的基因產(chǎn)物因此產(chǎn)生不同的蛋白。
依據(jù)細胞的類型(以及細胞需要)，基因表達的不同調(diào)控通過不同細胞中稱為啟動子和/或增強子的DNA片段被調(diào)控。只有啟動子或有時和增強子同時存在下，基因才被表達?；虮磉_是一個具有兩個步驟的過程。第一步是從DNA模板產(chǎn)生RNA的轉(zhuǎn)錄，第二步是從RNA模板合成蛋白的翻譯。
在蛋白合成完成之后，蛋白將被從產(chǎn)生位點運輸?shù)筋A(yù)定的功能位點。蛋白從合成其的細胞中輸出有兩個途徑。第一個途徑是組成性分泌，此途徑是指蛋白和脂類的宏觀流動機制。第二個途徑是一個胞吐調(diào)控過程。在此途徑中，蛋白僅在接受一種特定的觸發(fā)信號時被釋放，例如，被激素觸發(fā)。
天然蛋白的合成與輸出機制是過去幾十年基因治療中研究的主要方向，目前則集中于組織或細胞的特異性研究。研究者一直在尋找組織特異性基因及其傳遞到靶器官或組織中的方法，在此器官或組織中蛋白被自然的合成，并且天然蛋白通過天然途徑被運輸且被傳遞到它們的功能位點。例如，天然嗜血桿菌因子ⅩⅢ和人血清白蛋白在肝細胞中產(chǎn)生然后被傳輸?shù)窖髦杏糜诎l(fā)揮其功能。胰島素產(chǎn)生于胰腺β細胞且也被運輸?shù)窖髦邪l(fā)揮功能。
盡管基因治療的理想方式是治療基因特定地傳輸?shù)剿鼈兊奶烊划a(chǎn)生位點，但是在體內(nèi)或體外實施起來都是很困難的。在體外，幾乎不可能獲得足夠的靶細胞來導(dǎo)入治療基因。結(jié)果，獲得的靶細胞不能夠合成足夠量的用于治療的目的蛋白。在體內(nèi)，治療基因有一種可能性導(dǎo)入任意的細胞類型，不管它們是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，脂質(zhì)體包裹逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或裸露DNA。隨后，少量DNA(治療基因)將被傳遞到靶細胞中。因此，目前基因治療方法的成功嚴格依賴于是否一個組織特異性基因可被特異地傳遞到靶器官或組織。盡管進行了極大努力的研究，發(fā)現(xiàn)組織特異性方法極端困難并且離成功尚有很遠的距離。
另一方面，非組織特異性方法也遭遇嚴重的困難。盡管體內(nèi)的許多細胞類型是很容易獲得的，例如肌肉或皮膚細胞，但利用非組織特異性細胞作為宿主用于基因治療有一些缺點。在一些情況下，宿主細胞天然地不具有上述兩種蛋白輸出機制。在其它的情況下，即使宿主細胞具有用于其天然蛋白的輸出機制，它們在非天然或客體蛋白輸出上的作用并不相同。輸出客體蛋白的低效率或天然輸出途徑的完全阻斷已經(jīng)被報道。
最近，通過利用病毒的自然能力來進入細胞并帶入它們的遺傳物質(zhì)，基因治療獲得了長足的進步。許多微生物被工程改造作為載體，或傳輸載體來用于基因轉(zhuǎn)移。在不同的病毒中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是迄今為止所研究的最具希望的基因傳遞系統(tǒng)(Friedmann,Scientific American,June 1997,96)。逆轉(zhuǎn)錄病毒在被感染的細胞中轉(zhuǎn)化RNA為DNA并整合DNA進入染色體。該整合的DNA然后控制病毒蛋白質(zhì)的合成。
在正常的情況下，整合的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA將控制病毒蛋白質(zhì)以及RNA的合成，其然后裝配在原始病毒的克隆中。已經(jīng)研究出了改造逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。被改造的逆轉(zhuǎn)錄病毒，缺少產(chǎn)生病毒蛋白的結(jié)構(gòu)，不能產(chǎn)生后代。病毒實際上從細胞中消失，僅遺留外源基因以及僅促進基因表達的核苷酸序列。
美國專利US5399346(Anderson等)公開了提供給人給藥治療蛋白的的方法。該方法包括插入編碼一個治療蛋白的DNA片段到初級人細胞中，并且導(dǎo)入此初級人細胞到人體中。該初級人細胞在體內(nèi)表達和分泌治療蛋白。Anderson等人進一步揭示了初級人細胞是成核血細胞以及祖代細胞及其前體，這種細胞能夠培養(yǎng)繁殖。此外Anderson等人揭示，遺傳工程細胞可以和藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制成適當(dāng)?shù)娜擞盟?。載體可以為液態(tài)(例如生理鹽水溶液)或固態(tài)載體，例如一種植入物。在使用液態(tài)載體時，工程細胞可被導(dǎo)入，例如，靜脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi)地，腹膜內(nèi)的，病灶內(nèi)等方式。Anderson等人揭示了治療蛋白殘基的天然狀態(tài)或修飾狀態(tài)在體內(nèi)初級人細胞中的功能。
治愈人類疾病的早期基因療法之一是使用遺傳工程血紅蛋白來治療β珠蛋白生成障礙性貧血，其為血紅蛋白的一種失調(diào)，患者的紅血細胞缺乏β-珠蛋白，其和α-珠蛋白以及血紅素結(jié)合產(chǎn)生血紅蛋白。缺少β-珠蛋白引起血紅蛋白的不足和α珠蛋白的過量，其結(jié)果引起嚴重的貧血。研究者使用β珠蛋白啟動子和β珠蛋白基因(來源于紅細胞)來產(chǎn)生所期望的β珠蛋白。在這些應(yīng)用中，血紅蛋白啟動子沒有被用于紅血細胞異種蛋白(非來源于紅細胞)的基因工程上。
另一方面，多種天然啟動子已被用于構(gòu)建攜帶編碼對于宿主細胞而言同源或異源的治療蛋白的基因的載體。然而，因為集中努力于組織特異性基因治療的方法，因此，構(gòu)建的載體被主要集中于成核細胞，其具有用于細胞特異性靶運輸?shù)谋砻鏄擞洝?br> 最近，用于治療基因轉(zhuǎn)運的多種非病毒方法也被進一步開發(fā)。例如，脂質(zhì)體被用于包裹逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(來自稱為噬菌體的細菌病毒的穩(wěn)定的DNA環(huán))其原始基因已經(jīng)被用于治療的基因所替換。裸DNA(無脂類纏繞的)注射給病人也進行了研究。被注射入動物肌肉的裸DNA被表達為蛋白并且獲得了局部濃度相當(dāng)高的蛋白(Felgner,Scientific American,June1997,102)。然而，當(dāng)?shù)鞍妆幌♂尩胶腥獫{的血流中時，在肌肉中產(chǎn)生的局部高濃度的蛋白對于治療象糖尿病或血友病這樣的疾病是不足的。
顯然迫切需要新的策略和方法去克服基因治療的困難，并且達到體內(nèi)有足夠量的蛋白合成與運輸?shù)哪康摹?br> 本發(fā)明提供了一種在體內(nèi)產(chǎn)生和運輸?shù)鞍椎姆椒?。在一個實施例中，該方法包括步驟(1)在載體中插入一個啟動子以及一個編碼蛋白的基因，(2)從哺乳動物中收集適量的細胞，(3)在體外用載體處理宿主細胞，(4)將經(jīng)處理的宿主細胞回輸哺乳動物。處理后的宿主在體內(nèi)產(chǎn)生紅細胞以及蛋白，其中的蛋白只存在于紅細胞中。其后，蛋白通過紅細胞的破裂被釋放進入哺乳動物的血流中。該方法還可以包括在載體中插入一個或多個增強子。
在另一個實施例中，方法包括步驟(1)在載體中插入一個血紅蛋白啟動子以及一個編碼非血紅蛋白的基因，(2)從哺乳動物中收集適量的宿主細胞，(3)在體外用上述載體處理該宿主細胞，(4)將經(jīng)處理的宿主細胞回輸哺乳動物。在將處理后的宿主細胞重新回輸哺乳動物后，宿主細胞在體內(nèi)產(chǎn)生血細胞。蛋白只存在于紅細胞中，因為插入到載體中的血紅蛋白啟動子只在紅細胞的前體中才有活性。在生命周期的末期紅細胞破裂并且將蛋白釋放入血流中。
用本發(fā)明的方法，載體是一個病毒載體并且缺失負責(zé)病毒表達的片段。優(yōu)選的載體為一個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體和一個腺病毒載體。
適用于本發(fā)明方法的啟動子為一個基因的原始啟動子，其能夠誘導(dǎo)基因在紅細胞的祖代細胞中表達蛋白?？蛇x擇地，啟動子也可以為一個基因的突變的啟動子。優(yōu)選地，啟動子為一個血紅蛋白啟動子。
本發(fā)明方法中適合的宿主細胞為干細胞，和其它的紅細胞的祖代細胞。
本發(fā)明的方法不但利用干細胞和紅細胞的祖代細胞作為加工場所產(chǎn)生蛋白，也利用紅細胞作為蛋白的轉(zhuǎn)運工具。通過紅細胞破裂蛋白被釋放入血流中。
紅細胞破裂可以是一個自然或誘導(dǎo)的過程。在本發(fā)明的方法中，因為在體內(nèi)連續(xù)不斷的產(chǎn)生紅細胞和蛋白，連續(xù)不斷的蛋白供應(yīng)將被提供用于病人的治療目的。
通過本發(fā)明方法合成和運輸?shù)牡鞍装ǖ幌抻?，抗體，酶，輔因子，干擾素，激素以及肽。此外，蛋白包括天然蛋白，融合蛋白，以及突變蛋白。
本發(fā)明的一個目的是提供一個非組織特異性方法其利用合適的宿主細胞來合成蛋白。
本發(fā)明的另一個目的是特異性控制蛋白在紅細胞的前體中的表達和產(chǎn)生。
本發(fā)明的一個進一步的目的是利用天然紅細胞的巨大產(chǎn)量提供有效的蛋白合成以及足夠的蛋白供應(yīng)來用于治療目的。另一個目的是利用紅細胞的無核特性來提供一個有利于蛋白產(chǎn)生后穩(wěn)定性的環(huán)境。
然而，本發(fā)明的另一個目的是繞過蛋白從制造場所釋放的分泌和胞吐途徑，利用紅細胞在生命周期末期的破裂作為一種傳輸機制來提供足夠量的蛋白到血流中。
本發(fā)明的另外一個目的是利用血紅蛋白啟動子來控制蛋白在紅細胞前體的表達和合成。此外，利用血紅蛋白啟動子的強度來提高蛋白合成的效率。
本發(fā)明的一個進一步的目的是用一般機制產(chǎn)生廣譜蛋白，治療各種疾病。


圖1是本發(fā)明的一實施例的圖表說明。
圖2是實施例中描述的攜帶β-gal基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的說明。
優(yōu)選實施例的詳述本發(fā)明提供了一個在體內(nèi)產(chǎn)生并傳輸?shù)鞍椎姆椒?。在一個實施例中，該方法包括步驟(1)在載體中插入一個啟動子以及一個編碼蛋白的基因，(2)從哺乳動物中收集適量的宿主細胞，(3)在體外用上述載體處理宿主細胞，(4)將經(jīng)處理的宿主細胞回輸哺乳動物。將處理后的宿主細胞重新回輸哺乳動物后，處理后的宿主在體內(nèi)產(chǎn)生紅細胞以及蛋白，其中的蛋白只存在于紅細胞中。紅細胞在其生命周期的末期破裂并且將蛋白釋放入血流中。可選擇地，除了啟動子外一或多個增強子也插入到載體中。
為了本發(fā)明的目的，宿主細胞為干細胞，以及其它的紅細胞祖代。骨髓是干細胞的適宜的來源，并且其優(yōu)點在于其含有紅細胞的前體。載體DNA可以通過本領(lǐng)域公知的任意基因轉(zhuǎn)移方法被插入到哺乳動物宿主細胞中，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法，電轉(zhuǎn)移，微注射，細胞融合，或原生質(zhì)體融合。
此處所用的術(shù)語″載體″在廣義上是指能夠從一個細胞到另一個細胞轉(zhuǎn)移DNA的重組DNA物質(zhì)。載體可以是線性或環(huán)形的單鏈DNA，并且除了本發(fā)明的主要功能元件外，也可包括例如對于特殊用途必需的其它序列。例如，載體可以具有其它特性，如一個或多個可選擇的標記基因和/或幫助翻譯或產(chǎn)生克隆產(chǎn)物的其它方面的特性。
優(yōu)選的，載體為一個病毒載體。病毒載體缺失負責(zé)病毒表達的片段，例如不完全復(fù)制。更優(yōu)選地，載體為一個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，以及腺病毒載體。
此處所用的術(shù)語″啟動子″在廣義上是指能夠在紅細胞的祖代細胞中引發(fā)基因表達蛋白的任意啟動子。啟動子可以是一個基因的原始啟動子，或一個基因的突變啟動子。一個原始啟動子是存在于其蛋白對于細胞而言是原始的基因中的啟動子?？蛇x擇地，啟動子可與其它的啟動子串聯(lián)存在，并且可以包括一個或多個增強子元件。優(yōu)選的，啟動子是血紅蛋白啟動子。
此處所用的術(shù)語″增強子″在廣義上是指能夠增強啟動子利用的任意增強子，并且在定向以及相對于啟動子的任意位置(上游或下游)上起作用。
此處所用的術(shù)語″基因″是指一個DNA序列，優(yōu)選為編碼蛋白的結(jié)構(gòu)基因。用于本發(fā)明目的的蛋白包括但不限于抗體、酶、輔因子、干擾素、激素以及肽。此外，蛋白包括天然蛋白、融合蛋白以及突變蛋白。蛋白可以完全與宿主細胞異源。蛋白也可以是商業(yè)用途的多肽或肽，例如一種藥劑。
此處所用的術(shù)語″異源″和″非原始″指一個基因或蛋白是非天然存在的，或一個生物過程在宿主細胞中是非天然發(fā)生。
在另一個實施例中，方法包括步驟(1)在載體中插入一個血紅蛋白啟動子以及一個編碼非血紅蛋白的基因，(2)從哺乳動物中收集適量的宿主細胞，(3)在體外用上述載體處理宿主細胞，(4)將經(jīng)處理的宿主細胞回輸該哺乳動物。在將處理后的宿主細胞重新回輸哺乳動物后，宿主細胞在體內(nèi)產(chǎn)生血細胞。蛋白只存在于紅細胞中，因為插入到載體中的血紅蛋白啟動子只在紅細胞的前體中才有活性。紅細胞在生命周期的末期破裂并且將蛋白釋放入血流中。
自然地，紅細胞由骨髓中干細胞產(chǎn)生。干細胞是骨髓中細胞的亞型，產(chǎn)生全譜的血細胞并在人的一生中替換死亡細胞。
紅細胞在骨髓產(chǎn)生幾天之后運動到外周血中。成熟紅細胞主要含有血紅蛋白和細胞質(zhì)。在成熟的紅細胞中沒有細胞核，血細胞的主要功能是通過血紅蛋白運輸氧到機體中。在外周血中，紅細胞的半衰期大約為60天。在血細胞周期的末期，紅細胞在脾臟中破裂并且釋放血紅蛋白到血流中。釋放的血紅蛋白在肝臟中聚集并重新用于紅細胞的產(chǎn)生。
血紅蛋白是非常穩(wěn)定的蛋白，其已被用于藥物運輸?shù)妮d體(US5759517)。血紅蛋白只產(chǎn)生于紅細胞中且保留在外周血循環(huán)中。
本發(fā)明的方法在蛋白產(chǎn)生且特別在蛋白運輸?shù)綑C體方面是新穎的。本發(fā)明方法中，蛋白僅由紅細胞的祖代細胞產(chǎn)生并通過紅細胞攜帶，代替用于傳統(tǒng)的基因治療的組織特異性細胞。與以前的組織特異性方法不同，本發(fā)明的方法省略了將編碼蛋白的基因運輸?shù)接糜诘鞍桩a(chǎn)生的特異性器官或組織中的過程。本方法利用血紅蛋白來控制蛋白只在紅細胞祖代中產(chǎn)生，并且然后利用紅細胞作為載體來運輸?shù)鞍椎剿墓δ芪稽c。
本發(fā)明方法中，蛋白包含在紅細胞中未被暴露于細胞外環(huán)境或成核細胞的酶環(huán)境。蛋白被細胞膜保護抵抗細胞外環(huán)境的干擾，直至紅細胞破裂。從前的方法中，裸DNA及脂質(zhì)體的方法被利用來傳遞DNA，其傳導(dǎo)入病人或動物的身體后DNA降解。本發(fā)明的方法阻止蛋白暴露于苛刻的環(huán)境，并且在體內(nèi)合成蛋白后提供其穩(wěn)定性。
在蛋白的運輸方面，本發(fā)明的方法利用紅細胞的額外功能作為蛋白轉(zhuǎn)運的運輸載體。本方法利用紅細胞的自然破裂運輸所產(chǎn)生的蛋白到血流中。本發(fā)明的方法的蛋白運輸機制基本上不同于自然細胞的分泌或調(diào)節(jié)的胞吐。
本發(fā)明的方法具有很多優(yōu)點。首先，本發(fā)明的方法提供了有效的蛋白合成，并且能夠產(chǎn)生大量的蛋白合成用于基因治療。較特別的，一旦一個基因被導(dǎo)入干細胞，例如通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，干細胞將產(chǎn)生紅細胞并不斷合成蛋白。這意味著即使只有所有被處理干細胞的一小部分達到成功的基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，由這些干細胞產(chǎn)生的紅細胞量將含有足夠的蛋白量。因為紅細胞的產(chǎn)生是一個連續(xù)的過程，蛋白也是以連續(xù)的方式合成。
利用本發(fā)明的方法，蛋白是由紅細胞的祖代細胞產(chǎn)生，并且由紅細胞攜帶和運輸。一旦運輸?shù)鞍椎募t細胞釋放入外周血中，紅細胞自身沒有能力進一步表達蛋白。在紅細胞破裂蛋白釋放出之前，紅細胞是蛋白的暫時儲存場所，這是紅細胞和其它的成核細胞的主要區(qū)別。后者可以在外周血中表達蛋白。
第二，紅細胞提供防止蛋白降解的自然保護。蛋白只存在于紅細胞中因為血紅蛋白啟動子只在紅細胞的祖代細胞中具有活性。紅細胞沒有核。因此，產(chǎn)生的蛋白不會被核酶降解。與其它的成核細胞例如白細胞相比，蛋白在紅細胞中更穩(wěn)定。紅細胞中蛋白穩(wěn)定性的實例通過天然血紅蛋白在紅細胞的整個生命周期中都存在而被證實。另外，紅細胞在蛋白進入血循環(huán)之前也保護蛋白抵抗細胞外環(huán)境。
第三，本發(fā)明的方法提供了一種有效的蛋白運輸機制。天然紅細胞在外周血中的半衰期大約為60天。因此，通過利用紅細胞的破裂作為蛋白供應(yīng)的運輸機制是連續(xù)并恒定的。對于一些疾病例如血友病和與激素相關(guān)的疾病，連續(xù)的蛋白供應(yīng)是所期望的。其它的疾病，例如癌癥，連續(xù)的蛋白供應(yīng)不僅提供了治療，而且有助于預(yù)防疾病。此外，在一些情況下，雖然連續(xù)的蛋白供應(yīng)不是天然的供應(yīng)模式，但是其有治療意義而且是有益的。這種情況的適宜的例子是為糖尿病患者供應(yīng)胰島素。
第四，本發(fā)明的方法傳輸沒有天然細胞功能限制的蛋白。更特殊地，如果利用的宿主細胞并非天然產(chǎn)生蛋白的特異性器官或組織的細胞，該方法避免了宿主細胞在蛋白輸出或運輸上的困難。例如，通過遺傳方法在皮膚組織產(chǎn)生的特定蛋白在血流中用于治療之前必須從宿主皮膚組織中充分地釋放。由于宿主細胞并非天然蛋白產(chǎn)生過程的原始器官或組織的細胞，它們可能不具備輸出特異性客體蛋白的分泌功能。在后一種情況下，客體蛋白將在宿主細胞中積累并且導(dǎo)致細胞最終死亡。
本發(fā)明的方法利用紅細胞的自然破裂進行蛋白的傳輸?？蛇x擇地，如果需要的話，紅細胞的自然破裂也可被誘導(dǎo)。例如，紅細胞的生命循環(huán)時間可被通過遺傳突變來調(diào)整。本發(fā)明的方法通過紅細胞在外周血中循環(huán)提供蛋白，對于治療目的，本方法將蛋白保留在血流中優(yōu)于其它的傳統(tǒng)的蛋白載體。
第五，本發(fā)明的方法中，通過收集和處理的宿主細胞的量，蛋白產(chǎn)生和傳輸?shù)牧靠杀豢刂?。?dāng)從骨髓中收集干細胞時，處理后的骨髓可種植在最初的收集位置，或裝入一個sag中，然后植回病人的骨髓。如果需要大量的蛋白，例如人血清白蛋白，蛋白產(chǎn)生的量可通過移植位點的數(shù)目來控制。如果一個病人繼承了一個遺傳缺陷并且終生需要連續(xù)供應(yīng)正?；虍a(chǎn)物，則可選擇永久的移植。如果僅僅短期需要基因的活性，例如激活免疫系統(tǒng)抵抗癌細胞或感染因子，當(dāng)治療完成后或不再需要時，SAG可從體內(nèi)取出。
第六，在本發(fā)明的方法中，蛋白僅存在于紅細胞中。一旦處理過的干細胞從體內(nèi)取出，紅細胞的產(chǎn)生將立即停止。攜帶蛋白的外周血液中余下的紅細胞，將在生命循環(huán)的末期破裂。到那時，蛋白的供應(yīng)將完全停止。因此，本發(fā)明的方法提供一種簡單安全的用于治療過程的控制機制。如上所述，成熟的紅細胞本身不表達蛋白質(zhì)。在紅細胞從骨髓中釋放到外周血液后便沒有蛋白產(chǎn)生。與紅細胞不同，成核血細胞，例如白細胞，在外周血液中表達蛋白直至細胞死亡或喪失功能。因此，當(dāng)遺傳工程成核細胞被導(dǎo)入血液循環(huán)時，沒有蛋白產(chǎn)生的控制。更特殊地，當(dāng)?shù)鞍着c宿主成核細胞異源時，外源蛋白和原始蛋白間的相容性或相互作用，以及核酶在細胞生命的自始至終將是基因治療的安全問題。在另一方面，由于紅細胞不能在外周血液中產(chǎn)生蛋白，蛋白產(chǎn)生在始干細胞中被限制，其可通過移植的量被控制。
本發(fā)明的方法應(yīng)用廣泛，特別適用于具有爭議的基因治療，其中一個健康的基因替換了一個丟失的或有缺陷的基因的產(chǎn)物，但不是完全地替換有缺點的DNA本身。用本發(fā)明方法進行基因治療的一個實例是治療一個血友病患者。在此情況下，用血紅蛋白啟動子和血友病因子ⅩⅢ基因來構(gòu)建一個逆轉(zhuǎn)錄病毒。然后，收集患者大量的骨髓并且用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)干細胞。載體構(gòu)建與基因轉(zhuǎn)導(dǎo)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成。骨髓在處理后植回患者。之后，轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞將產(chǎn)生血細胞。血友病因子ⅩⅢ將僅在經(jīng)治療的患者外周血液中循環(huán)的紅細胞中產(chǎn)生。在這些紅細胞的生命循環(huán)的末期，血友病因子ⅩⅢ將通過紅細胞的破裂釋放到血流中。因為通過被轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞連續(xù)產(chǎn)生紅細胞以及紅細胞在生命循環(huán)的末期連續(xù)破裂，經(jīng)過這種治療的患者將具有連續(xù)不斷的血友病因子ⅩⅢ的供應(yīng)。
上述基因表達與蛋白運輸過程可以通過全血細胞血友病因子ⅩⅢ DNAPCR分析，紅細胞蛋白免疫測定或染色反應(yīng)，以及血清蛋白免疫測定或染色反應(yīng)被檢測。一個陽性的全血細胞血友病因子ⅩⅢ DNA PCR分析結(jié)果顯示了體內(nèi)基因表達的成功。一個陽性的紅細胞蛋白免疫測定或染色反應(yīng)結(jié)果表明在由轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞產(chǎn)生的紅細胞中產(chǎn)生蛋白的成功。一個陽性的血清蛋白免疫測定或染色反應(yīng)結(jié)果表明在體內(nèi)基因表達和蛋白產(chǎn)生后蛋白傳輸?shù)窖髦械某晒Α?br> 本發(fā)明的方法在治療遺傳病或后天獲得的疾病上有著廣泛的應(yīng)用。一般而言，任何蛋白，或在血流中有作用的，例如血友病因子ⅩⅢ，或者能夠通過血流被傳遞到功能位點的，例如激素，都能夠利用本發(fā)明的方法得到。一些應(yīng)用的類別可以被歸類，其中本發(fā)明的方法可以被用于提供所需要的與疾病相關(guān)或不相關(guān)的蛋白。
一個合適的應(yīng)用類型是治療遺傳性疾病。這樣的疾病包括(但不限于)膽囊纖維化，脊髓病性肌營養(yǎng)不良，血友病A，杭廷頓氏舞蹈病，家族性血膽甾醇過多，Ⅹ-易碎綜合癥。第二種應(yīng)用的類型是提供一種用于其它疾病治療的具有酶功能的蛋白，例如家族性脾性貧血。第三種應(yīng)用的類型是提供一種具有激素功能的蛋白。對這種類型蛋白可治療的病有為甲狀腺激素、生長激素疾病以及糖尿病。第四種應(yīng)用的類型是用于治療由特定條件引起的蛋白水平的降低。這種應(yīng)用的適宜的病例為由肝臟產(chǎn)生的低水平的人血清白蛋白，低水平的血紅蛋白刺激因子，皮質(zhì)醇缺乏，以及由某些腎病導(dǎo)致的醛甾酮缺乏。特定的垂體環(huán)境導(dǎo)致的生長素的缺乏，促性腺素的缺乏，甲狀腺刺激激素的缺乏以及腎上腺皮質(zhì)素的缺乏也可用本方法快速治療。第五種應(yīng)用的類型是提供一種具有治療功能的哺乳動物或非哺乳動物蛋白。這些蛋白包括動物蛋白(例如蛇)，微生物蛋白(例如干擾素)，以及具有治療功能的植物蛋白。
第六種應(yīng)用的類型是提供與癌癥相關(guān)的蛋白，合適的蛋白有抗原癌基因(腫瘤抑制因子)蛋白，腫瘤壞死基因蛋白和干擾素。已知在不同類型的癌癥患者中，相對于正常人某些蛋白濃度很低或無。特定蛋白的缺少可能決定惡性細胞的生長，或可能導(dǎo)致癌癥患者的免疫系統(tǒng)或代謝系統(tǒng)的嚴重損傷。在本發(fā)明的方法中，特定蛋白的提供在前一情況下具有治療的功能，或減輕后者的癥狀或并發(fā)癥。另外，特定蛋白的提供也用來預(yù)防特定類型的癌癥。更特殊地，此功能特別適用于那些他們的天然蛋白產(chǎn)生能力上有遺傳缺陷的癌癥高危人群。眾所周知的例子為乳腺癌、卵巢癌，以及前列腺癌。以前所述的組織特異性方法在此情況下可能沒有功能，因為靶組織或細胞不能與基因缺陷的基因轉(zhuǎn)移細胞相容。因此，本發(fā)明的方法在此類型的應(yīng)用中有顯著的臨床價值。
第七種應(yīng)用的類型是提供治療免疫系統(tǒng)疾病的蛋白。疾病適宜的例子為抗體缺失綜合癥，例如Bruton血γ球蛋白缺乏(IgG,IgM以及IgA的減少)，普通可變的免疫缺失IgG,IgM以及IgA的減少)，以及選擇性的IgA缺乏(IgA減少)。另一個病例是吞噬細胞失調(diào)，例如Clr,Clq,C2缺陷，C3缺陷，C4缺陷，以及C5-C9缺陷。第八種應(yīng)用的類型是提供突變，融合的以及合成的蛋白。
利用紅細胞的祖代細胞作為宿主細胞用于蛋白的產(chǎn)生以及利用后紅細胞用于蛋白運輸?shù)姆椒ㄒ部杀挥糜谄渌愃频募毎愋?。例如，可以利用一種特定的啟動子通過干細胞以與上述實施例中描述的相同方式來控制巨核細胞(血小板的前體)中蛋白的產(chǎn)生。當(dāng)巨核細胞在體內(nèi)破裂蛋白將被傳輸?shù)窖髦小?br> 本發(fā)明的方法通過下面的實施例進一步地描述，其為了解釋而不是為了限制。
實施例(a)用β-gal基因構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體首先，一個含有psi序列(逆轉(zhuǎn)錄病毒的組裝功能)和一個異源基因(在此β-gal)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將通過本領(lǐng)域公知的重組方法被構(gòu)建。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag,pol以及env基因?qū)⒈划愒椿?附圖2,(A))所替換。病毒生產(chǎn)細胞系也將被創(chuàng)建，其含有特定的野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒基因，例如gag,pol以及env基因，在反式結(jié)構(gòu)(附圖2,(B))中。之后，上述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)細胞系。轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致了攜帶含有異源基因(在此β-gal)的載體的不完全復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子能夠和靶細胞(干細胞)連接在一起并插入其成分到細胞中。在細胞中，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA通過逆轉(zhuǎn)錄作用轉(zhuǎn)為DNA，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA將通過整合被插到細胞染色體組中(附圖2,(C))。
兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用上述方法構(gòu)建。兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有相同的β-gal基因。這兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體僅有的區(qū)別在于啟動子或/和增強子。第一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有β-gal基因上游的SV40啟動子。此載體能夠在幾乎所有的哺乳動物(人或動物)細胞中表達β-gal基因。第二種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有β-gal基因上游的異源啟動子。此載體僅能夠在紅細胞中表達β-gal基因。
此外，兩種調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也將被構(gòu)建。調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有一個SV40啟動子或一個異源啟動子。然而，兩種調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒載體都不含有β-gal基因。
通過β-gal基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)細胞系然后37℃培養(yǎng)在標準細胞培養(yǎng)基中。逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子將從生產(chǎn)細胞系中釋放到培養(yǎng)基中。通過離心從培養(yǎng)基中收集逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子。收集的粒子通過DNA分析來證實β-gal逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的產(chǎn)生。
通過上述的方法，對于人細胞的β的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及β-gal蛋白表達將首先用市售的人細胞系檢測?；讦?gal蛋白的特性，轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果可通過本領(lǐng)域公知的染色反應(yīng)來證實。
(b)用β-gal逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓細胞用兔和狗作實驗和對照受試者。在麻醉的條件下通過手術(shù)從受試者的髖骨中收集骨髓細胞。通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)例如密度梯度法從骨髓細胞中分離干細胞。干細胞在標準的細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或瓶中。培養(yǎng)2到3天后，上述產(chǎn)生的實驗病毒(帶有β-gal基因的SV40啟動子，和攜帶β-gal基因的異源啟動子)，以及對照病毒(不攜帶β-gal基因的SV40啟動子，和不攜帶β-gal基因的異源啟動子)加到細胞培養(yǎng)物中用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)5至7天后，通過β-gal DNA分析檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的樣品來檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。通過β-gal蛋白分析檢測余下的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞來檢測β-gal基因表達的效率。
轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞然后被移植回實驗動物。這些移植物的區(qū)域被標記作為識別標記用于將來除去移植的細胞。
(c)體內(nèi)基因表達與蛋白運輸?shù)慕Y(jié)果骨髓移植后，在適當(dāng)?shù)臅r間間隔，從實驗組和對照組動物中收集外周全血樣。用常規(guī)方法從實驗以及對照的受試者的全部血樣中分離紅細胞與白細胞。洗滌分離的細胞以減少殘留的血清然后用溶劑溶解。通過β-gal蛋白試驗或染色反應(yīng)分析上清液。
具有用第一種實驗載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的移植物的實驗動物，所以在紅細胞與白細胞的上清液中均獲得陽性的β-gal蛋白測定。另一方面，具有用第二種實驗載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的移植物的受試者僅在紅細胞的上清液中獲得陽性的β-gal蛋白測定。對于具有用對照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的移植物，其β-gal蛋白分析的結(jié)果是陰性的。
此外，受試者具有用第二種實驗載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的移植物的，其血清通過全部血樣的離心被分離并通過免疫測定或染色反應(yīng)被分析。陽性的血清β-gal蛋白分析的結(jié)果表明了下述的成功(1)基因在經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細胞產(chǎn)生的干細胞以及紅細胞中的表達，(2)紅細胞中蛋白的產(chǎn)生，以及(3)蛋白運輸?shù)窖髦?，例如，從紅細胞中釋放。
本發(fā)明通過引用優(yōu)選的實施例來描述。然而，應(yīng)理解為本發(fā)明并不受其限制，并且本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)由下面的權(quán)利要求而不是前面的說明書來確定。
本申請引用的所有專利與出版物在此一并被整體引用。
權(quán)利要求
1．一種體內(nèi)產(chǎn)生和運輸?shù)鞍椎姆椒?，包括步驟(a)在載體中插入啟動子和編碼蛋白的基因；(b)從哺乳動物中收集適量的宿主細胞；(c)用所述載體處理宿主細胞；(d)將處理后的宿主細胞回輸所述的哺乳動物，其中處理后的宿主細胞在所述哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生紅細胞與所述蛋白，并且其中所述的蛋白僅包含在所述紅細胞中，其后所述的蛋白通過所述紅細胞的破裂釋放到所述哺乳動物的血流中。
2．如權(quán)利要求1所述的方法進一步包括在所述載體中插入一個增強子。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的啟動子是一個天然啟動子。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的啟動子是一個突變啟動子。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的啟動子是一個來自紅細胞的非同源性啟動子。
6．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的載體是一個病毒載體。
7．如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，慢病毒載體。
8．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的宿主細胞為干細胞和所述紅細胞的祖代細胞。
9．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的紅細胞的破裂是一個體內(nèi)的過程。
10．如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的紅細胞的破裂是一個體內(nèi)誘導(dǎo)的過程。
11．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白選自抗體，酶，輔因子，干擾素以及激素的組。
12．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的蛋白是肽。
13．如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述的蛋白是天然產(chǎn)生的蛋白。
14．如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述的蛋白是融合蛋白。
15．如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述的蛋白是突變蛋白。
16．體內(nèi)產(chǎn)生和運輸?shù)鞍椎姆椒òú襟E(a)在載體中插入血紅蛋白啟動子和編碼非血紅蛋白蛋白的基因；(b)從哺乳動物中收集適量的宿主細胞；(c)用所述載體處理宿主細胞；(d)將處理后的宿主細胞回輸所述的哺乳動物，其中處理后的細胞在所述哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生紅細胞與所述蛋白，并且其中所述的蛋白僅包含在所述紅細胞中，其后所述的蛋白通過所述紅細胞的破裂釋放到所述哺乳動物的血流中。
17．如權(quán)利要求16所述的方法進一步包括在所述載體中插入一個增強子。
18．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的啟動子是一個天然啟動子。
19．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的啟動子是一個突變啟動子。
20．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的載體是一個病毒載體。
21．如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和慢病毒載體。
22．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的宿主細胞為干細胞和所述紅細胞的祖代細胞。
23．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的紅細胞的破裂是一個體內(nèi)的過程。
24．如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的紅細胞的破裂是一個體內(nèi)誘導(dǎo)的過程。
25．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的蛋白選自抗體、酶、輔因子、干擾素以及激素。
26．如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的蛋白是肽。
27．如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述的蛋白是天然產(chǎn)生的蛋白。
28．如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述的蛋白是融合蛋白。
29．如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述的蛋白是突變蛋白。
30．一種在體內(nèi)產(chǎn)生和運輸?shù)鞍椎姆椒?，包括步驟(a)在載體中插入血紅蛋白啟動子和編碼非血紅蛋白的基因；(b)從哺乳動物中收集適量的宿主細胞；(c)在體外用所述載體處理宿主細胞；(d)將處理后的宿主細胞回輸所述的哺乳動物，其中處理后的宿主細胞在所述哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生紅細胞與所述蛋白，并且其中所述的蛋白僅包含在所述紅細胞中，其后所述的蛋白通過所述紅細胞的破裂釋放到所述哺乳動物的血流中。
31．如權(quán)利要求30所述的方法進一步包括在所述載體中插入一個增強子。
32．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血紅蛋白啟動子是一個天然啟動子。
33．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血紅蛋白啟動子是一個突變啟動子。
34．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的載體是一個病毒載體。
35．如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和慢病毒載體。
36．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的宿主細胞為干細胞和所述紅細胞的祖代細胞。
37．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的紅細胞的破裂是一個體內(nèi)的過程。
38．如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的紅細胞的破裂是一個體內(nèi)誘導(dǎo)的過程。
39．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的蛋白選自抗體、酶、輔因子、干擾素以及激素。
40．如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的蛋白是肽。
41．如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述的蛋白是天然產(chǎn)生的蛋白。
42．如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述的蛋白是融合蛋白。
43．如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述的蛋白是突變蛋白。
全文摘要
一種在體內(nèi)產(chǎn)生和運輸?shù)鞍椎姆椒?。該方法包?在載體中插入啟動子和編碼蛋白的基因;從哺乳動物中收集適量的宿主細胞;在體外用載體處理宿主細胞;然后將處理后的細胞回輸所述的哺乳動物。在體內(nèi),處理后的細胞在所述哺乳動物產(chǎn)生紅細胞與包含在紅細胞中的蛋白。蛋白通過所述天然的或誘導(dǎo)的紅細胞的破裂釋放到哺乳動物的血流中以供應(yīng)給機體。
文檔編號C07K14/00GK1322142SQ00800181
公開日2001年11月14日 申請日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月19日
發(fā)明者陳海星 申請人:Acgt公司