本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記領(lǐng)域，尤其涉及一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法。

背景技術(shù)：
二氧化鈦納米材料具有優(yōu)異的光催化降解有機有害物質(zhì)的性能，使其在環(huán)境污染治理方面發(fā)揮巨大的作用，也引起越來越多的科學(xué)家對其的關(guān)注。不同形貌的二氧化鈦納米材料的光催化降解效率有顯著的差異，二氧化鈦納米管的光催化降解有機有毒物質(zhì)的效率可以是二氧化鈦納米顆粒的幾十倍之多。同時，對于二氧化鈦納米管的生物毒性的研究也是十分關(guān)鍵的。觀察二氧化鈦納米管與細(xì)胞的相互作用是研究的主要手段，其中對二氧化鈦納米管的熒光染色是觀察二氧化鈦納米管在細(xì)胞內(nèi)部分布情況以及細(xì)胞對二氧化鈦納米管胞吞情況最重要的步驟，然而二氧化鈦納米管表面并沒有與常見染色劑可進(jìn)行標(biāo)記的特性，所以解決對二氧化鈦納米管的熒光染色問題對其與細(xì)胞的相互作用等研究中是十分關(guān)鍵的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法。本發(fā)明通過人血清蛋白與異硫氰酸熒光素的作用先制備合成異硫氰酸熒光素標(biāo)記的人血清蛋白，然后利用二氧化鈦納米材料與蛋白質(zhì)的吸附特性間接將異硫氰酸熒光素標(biāo)記在二氧化鈦納米材料上，該方法不會對細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，不影響實驗結(jié)果的科學(xué)性。本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將異硫氰酸熒光素溶解于二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存，其中異硫氰酸熒光素與二甲基亞砜的用量比為(0.7~1.1)/(2~6)mol/mL。2）將人血清蛋白添加到pH為8.5~9.5的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液,其中人血清蛋白與碳酸鈉水溶液用量比為(0.1~0.5)/(16~24)mol/mL。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將2~6體積份的A溶液滴加至10~20體積份的B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于pH為8.5~9.5的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）取二氧化鈦納米管分散于水中配制成0.5~1.5mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至2~3mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1：（1~1.2）的比例混合處理12~60h，然后將混合溶液經(jīng)離心分離后取固體，制得綠色標(biāo)記熒光的二氧化鈦納米管。本發(fā)明通過人血清蛋白與異硫氰酸熒光素的作用先制備合成異硫氰酸熒光素標(biāo)記的人血清蛋白，然后利用二氧化鈦納米管與蛋白質(zhì)的吸附特性間接將異硫氰酸熒光素標(biāo)記在二氧化鈦納米管上，該方法不會對細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，不影響實驗結(jié)果的科學(xué)性。作為優(yōu)選，步驟1）中異硫氰酸熒光素與二甲基亞砜的用量比為(0.8~1)/(3~5)mol/mL。作為優(yōu)選，步驟2）中人血清蛋白與碳酸鈉水溶液用量比為(0.2~0.4)/(18~22)mol/mL。作為優(yōu)選，步驟3）中所述A溶液與所述B溶液的體積比為4:15。作為優(yōu)選，步驟3）中將所述A溶液滴加至所述B溶液的滴加速度為0.1-0.15mL/sec。慢速滴加能夠避免A溶液滴加到B溶液后發(fā)生團聚現(xiàn)象，只有在特定的慢速滴加才能使A溶液與B溶液均勻、充分地混合而不發(fā)生團聚。另一方面，慢速的滴加，也有利于人血清蛋白能夠被異硫氰酸熒光素均勻地標(biāo)記，避免大多數(shù)異硫氰酸熒光素標(biāo)記于少量的人血清蛋白上。作為優(yōu)選，在步驟3）的透析過程中，所述透析袋的截留分子量為7000-10000；所述C溶液與碳酸鈉水溶液的體積比為1:(50-150)。作為優(yōu)選，步驟4）中的二氧化鈦納米管經(jīng)過預(yù)處理：將二氧化鈦納米管在鹽酸水溶液中浸泡處理，然后經(jīng)離心分離得到預(yù)處理的二氧化鈦納米管。本發(fā)明預(yù)先將二氧化鈦納米管與酸性溶液作用，減小了二氧化鈦納米管表面的zate電位，減弱了人血清蛋白與材料的電荷排斥作用，有利于材料與蛋白的結(jié)合，同時也能夠使得標(biāo)記物能夠均勻地分布在標(biāo)記對象上。作為優(yōu)選，所述鹽酸水溶液的濃度為1mol/L，所述二氧化鈦納米管與鹽酸水溶液用量比為(4~6):(40~60)mg/mL，浸泡時間為4~8h，離心轉(zhuǎn)速為16000~18000g。作為優(yōu)選，步驟4）的離心分離過程具體為：將所述混合溶液在18000-22000g的轉(zhuǎn)速下離心4-6min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：1）異硫氰酸熒光素與人血清蛋白的化學(xué)鍵作用十分牢靠，再利用二氧化鈦納米材料對蛋白質(zhì)的吸附性能，使二氧化鈦納米管標(biāo)記上綠色熒光。2）本發(fā)明用人血清蛋白促使熒光劑與二氧化鈦納米管的結(jié)合，不影響細(xì)胞實驗的準(zhǔn)確性。3）使用化學(xué)藥品較少，實驗過程綠色環(huán)保。4）方法簡便、成本低、效果好。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實施例1一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將0.9mol的異硫氰酸熒光素溶解于4mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.5mol的人血清蛋白添加到20mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.13mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為9000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于100倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱螅〕鐾肝龃?，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）取二氧化鈦納米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至2.5mg/mL，得到E溶液。在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1.1的比例混合處理36h，然后將混合溶液在20000g的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實施例2一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將0.9mol的異硫氰酸熒光素溶解于4mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.5mol的人血清蛋白添加到20mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.13mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于100倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）將5mg的二氧化鈦納米管在50mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理6h，然后在17000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的二氧化鈦納米管。5）取預(yù)處理后的二氧化鈦納米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至2.5mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1.1的比例混合處理36h，然后將混合溶液在20000g的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實施例3一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將0.7mol的異硫氰酸熒光素溶解于2mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.3mol的人血清蛋白添加到16mL的pH為8.5的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.1mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為7000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于50倍質(zhì)量的pH為8.5的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）取4mg二氧化鈦納米管在60mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理4h，然后在16000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的二氧化鈦納米管。5）取預(yù)處理后的二氧化鈦納米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至2mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1的比例混合處理12h，然后將混合溶液在18000g的轉(zhuǎn)速下離心4min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實施例4一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將1.1mol的異硫氰酸熒光素溶解于6mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.7mol的人血清蛋白添加到24mL的pH為9.5的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.15mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于150倍質(zhì)量的pH為9.5的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）取6mg二氧化鈦納米管在40mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理8h，然后在18000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的二氧化鈦納米管。5）取預(yù)處理后的二氧化鈦納米管分散于水中配制成1.5mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至3mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1.2的比例混合處理60h，然后將混合溶液在22000g的轉(zhuǎn)速下離心6min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實施例5一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將0.8mol的異硫氰酸熒光素溶解于3mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.4mol的人血清蛋白添加到18mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.12mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于120倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）取5mg二氧化鈦納米管在40mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理5h，然后在17000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的二氧化鈦納米管。5）取預(yù)處理后的二氧化鈦納米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至2.5mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1的比例混合處理24h，然后將混合溶液在21000的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實施例6一種綠色熒光標(biāo)記二氧化鈦納米管的方法，采用如下步驟：1）將1mol的異硫氰酸熒光素溶解于5mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.6mol的人血清蛋白添加到22mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.14mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為7000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于80倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到異硫氰酸?biāo)記的人血清蛋白溶液。4）取6mg二氧化鈦納米管在50mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理4~8h，然后在16000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的二氧化鈦納米管。5）取預(yù)處理后的二氧化鈦納米管分散于水中配制成1mg/mL的D溶液，再將所述異硫氰酸標(biāo)記的人血清蛋白溶液加水稀釋濃度至2.5mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1.1的比例混合處理48h，然后將混合溶液在19000g的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。