本發(fā)明涉及納米生物學領域，尤其涉及細胞表面生物正交拉曼成像的增強基底的制備。

背景技術：

對細胞尤其是活細胞中特定分子進行成像，是研究生命過程的重要方法。其中熒光成像應用廣泛。除了基于蛋白的熒光成像(如熒光蛋白和免疫熒光)，近年來，一種生物正交化學報告基團的策略發(fā)展起來。其將帶有生物正交化學基團(如炔基、疊氮等)的前體通過代謝途徑引入生物分子中，如核酸、蛋白、糖和脂；再經過正交反應連接上熒光基團進行成像。這些新的標記方法和先進的熒光顯微鏡技術結合起來，在細胞生物分子的動態(tài)和功能研究中發(fā)揮了重要作用。但是熒光成像仍然存在一系列的問題：后續(xù)的化學反應檢測體系生物相容性不佳；熒光基團可能會影響生物分子的結構和功能；活體動態(tài)標記很受限制。目前在解決正交反應的生物相容性問題方面，研究者們發(fā)展了活性炔基團，但活化炔的活化很復雜、合成成本高、吸附背景高、相對于催化反應速率慢，而且生物相溶性問題也未得到很好的解決。

拉曼(raman)是一種非化學標記的成像和檢測方法，可以對特定的具有raman信號的基團進行檢測和成像。在細胞的raman成像中，存在一段raman信號沉默的區(qū)域(1800-2800cm^-1)，所以，可以使用raman信號在此沉默區(qū)域的基團(例如，炔基的raman信號在2100cm^-1左右)進行細胞甚至活體切片的raman檢測和成像。然而，raman信號相對于熒光信號來說非常弱，需要采用表面增強拉曼(sers)、cars、srs等技術來提高信號強度。sers是au、ag等金屬表面對于raman信號的一種 增強現象，一般可以實現10⁶-10¹²的增強效果。這一增強使得細胞膜表面的少量的含raman信號基團的生物分子的檢測和成像成為可能。

已經有研究者通過修飾了巰基苯硼酸的金納米顆粒，檢測到細胞表面非天然糖的信號，但是這種增強方法無法對細胞進行二維以及三維的連續(xù)大范圍成像。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對現有技術中存在的難題，提供一種制備適于細胞表面生物正交拉曼成像的增強基底的方法，該基底是金納米陣列基底，該方法包括以下步驟：

a)將硅片表面進行化學處理從而引入巰基；

b)將步驟a)得到的硅片浸于金納米顆粒aunps溶膠中；

c)將步驟b)得到的產物浸于十二烷基硫醇的乙醇溶液中處理；

d)將步驟c)得到的產物用乙醇洗滌后，在硅片表面滴水；

e)待水蒸發(fā)后得到自組裝的單層aunps陣列基底。

優(yōu)選地，上述步驟a)包括如下：將硅片浸入piranha溶液中處理，洗滌后浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，洗滌后聚合，然后硅片浸于巰基丁二酸活性酯溶液中處理。

優(yōu)選地，上述步驟a)包括如下：將硅片浸入piranha溶液中，90℃處理30min，洗滌后浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液(1μl/5μl)30min，洗滌后120℃聚合1h，然后硅片浸于巰基丁二酸活性酯溶液中處理6h。

優(yōu)選地，上述aunps溶膠通過采用檸檬酸鈉還原法制備。

優(yōu)選地，上述檸檬酸鈉還原法中所用的haucl4的終濃度為0.25mm，檸檬酸鈉的終濃度為0.01％(w/w)。

優(yōu)選地，上述步驟c)中，十二烷基硫醇的乙醇溶液的體積比為1∶1，且處理時間為24h。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備適于細胞表面生物正交拉曼成像的增強基底的方法，所述基底是銀納米島基底，該方法包括以下步驟：

a)采用真空蒸鍍的方法在玻璃片上形成銀納米島基底；

b)用十二烷基硫醇的乙醇溶液中處理步驟a)得到的銀納米島基底。

優(yōu)選地，上述真空蒸鍍的壓強可為約2.9×10-7pa-3.1×10-7pa，優(yōu)選可為3×10^-7pa，銀納米島基底的厚度可約為7.5nm-8.2nm，優(yōu)選約為8nm。

優(yōu)選地，上述十二烷基硫醇的乙醇溶液的體積比為1∶1，且處理時間為24h。

本發(fā)明的又一目的是提供一種上述方法制備得到的金納米陣列基底或銀納米島基底用于細胞的大面積二維或三維生物正交拉曼成像的應用。

本發(fā)明在硅片上修飾巰基對金納米顆粒進行固定，增加基底在細胞生物正交拉曼檢測中的穩(wěn)定性。在銀納米島增強基底上修飾十二烷基硫醇，增加銀基底的生物相容性，使其能夠用于生物正交拉曼檢測。本發(fā)明可制備大尺寸均勻、規(guī)則排列的金基底和銀基底，用于細胞的大面積二維或三維生物正交拉曼成像。

本發(fā)明使用適于細胞的二維有序排列的納米增強基底，可以實現細胞表面的生物正交拉曼成像。

本發(fā)明提供的制備適于細胞表面生物正交拉曼成像的增強基底的方法，通過制備均勻的納米陣列、固定納米結構和修飾生物相容分子，使代謝上正交拉曼基團的細胞能夠在基底上附著生長，繼而獲得特定生物分子的連續(xù)且大范圍的細胞正交拉曼成像。

本發(fā)明適用于細胞表面特定生物分子的正交拉曼成像的增強基底的方法，其樣品制備可做到與熒光成像一樣便捷，能獲得連續(xù)的多維度成像，且使得拉曼檢測效率更高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明自組裝aunps陣列基底制備過程的流程圖；

圖2(a)是本發(fā)明制備的aunps陣列基底(a)在電鏡下的微觀結構；

圖2(b)是本發(fā)明制備的銀納米島基底(b)在電鏡下的微觀結構；

圖3是圖4和5中的探針的名稱對應的化學結構式；

圖4是含一定濃度的非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)的hela細胞在本發(fā)明制備的aunps陣列基底上用nanophoton儀器進行拉曼成像的結果；

圖5是含一定濃度的非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)的hela細胞在本發(fā)明制備的銀納米島基底上用nanophoton儀器進行拉曼成像的結果。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1金納米陣列基底和銀納米島基底的制備

本發(fā)明分別制備了兩種增強基底：組裝在硅片上的金納米陣列基底和真空蒸鍍在玻璃片上的銀納米島基底。

自組裝aunps陣列基底制備過程如圖1所示，具體步驟：采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒(aunps)溶膠，其中haucl4的終濃度為0.25mm，檸檬酸鈉的終濃度為0.01％(w/w)。硅片浸入piranha溶液中，90℃處理30min，洗滌后浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液(1μl/5μl)30min，洗滌后120℃聚合1h，然后硅片浸于巰基丁二酸活性酯溶液中處理6h，洗滌后浸于aunps溶膠中，24h后洗滌晾干，浸于十二烷基硫醇的乙醇溶液(1∶1)中處理24h，乙醇洗滌后，在硅片表面滴一滴水，自然晾干。得到自組裝的單層aunps陣列基底。

銀納米島基底的制備：用真空蒸鍍的方法，壓強～3×10^-7pa，在玻璃片上形成8nm的厚度。用十二烷基硫醇修飾基底表面。

最終得到的aunps陣列基底(a)和銀納米島基底(b)在電鏡下的 微觀結構如下圖2(a)和圖2(b)所示(標尺：大圖為5μm，插圖為500nm)：可以看到，aunps基底上納米顆粒排列緊密均勻，形成平整的單粒子層；銀納米島基底上，納米島也是均勻分布，間隔為幾個納米。

實施例2含拉曼正交基團(炔基、疊氮和c-d)的細胞在aunps陣列基底上的成像(細胞系：hela)

研究者們已開發(fā)出能分別代謝標記蛋白、糖和脂的非天然探針，如aha(含疊氮)、9azsia(含疊氮az)和[d3]sia、propargylcholine(含炔基)可分別代謝進入蛋白、糖和脂分子中(非天然探針的結構式見圖3)。而它們的raman信號正好處于細胞沉默區(qū)域，都在2100cm^-1左右。將非天然探針處理過的細胞直接轉移到aunps增強基底上，就可以進行相應生物分子的正交拉曼成像。本發(fā)明將硅片表面進行化學處理，引入巰基，利用au-s的較強作用力來固定組裝在表面的aunps，可防止細胞在基底表面生長遷移過程中吞入或移動aunps，使陣列結構遭到破壞；同時，金納米粒子的生物相容性較好，不會影響細胞生長，另外本發(fā)明在表面修飾的十二烷基硫醇可能能夠插入磷脂雙分子層，增加基底的生物相容性，有利于細胞在基底表面的充分附著和鋪展，使得正交基團進入基底的短程增強范圍。

本發(fā)明用hela細胞來進行拉曼成像。用含不同濃度的非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)hela一定時間后，將細胞消化下來轉移到aunps基底上，用不含非天然探針的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)6～12h后，用nanophoton儀器進行拉曼成像，其結果如下圖4所示(標尺為20μm)，圖4和圖5中的探針的名稱對應的化學結構式由圖3所示。

通過圖4的拉曼成像結果可知，hela細胞在基底上的形態(tài)良好，同時疊氮、炔基和c-d的信號在hela的表面能很好地檢測到，能夠得到細胞連續(xù)的二維成像。這說明基底的生物相容性良好，且在細胞生長其上后基底結構沒有產生明顯缺陷，至少每兩個增強熱點(hotspot)的距離在儀器的空間分辨率范圍內。這種基底適于細胞正交拉曼成像。

實施例3含拉曼正交基團(炔基、疊氮和c-d)的細胞在銀納米島基底 上的成像(細胞系：hela)

很多研究結果表明ag納米材料的生物相容性較差。本發(fā)明在銀納米島基底上修飾十二烷基硫醇，使得hela生長其上仍能保持良好的形態(tài)，且真空蒸鍍方法可使銀納米島在原子水平上與玻璃片結合，獲得穩(wěn)定性良好的基底，細胞生長遷移過程中不會破壞基底的納米結構。

本實施例中銀納米島基底的細胞成像方法與上述實施例2中的aunps基底相同，其結果如下圖5所示(標尺為20μm)，圖4和圖5中的探針的名稱對應的化學結構式由圖3所示。

通過圖5的拉曼成像結果可知，hela細胞在銀納米島基底上的形態(tài)良好，同時疊氮、炔基和c-d的信號在hela的表面能很好地檢測到，得到了細胞連續(xù)大范圍的二維成像。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，當可作些許的更動與改進，因此本發(fā)明的保護范圍當視權利要求所界定者為準。