專利名稱：轉(zhuǎn)反義vp1基因培育水稻抗穗萌雄性不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻雄性不育系的培育方法，尤其是水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法。
背景技術(shù)：
目前，水稻雄性不育系抗穗萌育種主要是選用無(wú)穗萌的育種材料進(jìn)行雜交選育，但常規(guī)育種材料中的不穗萌材料絕大多數(shù)不具備雄性不育保持基因，故較難用于培育不育系，而目前大多數(shù)優(yōu)良保持系又是不抗穗萌的，因而，抗穗萌雄性不育系培育周期長(zhǎng)，耗費(fèi)多。
現(xiàn)有的另一種抗穗萌方法是噴施一定濃度的化學(xué)藥劑(例如多效唑)，但該方法也存在以下缺陷一是成本高，二是操作較困難，雨天噴藥效果不好，晴天又沒(méi)必要噴藥；三是效果欠佳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種快捷有效、便于操作，成本較低的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法。
本發(fā)明方法的技術(shù)方案是(1)從水稻保持系中應(yīng)用PCR技術(shù)克隆VP1基因(該基因在基因銀行的登記號(hào)為D16640.1 GI391884)的部分片斷；(2)用合適的內(nèi)切酶切出長(zhǎng)度為400-800bp的DNA片斷；(3)用組成型啟動(dòng)子UBI、35S等或胚特異表達(dá)啟動(dòng)子，上述DNA片斷的反義鏈及終止子NOS，構(gòu)成反義的表達(dá)載體；(4)用轉(zhuǎn)基因手段將構(gòu)建的反義載體導(dǎo)入目標(biāo)不育系對(duì)應(yīng)的保持系；(5)用轉(zhuǎn)基因保持系與目標(biāo)不育系回交，獲得轉(zhuǎn)反義VP1基因抗穗萌不育系。
采用本發(fā)明方法培育水稻抗穗萌雄性不育系，較常規(guī)方法快速有效，可節(jié)省時(shí)間3-5年；較化學(xué)藥劑噴施法操作方便，不受天氣好壞影響，成本較低，每畝可節(jié)省50-100元。抽穗后15天的發(fā)芽率為0，30天的發(fā)芽率不超過(guò)5％。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
加以說(shuō)明。
實(shí)施例1(1)擴(kuò)增VP1基因第182到934核苷酸的一對(duì)具有BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物R5-TAG GAT CCG TCG TCA ATC GCC-3，F(xiàn)5-ATG GTA CCGCAC TCG CAC GGG AACC-3；從岡46BDNA中用PCR技術(shù)，調(diào)出VP1第182-934的核苷酸序列；(2)用BamHI和KpnI的酶切，將VP1基因的第一個(gè)外顯子的第182-934核苷酸序列克隆在公知的pGEM-T載體上，并在大腸桿菌DH52中擴(kuò)增；(3)對(duì)克隆到pGEM-T載體上的部分VP1序列進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)其真實(shí)性；(4)用BamHI和KpnI的酶切攜帶目標(biāo)VP1序列pGEM-T質(zhì)粒，在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)片斷大小是否與目標(biāo)片斷大小一致，并回收目標(biāo)片斷；(5)用BamHI和KprI的酶切攜帶目標(biāo)片斷的pGEM-T質(zhì)粒(VP1基因的第480個(gè)核苷酸位置含有一個(gè)SacI酶切位點(diǎn))，在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)片斷大小是否與目標(biāo)片斷大小(454bp)一致，并回收目標(biāo)片斷vp454；
(6)分別用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切具有多酶切位點(diǎn)且已在一個(gè)T-DNA區(qū)中攜帶潮霉素抗性基因，另一個(gè)T-DNA區(qū)內(nèi)已具備玉米泛素啟動(dòng)子ubi和胭脂堿基因終止子NOS的超級(jí)雙元載體PSB130，回收酶切后的載體；(7)將vp752和vp454與回收的載體PSB130連接，獲得下列四種反義VP1基因的載體構(gòu)建a)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp752——UBI--(RB1)b)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp752——35S--(RB1)c)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp454——UBI--(RB1)d)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp454——35S--(RB1)；(8)將構(gòu)建好的載體在大腸桿菌DH52中擴(kuò)增，分別用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切，并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)目標(biāo)片斷大小是否正確；(9)將構(gòu)建好的載體用凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，并在1.2％甘油中-70℃保存；(10)取容易穗萌的保持系金23B開(kāi)花后12天的未成熟種子滅菌后挑出未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)4天后，取新生愈傷組織直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；
(11)在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織；(12)在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，再生的小苗在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)壯苗后移入人工氣候室盆栽；(13)應(yīng)用Southern分析(提DNA后，用BamHI/KpnI，或BamHI/SacI酶切，再作Southern雜交)，篩選轉(zhuǎn)基因植株；(14)在轉(zhuǎn)基因植株后代中，對(duì)vp752和vp454作正向選擇(Southern)，對(duì)潮霉素抗性基因作負(fù)向選擇(PCR或Southern)，保留僅帶vp752或vp454而不含潮霉素抗性基因的單株；(15)自交純合目標(biāo)單株，進(jìn)行Northern分析，并在開(kāi)花后14天取新鮮種子浸種進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，保留三個(gè)星期內(nèi)不發(fā)芽的單株；(16)轉(zhuǎn)基因的保持系VP752-金23B和VP454金23B與目標(biāo)不育系回交5次，即獲得轉(zhuǎn)基因的抗穗萌的目標(biāo)不育系VP752-金23A和VP454-金23A。
轉(zhuǎn)反義vp1基因的金23A不育系穗萌情況

實(shí)施例2(1)--(3)步同實(shí)施例1(1)--(3)；(4)用BamHI和KpnI的酶切攜帶目標(biāo)VP1序列pGEM-T質(zhì)粒，在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)片斷大小與目標(biāo)片斷大小一致，并回收目標(biāo)片斷；(5)用BamHI和SanI酶片攜帶目標(biāo)片斷的pGEM-T質(zhì)粒(VP1基因的第480個(gè)核苷酸位置含量有一個(gè)SacI酶切位點(diǎn))，在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)片斷大小與目標(biāo)片斷大小(454bp)一致，并回收目標(biāo)片斷vp454；(6)分別用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切具有多酶切位點(diǎn)且已在一個(gè)T-DNA區(qū)中攜帶潮霉素抗性基因，另一個(gè)T-DNA區(qū)內(nèi)已具備玉米泛素啟動(dòng)子ubi和胭脂堿基因終止子NOS的超級(jí)雙元載體PSB130，回收酶切后的載體；(7)將vp752和vp454與回收的載體PSB130連接，獲得下列四種反義構(gòu)建a)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp752——UBI--(RB1)b)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp752——35S--(RB1)c)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp454——UBI--(RB1)d)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp454——35S--(RB1)；(8)將構(gòu)建好的載體在大腸桿菌DH52中擴(kuò)增，分別用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切，并在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)目標(biāo)片斷大小正確；(9)將構(gòu)建好的載體用凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，并在1％甘油中于-70℃保存；
(10)取容易穗萌的保持系岡46B開(kāi)花后15天的未成熟種子滅菌后挑出未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)5天后，取新生愈傷組織直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；(11)在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織；(12)在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，再生的小苗在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)壯苗后移入人工氣候室盆栽；(13)應(yīng)用Southern分析(提DNA后，用BamHI/KpnI，或BamHI/SacI酶切，再作Southern雜交)，篩選轉(zhuǎn)基因植株；(14)在轉(zhuǎn)基因植株后代中，對(duì)vp752、vp454作正向選擇(Southern)，對(duì)潮霉素抗性基因作負(fù)向選擇(PCR或southern)，保留僅帶vp752或vp454而不含潮霉素抗性基因的單株；(15)自交純合目標(biāo)單株，進(jìn)行Northern分析，并在開(kāi)花后15天取新鮮種子浸種進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)(包括對(duì)照)，保留二個(gè)星期內(nèi)不發(fā)芽的單株；(16)轉(zhuǎn)基因的保持系與目標(biāo)不育系岡46A回交5次，即獲得轉(zhuǎn)基因的抗穗萌的目標(biāo)不育系vp752岡46A和vp454岡46A。
轉(zhuǎn)反義vp1基因的岡46A不育系穗萌情況

權(quán)利要求
1.一種水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，包括以下步驟(1)從水稻保持系中應(yīng)用PCR技術(shù)克隆VP1基因的部分片斷；(2)用合適的內(nèi)切酶切出長(zhǎng)度為400-800bp的DNA片斷；(3)用組成型啟動(dòng)子UBI、35S等或胚特異表達(dá)啟動(dòng)子，上述DNA片斷的反義鏈及終止子NOS，構(gòu)成反義的表達(dá)載體；(4)用轉(zhuǎn)基因手段將構(gòu)建的反義載體導(dǎo)入目標(biāo)不育系對(duì)應(yīng)的保持系；(5)用轉(zhuǎn)基因保持系與目標(biāo)不育系回交，獲得轉(zhuǎn)反義VP1基因抗穗萌不育系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，克隆所用的引物為VP1基因第182到934核苷酸的一對(duì)具有BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物R5-TAG GAT CCG TCG TCA ATC GCC-3，F(xiàn)5-ATG GTACCG CAC TCG CAC GGG AACC-3；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，構(gòu)建的反義載體為下列四種a)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp752——UBI--(RB1)b)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp752——35S--(RB1)c)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp454——UBI--(RB1)d)(LB2)--NOS——HYG---35S--(RB2)--(LB1)--NOS——ANTI-vp454——35S--(RB1)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2或者3所述的水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，其特征在于，將構(gòu)建好的載體在大腸桿菌DH52中擴(kuò)增，用BamHI/KpnI和BamHI/SacI酶切，并在0.8％-1.2％瓊脂糖凝膠上電泳分離后，用凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，然后置于0.8％-1.2％甘油中于-70℃保存；再取容易穗萌的保持系開(kāi)花后12-15天的未成熟種子滅菌后挑出未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)4-5天后，取新生愈傷組織直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻抗穗萌雄性不育系的培育方法，該方法的特征是(1)從水稻保持系中利用PCR技術(shù)克隆VP1基因的部分片斷；(2)用內(nèi)切酶切出長(zhǎng)度為400－800bp的DNA片斷；(3)用組成型啟動(dòng)子UBI、35S等或胚特異表達(dá)啟動(dòng)子，上述DNA片斷的反義鏈及終止子NOS，構(gòu)建反義表達(dá)載體；(4)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因手段將構(gòu)建的反義載體導(dǎo)入目標(biāo)不育系對(duì)應(yīng)的保持系；(5)用轉(zhuǎn)基因保持系與目標(biāo)不育系回交，即獲得轉(zhuǎn)反義VP1基因抗穗萌不育系。本發(fā)明方法較化學(xué)藥劑噴法操作方便，不受天氣好壞影響；成本也較低，每畝可降低50－100元；較常規(guī)方法可縮短3－5年。抽穗后30天的穗上發(fā)芽率≤5％。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1510141SQ02139870
公開(kāi)日2004年7月7日 申請(qǐng)日期2002年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月25日
發(fā)明者武小金, 廖翠猛 申請(qǐng)人:袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司