本申請(qǐng)要求2014年5月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)62/005,703的提交日的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式以其全文并入本文。

引言

對(duì)大的完整組織樣品進(jìn)行成像的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是在實(shí)際可行的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行成像過(guò)程。共焦顯微術(shù)受成像速度緩慢困擾，在樣品完全成像之前，也可能由于光致漂白而損害樣品的信號(hào)發(fā)射能力。本領(lǐng)域中需要高速、高分辨率的成像方法和裝置，所述成像方法和裝置可以用于減少較大組織樣品成像所需的時(shí)間量，同時(shí)使光致漂白對(duì)樣品的影響最小化。本發(fā)明解決了這些和其他需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

提供了用于對(duì)大的完整組織樣品進(jìn)行高速、高分辨率成像的方法和裝置。方法各方面包括：將樣品放在光學(xué)均勻樣品操縱組件中；進(jìn)行校準(zhǔn)程序以使光片與檢測(cè)焦平面在所述樣品內(nèi)的多個(gè)位置對(duì)準(zhǔn)；以及對(duì)所述樣品進(jìn)行成像程序以從每個(gè)位置收集圖像。對(duì)所收集的圖像進(jìn)行重建以形成所述樣品的完整三維圖像。還提供了用于實(shí)施所述方法步驟的裝置。

附圖說(shuō)明

結(jié)合附圖來(lái)閱讀以下詳細(xì)描述，從中最佳地理解本發(fā)明。附圖中包括以下附圖：

圖1A示出了經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的光片顯微術(shù)(COLM)的光學(xué)布局。

圖1B，圖片a至d示出了大的完整樣品的光學(xué)均勻樣品安裝框架。

圖1C和1D示出了用于在COLM中同步照明檢測(cè)和自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)參數(shù)校準(zhǔn)的示意圖。全部比例尺：100μm。

圖2，圖片a至d示出了使用COLM而從完整透明的Thy1-eYFP小鼠腦獲取的完整腦體積的內(nèi)部細(xì)節(jié)的再現(xiàn)圖像。

圖3，圖片a至i提供了較大腦體積的各種放大視圖。圖片d至i示出了使用COLM而從完整透明的Thy1-eYFP小鼠腦獲取的50微米厚體積范圍內(nèi)的高分辨率圖像。全部比例尺：100μm。

圖4A至4C示出了使用COLM而進(jìn)行成像的透明完整小鼠腦中的小清蛋白免疫染色的圖像。圖4B中的圖像是使用COLM收集的，而圖4A和圖4C中的圖像是使用共焦顯微術(shù)收集的。所有圖像均表示最大Z投影并且全部比例尺均為100μm。

圖5示出了共焦顯微術(shù)、雙光子顯微術(shù)和光片顯微術(shù)的示意性比較。

圖6示出了控制電子器件框架和COLM零件的示意性概述。

圖7示出了方法的一個(gè)實(shí)施例的方框流程圖。

圖8，圖片a示出了具有兩個(gè)照明光束路徑和兩個(gè)檢測(cè)光束路徑的多平面式COLM的示意性表示。圖片b和c示出了可使用圖片a中所描繪的系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行以實(shí)現(xiàn)更深的成像和增大的成像速度的各種成像方法的示意性表示。

圖9示出了可用于從一個(gè)照明光束路徑生成四個(gè)獨(dú)立光片，因而在包括兩個(gè)照明光束路徑和兩個(gè)同時(shí)成像通路的一個(gè)實(shí)施方案中總共形成八個(gè)獨(dú)立光片的多平面式COLM的示意性表示。

圖10，圖片a示出了圖8(圖片a)中詳述的多平面式COLM系統(tǒng)的物理實(shí)現(xiàn)方式的圖片。圖片b、c和d呈現(xiàn)了使用兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)而獲取的成年小鼠的整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦和脊髓)的示例數(shù)據(jù)集。圖片b是來(lái)自一個(gè)相機(jī)的3D圖像的最大投影，圖片c是來(lái)自另一個(gè)相機(jī)的3D圖像的最大投影，并且d是在將這兩個(gè)投影合并后的最大投影。

圖11示出具有四個(gè)檢測(cè)光束路徑的多平面化COLM系統(tǒng)通過(guò)使用機(jī)動(dòng)化回轉(zhuǎn)鏡(FM)而延伸的示意性表示。通過(guò)使用FM，樣品可從正交視圖進(jìn)行成像，所述正交視圖隨后融合生成各向同性分辨率3D體積數(shù)據(jù)(LS：激光源；Sh：遮板；IFW：照明濾光輪；BE：光束擴(kuò)展器；2DSc：2D檢流計(jì)掃描儀；SL：f-θ掃描透鏡；TL：鏡筒透鏡；FM：機(jī)動(dòng)化回轉(zhuǎn)鏡；Obj：照明物鏡；EFW：發(fā)射濾光輪；以及Cm：sCMOS或CCD相機(jī)。

具體實(shí)施方式

提供了用于對(duì)大的完整組織樣品進(jìn)行高速、高分辨率成像的方法和裝置。方法各方面包括：將樣品放在光學(xué)均勻樣品操縱組件中；進(jìn)行校準(zhǔn)程序以使光片與檢測(cè)焦平面在所述樣品內(nèi)的多個(gè)位置對(duì)準(zhǔn)；以及對(duì)所述樣品進(jìn)行成像程序以從每個(gè)位置收集圖像。對(duì)所收集的圖像進(jìn)行重建以形成所述樣品的三維圖像。還提供了用于實(shí)施所述方法步驟的裝置。

在更詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的特定實(shí)施方案，因?yàn)榇祟?lèi)實(shí)施方案當(dāng)然可變化。也應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并且不旨在進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求限制。

在提供值的范圍的情況下，應(yīng)當(dāng)理解的是，除非上下文另外清楚指示，否則本發(fā)明內(nèi)涵蓋所述范圍的上限與下限之間的各插入值(至下限單位的十分之一)以及在所陳述范圍內(nèi)的任何其他陳述值或插入值。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地被包括在這些較小范圍內(nèi)并且也涵蓋于本發(fā)明內(nèi)，從屬于所述范圍內(nèi)的任何特定排除的限值。如果所述范圍包括限值的一個(gè)或兩個(gè)，則排除這些所包括的限值一者或兩者的范圍也包括在所發(fā)明內(nèi)。

本文中提供的某些范圍中數(shù)值前面有術(shù)語(yǔ)“約”。本文中使用術(shù)語(yǔ)“約”來(lái)準(zhǔn)確地指示它后面的確切數(shù)字以及與此術(shù)語(yǔ)后面的數(shù)字接近或近似的數(shù)字。在確定數(shù)值是接近還是近似具體列舉的數(shù)值時(shí)，接近或近似的未列舉的數(shù)值可以是在其出現(xiàn)的上下文中提供與具體列舉的數(shù)值大致等同的數(shù)值。

除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。雖然類(lèi)似或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用，但現(xiàn)在描述的是有代表性的示例性方法和材料。

本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有公布和專(zhuān)利均以引用的方式并入本文中，就如同各個(gè)別公布或?qū)＠囟ǖ厍覀€(gè)別地被指示為以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文中以公開(kāi)并且描述引用所述公布時(shí)所涉及的方法和/或材料。對(duì)任何公布的引用都是針對(duì)其在申請(qǐng)日之前的公開(kāi)內(nèi)容并且不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明由于先前發(fā)明而無(wú)權(quán)先于所述公布。此外，所提供的公布日期可能不同于可需要獨(dú)立確認(rèn)的實(shí)際公開(kāi)日期。

應(yīng)注意，如本文中和所附權(quán)利要求書(shū)中所用，除非上下文另外清楚指示，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括多個(gè)指示物。還應(yīng)該注意的是，權(quán)利要求可以撰寫(xiě)成排除任何可選的元素。因而，對(duì)于使用如“唯一”、“僅”等與權(quán)利要求書(shū)要素的敘述相關(guān)的排他性術(shù)語(yǔ)或使用“負(fù)面”限制來(lái)說(shuō)，這一陳述意圖起到前提基礎(chǔ)的作用。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開(kāi)時(shí)將明白的是，本文所述且說(shuō)明的各個(gè)個(gè)別實(shí)施方案具有離散組分和特征，這些組分和特征可容易地與任何其它若干實(shí)施方案的特征分離或組合而不偏離本發(fā)明的范圍或精神。任何引述的方法可以引述的事件的順序或以任何其他邏輯上可能的順序?qū)崿F(xiàn)。

在進(jìn)一步更詳細(xì)地描述本發(fā)明的實(shí)施方案的各個(gè)方面時(shí)，首先更詳細(xì)地檢查各種實(shí)施方案的系統(tǒng)和裝置的各個(gè)方面，接著論述根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的方法和套件。

系統(tǒng)

本發(fā)明各方面包括用于對(duì)大的完整組織樣品進(jìn)行成像的系統(tǒng)及其裝置。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)包括一種顯微鏡裝置，所述顯微鏡裝置包括：照明光束路徑，所述照明光束路徑包括光源；檢測(cè)光束路徑，所述檢測(cè)光束路徑包括相機(jī)；光學(xué)均勻樣品操縱組件，所述光學(xué)均勻樣品操縱組件包括樣品室；控制器；處理器；以及計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括指令，所述指令在由所述處理器執(zhí)行時(shí)，導(dǎo)致所述控制器：執(zhí)行校準(zhǔn)程序以獲取關(guān)于放在所述樣品室中的樣品的多個(gè)對(duì)準(zhǔn)參數(shù)；以及執(zhí)行成像程序，所述成像程序使用所述對(duì)準(zhǔn)參數(shù)以生成所述樣品的三維圖像?，F(xiàn)在進(jìn)一步更詳細(xì)地描述這些組件中的每一者。

如上概述，本發(fā)明各方面包括多個(gè)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括照明光束路徑。照明光束路徑組件是本領(lǐng)域眾所周知的并且并不在本文詳細(xì)描述。在一些實(shí)施方案中，照明光束路徑組件可包括準(zhǔn)直儀、遮板、照明濾光輪、光束擴(kuò)展器、二維掃描儀、掃描透鏡、鏡筒透鏡、一個(gè)或多個(gè)鏡子和光源，如以下進(jìn)一步描述。在本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置中，可以按照合適的方式使用這些組件中的任一者或它們的組合或安排。

在一些實(shí)施方案中，照明光束路徑包括柱面透鏡，所述柱面透鏡被配置成生成靜態(tài)光片。在一些實(shí)施方案中，照明光束路徑包括檢流計(jì)掃描儀/f-θ透鏡，所述檢流計(jì)掃描儀/f-θ透鏡被配置成利用高斯或貝塞爾光束形成動(dòng)態(tài)光片。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可包括兩個(gè)照明光束路徑，其中所述照明光束路徑被配置成從樣品的對(duì)面的或相對(duì)的側(cè)照明樣品。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可被配置成從單個(gè)照明光束路徑生成多個(gè)光片，諸如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)光片。在某些實(shí)施方案中，光片可以獨(dú)立地操縱以照明樣品的所需部分。在一些實(shí)施方案中，可以使用兩個(gè)或更多個(gè)光片來(lái)以協(xié)調(diào)的方式照明樣品的一部分，以使得第一光片照明樣品的第一部分并且第二光片照明樣品的第二部分，其中所述樣品的第一部分不同于所述樣品的第二部分。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)光片可以用于照明樣品的一部分，例如，高達(dá)三個(gè)或更多個(gè)，諸如四個(gè)或更多個(gè)，諸如五個(gè)或更多個(gè)，諸如六個(gè)或更多個(gè)，諸如七個(gè)或更多個(gè)，諸如八個(gè)或更多個(gè)光片可以用于以協(xié)調(diào)的方式照明樣品的一部分。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)光片均可獨(dú)立地操縱以照明樣品的給定部分。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)光片可按照協(xié)調(diào)的方式來(lái)操縱以根據(jù)本文進(jìn)一步描述的方法來(lái)完成樣品成像。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以包括兩個(gè)照明光束路徑。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)照明光束路徑可用于從相對(duì)的側(cè)照明樣品，由此允許從一側(cè)對(duì)樣品的一半進(jìn)行成像，并且從另一側(cè)對(duì)樣品的另一半進(jìn)行成像。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的照明光束路徑還可包括各種光源，所述光源被配置成生成在可見(jiàn)光譜中、波長(zhǎng)范圍為390nm至700nm的光或在紅外光譜中、波長(zhǎng)范圍為子區(qū)間700-1500的光。在一些實(shí)施方案中，光源可包括激光。在一些實(shí)施方案中，光源(諸如激光光源)被配置成發(fā)射波長(zhǎng)為例如405nm、488nm、514nm、561nm、594nm或647nm的光。多種合適光源中的任一種可用于本發(fā)明的系統(tǒng)。

如以上概述，本發(fā)明各方面包括多個(gè)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括檢測(cè)光束路徑。檢測(cè)光束路徑組件是本領(lǐng)域眾所周知的并且并不在本文進(jìn)行詳細(xì)描述。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)光束路徑組件包括相機(jī)、鏡筒透鏡、發(fā)射濾光輪和檢測(cè)物鏡。在本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置中，可以按照合適的方式使用這些組件中的任一個(gè)或它們的組合或安排。

在一些實(shí)施方案中，相機(jī)為CCD相機(jī)或科學(xué)CMOS相機(jī)(sCMOS)，其提供極低噪音、快速幀率、寬動(dòng)態(tài)范圍、高量子效率(QE)、高分辨率和大視場(chǎng)。此類(lèi)相機(jī)可從科學(xué)技術(shù)供應(yīng)商處商購(gòu)獲得。

在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡被配置成具有一定折射率(RI)，所述折射率與進(jìn)行成像的樣品的RI匹配。例如，在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡可以是25X、10X或4X檢測(cè)物鏡，其RI與進(jìn)行成像分析的浸液和/或組織樣品的RI匹配。

在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡可以是低數(shù)值孔徑檢測(cè)物鏡。物鏡的數(shù)值孔徑描述了可由物鏡收集的所發(fā)射光信號(hào)(例如，熒光信號(hào))的數(shù)量以及可實(shí)現(xiàn)的衍射極限分辨率。較高的數(shù)值孔徑根據(jù)由阿貝衍射極限(λ/2NA)所限定的關(guān)系而以波長(zhǎng)依賴(lài)方式轉(zhuǎn)化為改進(jìn)的分辨率。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡的數(shù)值孔徑范圍為0.1至1.4，諸如0.6至1.0。

在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡具有工作距離(WD)，所述工作距離為焦平面(或成像平面)與物鏡物理邊緣之間的距離。因此，檢測(cè)物鏡的WD確定了在樣品與物鏡之間無(wú)物理接觸的情況下，樣品成像可以進(jìn)行的深度。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡的WD在0.1至100mm的范圍內(nèi)，諸如6mm至8mm。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)可包括兩個(gè)檢測(cè)光束路徑。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)檢測(cè)光束路徑可用于從相對(duì)側(cè)來(lái)對(duì)樣品同步成像，由此允許從一側(cè)對(duì)樣品的一半進(jìn)行成像，并且從另一側(cè)對(duì)樣品的另一半進(jìn)行成像。這個(gè)實(shí)施例使得可進(jìn)行成像的樣品尺寸增加兩倍，因?yàn)檫@兩個(gè)物鏡的組合的總體工作距離通過(guò)第二檢測(cè)光束路徑中的第二物鏡的添加而增加兩倍。

如以上概述，本發(fā)明各方面包括光學(xué)均勻樣品操縱組件，所述光學(xué)均勻樣品操縱組件被配置成在光學(xué)均勻環(huán)境中包含樣品?！肮鈱W(xué)均勻”是指所述環(huán)境中各種材料的折射率(RI)相匹配或類(lèi)似，以使得行進(jìn)通過(guò)光學(xué)均勻環(huán)境的光束由于穿過(guò)其中行進(jìn)的材料的RI的任何變化而受到非實(shí)質(zhì)性的影響。

在一些實(shí)施方案中，光學(xué)均勻樣品操縱組件包括將樣品室限定為具有打開(kāi)頂部的箱形的底部或基底以及外壁。在一些實(shí)施方案中，將透鏡從一個(gè)或多個(gè)照明光束路徑設(shè)置在外壁的一部分之上或之中，以使得從照明光束路徑發(fā)出的光通過(guò)透明窗直接進(jìn)入樣品室的內(nèi)部部分中。在一些實(shí)施方案中，透明窗由與光學(xué)均勻環(huán)境的RI匹配的材料制成。在一些實(shí)施方案中，透明窗由例如石英蓋玻片制成。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)光束路徑的檢測(cè)物鏡被設(shè)置在外壁的一部分之上或之中。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)物鏡相對(duì)于照明光束路徑來(lái)說(shuō)以正交關(guān)系定位(例如，相對(duì)于照明光束路徑來(lái)說(shuō)以90°的角度定位)。

在一些實(shí)施方案中，光學(xué)均勻樣品操縱組件包括xyz-θ樣品安裝件，所述xyz-θ樣品安裝件被配置成使樣品在多個(gè)方向中的任一方向上移動(dòng)，包括x、y和z方向以及角度或旋轉(zhuǎn)方向。在一些實(shí)施方案中，xyz-θ臺(tái)安裝件具有較大行程范圍并且被配置成在x、y和z方向中的每一方向上移動(dòng)至少45mm。在一些實(shí)施方案中，xyz-θ臺(tái)安裝件被配置成使樣品在角度或θ方向上旋轉(zhuǎn)完整360°。這樣的xyz-θ樣品安裝件可從科學(xué)技術(shù)供應(yīng)商處商購(gòu)獲得。

在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)的光學(xué)器件被配置成相對(duì)于所述樣品移動(dòng)，而在一些實(shí)施方案中，樣品操縱組件被配置成使所述樣品相對(duì)于所述系統(tǒng)的光學(xué)器件來(lái)移動(dòng)。光學(xué)器件或樣品操縱組件可例如按照循序漸進(jìn)的方式或按照連續(xù)的方式來(lái)移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，光學(xué)器件或樣品操縱組件可按照同步方式移動(dòng)，而在某些實(shí)施方案中，光學(xué)器件或樣品操縱組件可按照非同步方式移動(dòng)。

在一些實(shí)施方案中，光學(xué)均勻樣品操縱組件的樣品室用溶液填充。在一些實(shí)施方案中，所述溶液的RI與檢測(cè)光束路徑的檢測(cè)物鏡的樣品的RI匹配。例如，在一些實(shí)施方案中，用于填充樣品室的溶液為FocusClear或MountClear(均可從CelExplorer實(shí)驗(yàn)室商購(gòu)獲得)。在一些實(shí)施方案中，用于填充所述室的溶液為折射率范圍為1.42一直到1.46諸如1.45的液體。在一些實(shí)施方案中，用于填充樣品室的溶液為87％甘油。具有所需折射率范圍的溶液可從供應(yīng)商諸如Cargille實(shí)驗(yàn)室處商購(gòu)獲得。

在一些實(shí)施方案中，光學(xué)均勻樣品操縱組件的樣品室包括較小內(nèi)室，所述較小內(nèi)室的體積小于較大外部樣品室的體積。例如，在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)室為被配置成容納用于進(jìn)行分析的樣品的吸收池。在某些實(shí)施方案中，由熔融石英制成的吸收池用作內(nèi)室。在一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)室如上所述用溶液填充，所述溶液的RI與檢測(cè)光束路徑的檢測(cè)物鏡的樣品的RI匹配。例如，在一些實(shí)施方案中，用于填充內(nèi)室的溶液為FocusClear或MountClear(均可從CelExplorer實(shí)驗(yàn)室商購(gòu)獲得)。在一些實(shí)施方案中，用于填充內(nèi)室的溶液為RI1.454，可從供應(yīng)商諸如Cargille實(shí)驗(yàn)室處商購(gòu)獲得。在一些實(shí)施方案中，用于填充內(nèi)室的溶液為87％甘油。在某些實(shí)施方案中，第一溶液可用于填充內(nèi)室，并且另一種不同的溶液可以用于填充較大外室。例如，在一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)室用FocusClear填充，而所述外室用RI 1.454溶液或87％甘油溶液填充。

如以上概述，本發(fā)明各方面包括控制器、處理器和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，它們被配置或適配成控制或操作本發(fā)明的系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組件。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包括控制器，所述控制器如本文所述與所述系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組件通信，并且被配置成控制所述系統(tǒng)的各方面和/或執(zhí)行本發(fā)明的系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)功能或操作。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包括處理器和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，它們可以包括存儲(chǔ)器介質(zhì)和/或存儲(chǔ)介質(zhì)。在計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器上作為計(jì)算機(jī)可讀指令來(lái)實(shí)施的應(yīng)用程序和/或操作系統(tǒng)可由處理器執(zhí)行以提供本文所述功能的一些或全部。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包括用戶接口諸如圖形用戶接口(GUI)，所述用戶接口被適配或配置成從用戶接收輸入并且如本文所述執(zhí)行所述方法中的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，GUI被配置成向用戶顯示數(shù)據(jù)或信息。

現(xiàn)在參照?qǐng)D1A，描繪了顯微鏡裝置的一個(gè)實(shí)施方案。所描繪的顯微鏡裝置包括第一和第二照明光束路徑，其中每個(gè)照明光束路徑均包括準(zhǔn)直儀、遮板、照明濾光輪、光束擴(kuò)展器、二維檢流計(jì)掃描儀、掃描透鏡(或f-θ透鏡)、鏡筒透鏡、鏡子和照明物鏡。所描繪的顯微鏡裝置還包括檢測(cè)光束路徑，所述檢測(cè)光束路徑包括sCMOS相機(jī)、鏡筒透鏡、發(fā)射濾光輪和定位在光學(xué)均勻樣品操縱組件內(nèi)的檢測(cè)物鏡。

現(xiàn)在參照?qǐng)D1B，描繪了光學(xué)均勻樣品操縱組件的各種組件。圖片a示出了可充當(dāng)內(nèi)部樣品室的石英吸收池。圖片b示出了定位在樣品室基底的xyz-θ樣品安裝臺(tái)。還示出了檢測(cè)光束路徑的檢測(cè)物鏡和兩個(gè)照明光束路徑的透鏡。圖片c示出了放在樣品室內(nèi)以形成內(nèi)部樣品室的吸收池。圖片d示出了用RI 1.454液體填充的樣品室。

現(xiàn)在參照?qǐng)D6，示出了控制電子器件框架和COLM零件的示意性概述。如圖所示，控制計(jì)算機(jī)或處理器與所述系統(tǒng)的各種組件(包括例如，檢測(cè)光束路徑中的sCMOS相機(jī)、照明光束路徑中的激光控制器和各種附接組件)通信。

現(xiàn)在參照?qǐng)D8(圖片a)，示出了多平面式COLM系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案。如圖所示，所述系統(tǒng)包括兩個(gè)照明光束路徑和兩個(gè)檢測(cè)光束路徑。照明光束路徑被配置成從相對(duì)側(cè)照明樣品，并且檢測(cè)光束路徑被配置成從相對(duì)側(cè)對(duì)樣品進(jìn)行成像。通過(guò)對(duì)兩個(gè)檢測(cè)臂在逐行讀出方向上彼此略微偏離(約100微米就足夠了，如圖8(圖片c)所示)進(jìn)行操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)平面的同時(shí)成像。

現(xiàn)在參照?qǐng)D9，示出了多平面式COLM系統(tǒng)的照明光束路徑的一個(gè)實(shí)施方案。如圖所示，照明光束路徑包括被配置成生成多個(gè)獨(dú)立光片的多種組件。確切地，所描繪的實(shí)施方案被配置成生成四個(gè)獨(dú)立光片。應(yīng)當(dāng)指出的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可選擇各種組件以便生成用于本發(fā)明的方法的不同數(shù)量的獨(dú)立光片，如本文進(jìn)一步描述。

現(xiàn)在參照?qǐng)D11，可以通過(guò)使用機(jī)動(dòng)化回轉(zhuǎn)鏡以將照明光束重定向到兩個(gè)不同配置來(lái)使兩個(gè)檢測(cè)路徑擴(kuò)展為四個(gè)檢測(cè)路徑，所述不同配置允許通過(guò)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)臂對(duì)進(jìn)行成像。

方法

本發(fā)明各方面包括可用于對(duì)大的完整組織樣品進(jìn)行成像的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及：將樣品放在光學(xué)均勻樣品操縱組件的樣品室中；執(zhí)行校準(zhǔn)程序以使光片與顯微鏡裝置的檢測(cè)焦平面在所述樣品內(nèi)的多個(gè)位置處對(duì)準(zhǔn)以獲取關(guān)于每個(gè)位置的對(duì)準(zhǔn)參數(shù)；執(zhí)行成像程序以從所述樣品內(nèi)的多個(gè)位置中的每個(gè)位置收集圖像；以及使用每個(gè)位置的圖像來(lái)構(gòu)造所述樣品的三維圖像。現(xiàn)在將在下文進(jìn)一步更詳細(xì)地描述方法各方面。

如上所述，方法各方面涉及將樣品放在光學(xué)均勻樣品操縱組件中。在一些實(shí)施方案中，將樣品放在樣品安裝臺(tái)上，諸如被配置成使樣品在任何方向上移動(dòng)的xyz-θ樣品安裝臺(tái)。在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及：將樣品放在光學(xué)均勻樣品操縱組件的樣品室中；以及將所述樣品用溶液填充，所述溶液的折射率(RI)與所述樣品的折射率匹配。在一些實(shí)施方案中，在執(zhí)行本文所述的成像分析之前，可以準(zhǔn)備樣品以進(jìn)行顯微鏡分析。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)以下操作來(lái)制備樣品：將所述樣品利用多個(gè)水凝膠子單元固定；聚合所述水凝膠子單元以形成水凝膠包埋樣品；以及清理所述水凝膠包埋樣品。在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US2013/031066中進(jìn)一步描述了制備方法，所述專(zhuān)利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式以其全文并入本文。

方法各方面涉及執(zhí)行校準(zhǔn)程序，所述校準(zhǔn)程序用于使顯微鏡裝置的檢測(cè)焦平面與所述樣品的利用光片來(lái)照明的照明平面對(duì)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，所述校準(zhǔn)程序涉及指定所述樣品在所述z方向上的開(kāi)始位置和結(jié)束位置。在某些實(shí)施方案中，所述校準(zhǔn)程序涉及指定用于將所述樣品在所述z方向上劃分成多個(gè)平面的z步進(jìn)值，其中每個(gè)平面均表示所述樣品的二維區(qū)段或部分。在一些實(shí)施方案中，所述z步進(jìn)值的范圍為0.1μm至1mm，諸如1μm至5μm。

在一些實(shí)施方案中，所述校準(zhǔn)程序涉及將樣品以數(shù)學(xué)方式劃分成多個(gè)拼貼?！捌促N”是指樣品的離散部分的圖像。當(dāng)顯微鏡物鏡的視場(chǎng)小于樣品本身時(shí)，可能有必要在傾斜布置中收集多個(gè)圖像層疊件，并且隨后將這些拼貼縫合在一起以生成完整圖像。在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及：定義將限定拼貼數(shù)量的區(qū)域的兩個(gè)相對(duì)拐角的坐標(biāo)；以及設(shè)置用于收集拼貼圖像層疊件的所需z步進(jìn)值。在一些實(shí)施方案中，將區(qū)域選擇作為彼此重疊范圍為10％至50％，諸如15％至20％的拼貼。

校準(zhǔn)程序各方面涉及獲取關(guān)于樣品內(nèi)的多個(gè)位置中的每一者的對(duì)準(zhǔn)參數(shù)。為了獲取每個(gè)位置處的對(duì)準(zhǔn)參數(shù)，使用通過(guò)在一個(gè)維度上移動(dòng)光束而產(chǎn)生的光片來(lái)照明樣品平面。所述樣品的由光片照明的平面在本文稱(chēng)為“樣品照明平面”或“照明平面”。通過(guò)在指定附近找到與樣品照明平面與檢測(cè)焦平面之間的最優(yōu)對(duì)準(zhǔn)相對(duì)應(yīng)的最大圖像質(zhì)量測(cè)量值完成顯微鏡的檢測(cè)焦平面與樣品照明平面之間的對(duì)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，圖像質(zhì)量測(cè)量為光焦點(diǎn)質(zhì)量測(cè)量，所述光焦點(diǎn)質(zhì)量測(cè)量包括傅里葉空間中的高頻信號(hào)與低頻信號(hào)的比。

所述校準(zhǔn)程序產(chǎn)生與樣品內(nèi)的不同位置相對(duì)應(yīng)的多個(gè)對(duì)準(zhǔn)參數(shù)。通過(guò)在樣品內(nèi)的給定位置應(yīng)用對(duì)準(zhǔn)參數(shù)，在所述位置實(shí)現(xiàn)顯微鏡裝置的檢測(cè)焦平面與光片之間的最優(yōu)對(duì)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，z步進(jìn)值(1mm)用于執(zhí)行校準(zhǔn)程序，并且樣品內(nèi)的兩個(gè)相鄰位置之間的線性插值用于確定所述兩個(gè)相鄰位置之間的某個(gè)位置處的對(duì)準(zhǔn)參數(shù)。這樣一來(lái)，可使用z步進(jìn)值(1mm)來(lái)執(zhí)行校準(zhǔn)程序，并且可以將這些結(jié)果應(yīng)用于整個(gè)樣品以確定任何位置處的對(duì)準(zhǔn)參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，校準(zhǔn)程序自動(dòng)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，處理器執(zhí)行多個(gè)指令，所述指令導(dǎo)致控制器執(zhí)行所述校準(zhǔn)程序并且獲取樣品的多個(gè)對(duì)準(zhǔn)參數(shù)。

如上所述，方法各方面包括執(zhí)行成像程序，所述成像程序使用對(duì)準(zhǔn)參數(shù)以使顯微鏡裝置的檢測(cè)焦平面與樣品的照明平面對(duì)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，所述成像程序涉及：使顯微鏡裝置的檢測(cè)焦平面與樣品的照明平面對(duì)準(zhǔn)；利用來(lái)自光源的光束來(lái)照明照明平面的線性部分；以及利用相機(jī)來(lái)從所述照明平面的所照明的線性部分獲取多個(gè)所發(fā)射的光信號(hào)。在某些實(shí)施方案中，顯微鏡裝置的檢測(cè)焦平面與樣品的照明平面的對(duì)準(zhǔn)同步，以使得在檢測(cè)焦平面與照明平面對(duì)準(zhǔn)的同時(shí)，實(shí)施照明平面的照明。這樣一來(lái)，僅僅樣品的正主動(dòng)成像的部分被照明，由此使得樣品中的信號(hào)的可能由于過(guò)度照明而引起光致漂白減少。

在一些實(shí)施方案中，成像程序涉及將來(lái)自光源的光束定向成掃過(guò)照明平面并且由此照明所述照明平面的多個(gè)線性部分。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)光束掃過(guò)照明平面時(shí)，從照明平面的每個(gè)不同線性部分發(fā)出的多個(gè)光信號(hào)被相機(jī)捕獲，從而產(chǎn)生樣品的與照明平面一致的二維圖像。在一些實(shí)施方案中，樣品的照明平面受到照明的時(shí)間段范圍為1毫秒(ms)至1秒，諸如5ms至100ms。

在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及將多個(gè)獨(dú)立光片定向?yàn)檎彰鳂悠返牟煌糠?。例如，在一些?shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)光片用于從樣品的相對(duì)側(cè)照明樣品。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)光片用于照明樣品，諸如兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)或多達(dá)八個(gè)或更多個(gè)光片。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)光片用于通過(guò)使光片從一個(gè)位置到另一個(gè)位置快速移動(dòng)或“切換”而照明樣品的兩個(gè)或更多個(gè)不同部分。

在一些實(shí)施方案中，照明程序進(jìn)一步涉及使樣品在z方向上移動(dòng)，以使得光片照明新的照明平面，并且重復(fù)成像程序以生成樣品與新照明平面一致的另一二維圖像。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)光片和檢測(cè)物鏡移動(dòng)以對(duì)新照明平面進(jìn)行成像時(shí)，樣品保持靜止。在一些實(shí)施方案中，成像程序涉及使用于照明樣品的光學(xué)器件(例如，照明光束路徑中的物鏡)和光片同時(shí)移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，成像程序涉及通過(guò)樣品操縱組件來(lái)使樣品以所定義速率連續(xù)地移動(dòng)，以使得檢測(cè)光束路徑中的相機(jī)在樣品的各個(gè)平面受到照明時(shí)，對(duì)所述平面連續(xù)地進(jìn)行成像。上述方法中的任一種可以相對(duì)于任何給定光片來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣，在COLM系統(tǒng)中使用多個(gè)光片可用于增大具體樣品的成像程序的總體速度并且增大可使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法進(jìn)行成像的樣品的尺寸。

在一些實(shí)施方案中，照明程序產(chǎn)生樣品的多個(gè)二維圖像，各自與樣品的一個(gè)不同照明平面相對(duì)應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，成像程序自動(dòng)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，處理器執(zhí)行多個(gè)指令，所述指令導(dǎo)致控制器執(zhí)行所述成像程序并且獲取樣品的多個(gè)二維圖像，各自與樣品的一個(gè)不同照明平面相對(duì)應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，成像程序進(jìn)一步涉及多個(gè)二維圖像的數(shù)據(jù)處理以形成樣品的三維圖像。在一些實(shí)施方案中，可將樣品的兩個(gè)或更多個(gè)不同的二維圖像組合或“縫合”在一起以形成樣品平面的單個(gè)二維圖像。例如，如上所述，當(dāng)樣品使用兩個(gè)或更多個(gè)不同的獨(dú)立光片進(jìn)行成像時(shí)，從每個(gè)光片獲得的圖像可以組合起來(lái)以形成與樣品的給定平面相對(duì)應(yīng)的單個(gè)二維圖。

三維重建軟件是可商購(gòu)獲得的，并且可用于將拼貼圖像縫合在一起和/或?qū)⒍鄠€(gè)二維圖像重建為一個(gè)三維圖像。可商購(gòu)軟件程序包括來(lái)自Imaris、Bitplane和Amira的軟件程序以及開(kāi)源軟件諸如Fiji、XuvTools、Vaa3D plugin和TeraStitcher中的縫合插件。在一些實(shí)施方案中，可使用商業(yè)軟件諸如Imaris和Amira中的具體模塊或者利用開(kāi)源工具諸如Neuromantic來(lái)在包含神經(jīng)組織的樣品中進(jìn)行神經(jīng)元形態(tài)的手動(dòng)或半自動(dòng)跟蹤。

現(xiàn)在參照?qǐng)D7，示出了方法的一個(gè)實(shí)施方案的方框流程圖。在所示實(shí)施方案中，所述方法包括：將樣品放在光學(xué)均勻樣品操縱組件中；對(duì)所述樣品執(zhí)行校準(zhǔn)程序以獲取多個(gè)對(duì)準(zhǔn)參數(shù)；使用所述對(duì)準(zhǔn)參數(shù)來(lái)對(duì)所述樣品執(zhí)行成像程序；以及使用在成像程序期間所獲取的圖像來(lái)構(gòu)建整個(gè)樣品的三維圖像。

現(xiàn)在參照?qǐng)D8(圖片b)示出了一種用于獲得大的完整樣品的高質(zhì)量深度圖像的方法的一個(gè)實(shí)施方案。如圖所示，兩個(gè)獨(dú)立平面是從相對(duì)的檢測(cè)臂同時(shí)或連續(xù)成像的，所述兩個(gè)獨(dú)立平面利用兩個(gè)對(duì)準(zhǔn)的光片來(lái)照明(其中每側(cè)一個(gè)光束，照明兩個(gè)不同的平面；或者每側(cè)兩個(gè)光束，其中來(lái)自每個(gè)平面?zhèn)鹊囊粋€(gè)光束照明相同的平面并且剩下的一個(gè)光束照明另一平面)。由每個(gè)光片生成樣品的二維圖像。圖片b展示出由兩個(gè)相對(duì)檢測(cè)臂進(jìn)行成像的同一平面的圖像。所述檢測(cè)臂可以精確地對(duì)準(zhǔn)(例如，通過(guò)亞微米精度)。圖片b展示從略微失準(zhǔn)壁獲得的圖像，以及在X或Y方向上可以疊加的較小校正?？墒褂眠@種方法對(duì)較大樣品進(jìn)行成像，因?yàn)檫@兩個(gè)物鏡的組合的總體工作距離通過(guò)第二檢測(cè)光束路徑中的第二物鏡的添加而增大兩倍。

現(xiàn)在參照?qǐng)D8(圖片c)示出了增大成像速度的各種方法。如圖所示，光片的較快切換可用于照明兩個(gè)獨(dú)立平面，這用于增大總體成像速度。類(lèi)似地，同時(shí)多平面化成像也可用于增大成像過(guò)程的總體速度。不間斷樣品成像，其中多個(gè)光片連續(xù)地移動(dòng)穿過(guò)樣品或樣品連續(xù)地移動(dòng)穿過(guò)多個(gè)光片同時(shí)連續(xù)地獲取圖像也可用于增大成像過(guò)程的總體速度。另外，步進(jìn)式光學(xué)z掃描可通過(guò)多個(gè)光片來(lái)使用以便對(duì)樣品的不同光學(xué)平面連續(xù)地進(jìn)行成像。單向和雙向同步照明和檢測(cè)也可用于增大成像過(guò)程的總體速度。在雙向同步照明和檢測(cè)中，兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立光片用于照明樣品的不同部分并對(duì)其進(jìn)行成像，如圖8(圖片c)所示。在不同方向上移動(dòng)的多個(gè)光片的使用會(huì)增大成像過(guò)程的總體速度。

現(xiàn)在參照?qǐng)D11，示出了一種增大軸向(z分辨率)的方法。通過(guò)從四個(gè)獨(dú)立的、正交設(shè)置的信號(hào)檢測(cè)臂對(duì)樣品進(jìn)行成像，從四個(gè)正交視圖獲取3D圖像。通過(guò)融合這四個(gè)圖，實(shí)現(xiàn)了軸向分辨率(z-分辨率)的改進(jìn)。圖11示出了兩個(gè)可自動(dòng)切換配置，其中樣品為通過(guò)一組兩個(gè)檢測(cè)臂，并且隨后通過(guò)檢測(cè)臂的正交布置部件而獲得的第一圖像。所述切換使用快速、精確的回轉(zhuǎn)鏡來(lái)執(zhí)行，這反映了激發(fā)光或允許所述激發(fā)光通過(guò)而不受阻礙。

應(yīng)用

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)來(lái)對(duì)任何生物組織進(jìn)行成像。方法和系統(tǒng)可用于對(duì)來(lái)自任何植物或動(dòng)物的試樣進(jìn)行成像，例如脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物，例如昆蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)、爪蟾、斑馬魚(yú)、哺乳動(dòng)物，例如馬、牛、羊、犬、貓、鼠科動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或人類(lèi)。所述試樣可具有任何組織類(lèi)型，例如造血組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織(中樞或外圍)、神經(jīng)膠質(zhì)組織、間質(zhì)組織、皮膚組織、粘膜組織、基質(zhì)組織、肌肉組織(心肌、骨骼肌或平滑肌)、脾臟組織、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織、上皮組織、內(nèi)皮組織、肝組織、腎組織、胰腺組織、胃腸道組織、肺組織、成纖維細(xì)胞組織和其他細(xì)胞類(lèi)型。在一些情況下，試樣為有機(jī)體，例如，蠕蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、斑馬魚(yú)或發(fā)育胚胎。在其他情況下，試樣為完整器官，例如，嚙齒動(dòng)物的全腦。在其他情況下，試樣為器官的一部分，即，活體組織切片，例如移植組織的活體組織切片。所述試樣可以進(jìn)行新鮮分離或保存，例如，急速冷凍。所述試樣可具有“正常”病理學(xué)，或可顯示異?；蚣膊∮嘘P(guān)病理學(xué)的癥狀。此類(lèi)試樣的示例包括從腫瘤或腫瘤相關(guān)組織、病變組織等獲得的那些試樣。這樣，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于組織試樣的病理學(xué)分析。

本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以結(jié)合制備微生物試樣的技術(shù)一起用于顯微鏡分析。在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及通過(guò)以下操作來(lái)制備進(jìn)行本發(fā)明的成像分析的樣品：將樣品利用多個(gè)水凝膠子單元來(lái)固定；聚合所述水凝膠子單元以形成水凝膠包埋樣品；以及清洗所述水凝膠包埋樣品?？稍趪?guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US2013/031066中找出關(guān)于制備顯微鏡分析所用試樣的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，所述專(zhuān)利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式以其全文并入本文。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“清晰度”指的是如PCT/US2013/031066中所公開(kāi)的一種制備分析用生物試樣的方法。

本發(fā)明的方法和系統(tǒng)具有多種用途。例如，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的連接性研究。如本文所使用的“連接性”一般是指：神經(jīng)元之間的連接，包括單細(xì)胞水平上的連接(例如，突觸、軸突末端、樹(shù)突棘等)；以及神經(jīng)元組與CNS區(qū)域之間的連接，作為主要軸突束，例如，胼胝體(CC)、前連合(AC)、海馬連合(HC)、錐體交叉、錐體束、外囊、內(nèi)囊(IC)、大腦腳(CP)等。全腦和/或脊髓試樣或其區(qū)域(例如，大腦(即，大腦皮層)、小腦(即，小腦皮質(zhì))、前腦腹側(cè)區(qū)(例如，紋狀體、尾狀核、殼核、蒼白球、伏隔核；隔核、丘腦底核)；丘腦和下丘腦的區(qū)域和核；深部小腦的區(qū)域和核(例如，齒狀核、球狀核、栓狀核、頂核)和腦干的區(qū)域和核(例如，黑質(zhì)、紅核、腦橋、橄欖核、腦神經(jīng)核)；以及脊柱區(qū)域(例如，前角、側(cè)角、后角))可以在死后之別并且可以使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)(例如，所獲得的、所存儲(chǔ)的、所再現(xiàn)的、所使用的和所致動(dòng)的)來(lái)對(duì)其中的神經(jīng)元的連接性進(jìn)行顯微鏡分析(例如)以便提供腦(例如，人腦)在死后的完全連接性。這樣的研究極大地有助于理解大腦是如何發(fā)展的以及在健康和疾病過(guò)程中如何作用并且有助于理解認(rèn)知和人格的基礎(chǔ)。

再例如，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于診斷或監(jiān)測(cè)疾病。如本文所使用的“診斷”一般包括：受試者對(duì)于疾病或疾患的易感性的預(yù)測(cè)；關(guān)于受試者目前是否受到疾病或疾患影響的確定；受到疾病或疾患影響的受試者的預(yù)后(例如，癌變狀態(tài)的識(shí)別、癌癥階段、患者死于癌癥的可能性)；受試者對(duì)疾病或疾患治療的反應(yīng)性的預(yù)測(cè)(例如，對(duì)于例如異基因造血干細(xì)胞移植、化學(xué)治療、放射治療、抗體治療、小分子化合物治療的肯定響應(yīng)、否定響應(yīng)、根本無(wú)響應(yīng))；以及療法的使用(例如，檢測(cè)受試者的病況以提供關(guān)于治療效果或效力的信息)。例如，活體組織檢查可根據(jù)癌組織來(lái)準(zhǔn)備并且使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進(jìn)行顯微鏡分析以確定癌癥的類(lèi)型、癌癥發(fā)展的程度、癌癥是否對(duì)治療性干預(yù)作出響應(yīng)等。再例如，活體組織檢查可根據(jù)病變組織(例如，腎、胰腺、胃等)來(lái)準(zhǔn)備并且使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進(jìn)行成像以確定組織的病況、疾病發(fā)展的程度、治療成功的可能性等。術(shù)語(yǔ)“治療(treatment/treating)”等在本文一般是指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理效應(yīng)。所述效果在完全或部分防止疾病或癥狀方面可以是預(yù)防性的和/或在完全或部分治愈疾病和/或由疾病引起的副作用方面可以是治療性的。如本文所使用的“治療”涵蓋對(duì)哺乳動(dòng)物的任何疾病治療，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未診斷為患有疾病的受試者發(fā)生疾??；(b)抑制疾病，即攔阻疾病的發(fā)展；或(c)緩解疾病，即導(dǎo)致疾病消退?？梢栽诩膊』驌p傷開(kāi)始之前、期間或之后施用治療劑。在治療使不期望的患者臨床癥狀穩(wěn)定或減少的情況下，持續(xù)疾病的治療特別引人關(guān)注。所希望的是，在受影響組織的功能完全損失之前，執(zhí)行這種治療。所希望的是，本發(fā)明的治療在疾病癥狀期被施用，并且在某些情況下，在疾病癥狀期之后被施用。術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“受試者”、“宿主”和“患者”在本文可互換使用并且指的是需要診斷、治療或療法的任何哺乳動(dòng)物受試者。

類(lèi)似地，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于監(jiān)測(cè)組織移植物以確定受試者對(duì)移植器官/組織諸如心臟、腎臟、肝臟或其他器官的接受程度。在這樣的情況下，移植器官的活體組織檢查可以使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進(jìn)行顯微鏡分析以尋求例如組織完整性、組織血管化、免疫細(xì)胞的滲透等。

本發(fā)明的方法和系統(tǒng)還提供一種可用于針對(duì)它們對(duì)組織或疾病的效果而選擇候選治療劑的系統(tǒng)。例如，受試者例如小鼠、大鼠、狗、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、人類(lèi)等可與候選試劑接觸，可制備器官或其活體組織切片，并且可使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)對(duì)所制備的試樣進(jìn)行顯微鏡分析以尋求一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或組織參數(shù)。參數(shù)為細(xì)胞或組織的可量化組分，具體來(lái)說(shuō)，可在高吞吐量系統(tǒng)中根據(jù)需要精確地測(cè)量的組分。參數(shù)可以是任何細(xì)胞組分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或它們的構(gòu)象或轉(zhuǎn)譯后修飾、脂質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、核酸，例如，mRNA、DNA等或源自細(xì)胞組分或其組合的一部分。雖然大多數(shù)參數(shù)提供定量讀出，但在某些情況下，半定量或定性結(jié)果將是可以接受的。讀出可以包括單個(gè)確定值，或可以包括平均值、中值或方差等。典型地，從大量同樣的分析中獲得關(guān)于每個(gè)參數(shù)的參數(shù)讀出值的范圍?？勺冃允撬谕牟⑶彝ㄟ^(guò)利用一種用于提供單個(gè)值的常見(jiàn)統(tǒng)計(jì)方法使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法將獲得測(cè)試參數(shù)集中每一者的值范圍。因此，例如，一種這樣的方法可以包括檢測(cè)細(xì)胞存活力、組織血管化、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)物的存在、改變疾病進(jìn)展的效力等。在一些實(shí)施方案中，篩選包括將已進(jìn)行分析的參數(shù)與來(lái)自控制或參考樣品(例如由并不與候選試劑接觸的受體以類(lèi)似方式制備的試樣)的參數(shù)進(jìn)行比較。篩選所用的感興趣候選試劑包括已知的和未知的化合物，包括眾多化學(xué)類(lèi)型，主要是有機(jī)分子，所述眾多化學(xué)類(lèi)型可包括有機(jī)金屬分子、無(wú)機(jī)分子、基因序列等。感興趣候選試劑還包括例如核酸、對(duì)siRNA、shRNA、反義分子或miRNA編碼的核酸或者對(duì)多肽進(jìn)行編碼的核酸。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是評(píng)估候選藥物，包括毒性測(cè)試等。

本發(fā)明的方法和系統(tǒng)還可用于使以下各項(xiàng)可視化：基因編碼標(biāo)記物在全組織中以亞細(xì)胞分辨率的分布，例如，染色體異常(倒位、復(fù)制、易位等)；基因雜合性的損失；指示疾病或健康傾向的等位基因的存在；對(duì)治療作出響應(yīng)的可能性；血統(tǒng)；等。此類(lèi)檢測(cè)可以用于例如如上所述在個(gè)體化用藥和親子鑒定研究中診斷和監(jiān)測(cè)疾病。

實(shí)施例

從上文提供的公開(kāi)內(nèi)容可以理解，本發(fā)明具有廣泛多種應(yīng)用。因此，提供以下實(shí)施例是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何實(shí)施并且使用本發(fā)明的完整的說(shuō)明和介紹，而不是要限定本發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍，也不是要將下面的實(shí)驗(yàn)作為所進(jìn)行的所有或僅有的實(shí)驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，可以改變或調(diào)整各種非關(guān)鍵參數(shù)以便產(chǎn)生相似的結(jié)果。因此，提供以下實(shí)施例是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何實(shí)施并且使用本發(fā)明的完整的說(shuō)明和介紹，而不是要限定本發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍，也不是要將下面的實(shí)驗(yàn)作為所進(jìn)行的所有或僅有的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)努力確保所用數(shù)值(例如，量、溫度等等)的精確性，但是應(yīng)說(shuō)明某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。

實(shí)施例概述

如上所提供，在光片顯微術(shù)中，從側(cè)面利用薄光片照明樣品，并且利用焦點(diǎn)內(nèi)正交布置的物鏡檢測(cè)所發(fā)出的光信號(hào)(例如，熒光信號(hào))。通過(guò)將照明限于所選擇的一個(gè)平面而實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層顯微術(shù)，這允許使用快速CCD或sCMOS相機(jī)來(lái)同時(shí)捕獲完整圖像，并且導(dǎo)致成像速度增大。此外，光片顯微術(shù)通過(guò)將照明限于感興趣平面而使得光致漂白(圖5)最小化。光片顯微術(shù)的這些性質(zhì)適于對(duì)例如通過(guò)CLARITY過(guò)程而產(chǎn)生的透明樣品進(jìn)行成像。經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的光片顯微術(shù)(COLM)(圖1A至1D)允許使用經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的物鏡(圖2、3、4B)而對(duì)透明樣品例如小鼠腦(>5mm)的整個(gè)深度以高分辨率進(jìn)行成像并且較大透明體積的高速收集導(dǎo)致光致漂白大大地減少(圖2、3)。兩個(gè)檢測(cè)臂允許提高較大深度范圍內(nèi)的成像質(zhì)量，因?yàn)闃悠返囊徊糠謴碾x其最近的檢測(cè)臂進(jìn)行成像。(圖10，圖片b，c和d)。

材料和方法

反應(yīng)物和樣品

水凝膠單體(HM)溶液通過(guò)將以下各項(xiàng)混合來(lái)制備400ml的HM溶液：40mL的40％丙烯酰胺(Bio-Rad，目錄號(hào)161-0140，4％最終濃度)；10mL的2％雙丙烯酰胺(Bio-Rad，目錄號(hào)161-0142；0.05％最終濃度)；40mL的10X PBS；100mL的16％PFA(電子顯微鏡科學(xué)，目錄號(hào)15710-S；4％最終濃度)；210mL的蒸餾水；以及1g的VA-044熱引發(fā)劑(Wako，目錄號(hào)VA-044；0.25％w/v最終濃度)。所有試劑都保存在冰上。將40mL的HM溶液分裝到50mL的離心管中并且在需要時(shí)保存在-20℃下。HM溶液中的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺濃度可按比例減少以加速清洗過(guò)程。成功地使用0.5％/0.0125％丙烯酰胺/雙丙烯酰胺的范圍高達(dá)4.0％/0.05％的濃度；然而，當(dāng)清洗速度增大數(shù)倍時(shí)，可以采用較低的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺濃度來(lái)就此開(kāi)始。

SDS/硼酸清洗緩沖液(SBC)制備由以下各項(xiàng)組成的備料：20％的SDS(Sigma，目錄號(hào)L337或Amresco，目錄號(hào)0837；在H2O中)；以及1M的硼酸緩沖液(pH調(diào)整為8.5)。通過(guò)將20％的SDS和1M的硼酸緩沖液在蒸餾水中稀釋5倍來(lái)新鮮制備最終清洗緩沖液。

其他反應(yīng)物其他反應(yīng)物使用如下：FocusClear(CelExplorer實(shí)驗(yàn)室)；定制折射率液體(RI 1.454，目錄號(hào)1806Y，Cargille實(shí)驗(yàn)室)；清洗溶液(硼酸(Sigma，目錄號(hào)B7901)；氫氧化鈉小球(EMD，目錄號(hào)SX0590-3)。

成像樣品由成年Thy1-eYFP或WT小鼠制備成像樣品。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在斯坦福大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。

分子標(biāo)記

組織樣品可具有熒光素的內(nèi)源性轉(zhuǎn)基因表達(dá)以標(biāo)記樣品中的分子和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，但另外，免疫組織化學(xué)可用于標(biāo)記感興趣的結(jié)構(gòu)和分子。

37℃下，將組織在PBST中徹底清洗至少1天(或?qū)τ谌X來(lái)說(shuō)，在硼酸緩沖液/0.1％的Triton X-100中進(jìn)行清洗)。將樣品在一次抗體/PBST溶液(從1:50稀釋開(kāi)始)中在37℃下對(duì)于組織塊來(lái)說(shuō)溫育2天，或?qū)τ谡麄€(gè)完整大腦來(lái)說(shuō)溫育一周。大約1M的硼酸/0.1％的Triton X-100緩沖液(pH 8.5)也可替代PBST用于抗體溫育以減少背景染色。對(duì)于1mm厚的塊來(lái)說(shuō)，將抗體在1mL溶液中利用進(jìn)行溫育或?qū)τ谡麄€(gè)小鼠腦來(lái)說(shuō)，在5mL溶液中進(jìn)行溫育，其中定期補(bǔ)充比例增大的抗體體積；例如，可以添加50μL的抗-TH Ab(10μl至20μl)，隨后在大約1周內(nèi)每?jī)商煸偬砑?0μL。為了進(jìn)行有效的免疫染色，需要較高的抗體濃度(1:20至1:100)，以確保深層滲透到組織中并且克服所述體積范圍內(nèi)的總抗體結(jié)合位點(diǎn)的巨大的總數(shù)量。成功免疫染色的另一個(gè)主要因素是在清洗期間完全移除脂質(zhì)。

對(duì)于組織塊來(lái)說(shuō)，將一次抗體在37℃下利用PBST緩沖液沖洗一天，并且對(duì)于全腦來(lái)說(shuō)，2至3天(每4至6個(gè)小時(shí)重新緩沖)。將樣品利用所需二次抗體在PBST中在37℃下對(duì)于組織塊來(lái)說(shuō)溫育2天(1:50-1:100)或?qū)τ谌X來(lái)說(shuō)，高達(dá)1周。應(yīng)當(dāng)指出的是，在這一步，還可以添加核標(biāo)記染料，諸如DAPI。將二次抗體利用PBST在37℃下對(duì)于組織塊來(lái)說(shuō)沖洗1天并且對(duì)于全腦來(lái)說(shuō)沖洗2至3天。為了準(zhǔn)備進(jìn)行成像，將組織轉(zhuǎn)移到FocusClear中進(jìn)行折射率均勻化。在通過(guò)將組織在清洗緩沖液中在60℃下過(guò)夜溫育后，通過(guò)洗脫(移除)先前標(biāo)記而執(zhí)行多輪標(biāo)記，接著進(jìn)行另一輪標(biāo)記。

設(shè)備裝置

經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的光片顯微鏡

光片顯微鏡由以下各項(xiàng)組成：一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)寬場(chǎng)檢測(cè)光學(xué)臂，所述光學(xué)臂包括檢測(cè)物鏡、鏡筒透鏡和相機(jī)；以及一個(gè)或多個(gè)正交布置的獨(dú)立照明壁，所述照明壁包括用于生成靜態(tài)光片的低NA物鏡、鏡筒透鏡和任一個(gè)柱面透鏡或者用于利用高斯或貝塞爾光束而形成動(dòng)態(tài)光片的檢流計(jì)掃描儀/f-θ透鏡。

開(kāi)發(fā)了經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的光片顯微鏡(COLM)以使透明樣品與光片顯微鏡的兼容性最大化，所述顯微鏡使用了以下各項(xiàng)：CLARITY物鏡(25X和10X，奧林巴斯)；快速sCMOS相機(jī)；雙軸檢流計(jì)掃描儀；以及f-θ透鏡；低NA物鏡，其用于使用高斯光束生成動(dòng)態(tài)光片；經(jīng)過(guò)優(yōu)化的樣品室(在以下部分詳述)；以及xyz-θ樣品安裝臺(tái)，其在每個(gè)維度上提供45mm的較長(zhǎng)行程范圍以允許較大樣品進(jìn)行成像(圖1A至1D)。

使用COLM進(jìn)行同步照明檢測(cè)以改進(jìn)成像質(zhì)量，尤其是在較高的深度處(圖1C)，利用在下一代sCMOS相機(jī)中可用的單向讀出(與標(biāo)準(zhǔn)雙向形成對(duì)照)模式。使掃描光束(其形成了動(dòng)態(tài)光片)與所發(fā)射信號(hào)的單向單行讀出同步進(jìn)行，從而產(chǎn)生虛擬共焦狹縫布置，這拒絕了由于樣品中的更深散射而引起的焦點(diǎn)外平面信號(hào)。COLM中的自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)參數(shù)校準(zhǔn)(使用線性適應(yīng)性進(jìn)行)糾正了整個(gè)樣品空間上的失準(zhǔn)偽影(圖1D)。COLM的控制電子器件設(shè)計(jì)和零件在圖6中概述。FPGA邏輯用于對(duì)顯微鏡的各種零件進(jìn)行控制和同步化。

COLM的樣品安裝設(shè)備

COLM的一個(gè)組件為經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的樣品安裝策略，使得沿著一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)通路的光學(xué)不均勻性最小化(圖1B)。將透明的整個(gè)小鼠腦(或任何較大的透明完整組織諸如脊髓)安裝在由熔融石英玻璃制成的、用FocusClear填充的吸收池中(標(biāo)準(zhǔn)吸收池用于進(jìn)行分光光度計(jì)測(cè)量)；熔融石英的折射率(大約1.458)與FocusClear的折射率幾乎完全相同。使用底部適配器(圖1B)來(lái)將樣品吸收池安裝到xyz-θ臺(tái)上，在樣品室內(nèi)部(圖1B)。隨后將大得多的室用相對(duì)經(jīng)濟(jì)型的定制折射率匹配液體(RI 1.454，目錄號(hào)1806Y，Cargille實(shí)驗(yàn)室)填充，從而產(chǎn)生光學(xué)均勻的樣品操縱系統(tǒng)。RI液體每半升花費(fèi)幾百美元，這足以填充樣品室(并且超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)，比FocusClear更便宜)并且可以重復(fù)使用很多次。替代地，所述室也可用87％的甘油填充。

進(jìn)行數(shù)據(jù)分析所用的計(jì)算工作臺(tái)

由于圖像數(shù)據(jù)尺寸非常大，因此重要的是，使用具有豐富RAM、多芯CPU和優(yōu)良圖形卡的計(jì)算工作臺(tái)。這里示出的數(shù)據(jù)在具有以下配置的工作臺(tái)上進(jìn)行處理：英特爾服務(wù)器板S2600CO；兩個(gè)Intel Xeon E5-2687W 8C CPU；大約130GB的DIMM RAM；大約8TB的硬盤(pán)(Seagate Savvio 10K)；NVidia K5000圖形卡；以及高分辨率監(jiān)測(cè)器(NEC MultiSync PA301W 30，2560x1600英寸)。

成像和分析

經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的光片顯微術(shù)

將樣品(例如，完整小鼠腦)安裝在適當(dāng)尺寸的石英吸收池中，以使得樣品在成像時(shí)保持靜止(圖1B)。應(yīng)當(dāng)指出的是，很多不同尺寸的石英吸收池從供貨商(諸如Starna Cells)處獲得；小塊丙烯酰胺凝膠(或類(lèi)似的透明材料)可用于在與成像側(cè)相對(duì)的一側(cè)上提供結(jié)構(gòu)填料。對(duì)于成年小鼠腦來(lái)說(shuō)，可以取決于年齡而使用具有填料的10x 5mm或10x 10mm基底吸收池。

所述吸收池用FocusClear填充，剛好足以覆蓋整個(gè)樣品。使用適配器而將吸收池安裝在xyz-θ臺(tái)上(圖1B)。氣泡或灰塵顆粒得以避免，因?yàn)樗鼈兏蓴_了成像。

透明樣品(諸如完整成年小鼠腦)被安裝在用折射率匹配溶液諸如FocusClear填充的石英吸收池中。石英玻璃的折射率(大約1.458)與FocusClear的折射率(大約1.454)幾乎相同。底部適配器用于將吸收池附接到樣品室中的xyz-θ臺(tái)，所述樣品室隨后用折射率匹配液體(大約1.454)填充。這導(dǎo)致產(chǎn)生具有最小折射率過(guò)渡邊界的光學(xué)均勻樣品操縱系統(tǒng)。

拼貼參數(shù)設(shè)置如下。一些樣品比所使用物鏡的視場(chǎng)更大，并且因此需要拼貼圖像層疊件以覆蓋整個(gè)樣品。為了指定拼貼的數(shù)量，定義所感興趣區(qū)域的兩個(gè)相對(duì)拐角的坐標(biāo)，其中拼貼覆蓋20％或更多。通過(guò)從樣品找出包含有用信號(hào)的第一圖像幀和最后一個(gè)圖像幀來(lái)指定層疊件的開(kāi)始位置和z位置，并且隨后設(shè)置所需z步進(jìn)值。

調(diào)整光片與檢測(cè)焦平面之間的任何失準(zhǔn)，所述失準(zhǔn)(尤其是在較大樣品成像期間)可能引起圖像混亂不清。在如上所定義的整個(gè)樣品空間內(nèi)，優(yōu)化光片和焦平面對(duì)準(zhǔn)參數(shù)。通過(guò)在全部拼貼的每毫米組織處優(yōu)化這些參數(shù)，并且隨后在這些毫米步進(jìn)之間線性地插入z步進(jìn)的值來(lái)實(shí)現(xiàn)這種效果。通過(guò)在指定附近找出與圖像質(zhì)量度量相對(duì)應(yīng)的最大值來(lái)識(shí)別最優(yōu)參數(shù)；為使這一過(guò)程自動(dòng)化，實(shí)施光學(xué)焦點(diǎn)質(zhì)量測(cè)量，作為傅里葉空間中的高頻信號(hào)與低頻信號(hào)的比。

成像實(shí)驗(yàn)已啟動(dòng)并且數(shù)據(jù)收集如下。從相對(duì)側(cè)形成兩個(gè)光片并且利用焦點(diǎn)內(nèi)檢測(cè)物鏡、鏡筒透鏡和sCMOS相機(jī)來(lái)對(duì)所發(fā)射的熒光進(jìn)行成像。照明和發(fā)射濾光輪(機(jī)動(dòng)化)用于分別生成定義明確的激發(fā)信號(hào)和發(fā)射信號(hào)帶。

通過(guò)使掃描光束與sCMOS相機(jī)芯片的單向讀出同步進(jìn)行來(lái)實(shí)現(xiàn)同步照明和檢測(cè)，導(dǎo)致產(chǎn)生虛擬狹縫效應(yīng)，所述虛擬狹縫效應(yīng)允許大幅提高成像質(zhì)量，如通過(guò)COLM并且通過(guò)常規(guī)光片顯微術(shù)(圖1C)而從相同平面獲取的圖像所示。通過(guò)COLM獲取的圖像中的視場(chǎng)的信號(hào)強(qiáng)度分布與通過(guò)常規(guī)光片顯微術(shù)(圖1C，右邊的圖)所獲取的圖像相比得到改進(jìn)。

為了調(diào)整較大透明樣品的折射率均勻性，在如上所述開(kāi)始成像實(shí)驗(yàn)之前，利用檢測(cè)物鏡的焦平面通過(guò)線性適應(yīng)性校準(zhǔn)程序來(lái)糾正照明失準(zhǔn)。

3D重建和分析

利用商業(yè)軟件(例如，來(lái)自Imaris、Bitplane或Amira)或經(jīng)由免費(fèi)/開(kāi)源項(xiàng)目(例如，Vaa3D，www.vaa3d.org)執(zhí)行三維重建。利用TeraStitcher執(zhí)行拼貼縫合。可以使用商業(yè)軟件諸如Imaris和Amira中的特定模塊或利用開(kāi)源工具諸如Neuromantic來(lái)執(zhí)行對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的手動(dòng)或半自動(dòng)跟蹤。

實(shí)施例1：使用COLM對(duì)整個(gè)小鼠腦的超高速成象

將Thy1-eYFP小鼠腦用0.5％丙烯酰胺單體溶液灌注，并且在37℃下通過(guò)輕輕搖動(dòng)而被動(dòng)地透明化。使用20ms的相機(jī)曝光時(shí)間，并且使用折射率1.454的液體作為浸漬介質(zhì)。使用10X的0.6NA物鏡在大約4小時(shí)內(nèi)獲取整個(gè)數(shù)據(jù)集。通過(guò)連續(xù)地移除背側(cè)封閉圖像(圖2，圖片b、c和d)而使完整小鼠腦體積的內(nèi)部細(xì)節(jié)可視化。圖10(圖片b、c和d)呈現(xiàn)了使用兩個(gè)獨(dú)立檢測(cè)臂COLM實(shí)現(xiàn)方式來(lái)對(duì)整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(所附接的大腦和脊髓)進(jìn)行成像的一個(gè)示例。

實(shí)施例2：使用COLM對(duì)透明大腦的快速高分辨率成像

將Thy1-eYFP小鼠腦用0.5％丙烯酰胺單體溶液灌注。使用具有25x放大率的完整透明大腦來(lái)獲取3.15mm x 3.15mm x 5.3mm體積。在大約1.5小時(shí)內(nèi)獲取完整的圖像數(shù)據(jù)集；為獲得最優(yōu)對(duì)比度，在圖片之間線性地調(diào)整放大圖像的LUT。獲得來(lái)自圖3(圖片c)的由矩形限定的放大視圖(圖3，圖片a，b)。獲得50微米厚體積的最大強(qiáng)度投影(圖3，圖片d至i，通過(guò)框和箭頭的累進(jìn)示出)。使用20ms的相機(jī)曝光時(shí)間；使用折射率1.454的液體作為浸漬介質(zhì)。

實(shí)施例3：透明組織的分子查詢

將整個(gè)小鼠腦用4％丙烯酰胺單體溶液灌注且被動(dòng)地透明化，并且進(jìn)行免疫染色以標(biāo)記所有的小清蛋白(PV)陽(yáng)性神經(jīng)元。利用25X物鏡使用COLM來(lái)對(duì)完整大腦進(jìn)行成像。在樣品中在不同的深度觀察到標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞(圖4B)。

經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的物鏡用于利用共焦顯微術(shù)(圖4A和4C)來(lái)對(duì)透明的小鼠腦組織塊進(jìn)行成像。將小鼠腦用4％丙烯酰胺單體溶液灌注并且利用抗PV抗體進(jìn)行免疫染色。利用經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的水浸物鏡(10X，0.6NA，3mm)進(jìn)行的共焦顯微術(shù)用于獲取1mm厚的組織塊的高質(zhì)量圖像，并且對(duì)所述圖像進(jìn)行處理以生成PV陽(yáng)性神經(jīng)元(圖4A)的最大強(qiáng)度投影圖像。

也可以在來(lái)自透明小鼠腦的相同組織塊中利用經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的水浸物鏡(10X，0.6NA，3mm)執(zhí)行多輪免疫染色和共焦成像。使用1％的丙烯酰胺單體溶液來(lái)灌注小鼠腦。在針對(duì)PV進(jìn)行第一輪免疫染色(圖4C，左圖片)后，通過(guò)在60℃下在清洗緩沖液中溫育而對(duì)標(biāo)簽洗脫過(guò)夜(大約12小時(shí))(圖4C，中間圖片)。隨后將組織塊利用抗PV抗體進(jìn)行免疫染色(圖4C，右圖片)。也對(duì)第一輪中存在的DAPI成功洗脫。所有所示圖像均表示最大Z投影。

實(shí)施例4：共焦顯微術(shù)、雙光子顯微術(shù)和光片顯微術(shù)的比較

共焦顯微術(shù)(圖5，左列)通過(guò)在光電倍增管(PMT)的前面使用針孔而實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層顯微術(shù)。雙光子顯微術(shù)(圖5，中間列)使用以下事實(shí)，即僅僅兩個(gè)光子(具有較長(zhǎng)波長(zhǎng))的同時(shí)吸收會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)發(fā)射，在樣品中的最高光強(qiáng)度點(diǎn)即焦平面處更有可能發(fā)生這種事件。光片螢光顯微術(shù)(圖5，右列)通過(guò)將照明選擇性地限于感興趣平面而實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層顯微術(shù)。共焦顯微術(shù)和雙光子顯微術(shù)為點(diǎn)掃描并且因此固有地緩慢，盡管光片顯微術(shù)使用快速sCMOS/CCD相機(jī)來(lái)對(duì)選擇性照明的焦平面進(jìn)行成像，從而產(chǎn)生2至3數(shù)量級(jí)的較快成像速度和最小光致漂白。

對(duì)透明樣品與光片的兼容性進(jìn)行了評(píng)估并且在最小光致漂白的情況下實(shí)現(xiàn)了大于2數(shù)量級(jí)的較快成像速度；例如，將完整小鼠腦使用10X放大率的物鏡在大約4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行成像并且使用25X物鏡在大約1.5天內(nèi)進(jìn)行成像，這分別與共焦顯微術(shù)情況下的許多天和許多月形成對(duì)照。經(jīng)過(guò)CLARITY優(yōu)化的光片顯微術(shù)(COLM)尤其適于對(duì)利用轉(zhuǎn)基因和組織化學(xué)方法標(biāo)記的較大組織樣品進(jìn)行查詢。使用新的顯微方法經(jīng)由CLARITY而生成的增大的采集速度和較高的數(shù)據(jù)質(zhì)量，結(jié)合通過(guò)本文所描述的并行和高效的組織轉(zhuǎn)型協(xié)議而本身啟用的高速CLARIT處理，一定限定用于對(duì)較大且完全組裝的組織進(jìn)行結(jié)構(gòu)和分子查詢的通用高效平臺(tái)。

盡管為了清楚理解的目的前述發(fā)明已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和實(shí)例的方式詳細(xì)描述，但是鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)是，在不偏離所附權(quán)利要求的精神或范圍的情況下可以對(duì)本發(fā)明作出某些改變和修改。

因此，以上僅僅說(shuō)明本發(fā)明的原理。應(yīng)了解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠設(shè)想各種安排，雖然這些安排未在本文中明確地描述或展示，但是它們體現(xiàn)了本發(fā)明的原理并且包括在其精神和范圍內(nèi)。此外，本文所引用的所有實(shí)施例和條件語(yǔ)言主要意圖幫助讀者理解本發(fā)明的原理和由發(fā)明人提供的促進(jìn)技術(shù)的構(gòu)想，并且應(yīng)解釋為不對(duì)此類(lèi)特別引用的實(shí)施例和條件構(gòu)成限制。此外，本文中引述本發(fā)明的原理、方面和實(shí)施方案以及其特定實(shí)施例的所有陳述均意圖涵蓋其結(jié)構(gòu)等效物和功能等效物。此外，希望此類(lèi)等效物包括目前已知的等效物和未來(lái)開(kāi)發(fā)出來(lái)的等效物，即不管結(jié)構(gòu)如何，所開(kāi)發(fā)的執(zhí)行相同功能的任何元件。因此，本發(fā)明的范圍并非意圖限于本文所示和描述的示例性實(shí)施方案。而是，本發(fā)明的范圍和精神由隨附權(quán)利要求體現(xiàn)。