專利名稱：具有連續(xù)片光源的spim顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括光源和照相機(jī)的SPIM顯微鏡，所述光源從y方向發(fā)出照射光束到要成像的對(duì)象上，所述照相機(jī)以ζ方向作為第一檢測(cè)方向檢測(cè)從所述對(duì)象上發(fā)出的熒光和 /或反射光，其中Z方向基本沿與y方向垂直的方向延伸。
背景技術(shù)：
特別對(duì)于生物樣品的分析應(yīng)是快速的且不應(yīng)對(duì)其造成損傷。這對(duì)很多需要生成三維圖像的應(yīng)用很有用。應(yīng)該避免因照射光與樣品的相互作用而發(fā)生的散射偽像和吸收偽像，特別是在熒光顯微鏡的視場(chǎng)下時(shí)，其中照射光具有用于激發(fā)熒光的激發(fā)光功能。所謂的SPIM(有選擇性的平面照射顯微鏡)技術(shù)特別適合于以高分辨率實(shí)現(xiàn)快速分析顯微樣品，且對(duì)樣品不造成損傷，其中照射光產(chǎn)生片光源(light sheet)，同時(shí)照相機(jī)在相對(duì)于照射方向相垂直的方向上檢測(cè)由光致發(fā)光和反射產(chǎn)生的檢測(cè)光。片光源為具有大體矩形的截面的照射體積，其在第一截面方向上(此處為ζ方向) 非常薄，而相對(duì)于第一截面方向，第二截面方向上(此處為X方向)明顯更厚。照射方向 (此處為y方向)基本垂直于第一截面方向(此處為Z方向)延伸，且基本沿與第二截面方向(此處為χ方向)垂直的方向延伸。片光源由圓柱狀透鏡聚焦且該片光源的焦距或焦長(zhǎng)可被理解為照射方向(此處為y方向)上的特定范圍，其中片光源特別薄，使得被照射體積的形狀為片狀，即在Z方向上非常薄而在X和y方向上更厚。根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)，利用圓柱狀透鏡產(chǎn)生的片光源的缺點(diǎn)在于，該系統(tǒng)很不靈活，例如其提供的是固定焦點(diǎn)，因此被照射體積也是預(yù)確定的。為了實(shí)現(xiàn)高分辨率，非常薄且長(zhǎng)的焦距是有益的。可以在樣品的一個(gè)方向上掃描該焦距以獲得三維圖像。由于長(zhǎng)度增加也使寬度增加，ζ方向上的分辨率就降低了。這意味照射光學(xué)元件數(shù)值孔徑較低時(shí)的長(zhǎng)焦距也會(huì)使被照射體積的厚度較大。這意味著檢測(cè)方向上沿光軸的光學(xué)分辨率也同樣降低。激發(fā)光和樣品間的相互作用會(huì)產(chǎn)生散射偽影和吸收偽影，看起來(lái)像沿著照明光軸的光條紋或陰影，因此還被稱為“幕簾效應(yīng)”。一種減少幕簾效應(yīng)的現(xiàn)有方法是SPIM技術(shù)，根據(jù)該SPIM技術(shù)，并另外通過(guò)在遠(yuǎn)心布置中的諧振鏡將片光源相對(duì)于光軸傾斜，使得來(lái)自各個(gè)方向照明光束入射到樣品上，從而減少散射偽影和吸收偽影。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，入射方向的改變給樣品內(nèi)的吸收區(qū)域提供了一些背景照明，使得圖像中的光條紋或陰影減少。但該技術(shù)的缺點(diǎn)是比較復(fù)雜，特別是在片光源需要在ζ方向上被掃描以生成三維圖像時(shí)。此外，其并沒有解決因焦距是預(yù)確定的而帶來(lái)的靈活性低的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是首先提高被描述顯微鏡的靈活性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高分辨率以及檢測(cè)更多的圖像信息。根據(jù)本發(fā)明，上述目的通過(guò)第一 χ掃描儀和照明光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)，所述第一 X掃描儀通過(guò)在X方向上掃描照射光束產(chǎn)生連續(xù)片光源，其中X方向沿與y方向和Z方向基本垂直的方向延伸，且片光源在由χ方向和y方向所限定的平面內(nèi)連續(xù)形成；所述照明光學(xué)元件包括提供在照明光束的光束路徑上的變焦光學(xué)元件，該變焦光學(xué)元件可以改變照明光束的焦距。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，提供光檢測(cè)器檢測(cè)由物體發(fā)出的位于與y方向相反方向上的檢測(cè)光，該檢測(cè)光的方向?yàn)榈诙z測(cè)方向，檢測(cè)光為熒光和/或反射光。這樣可以產(chǎn)生第二數(shù)據(jù)流，例如用于另外共焦地產(chǎn)生圖像?？筛鶕?jù)需要，開啟或關(guān)閉該可選的另外的圖像。當(dāng)使用多光子激光器時(shí)，可以選擇共焦檢測(cè)和非去掃描(non-descarming)光路以通過(guò)多光子檢測(cè)產(chǎn)生圖像。非去掃描檢測(cè)路徑的優(yōu)點(diǎn)是，收集效率更高，尤其是在樣品較厚的情況下。術(shù)語(yǔ)非去掃描應(yīng)被理解為在檢測(cè)物鏡處直接從檢測(cè)光中耦合出去。如果用SPIM檢測(cè)光束路徑(ζ方向上)來(lái)收集熒光且該光被導(dǎo)向至光電倍增管、 APD或APD陣列，那么比通過(guò)照明光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)的收集熒光的效率要高得多，這是因?yàn)檎彰飨到y(tǒng)所使用的數(shù)值孔徑一般比SPIM布置的檢測(cè)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑小。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，通過(guò)應(yīng)用SPIM技術(shù)在ζ方向上檢測(cè)到2維寬視場(chǎng)圖像的同時(shí)，還可選擇通過(guò)使用多光子照明，并行生成物體的共焦一維圖像，該共焦一維圖像為在X方向上延伸的一行。該情況下，二維圖像成像的是由以上描述的片光源所照射的并由變焦光學(xué)元件控制的那個(gè)照射層，同時(shí)并行產(chǎn)生稱為x-t的圖像，即行圖像，該行圖像特別提供了在生物樣品內(nèi)的關(guān)于物體內(nèi)特定單元的移動(dòng)速度信息，例如分子或其他細(xì)胞部分(細(xì)胞器)的擴(kuò)散。優(yōu)選地，為了產(chǎn)生三維圖像，提供第一 ζ掃描儀，其在ζ方向上移動(dòng)物體，使得在ζ 方向上生成多個(gè)彼此間隔的在各自照射面內(nèi)的連續(xù)片光源，其中各個(gè)片光源與照相機(jī)間的距離保持不變。其優(yōu)點(diǎn)是可選擇地額外開啟整個(gè)照射光學(xué)元件、SPIM檢測(cè)光學(xué)元件以及共焦檢測(cè)光學(xué)元件，并保持在同一位置，而且照明光束不必另外要由掃描儀在ζ方向上偏轉(zhuǎn)， 這也使照明光學(xué)元件得以簡(jiǎn)化。在可替代方案中，還可以移動(dòng)照明光學(xué)元件或在ζ方向上偏轉(zhuǎn)照明光束，例如通過(guò)聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)或通過(guò)檢流計(jì)。在該情況下，優(yōu)選使SPIM檢測(cè)光學(xué)元件在后跟蹤，這可以通過(guò)改變SPIM檢測(cè)光學(xué)元件的物鏡的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)，或在可替代方案中，通過(guò)移動(dòng)包括照相機(jī)的整個(gè)SPIM檢測(cè)光學(xué)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供圖像處理單元，其將與在ζ方向上彼此間隔一定距離的多個(gè)片光源相關(guān)聯(lián)的連續(xù)生成的圖像合成為三維圖像。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，通過(guò)SPIM技術(shù)在ζ方向上生成3維寬視場(chǎng)圖像的同時(shí)，并行生成物體的共焦2維圖像，該共焦2維圖像位于由χ方向和ζ方向所限定的平面內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供第二 ζ掃描儀和第三ζ掃描儀，所述第二 ζ掃描儀相對(duì)于物體在Z方向上移動(dòng)照明光束用于在Z方向上連續(xù)產(chǎn)生多個(gè)彼此間隔的片光源，所述第三Z掃描儀根據(jù)第二 Z掃描儀在Z方向上對(duì)照明光束的偏轉(zhuǎn)跟蹤檢測(cè)光束路徑， 使得片光源和照相機(jī)間的距離保持不變。通過(guò)此方式產(chǎn)生的數(shù)據(jù)流優(yōu)選由圖像處理單元處理，所述圖像處理單元通過(guò)各種可能的重現(xiàn)方法(投影、透過(guò)、陰影、光線跟蹤等)將與在Z 方向上彼此間隔一定距離的多個(gè)片光源相關(guān)聯(lián)的連續(xù)生成的圖像合成為三維圖像。優(yōu)選地，除了通過(guò)重現(xiàn)產(chǎn)生三維圖像外，在通過(guò)SPIM技術(shù)生成三維圖像的同時(shí)，并行生成物體的共焦(多光子)二維圖像，該共焦2維圖像位于由χ方向和ζ方向所限定的平面內(nèi)。如果需要成像物體的較大區(qū)域，可以通過(guò)所謂的“拼接”來(lái)實(shí)現(xiàn)，即把連續(xù)被成像的物體的相鄰區(qū)域組合起來(lái)。為此，需要物體在X方向上移動(dòng)且照明一個(gè)新的區(qū)域，由照相機(jī)檢測(cè)圖像。在X方向上移動(dòng)的次數(shù)取決于物體尺寸、物鏡視場(chǎng)的尺寸以及照相機(jī)的參數(shù)。 還可以在y方向上移動(dòng)物體用于檢測(cè)物體的較大區(qū)域。可以把所有這些圖像組合為一個(gè)大的總圖像。通過(guò)該靈活的光學(xué)變焦布置，可調(diào)節(jié)片光源的尺寸(在y方向和Z方向上)。如果期望僅照射一薄層，提高變焦光學(xué)元件的數(shù)值孔徑，那么片光源的可用尺寸就會(huì)減低。通過(guò)沿y方向上連續(xù)檢測(cè)(拼接)，可以檢測(cè)到一系列沿ζ方向具有高分辨率的圖像。由于變焦光學(xué)元件的光學(xué)參數(shù)已知，通過(guò)選擇合適的圖像處理來(lái)僅使用那些可用對(duì)區(qū)域并對(duì)其組合，可以提供高分辨率。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，允許改變照明光束焦距的變焦光學(xué)元件可以是光學(xué)變焦的，具有可彼此間機(jī)械移動(dòng)的透鏡組。通過(guò)使變焦光學(xué)元件與照明物鏡組合并改變數(shù)值孔徑，擴(kuò)大或縮短照明光束的焦距，從而擴(kuò)大或縮短由片光源在y方向上照射的視場(chǎng)的長(zhǎng)度。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供適于改變X方向上的掃描長(zhǎng)度的電子變焦元件。優(yōu)選地，通過(guò)電子變焦元件使X方向上的圖像像素?cái)?shù)量保持不變，且該數(shù)量與X方向上已選定的掃描長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。如果X方向上的掃描長(zhǎng)度縮短了，但在該縮短的掃描長(zhǎng)度上被掃描像素的數(shù)量保持不變，那么如果共焦檢測(cè)能符合奈奎斯特定理，就能提高分辨率。如果同時(shí)生成共焦檢測(cè)圖像，還應(yīng)注意此圖像包括了在χ方向上能符合奈奎斯特定理的較高分辨率，但X方向上的圖像尺寸較小，這就是電子變焦元件的作用。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，還提供電子變焦元件，通過(guò)該電子變焦元件可以改變?chǔ)?方向上的掃描長(zhǎng)度，其中沿該ζ方向可連續(xù)生成多個(gè)彼此間隔的片光源。該情況下，電子變焦元件所起的作用與在χ方向上基本相同。優(yōu)選地，通過(guò)電子變焦元件使ζ方向上彼此間隔的片光源的數(shù)量保持不變，且該數(shù)量與ζ方向上已選定的掃描長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，在χ方向上被掃描的照明光束在返回點(diǎn)處或其附近被關(guān)閉(turn off)，在該返回點(diǎn)處在χ方向上掃描長(zhǎng)度達(dá)到最大。由于這樣可以使返回點(diǎn)處的發(fā)送到樣品上的光較少，從而避免對(duì)樣品的損傷。另外，這還可以避免在返回點(diǎn)處圖像顯得特別亮，因?yàn)橄啾扔跇悠返钠渌麉^(qū)域，返回點(diǎn)處的照明持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。理想情況下，χ方向上的掃描速度遵循鋸齒圖形。如果掃描速度非?？?盡管這難以實(shí)現(xiàn))，使速度呈正弦圖形 (sinus graph)，那么返回點(diǎn)處的掃描速度會(huì)比在掃描路徑中時(shí)更低。特別對(duì)于正弦圖形來(lái)說(shuō)，在靠近返回點(diǎn)處關(guān)閉照明光束是很有用的。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，照相機(jī)為從包括CMOS照相機(jī)CCD照相機(jī)或陣列檢測(cè)器的組中選擇的區(qū)域檢測(cè)器。由于SPIM技術(shù)為寬視場(chǎng)顯微技術(shù)，照相機(jī)應(yīng)提供檢測(cè)光的定位。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡配置有適于在以下工作模式間切換的切換器與1照明方向相反的檢測(cè)光的共焦檢測(cè)；ζ方向?qū)捯晥?chǎng)檢測(cè)光的SPIM檢測(cè)；以及前述共焦檢測(cè)與SPIM檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供去活化光源，其從y方向發(fā)出至少一個(gè)去活化光束至物體上，使連續(xù)產(chǎn)生的片光源在ζ方向上更薄，其中發(fā)出的去活化光束在ζ方向上相對(duì)于照明光束有偏移且平行于χ方向上被掃描的照明光束延伸。優(yōu)選地，去活化光束的截面已調(diào)制成包括兩個(gè)極值，從ζ方向上觀察這兩個(gè)極值位于激發(fā)光束中心的一前一后， 其中激發(fā)光束中心在極值之間具有零點(diǎn)。然而，在可替代方案中，還可以發(fā)送兩個(gè)獨(dú)立激光束作為去活化光束，或使片光源的僅一側(cè)變薄，即從ζ方向觀察，僅在激發(fā)光束的前面或后面提供一個(gè)去活化光束。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供適于把激發(fā)光束調(diào)制成貝塞爾光束的激發(fā)光束調(diào)制器。貝塞爾光束在光束截面上的強(qiáng)度分布不均勻，且包括相對(duì)尖的主要最大值和幾個(gè)明顯的旁瓣。特別在加入STED去活化光束時(shí)，可通過(guò)去活化壓制旁瓣，使得只有較窄的主要最大值保持在去活化光束的中心。貝塞爾光束還具有以下優(yōu)點(diǎn)，可以至少部分地改善相對(duì)不透明的部分，從而進(jìn)一步減少幕簾效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，照射光源為脈沖光源；照射光束為多光子激光束； 且多光子信號(hào)在ζ方向上被檢測(cè)。其特別的優(yōu)點(diǎn)在于，SPIM檢測(cè)光學(xué)元件具有更大的數(shù)值孔徑，因此在檢測(cè)多光子信號(hào)時(shí)提供了較高的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，照相機(jī)為快速照相機(jī)，其不僅適于檢測(cè)SPIM信號(hào)，還適于檢測(cè)多光子信號(hào)?？焖僬障鄼C(jī)例如可以達(dá)到每秒1000幅圖像，格式為51&512。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，提供可換向的鏡，其可從ζ方向提取多光子信號(hào)且將其導(dǎo)向至光檢測(cè)器。光檢測(cè)器通常比照相機(jī)速度快，但不能提供定位，然而如果通過(guò)多光子照明光束實(shí)現(xiàn)定位的話，這完全不必要；特別是在多光子照明時(shí)，這更容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)檫@種類型的照明幾乎可以及時(shí)準(zhǔn)確地知道物體中哪部分特定體積在任何給定點(diǎn)處被照射了，從而檢測(cè)到來(lái)自所有可能方向上的信號(hào)檢測(cè)光。


以下參照附圖對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行討論。其中，圖1為根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)的示意性基本原理透視圖；圖2為根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)的照射光束路徑與檢測(cè)光束路徑的示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的示意圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明顯微鏡的從χ掃描方向觀察的示意圖，包括激發(fā)光束，去活化光束和檢測(cè)光束路徑；圖5是圖4所示的顯微鏡從y照射方向觀察的示意圖；圖6是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)描述的STED原理的示意圖；圖7是描述由通過(guò)相移片調(diào)制STED去活化光束(deactivation beam)的示意圖；圖示出了激發(fā)光束的截面以及在χ、y和ζ坐標(biāo)系中的相關(guān)強(qiáng)度分布；圖8b示出了相比較的激發(fā)光束與活化光束，以及通過(guò)在χ方向上的掃描生成的連續(xù)片光源和在χ、y和ζ坐標(biāo)系中的相關(guān)強(qiáng)度分布；以及圖9為本發(fā)明另一實(shí)施例的示意圖，其另外采用SPIM檢測(cè)光學(xué)元件檢測(cè)多光子信號(hào)。
具體實(shí)施例方式圖1示出了根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的SPIM顯微鏡的簡(jiǎn)化后原理圖，該顯微鏡的工作原理基于“有選擇性的平面成像”技術(shù)。由片光源實(shí)現(xiàn)y方向上的照射，用于只照射物平面內(nèi)的物體。檢測(cè)方向基本垂直于片光源1(即在ζ方向上)延伸，其中對(duì)檢測(cè)光的檢測(cè)由物鏡3實(shí)現(xiàn)。如圖1所示，片光源1應(yīng)該在其內(nèi)部區(qū)域內(nèi)特別薄，從而在ζ方向上獲得高分辨率。當(dāng)片光源1在物體中的聚焦較窄時(shí)，能實(shí)現(xiàn)高分辨率。如下面將更詳細(xì)解釋，聚焦的長(zhǎng)度是可控的使得被成像的視場(chǎng)更大，但這樣會(huì)降低聚焦的清晰度，并降低片光源1的寬窄度，從而減低圖片在ζ方向上的分辨率。根據(jù)特定場(chǎng)合的應(yīng)用，也許有用的是基于更厚的片光源，降低ζ方向上的分辨率，但同時(shí)能看到更大的視場(chǎng)和更大的成像體積。如果生成的圖像還能允許觀察圖像的關(guān)注區(qū)域，那么更大的成像體積也許是有用的，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)更大圖像體積的優(yōu)點(diǎn)在于，更容易確認(rèn)被成像體積確實(shí)包含了所關(guān)注的區(qū)域。如果在形成被關(guān)注區(qū)域的圖像時(shí)需要用更高的分辨率，可以借助變焦光學(xué)元件調(diào)節(jié)連續(xù)的片光源1的聚焦，使該聚焦更小但更清晰。與共焦掃描顯微技術(shù)相比，SPIM技術(shù)在對(duì)ζ方向上檢測(cè)光進(jìn)行檢測(cè)時(shí)要求定位被檢測(cè)光，因?yàn)镾PIM技術(shù)是一種寬視場(chǎng)顯微技術(shù)。該定位一般通過(guò)照相機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如CXD 照相機(jī)或CMOS照相機(jī)。如果應(yīng)該由SPIM技術(shù)生成物體的三維圖像，可以在ζ方向上掃描片光源1，然后把在不同照射面內(nèi)獲得的圖像組合成三維圖像。該成像過(guò)程也稱為“重現(xiàn)”， 此時(shí)為ζ方向上的重現(xiàn)。圖2示意性示出了根據(jù)現(xiàn)有SPIM技術(shù)的照射光束路徑。激光器4產(chǎn)生照射光束 5，其穿過(guò)擴(kuò)束器傳輸?shù)綔?zhǔn)直透鏡6內(nèi)，接著由柱面透鏡7聚焦成片光源1至物體上。物鏡透鏡收集檢測(cè)光束并將其導(dǎo)入照相機(jī)9。通過(guò)移動(dòng)透鏡組中的元件可以調(diào)節(jié)片光源的焦距， 在圖2的這個(gè)極其簡(jiǎn)化的示例中，可以相對(duì)準(zhǔn)直透鏡6移動(dòng)柱面透鏡7來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的SPIM顯微鏡的示意性結(jié)構(gòu)，其中參考數(shù)字10表示照明光束路徑，參考數(shù)字11表示SPIM-檢測(cè)光束路徑。照明光束路徑10還包括提供共焦檢測(cè)光束路徑的功能，但是后者的延伸方向與照明方向相反。首先描述一下照明光束路徑；激光器4產(chǎn)生照明光，該照明光經(jīng)掃描儀12傳送至變焦光學(xué)元件13。掃描儀12產(chǎn)生連續(xù)片光源1用于照明物體2。為了連續(xù)產(chǎn)生片光源1， 照明激光束在χ方向上進(jìn)行掃描，即分別沿圖3所示的從外向里的方向或從里向外的方向掃描。激光束例如可以具有圓形橫截面，但可替代地，也可以調(diào)節(jié)橫截面的形狀，例如為橢圓形橫截面，其中橢圓形的長(zhǎng)軸在χ方向上延伸。類似地，照明光束路徑例如可以為矩形或任一其他可選擇的形狀。SPIM檢測(cè)光束路徑11沿ζ方向延伸，即與照明光束路徑10的延伸方向(y方向) 基本垂直。使照明光束路徑與檢測(cè)光束路徑間的垂直關(guān)系稍有偏離是有益的，例如兩個(gè)路徑間的夾角可比90°稍小或稍大，這樣可為物體中的顆粒或局部產(chǎn)生背景照明。還可以從不同角度檢測(cè)圖像，然后將它們合成，例如與公知的SPIM技術(shù)相同。為了保持描述上的簡(jiǎn)化，下面描述的關(guān)系為矩形的，但應(yīng)理解的是其還包含了偏離角度，即比90°稍大或稍小。 由物體2發(fā)出的檢測(cè)光(反射或發(fā)射熒光)被物鏡3收集。對(duì)于多色檢測(cè)來(lái)說(shuō)，尤其需要在物鏡下游提供濾光片14，其能夠?yàn)V過(guò)特定波長(zhǎng)的檢測(cè)光，然后該檢測(cè)光經(jīng)管狀透鏡15被導(dǎo)向至照相機(jī)16，例如CXD照相機(jī)16。為了生成三維圖像，載物臺(tái)17可在ζ方向上被掃描用于連續(xù)照射物體2內(nèi)不同的照射面，每個(gè)照射面由在X方向上掃描的掃描激光束掃描且由在各個(gè)照射面內(nèi)連續(xù)形成的片光源1連續(xù)照射。在Z方向上連續(xù)形成的多個(gè)相鄰的片光源1可通過(guò)Z方向上的“重現(xiàn)” 被合成。如果需要通過(guò)ζ向驅(qū)動(dòng)的“重現(xiàn)”生成三維圖像，那么移動(dòng)物體2的好處是，物體內(nèi)每個(gè)相鄰的照射面與物鏡間的距離保持相同，因?yàn)檎丈涔馐奈恢煤驼障鄼C(jī)16的位置均沒有變化?？商娲兀梢杂衫鐧z流計(jì)(galvanometer)在ζ方向上掃描片光源1。然而，這也需要移動(dòng)物鏡3，使每個(gè)照射面與物鏡間的距離保持相同?？商娲兀梢砸苿?dòng)包括物鏡3、濾光片14、管狀透鏡15以及照相機(jī)16的整個(gè)SPIM檢測(cè)光學(xué)組件。如已提到，照明檢測(cè)光束路徑10還可提供共焦檢測(cè)光束路徑的功能，為此，提供檢測(cè)器18用于檢測(cè)y方向上的從物體反射的檢測(cè)光和/或檢測(cè)發(fā)出的熒光。在用SPIM技術(shù)通過(guò)檢測(cè)光束路徑11進(jìn)行圖像檢測(cè)的同時(shí)，還可以平行地進(jìn)行共焦圖像檢測(cè)，因?yàn)槠庠?由χ方向上的掃描連續(xù)地生成。該共焦生成的圖像比由SPIM檢測(cè)所檢測(cè)到的圖像少一個(gè)維度。例如，如果由SPIM生成的是二維圖像，即只在一個(gè)獨(dú)立像平面內(nèi)的圖像，那么還可以檢測(cè)到稱為x_t的圖像，即一維行圖像。這例如可用來(lái)確定特定分子的擴(kuò)散速率，該特定分子可以由標(biāo)記物所標(biāo)記或被染色用于發(fā)出熒光，然而同時(shí)成像的二維SPIM圖像可以提供不同的信息，例如關(guān)于在被成像物體的像平面內(nèi)哪些分子與其他分子相結(jié)合的信息。這同樣可應(yīng)用到通過(guò)SPIM檢測(cè)用ζ驅(qū)動(dòng)生成三維圖像的情況，即可以生成共焦二維圖像。通過(guò)這種方式可以例如用來(lái)確定在三維圖像中的物體內(nèi)哪些分子與其他分子相結(jié)合，并可同時(shí)確定穿過(guò)特定平面擴(kuò)散的分子的擴(kuò)散速率。對(duì)于在檢測(cè)“η”維SPIM圖像時(shí)同時(shí)檢測(cè)到的并行共焦生成的“η-?！S圖像，可以結(jié)合其額外的確定信息，例如結(jié)合其額外的速度信息來(lái)確定哪些獨(dú)立單元(例如分子或其他單元)在物體2內(nèi)移動(dòng)。因此，在顯微鏡領(lǐng)域中，這可應(yīng)用到有生命的有機(jī)體內(nèi)。圖4示出本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例。使用之前附圖中相同的參考數(shù)字來(lái)表示類似的元件。該圖中，仍用參考數(shù)字10表示照明光束路徑，參考數(shù)字11表示SPIM-檢測(cè)光束路徑。 在該圖4的實(shí)施例中，照明光束路徑10還具有檢測(cè)光束路徑的額外功能，其中共焦檢測(cè)光 21穿過(guò)孔20，通過(guò)光電二極管19接收并實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)，然后信號(hào)經(jīng)過(guò)圖像處理單元22傳送至監(jiān)視器23內(nèi)。檢測(cè)光由分色鏡M反射至光電二極管19?？梢蕴峁┢渌鈱W(xué)傳感器來(lái)替代光電二極管19，例如雪崩二極管、光電倍增管或照相機(jī)。因?yàn)檫@些與共焦圖像檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，所以不需要定位，原因是關(guān)于定位的信息由被掃描的照明光束提供，即如果及時(shí)知道在特定點(diǎn)處物體的哪個(gè)成像點(diǎn)被照射，那么就獲知了這樣的信息，即從該特定成像點(diǎn)接收的信號(hào)來(lái)自于正好在接收信號(hào)之前被照射的成像點(diǎn)的信號(hào)。因此，共焦檢測(cè)不需要照相機(jī)。為了改變連續(xù)產(chǎn)生的片光源1的焦點(diǎn)，可以在y方向上相對(duì)另一透鏡沈移動(dòng)變焦透鏡25。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可以為此提供一透鏡組，但簡(jiǎn)化起見，所討論的實(shí)施例僅具有一個(gè)獨(dú)立的變焦透鏡25。變焦光學(xué)元件13與照明物鏡(顯宏物鏡)組合，從而提供光學(xué)變焦以調(diào)節(jié)焦距范圍27的長(zhǎng)度。為了簡(jiǎn)化，圖4中省去了 SPIM檢測(cè)光學(xué)元件的細(xì)節(jié)，因?yàn)檫@些光學(xué)元件在圖3中已示出，包括物鏡3、濾色片14和管狀透鏡15。圖中示意性示出的CXD照相機(jī)16給接收到的ζ方向上的檢測(cè)光提供了 χ-y平面內(nèi)的定位。由CCD照相機(jī)接收的信號(hào)經(jīng)SPIM圖像處理單元觀處理且轉(zhuǎn)至SPIM監(jiān)視器四。如果需要照射物體2內(nèi)的多個(gè)平面， 可沿ζ方向移動(dòng)載物臺(tái)17。從圖4可以清楚地理解，表示照射平面與CCD照相機(jī)間距離的長(zhǎng)度L通常保持不變。如參照?qǐng)D3已說(shuō)明，還可以在ζ方向上移動(dòng)照射光束同時(shí)保持物體2 的位置不變，從而替代移動(dòng)CCD照相機(jī)，因?yàn)檫@更易于改變物鏡3相對(duì)CCD照相機(jī)16的位置。圖5示出了從另一不同觀察角度所觀察到的圖4的實(shí)施例，其中沿照明光束，也就是y方向觀察。這里特別示意出單個(gè)成像點(diǎn)30，其在χ方向上被掃描用以產(chǎn)生連續(xù)形成的片光源1。分色鏡M朝光電二極管19的方向偏轉(zhuǎn)檢測(cè)光?？稍讦品较蛏蠏呙栎d物臺(tái)17， 艮口，可以朝著CCD照相機(jī)16移動(dòng)，也可以遠(yuǎn)離于CCD照相機(jī)移動(dòng)，用于照射物體內(nèi)不同的照射面。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，可通過(guò)使用STED去活化光束(受激發(fā)射損耗)進(jìn)一步窄化片光源1，即，使片光源1變得更薄以在Z方向上實(shí)現(xiàn)更高分辨率。本領(lǐng)域已知的STED顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)如圖6所示。激發(fā)光束31和去活化光束32由光束組合器組合成(在該實(shí)施例中例如為分色濾光器)共同光束路徑34，然后導(dǎo)向穿過(guò)物鏡3到物體2上。在該光路中可以提供數(shù)個(gè)其他光學(xué)元件，例如透鏡、光導(dǎo)纖維或?yàn)V色片。一般可調(diào)制去活化光束的強(qiáng)度分布，例如可通過(guò)相移片來(lái)調(diào)制，但還可以通過(guò)為此目的而具有特殊結(jié)構(gòu)的透鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)。在調(diào)制時(shí)，使去活化光束的中間為零點(diǎn)，這意味著在該零點(diǎn)處強(qiáng)度為零或非常低，而在該零點(diǎn)周圍提供均勻、圓形的強(qiáng)度極值。在熒光顯微技術(shù)中用以在特定激發(fā)波長(zhǎng)和去活化波長(zhǎng)處進(jìn)行反應(yīng)的染料也可以被用來(lái)激發(fā)熒光或去活化熒光。一般激發(fā)波長(zhǎng)和去活化波長(zhǎng)彼此是有區(qū)別的，而且通常以時(shí)間延遲的方式將激發(fā)光束和去活化光束分別傳送到對(duì)象上。通過(guò)激發(fā)，具有特定尺寸的成像點(diǎn)受激發(fā)射出熒光，與此同時(shí)立即在該激發(fā)中心周圍施加去活化，使得由物體的該成像點(diǎn)發(fā)出的熒光變窄而形成小成像點(diǎn)，由此提高分辨率。對(duì)于彩色熒光顯微技術(shù)，可以使用各種不同的染料，這些染料通過(guò)不同的激發(fā)波長(zhǎng)相區(qū)分，即，用于發(fā)射熒光的特定強(qiáng)激發(fā)的各種波長(zhǎng)的激發(fā)光。優(yōu)選地，可以選擇染料進(jìn)行組合，使得它們可以被共同且相同的去活化波長(zhǎng)去活化，從而不必提供不同的去活化波長(zhǎng)。從物體返回的檢測(cè)光35穿過(guò)物鏡3，由分束器(此情況下為分光鏡37)傳送通過(guò)透鏡和合適的孔徑38至光檢測(cè)器36上，所述孔徑用于消除散射光。圖7示意了由相移片39調(diào)節(jié)去活化光束40。使用該相移片39可調(diào)節(jié)相位以及強(qiáng)度分布。為此，相移片被設(shè)計(jì)為調(diào)節(jié)去活化光束40，而不是激發(fā)光束41，即該調(diào)節(jié)取決于與激發(fā)光束41不同的去活化光束40的波長(zhǎng)?？梢岳斫獾氖牵€可以在圖4所示的照明光束路徑10中實(shí)施STED原理。除了把激光器4用于照明光外(在該情況下等于激發(fā)光)，還可以提供其他激光器用于產(chǎn)生去活化光。激勵(lì)光束和去活化光束可以如圖6所示的組合成一個(gè)光路路徑，也可以使去活化光束沿一個(gè)單獨(dú)的光束路徑傳送。還可以僅使用一個(gè)單獨(dú)激光器4(白色激光器)產(chǎn)生激發(fā)光束和去活化光束。為此，將光束分離，使一部分光束穿過(guò)聲光元件(例如聲光可調(diào)諧濾波器，A0TF)，其中可以選擇所期望的波長(zhǎng)。通過(guò)使用脈沖激光器，可以憑所謂的延遲階段實(shí)現(xiàn)激發(fā)光束與去活化光束間的時(shí)間延遲。
圖8a和圖8b示出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例。圖8a示出了激發(fā)光束41的圓形截面。 圖8a和圖8b還示出了圖4和圖5中所示的x、y、z方向。圖右側(cè)示出的是激發(fā)光束的強(qiáng)度分布輪廓，該輪廓基本符合高斯分布-除了由于衍射效應(yīng)旁瓣部分相對(duì)較低。圖8b示出了去活化光束40，其被調(diào)制成在激發(fā)光束41兩側(cè)具有最大強(qiáng)度，而在這兩個(gè)最大強(qiáng)度之間有一零點(diǎn)，即強(qiáng)度為零或至少非常低。從圖8b中可以看出，位于零點(diǎn)兩側(cè)的該去活化光束40 的最大強(qiáng)度處，光束的截面非圓形，與遠(yuǎn)離激發(fā)中心的一側(cè)相比，截面中面向激發(fā)中心這一側(cè)的曲率較平坦。由于連續(xù)產(chǎn)生的片光源1(如圖8b中所示的虛線區(qū)域)，去活化光束只有在中心部分內(nèi)的一小條區(qū)域內(nèi)沒有去活化熒光。在挨著激發(fā)光束41、去活化光束40和連續(xù)產(chǎn)生的片光源1的截面的右側(cè)，也就是在圖8b中，示意出激發(fā)光束41和去活化光束40的強(qiáng)度分布?？梢粤硗庥羞x擇性地開啟或關(guān)閉STED-去活化光束，例如可以只在χ方向上的某行或某個(gè)像素上實(shí)現(xiàn)。由于當(dāng)去活化光束打開或關(guān)閉時(shí)，已獲知該信息，可以將各自的數(shù)據(jù)流分開，即分成第一數(shù)據(jù)流和第二數(shù)據(jù)流，所述第一數(shù)據(jù)流基于較厚的片光源產(chǎn)生圖像且覆蓋較大的照明區(qū)域(相比于照明焦點(diǎn)的截面)和較大的照明體積，所述第二數(shù)據(jù)流基于較薄的片光源產(chǎn)生圖像且覆蓋較小的照明區(qū)域(與照明焦點(diǎn)的截面相關(guān))和較小的照明體積，這就同時(shí)產(chǎn)生了因加入STED-光束而在ζ方向上形成的高分辨率圖像，以及因沒加入 STED-光束而在ζ方向上形成的低分辨率圖像，但帶來(lái)的優(yōu)點(diǎn)是物體內(nèi)照射的體積更大。除可加入或關(guān)閉STED-光束外，本發(fā)明的顯微鏡還可并行產(chǎn)生η維的SPIM顯微鏡圖像和η-1維的共焦產(chǎn)生圖像，然而通過(guò)另外開啟或關(guān)閉STED-光束也可以在ζ方向上并行產(chǎn)生具有高分辨率或低分辨率的這些圖像?？偠灾梢酝瑫r(shí)產(chǎn)生4個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)流， 用以產(chǎn)生以下數(shù)據(jù)集i)高分辨率的三維數(shù)據(jù)集(SPIM)，但物體被成像部分的體積較?。籭)低分辨率的三維數(shù)據(jù)集(SPIM)，但物體被成像部分的體積較大；iii) ζ方向上高分辨率的二維共焦圖像；以及iv) ζ方向上低分辨率的二維共焦圖像。如果用片光源僅照射一個(gè)面，可以同時(shí)生成以下這些圖像i)高分辨率的二維圖像(SPIM)，但物體被成像部分的體積較??；i)低分辨率的二維圖像(SPIM)，但物體被成像部分的體積較大；iii) ζ方向上高分辨率的x_t —維共焦圖像；以及iv) ζ方向上低分辨率的χ-t —維共焦圖像。片光源在ζ方向上的維度不取決于χ方向上的維度，即，可以選擇不同的圖像格式，例如χ方向上的像素?cái)?shù)量為512，但ζ方向上的像素?cái)?shù)量可以更多或更少。為了實(shí)現(xiàn)ζ 方向上的連續(xù)數(shù)據(jù)集，需要在ζ方向上實(shí)現(xiàn)進(jìn)給運(yùn)動(dòng)，從而保證有部分重疊(Nyquist，奈奎斯特原理)。圖9示出了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，其中與圖3相同的零部件由相同的參考數(shù)字表示。另外，除了變焦光學(xué)元件13外，還提供了照明物鏡42。該照明物鏡還可以是光學(xué)變焦的一部分，例如根據(jù)圖4所示實(shí)施例的示例。與帶有連續(xù)激光器(連續(xù)波CW)的照明系統(tǒng)相比，還可以使用脈沖激光器用于多光子熒光顯微鏡，從而傳送長(zhǎng)波長(zhǎng)但能量相對(duì)較低的激發(fā)光子，這在避免對(duì)樣品造成損傷(這對(duì)生物樣品特別重要)時(shí)尤其適用。與檢測(cè)SPIM-信號(hào)類似，多光子信號(hào)可由可換向的鏡43從沿ζ方向延伸的檢測(cè)光束路徑44中提取，且通過(guò)光電倍增管或雪崩光電二極管45 檢測(cè)。除此之外，SPIM-信號(hào)可以由照相機(jī)16檢測(cè)，如參考圖3所描述。如果照相機(jī)16工作速度足夠快，作為圖9所示的實(shí)施例的另一種變形，可以免去可換向的鏡43，取而代之地用照相機(jī)16檢測(cè)多光子信號(hào)。如果多光子照明與檢測(cè)ζ方向上的信號(hào)(即垂直于照明方向)在一起，物體上的每個(gè)照明點(diǎn)在照相機(jī)16上成像為一行，并且通過(guò)在χ方向上進(jìn)行掃描，在χ方向上延伸的物體的連續(xù)掃描行將在照相機(jī)16上連續(xù)照射成一區(qū)域，該區(qū)域需要用軟件來(lái)縮小，以使數(shù)據(jù)縮小成一行。通過(guò)ζ方向上的連續(xù)掃描， 物體的數(shù)行被檢測(cè)并且被進(jìn)一步處理成物體某一區(qū)域的圖像。簡(jiǎn)而言之，該SPIM信號(hào)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的變形可用于具有快速照相機(jī)的多光子信號(hào)檢測(cè)，該照相機(jī)的檢測(cè)例如可以達(dá)到每秒1000張，每張格式為51&512。用于多光子信號(hào)檢測(cè)的SPIM信號(hào)檢測(cè)結(jié)構(gòu)的特殊有點(diǎn)是明顯增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度， 除其他原因外，主要有以下幾點(diǎn)為了產(chǎn)生片光源，使用數(shù)值孔徑小的照明物鏡，例如數(shù)值孔徑在0.04NA范圍內(nèi)的物鏡。如果現(xiàn)在用SPIM檢測(cè)路徑檢測(cè)由多光子照射產(chǎn)生的信號(hào)， 所得到的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高，因?yàn)樗褂玫奈镧R的數(shù)值孔徑已經(jīng)高得多(NA，例如1.0NA)。 這意味著信號(hào)強(qiáng)度將增大超過(guò)20倍。如果用SPIM檢測(cè)光束路徑(ζ方向上)來(lái)檢測(cè)熒光且該光被傳送至光電倍增管、 APD或APD陣列，或根據(jù)以上所描述的變形，被直接傳送至快速照相機(jī)，那么通過(guò)照明光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)的在y方向上的信號(hào)檢測(cè)效率要高得多，這是因?yàn)檎彰飨到y(tǒng)的數(shù)值孔徑一般比 SPIM布置的檢測(cè)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑小。采用多光子檢測(cè)具有諸多優(yōu)點(diǎn)。幾乎只有在焦點(diǎn)處才能激發(fā)出熒光，因?yàn)榧ぐl(fā)需要有數(shù)個(gè)光子大約同時(shí)到達(dá)，而這只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生，或者換言之，在焦點(diǎn)以外激發(fā)的可能性非常低。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)使用紅外范圍內(nèi)的波長(zhǎng)時(shí)(散射較少)，穿透深度較大。還有一個(gè)有點(diǎn)是不需要針孔，因?yàn)樗邪l(fā)射光都被分配至照明焦點(diǎn)。這還便于從各個(gè)方向收集光束。相反，共焦顯微鏡需要阻擋降低信號(hào)強(qiáng)度的散射光和反射光。除具有使信號(hào)強(qiáng)度增大、降低照明強(qiáng)度進(jìn)而避免損傷樣品的這些優(yōu)點(diǎn)外，該方案還提供了結(jié)構(gòu)上的優(yōu)點(diǎn)，即， 已提供用于檢測(cè)的SPIM顯微鏡光學(xué)元件還可以被用來(lái)進(jìn)行多光子信號(hào)檢測(cè)，因此在不用再投入結(jié)構(gòu)成本而僅投入相對(duì)較低的軟件成本的情況下，可以具有所有這些優(yōu)點(diǎn)。STED技術(shù)還可以用于多光子照射，從而使分辨率從多光子模式下的大約300nm提高到多光子加STED模式下的幾個(gè)納米。從軟件角度考慮，還可以把由照相機(jī)16檢測(cè)的數(shù)據(jù)分成行和像素用以同時(shí)產(chǎn)生 SPIM圖像和多光子圖像。可以在SPIM模式和多光子模式間切換，或者在可替代的實(shí)施例中，增加一種同時(shí)在SPIM模式和多光子模式下工作的切換選擇。綜上所述，根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡使用了共焦顯微鏡的一部分，即照明光學(xué)元件，用于產(chǎn)生基于SPIM技術(shù)的圖像，其中照明光學(xué)元件還可以變成變焦光學(xué)元件，并且根據(jù)本發(fā)明，還可以生成比由SPIM技術(shù)生成的圖像低一維的共焦圖像，或者在可替代的實(shí)施例中， 除了共焦圖像，還可以生成多光子圖像，也可以用來(lái)替代由SPIM技術(shù)生成的圖像。這樣不僅能更靈活地控制由SPIM技術(shù)生成的圖像，還可由共焦或多光子檢測(cè)獲得額外的圖像信息，并且根據(jù)具體應(yīng)用，可以把SPIM和/或多光子圖像的交疊組合成最終圖像。通過(guò)增添或關(guān)閉STED光束，可以進(jìn)一步控制光束，且可以產(chǎn)生能提供給各種圖像的額外數(shù)據(jù)流，并且還具有同時(shí)產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)。由此，提供一種具有多方面應(yīng)用的顯微鏡，該顯微鏡具有使調(diào)制圖像與可大量分析的圖像信息產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的可能性。
權(quán)利要求
1.一種SPIM顯微鏡，包括光源G)，其從y方向發(fā)送照射光束(5，41)至待成像的物體( 上；和照相機(jī)(16)，其以ζ方向作為第一檢測(cè)方向檢測(cè)從所述物體上發(fā)出的熒光和/或反射光，其中ζ方向沿與y方向基本垂直的方向延伸，其特征在于，χ掃描儀(12)，其通過(guò)在χ方向上掃描照射光束(5，41)產(chǎn)生連續(xù)片光源，其中χ方向沿與y方向和ζ方向基本垂直的方向延伸，且片光源⑴在由χ方向和y方向所限定的平面內(nèi)連續(xù)形成；和照明光學(xué)元件，包括提供在照明光束(5，41)的光束路徑上的變焦光學(xué)元件，該變焦光學(xué)元件適于改變照明光束(5，41)的焦距。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，光檢測(cè)器(19)檢測(cè)由物體(2)發(fā)出的位于與y方向相反方向上的檢測(cè)光，該檢測(cè)光的方向?yàn)榈诙z測(cè)方向，檢測(cè)光為熒光和/或反射光。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)SPIM技術(shù)在ζ方向上生成2 維寬視場(chǎng)圖像的同時(shí)，并行生成物體O)的共焦1維圖像，該共焦1維圖像為在X方向上延伸的一行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，第一ζ掃描儀在ζ方向上移動(dòng)物體0)，使得在ζ方向上在各自照射面內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)彼此間隔的連續(xù)片光源(1)，其中各個(gè)片光源⑴和照相機(jī)(16)間的距離(L)保持不變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，圖像處理單元08)將與在ζ方向上彼此間隔一定距離的多個(gè)片光源(1)中的每個(gè)相關(guān)聯(lián)的連續(xù)生成圖像合成為三維圖像。
6.根據(jù)權(quán)利要求2和5相結(jié)合的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)SPIM技術(shù)生成3維圖像的同時(shí)，并行生成物體O)的共焦2維圖像，該共焦2維圖像位于由χ方向和ζ方向所限定的平面內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，第二ζ掃描儀，其相對(duì)于物體(2)在ζ方向上移動(dòng)照明光束(5，41)用于在ζ-方向上連續(xù)產(chǎn)生多個(gè)彼此間隔的片光源 ⑴，和第三ζ掃描儀，其根據(jù)第二 ζ掃描儀在ζ方向上對(duì)照明光束(5，41)的偏轉(zhuǎn)跟蹤檢測(cè)光束路徑(11)，使得片光源(1)和照相機(jī)(16)間的距離保持不變。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，圖像處理單元08)將與在ζ方向上彼此間隔一定距離的多個(gè)片光源(1)相關(guān)聯(lián)的連續(xù)生成的圖像合成為三維圖像。
9.根據(jù)權(quán)利要求2和8相結(jié)合的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)SPIM技術(shù)生成3維圖像的同時(shí)，并行生成物體O)的共焦2維圖像，該共焦2維圖像位于由χ方向和ζ方向所限定的平面內(nèi)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，適于改變照明光束(5， 41)焦距的變焦光學(xué)元件(1 為光學(xué)變焦的，具有彼此間能機(jī)械移動(dòng)的透鏡組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)變焦光學(xué)元件(13)，能夠通過(guò)改變數(shù)值孔徑來(lái)擴(kuò)大或縮短照明光束(5，41)的焦距，且由此擴(kuò)大或縮短在y照射方向上由片光源(1)照射的區(qū)域的長(zhǎng)度。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于電子變焦元件，其適于改變?chǔ)址较蛏系膾呙栝L(zhǎng)度。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)電子變焦元件使χ方向上的圖像像素?cái)?shù)量保持不變，且該數(shù)量與χ方向上已選定的掃描長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。
14.根據(jù)權(quán)利要求4至13之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)電子變焦元件改變?chǔ)品较蛏系膾呙栝L(zhǎng)度，且沿該ζ方向連續(xù)生成多個(gè)彼此間隔的片光源(1)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，通過(guò)電子變焦元件使ζ方向上彼此間隔的片光源(1)的數(shù)量保持不變，且該數(shù)量與ζ方向上已選定的掃描長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，將在χ方向上被掃描的照明光束(5，14)在返回點(diǎn)處或其附近關(guān)閉，在該返回點(diǎn)處獲得在χ方向上的最大掃描長(zhǎng)度。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，照相機(jī)(16)為從包括 CMOS照相機(jī)CCD照相機(jī)或陣列檢測(cè)器的組中選擇的區(qū)域檢測(cè)器。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，切換器適于在以下工作模式間切換與y照明方向相反的檢測(cè)光的共焦檢測(cè)；ζ方向?qū)捯晥?chǎng)檢測(cè)光的SPIM檢測(cè)；以及前述共焦檢測(cè)與SPIM檢測(cè)的同時(shí)檢測(cè)。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，去活化光源從y方向發(fā)出去活化光束GO)至物體( 上，使連續(xù)產(chǎn)生的片光源(1)在ζ方向上更薄，其中去活化光束GO)在ζ方向上相對(duì)于照明光束有偏移地被發(fā)射且平行于照明光束在χ方向上被掃描。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，激發(fā)光束調(diào)制器適于把激發(fā)光束調(diào)制成貝塞爾光束。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，照明光源(4)為脈沖激光；照明光束為多光子激光光束；以及多光子信號(hào)在ζ方向上被檢測(cè)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，照相機(jī)(16)為快速照相機(jī)，其不僅適于檢測(cè)SPIM信號(hào)，還適于檢測(cè)多光子信號(hào)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的SPIM顯微鏡，其特征在于，可換向的鏡可從ζ方向提取多光子信號(hào)且將其導(dǎo)向至光檢測(cè)器G5)。
全文摘要
描述了一種具有y方向照明光源和z方向檢測(cè)光照相機(jī)的SPIM顯微鏡(選擇性平面照射顯微鏡)。x掃描儀通過(guò)在x方向上掃描照明光束產(chǎn)生連續(xù)片光源。由于照明光學(xué)元件包括提供在照明光束的光束路徑上的變焦光學(xué)元件，從而可以改變照明光束的焦距。
文檔編號(hào)G02B21/36GK102455501SQ201110326240
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者W·克內(nèi)貝爾, W·奧斯特賴克 申請(qǐng)人:徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司