專利名稱：穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于光學(xué)顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡。
背景技術(shù)：
熒光顯微鏡是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)研究中的一個(gè)重要工具。其中，基于熒光材 料單光子過(guò)程的共聚焦熒光顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度和高放大率等特點(diǎn)，已經(jīng)成 為細(xì)胞形態(tài)學(xué)、(分子)細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中不可缺少的研究工 具。但它也有固有的缺陷，如樣品容易被光漂白，不能完全消除生物樣品自發(fā)熒光的干擾， 使用紫外光和藍(lán)光等短波長(zhǎng)的激光作為激發(fā)光造成成像深度有限(幾十微米)，同時(shí)短波 長(zhǎng)的光容易損傷生物樣品。隨后發(fā)展起來(lái)的雙光子熒光顯微鏡采用波長(zhǎng)在紅外光區(qū)的飛秒 激光作為激發(fā)光源，減小了激發(fā)光對(duì)生物樣品的光損傷，提高了成像深度(幾百微米)， 同時(shí)減弱了非焦面的光漂白。由于現(xiàn)有的熒光材料的雙光子吸收性能非常有限，雙光子顯 微鏡的激發(fā)光源必須使用昂貴的飛秒脈沖激光器( $200,000)，因此，基于飛秒激光技術(shù) 的雙光子熒光顯微鏡難以普及。此外，脈沖的飛秒激光具有極高的瞬時(shí)功率(峰值功率密 度一般大于(10"W/cm2)，所以焦點(diǎn)處的漂白不可避免，限制了雙光子熒光顯微鏡在生物樣 品長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)成像中的使用。
最近，穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在生物成像中的應(yīng)用引起了越來(lái)越多研究者的
重視。和傳統(tǒng)的熒光材料相比，這類材料具有特殊的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)，即能吸收兩個(gè)或兩
個(gè)以上低能光子而輻射一個(gè)高能光子，通常是將近紅外光轉(zhuǎn)換成可見(jiàn)光。采用近紅外光作
為激發(fā)光，可以減小激發(fā)光對(duì)生物樣品的損傷，提高成像深度，而使用廉價(jià)的穩(wěn)態(tài)激光器
(~$2，000)大大降低了儀器造價(jià)。另外，由于生物樣品內(nèi)源性熒光物質(zhì)不能被穩(wěn)態(tài)近紅外
激光激發(fā)，使用這類材料可以完全消除生物樣品自發(fā)熒光的干擾。因此，如果能將穩(wěn)態(tài)激
光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與顯微技術(shù)結(jié)合起來(lái)，發(fā)展一種新型的顯微鏡，則有望解決共聚
焦和雙光子熒光顯微鏡存在的一些問(wèn)題，為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)研究提供一種新的
方法。 發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的在于提供一種穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，該顯微鏡能直接對(duì) 具有穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料進(jìn)行成像，也可以將穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料引入細(xì)胞、組織或其它基質(zhì)中進(jìn)行成像。
本實(shí)用新型的技術(shù)解決方案是 一種穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，包括物鏡和載
物臺(tái)組成的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。由半導(dǎo)體激光器(中心波長(zhǎng)》800nm)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通 過(guò)光纖導(dǎo)入該顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中，沿該激光束前進(jìn)方向上依次放置有擴(kuò)束透鏡、光束整形 鏡和短通分色鏡(近紅外光反射，可見(jiàn)光透過(guò))，其中短通分色鏡與該激光束成45。C角放 置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該分色鏡的光軸上，在該分色鏡上方同軸地依次放置有發(fā)射 濾光片和檢測(cè)器，在該分色鏡下方同軸地依次放置有物鏡、樣品和載物臺(tái)，樣品位于載物 臺(tái)上。
本實(shí)用新型的工作過(guò)程是半導(dǎo)體激光器(中心波長(zhǎng)》800nm)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束經(jīng) 過(guò)擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束較大的平行光束，短通分色鏡(近紅外光反射，可見(jiàn) 光透過(guò))使光束偏轉(zhuǎn)90。C，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中具有穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn) 換發(fā)光性質(zhì)的材料在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各方向的上轉(zhuǎn)換發(fā)光， 一部分上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)由 物鏡收集轉(zhuǎn)換成平行光束，通過(guò)該短通分色鏡(近紅外光反射，可見(jiàn)光透過(guò))，再通過(guò)發(fā) 射濾光片， 一定波長(zhǎng)范圍的信號(hào)被截取，然后被檢測(cè)器接收。
本實(shí)用新型與已有的熒光顯微成像技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1.由于生物樣品內(nèi)源性 熒光物質(zhì)和常用的有機(jī)熒光染料不能被穩(wěn)態(tài)近紅外激光器激發(fā)，因此本實(shí)用新型消除了生 物樣品自發(fā)熒光和有機(jī)熒光染料發(fā)光等背景熒光的干擾，是一種高靈敏度的成像技術(shù)。2. 由于穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在穩(wěn)態(tài)近紅外激光激發(fā)下幾乎不被光漂白，而且穩(wěn)態(tài) 近紅外激光對(duì)有機(jī)熒光染料的光漂白很弱，對(duì)生物樣品的損傷小，因此本實(shí)用新型是一種 能對(duì)生物樣品進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)觀察的成像技術(shù)。3.本實(shí)用新型采用半導(dǎo)體激光器作為激 發(fā)光源，和雙光子熒光顯微鏡采用的飛秒激光器相比，半導(dǎo)體激光器已經(jīng)國(guó)產(chǎn)化，價(jià)格低 廉，因此本實(shí)用新型易于推廣普及。


圖1是本實(shí)用新型的基本結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2是本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)例的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是用本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例獲得的穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、有機(jī)熒光染 料DAPI和DiI的光漂白實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)和(b)分別是在高功率980 nm穩(wěn)態(tài)激光(焦面 處功率約為19mW)和低功率543， 405 nm穩(wěn)態(tài)激光(焦面處功率分別約為15和0.8 pW) 同時(shí)照射下，有機(jī)熒光染料DAPI和DiI的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線。(c), (d)和(e) 分別是在高功率980， 543， 405nm穩(wěn)態(tài)激光(焦面處功率分別約為1.6， 0.13和19mW)同時(shí)照射下，有機(jī)熒光染料DAPI和DiI，以及穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)光強(qiáng)度隨 時(shí)間的變化曲線。
圖中標(biāo)號(hào)1為半導(dǎo)體激光器，2為擴(kuò)束透鏡，3為光束整形鏡，4為短通分色鏡，5
為發(fā)射濾光片，6為檢測(cè)器，7為物鏡、8為樣品，9為載物臺(tái)，IO為照明針孔，ll為反射
鏡，12為聚焦透鏡，13為探測(cè)針孔，14為光柵，15為計(jì)算機(jī)，16為掃描鏡。
具體實(shí)施方式

下面根據(jù)圖2給出本實(shí)用新型的一個(gè)較好的實(shí)施例，用以說(shuō)明本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)特征 和功能特點(diǎn)，而不是用來(lái)限定本實(shí)用新型的范圍。
如圖2所示，半導(dǎo)體激光器1產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通過(guò)光纖導(dǎo)入，沿該激光束前進(jìn)方向 上依次放置有擴(kuò)束透鏡2、光束整形鏡3、照明針孔10和短通分色鏡4，其中短通分色鏡 4與該激光束成45。C角放置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該分色鏡的光軸上，在該分色鏡下 方與光軸成45。C放置有反射鏡11，在該反射鏡的反射光束的前進(jìn)方向上依次放置有聚焦 透鏡12、探測(cè)針孔13、光柵14和光電倍增管檢測(cè)器6，其中光電倍增管檢測(cè)器與計(jì)算機(jī) 15連接。另外，在分色鏡4上方與激光束垂直的光軸上，同軸地放置有掃描鏡16、物鏡7、 載物臺(tái)9和樣品8，其中掃描鏡16與計(jì)算機(jī)15連接。本實(shí)施例中，通過(guò)光柵分光的方式 選擇一定波長(zhǎng)范圍的信號(hào)由檢測(cè)器6接收。同時(shí)在光路中引入照明針孔IO、探測(cè)針孔13 和掃描鏡16等組成的共聚焦掃描單元。計(jì)算機(jī)15與檢測(cè)器6和掃描鏡16連接，實(shí)現(xiàn)圖 像存儲(chǔ)及掃描控制。此外，通過(guò)步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載體臺(tái)9沿Z軸移動(dòng)可以獲得三維圖像。本 實(shí)施例中，半導(dǎo)體激光器采用中心波長(zhǎng)為980nm、輸出功率為0-600mW可調(diào)的國(guó)產(chǎn)激光 器(上海瀚宇光纖通信技術(shù)有限公司)，短通分色鏡為反射波長(zhǎng)大于850nm光，透過(guò)波長(zhǎng) 小于850 nm光的分色鏡(Model 850DMSP, OMEGA)，顯微鏡采用OLYMPUS 1X81倒置 顯微鏡，共聚焦掃描單元為OLYMPUS FVIOOO，檢測(cè)器是R6357 Enhanced model (HAMAMATSU)，圖像存儲(chǔ)、分析及掃描控制軟件為FV10-ASW (OLYMPUS)。
本實(shí)施例的工作過(guò)程是
半導(dǎo)體激光器(中心波長(zhǎng)為980 nm) 1發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡2和光束整形鏡3， 變成一束直徑較大的平行光束，通過(guò)照明針孔10后，短通分色鏡(反射波長(zhǎng)大于850nm 的光，透過(guò)波長(zhǎng)小于850nm的光)4使光束偏轉(zhuǎn)90。，經(jīng)過(guò)掃描鏡16后被物鏡7會(huì)聚在 物鏡的焦點(diǎn)上，樣品8中具有穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料在激光的激發(fā)下發(fā)射沿 各個(gè)方向的上轉(zhuǎn)換發(fā)光， 一部分上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)被物鏡7收集，經(jīng)過(guò)掃描鏡16和短通分 色鏡4后被反射鏡11反射，反射后的信號(hào)經(jīng)聚焦透鏡12，會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再 通過(guò)焦點(diǎn)處的探測(cè)針孔13和光柵14，由檢測(cè)器6接收。然后通過(guò)計(jì)算機(jī)15控制掃描鏡16，利用聚焦光斑掃描樣品的方式獲得一幅二維圖像。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載 體臺(tái)9沿Z軸移動(dòng)可以獲得三維圖像。
用本實(shí)施例對(duì)穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行二維成像，可以獲得清晰 的圖像。
用本實(shí)施例對(duì)穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料摻雜的PMMA膜進(jìn)行三維成像。 如圖3所示，用本實(shí)施例通過(guò)時(shí)間序列掃描成像的方法考察了它對(duì)穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)' 換發(fā)光材料、有機(jī)熒光染料DAPI和DiI的光漂白情況。圖中縱坐標(biāo)表示發(fā)光強(qiáng)度(歸一化 后)，橫坐標(biāo)表示時(shí)間。首先考察980nm穩(wěn)態(tài)激光對(duì)有機(jī)熒光染料的光漂白，(a)和(b) 分別是在高功率980nm穩(wěn)態(tài)激光(焦面處功率約為19mW)照射下有機(jī)熒光染料DAPI 和DiI發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線；此時(shí)需要將543， 405nm穩(wěn)態(tài)激光控制在很低的功率 (焦面處功率分別約為15和0.8 ^W)以得到DAPI和Dil圖像，同時(shí)盡量避免它們對(duì)DAPI 和DiI的漂白。由曲線(a)和(b)可知，經(jīng)過(guò)425s的連續(xù)照射，DAPI和DiI的信號(hào)強(qiáng) 度分別為初始強(qiáng)度的84%和90%。在只有相同功率的543,405 nm穩(wěn)態(tài)激光照射而沒(méi)有980 nm穩(wěn)態(tài)激光的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，DAPI和Dil的信號(hào)強(qiáng)度分別為初始強(qiáng)度的94。/。和99。/。。對(duì)比 兩組數(shù)據(jù)說(shuō)明穩(wěn)態(tài)近紅外激光對(duì)有機(jī)熒光染料的光漂白很弱。然后考察具有穩(wěn)態(tài)激光泵浦 上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料、有機(jī)熒光染料DAPI和DiI的光穩(wěn)定性，(c)， (d)和(e)分別 是在高功率980， 543， 405nm穩(wěn)態(tài)激光(焦面處功率分別約為1.6， 0.13和19mW)同時(shí) 照射下，有機(jī)熒光染料DAPI和DiI，以及穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí) 間的變化曲線。由曲線(c)， (d)和(e)可知，經(jīng)過(guò)425s的連續(xù)照射后，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材 料的發(fā)光強(qiáng)度仍然為初始值的96%。而DAPI和DiI的發(fā)光強(qiáng)度衰減得很快，經(jīng)過(guò)400s的 連續(xù)照射，DAPI和Dil的發(fā)光強(qiáng)度分別衰減到初始值的1%和2.5%。對(duì)比兩組數(shù)據(jù)說(shuō)明穩(wěn) 態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的光穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于有機(jī)熒光染料，它在穩(wěn)態(tài)近紅外激光激發(fā) 下幾乎不被光漂白。
權(quán)利要求1、一種穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡，其特征在于由擴(kuò)束透鏡、光束整形鏡、短通分色鏡、發(fā)射濾光片、檢測(cè)器、物鏡和載物臺(tái)組成，由半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通過(guò)光纖導(dǎo)入該顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中，沿該激光束前進(jìn)方向上依次為擴(kuò)束透鏡、光束整形鏡和短通分色鏡，其中短通分色鏡與該激光束成45℃放置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該分色鏡的光軸上，在該分色鏡上方同軸地依次放置發(fā)射濾光片和檢測(cè)器，在該分色鏡下方同軸地依次放置物鏡、樣品和載物臺(tái)，樣品位于載物臺(tái)上。
專利摘要本實(shí)用新型屬于光學(xué)顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡。該顯微鏡包括物鏡和載物臺(tái)組成的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。由半導(dǎo)體激光器產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束通過(guò)光纖導(dǎo)入該顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中，沿該激光束前進(jìn)方向上依次放置擴(kuò)束透鏡、光束整形鏡和短通分色鏡，其中短通分色鏡與該激光束成45℃角放置，在垂直于該激光束且穿過(guò)該分色鏡的光軸上，在該分色鏡上方同軸地依次放置有發(fā)射濾光片和檢測(cè)器，在該分色鏡下方依次放置有物鏡、樣品和載物臺(tái)。本實(shí)用新型能直接對(duì)具有穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料進(jìn)行成像，也可以將穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料引入細(xì)胞、組織或其它基質(zhì)中進(jìn)行成像。
文檔編號(hào)G02B21/00GK201242612SQ20082005961
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者余夢(mèng)曉, 李富友, 紅 楊 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)