一種新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制備與應(yīng)用。該酰胺酶Azl13的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其具有芳基?；０访富钚?。酰胺酶Azl13的編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。通過將酰胺酶Azl13的編碼基因連接到原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，再將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到酰胺酶Azl13。本發(fā)明的酰胺酶Azl13可用于治理苯胺酰胺類環(huán)境污染物，特別是敵稗。本發(fā)明采用基因工程菌生產(chǎn)酰胺酶Azl13，生產(chǎn)周期短，成本比較低，無環(huán)境污染，適合大規(guī)模培養(yǎng)；本發(fā)明的酰胺酶Azl13在環(huán)境農(nóng)藥污染物治理方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種新型水解酶超家族酰胺酶Az 113及其制備與應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]在動物、植物、真菌的生物體內(nèi)存在許多非肽類的碳氮鍵的水解反應(yīng)，在該類反應(yīng)中很多都是由腈水解酶超家族中的相關(guān)酶來催化完成的，其中植物生長素、生物素、丙氨酸以及其他天然產(chǎn)物的合成都與腈水解酶超家族有關(guān)，同時該家族還參與蛋白質(zhì)的脫氨基反應(yīng)。與動植物存在生態(tài)學(xué)關(guān)系的細(xì)菌和古生菌體內(nèi)同樣可以合成腈水解酶超家族中的相關(guān)蛋白，負(fù)責(zé)一系列腈和酰胺的水解反應(yīng)以及多肽末端?；ф湹目s合反應(yīng)。[0004]依據(jù)基于結(jié)構(gòu)的序列分析，腈水解酶超家族可以分為13個分支，其中9個分支的底物特異性已知。盡管已往的分類將此類酶都?xì)w為腈水解酶超家族，但是事實上只有第一個分支具有腈水解酶活性，其他8個分支具有酰胺酶活性和酰胺合成酶活性。在這13個分支中有7個分支都含有融合的保守區(qū)域，這些融合的保守區(qū)域可能參與胺的產(chǎn)生與消耗兩個過程的連接或蛋白與胞外信號分子的連接。
[0005]與腈水解酶相似的一類酶是腈水合酶，該酶是一類含有金屬離子的酶，它能催化腈化合物的水解形成酰胺類化合物，但是此類酶不屬于腈水解酶超家族。另外，盡管腈水解酶超家族中絕大多數(shù)都是酰胺酶，但是還有許多酰胺酶包括Ntn、Triad、AS酰胺酶和硫醇蛋白酶，它們都不屬于腈水解酶超家族。由于脂肪族酰胺酶與腈水解酶有關(guān)，所以保留了腈水解酶這一詞作為該家族的名稱，同時其他含有Glu-Lys-Cys保守氨基酸殘基的同源蛋白作為該家族的其他分支。
[0006]腈水解酶超家族的第一個分類依據(jù)就是根據(jù)序列分析和A-value值進(jìn)行分類。對大量該家族中的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該家族可以分為13個分支，同時發(fā)現(xiàn)不同分支之間的E-Nalue值有明顯區(qū)別，當(dāng)兩個序列的萬-value值大于IX 10-25時,可以判斷這兩個序列不屬于同一分支。
[0007]腈水解酶超家族中絕大多數(shù)分支的分類不光依據(jù)萬-value值，還要參考活性位點周圍相對保守的氨基酸殘基進(jìn)行分類。
[0008]腈水解酶超家族中有些分支包含有融合的保守區(qū)域，這些融合的保守區(qū)域賦予了該類蛋白具有額外的特殊的催化功能。根據(jù)它們所具有的融合區(qū)域的類型不同可以將該家族分為不同的分支。
[0009]在工業(yè)生產(chǎn)中，人們往往使用酰胺類化合物作為化學(xué)合成的前體。酰胺類化合物在自然界中具有致癌性、致畸性和神經(jīng)毒性，因此酰胺類化合物的濫用和任意排放導(dǎo)致環(huán)境的嚴(yán)重污染，而腈水解酶超家族中的酰胺酶可以催化有毒的酰胺類化合物形成無毒的化合物，因此該家族中的酶在環(huán)境污染物的治理方面起著重要作用。[0010]利用酰胺酶的?；D(zhuǎn)移酶活性可以催化底物形成相應(yīng)的異羥肟酸，異羥肟酸是一種非常重要的化學(xué)療法的藥物。它可以作為生長因子、食品添加劑、腫瘤抑制因子、抗肺結(jié)核病、抗白血病等藥物具有非常重要的生物學(xué)活性。微生物還可以利用其金屬離子的螯合作用吸收環(huán)境中的金屬離子，特別是在金屬離子匱乏的環(huán)境中，具有重要的生理學(xué)意義。乙酰氧肟酸可以作為脲酶的不可逆抑制劑，而且可以用于治療慢性泌尿系統(tǒng)感染等疾病。有些異羥肟酸在哮喘和Hiv治療方面也有一定的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的首要目的在于提供一種新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3。本發(fā)明的另一目的在于提供上述酰胺酶Azll3的制備方法。本發(fā)明的目的還在于提供上述酰胺酶Azl 13的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
一種新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。該酶具有芳基?；０访富钚?，其芳基?；０访富钚缘淖钸m作用PH值為8.0，最適作用溫度為35-45。。。
[0013]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的芳基?；０访富钚詼y定方法優(yōu)選為:在20mM Tris-HCl pH 8.0UOOmM NaCl緩沖液中加入反應(yīng)底物和酰胺酶Azll3，于35°C反應(yīng)；再通過液相色譜檢測酰胺酶Azll3催化效率。
[0014]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制備方法包括如下步驟:將新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl 13的編碼基因(序列如SEQ ID N0.2所示)連接到原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；并將所形成的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3。
[0016]優(yōu)選的，新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制備方法包括如下步驟:
(I)重組His-Azl 13質(zhì)粒的構(gòu)建
提取鏈霉菌211726的總DNA，利用特異性引物az 113_F和az 113-R對鏈霉菌211726的總DNA進(jìn)行PCR擴增；PCR產(chǎn)物純化后與原核表達(dá)載體pET28a (+)分別用Nde\和&oRI酶切，回收酶切片段，將這二片段用T4 DNA連接酶連接；將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH10B，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，得到重組His-Azl 13質(zhì)粒；
其中特異性引物azll3-F和azll3-R的5’端分別引入和&oRI限制性酶切位點，序列如下:azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3?,azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3?。
[0017](2) Azll3的表達(dá)與制備
提取大腸桿菌DHlOB中的重組質(zhì)粒His-Azll3，并用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，篩選轉(zhuǎn)化菌株接種至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜；第二天接種種子液至IL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)培養(yǎng)至0D_=0.6左右加入IPTG 16°C誘導(dǎo)20h ;誘導(dǎo)后培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎和鎳柱純化后得到目標(biāo)蛋白酰胺酶Azll3。[0018]對由上述方法制備得到的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3進(jìn)行了芳基?；０访富钚苑治?，發(fā)現(xiàn)酰胺酶Azll3具有較好的芳基?；０访富钚?，對敵稗、對甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺均具有較好的降解作用，尤其是對酰胺類農(nóng)藥敵稗具有很好的降解效果。敵稗是目前市面上應(yīng)用廣泛的酰胺類除草劑，Azll3對其的水解作用預(yù)示著該酶將在環(huán)境農(nóng)藥污染物治理方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0019]基于酰胺酶Azll3的芳基?；０访富钚?，本發(fā)明還提供上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在環(huán)境污染物的治理中的應(yīng)用，所述的環(huán)境污染物為苯胺酰胺類化合物。
[0020]優(yōu)選的，所述的環(huán)境污染物為敵稗。
[0021]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
(I)酰胺酶AZ113是一種新型的腈水解酶超家族酰胺酶，具有芳基?；０访富钚?。
[0022](2)本發(fā)明的制備方法采用基因工程菌生產(chǎn)腈水解酶超家族酰胺酶適合大規(guī)模培養(yǎng)和分離提取，生產(chǎn)工藝不復(fù)雜，設(shè)備要求簡單，生產(chǎn)周期短，成本比較低，無環(huán)境污染。
[0023](3)酰胺酶Azll3能降解苯胺酰胺類底物，如敵稗、對甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺，特別是敵稗。敵稗是目前市面上應(yīng)用廣泛的酰胺類除草劑，Azll3對其的水解作用預(yù)示著該酶將在環(huán)境農(nóng)藥污染物治理方面具有廣泛的應(yīng)用前景。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是實施例1中制備的重組腈水解酶超家族酰胺酶Azl 13的SDS-PAGE圖，泳道I:marker ;泳道 2:酰胺酶 Azll3。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0026]在本發(fā)明實施例中涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法:
(I)質(zhì)粒提取、DNA (PCR產(chǎn)物)純化、DNA片段從凝膠中回收皆采用“天根生化科技有限公司”的相應(yīng)試劑盒。
[0027](2)所有限制性內(nèi)切酶和連接酶均購自“New England Biolabs公司”,英國。
[0028]實施例1重組腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制備 (I)總DNA的提取
將 100 μ L鏈霉菌211726菌絲體充分懸浮于500 μ L SET(75mM NaCl,25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl pH7.5)緩沖液中，加入10 μ L溶菌酶(50mg/mL)后于37°C水浴I小時。然后向其加入14 μ L的蛋白酶K溶液后充分混合均勻，加入60 μ L 10%SDS，再次混合均勻后于55°C水浴I小時。孵育后繼續(xù)加入200 μ L 5M的氯化鈉溶液，充分混勻。繼續(xù)加入500 μ L的氯仿，混勻。于12000rpm離心10min,并將上清全部轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。向其加入0.6倍體積的異丙醇,混勻后于12000rpm離心I min。去除上清,加入ImL 70%乙醇充分洗滌沉淀兩次。去除上清，于室溫將乙醇全部揮干后，將DNA用100 μ L無菌水充分溶解。
[0029](2)質(zhì)粒 His-Azl 13 的構(gòu)建
以鏈霉菌211726的總DNA為模板用購自“New England Biolabs公司”的fusion酶擴增片段，其特異性引物序列如下:azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’ ；
azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3?。
[0030]首先進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)條件為:95°C 2min ；95°C 30s，58°C 30s, 72°C Imin 循環(huán)30次；最后72°C延伸lOmin。用PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，用和EcoRl酶切擴增產(chǎn)物，與經(jīng)同樣酶酶切的原核表達(dá)載體pET28a(+)用T4 DNA連接酶于室溫連接2-8小時。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOB中，通過藍(lán)白斑篩選帶有目的基因的質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒產(chǎn)物經(jīng)測序檢測為腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的編碼基因序列，如SEQ ID N0.2，得到重組質(zhì)粒His-Azll3。
[0031](2)重組腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的表達(dá)和純化: 提取大腸桿菌DHlOB中的重組質(zhì)粒His-Azll3，并用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，并涂布于含有50mg/mL卡那霉素LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。將選出的轉(zhuǎn)化菌株接種至含50mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜。第二天接種IOmL種子液至IL含50mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)培養(yǎng)2h至OD600=0.6左右加入IPTG至終濃度0.1mM 16°C誘導(dǎo)20h。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物于4°C 6000rpm離心 10 分鐘去上清，沉淀用 3OmL 的 binding buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mM NaCl，5mM咪唑)充分懸浮，在冰浴條件下，用超聲波破碎細(xì)胞(條件為:工作時間3秒，間歇時間10秒，總次數(shù)120-200)。4°C 12000rpm離心20分鐘以去除細(xì)胞碎片，上清與Ni2+親和層析柱混合。上樣后，分別用 binding buffer 和 wash buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mMNaCl, 50-100mmol/L 咪唑)洗脫雜蛋白質(zhì)，用 elution buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mM NaCl，200mmol/L咪唑)洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)?；厥漳康牡鞍捉?jīng)I3D-1O脫鹽柱脫鹽后得到高純度的目的蛋白重組His6-Azll3蛋白(見圖1)。
[0032]實施例2重組腈水解酶超家族酰胺酶Azll3芳基?；０访富钚缘臏y定 以敵稗、對甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺為反應(yīng)底物，其反應(yīng)體系和反應(yīng)條
件如下:1μ g純化后的重組His6-Azll3蛋白，0.2mM待檢測底物在ImL反應(yīng)緩沖液(20mMTris-HCl pH 8.0, IOOmM NaCl)中于35°C反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，取上層有機相旋干，溶解于100 μ L甲醇中。反應(yīng)后樣品用液相檢測，檢測條件如下:
Waters 2998 PDA 二極管陣列檢測器
Waters LC-20AD高效液相色譜儀
色譜柱:Thermo C18 反相柱(3μ ；2.1 X 150 mm)
分離反應(yīng)產(chǎn)物所用流動相為水:甲醇=2:3 (V/V)
等度洗脫20min,流速0.2mL/min 檢測波長250nm 柱溫:25°C
甲醇(HPLC級、MS級)=Merck公司 水:去離子水
在不同的溫度和PH條件下，對重組腈水解酶超家族酰胺酶Azll3進(jìn)行了生物學(xué)分析，最適作用pH值為8.0，最適作用溫度為35-45°C。
[0033]重組腈水解酶超家族酰胺酶Azll3對敵稗、對甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺的水解活力分別為0.55U/mg、0.87U/mg和0.69U/mg。酰胺酶Azll3所具有的芳基?；０访富钚允侵耙褕蟮赖碾嫠饷赋易艴０访肝窗l(fā)現(xiàn)的活性，其能降解苯胺酰胺類底物，可應(yīng)用于治理環(huán)境污染物。
【權(quán)利要求】
1.一種新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:該酶具有芳基?；０访富钚裕蓟；０访富钚缘淖钸m作用PH值為8.0,最適作用溫度為35-45。。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:該酶的芳基?；０访富钚詼y定方法為:在20mM Tris-HCl pH 8.0、IOOmM NaCl緩沖液中加入反應(yīng)底物和酰胺酶Azll3，于35°C反應(yīng)；再通過液相色譜檢測酰胺酶Azll3催化效率。
4.權(quán)利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的編碼基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.權(quán)利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制備方法，其特征在于包括如下步驟:將權(quán)利要求4所述的編碼基因連接到原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；并將所形成的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Az 113。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)重組His-Azl13質(zhì)粒的構(gòu)建 提取鏈霉菌211726的總DNA，利用特異性引物azll3_F和azll3_R對鏈霉菌211726的總DNA進(jìn)行PCR擴增；PCR產(chǎn)物純化后與原核表達(dá)載體pET28a (+)分別用Nde\和&oRI酶切，回收酶切片段，將這二片段用T4 DNA連接酶連接；將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH10B，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，得到重組His-Azl 13質(zhì)粒； 其中，特異性引物azll3-F和azll3-R如下:
azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’，
azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3’ ； (2)Azll3的表達(dá)與制備 提取大腸桿菌DHlOB中的重組質(zhì)粒His-Azll3，并用氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，篩選轉(zhuǎn)化菌株接種至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜；第二天接種種子液至IL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)培養(yǎng)至OD6tltl=0.6加入IPTG16°C誘導(dǎo)20h ;誘導(dǎo)后培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎和鎳柱純化后得到目標(biāo)蛋白酰胺酶Azll3。
7.權(quán)利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在環(huán)境污染物的治理中的應(yīng)用，其特征在于:所述的環(huán)境污染物為苯胺酰胺類化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在環(huán)境污染物的治理中的應(yīng)用，其特征在于:所述的環(huán)境污染物為敵稗。
【文檔編號】A62D101/04GK103898083SQ201410160172
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】孫宇輝, 馬艷玲, 鄧子新 申請人:武漢大學(xué)