專利名稱：一株鄰苯二甲酸酯降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鄰苯二甲酸酯降解菌-節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. )ZJUTW及其
在微生物降解鄰苯二甲酸酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸酯類化合物(Phthalic acid esters,PAEs)是世界上廣泛使用的人工合成難降解有機(jī)化合物，主要用于塑料增塑劑、涂料、油漆等化工生產(chǎn)中。美國國家環(huán)保局(EPA)1999年公布的129種優(yōu)先污染物中包括了 6種PAEs類化合物，我國也已將其中的鄰苯二甲酸二正辛酯(D0P)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)和鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)列為環(huán)境優(yōu)先污染物。已有證據(jù)表明PAEs是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其最 明顯的危害是使生殖機(jī)能下降，對動物及人類生殖系統(tǒng)有一定損害，可引起睪丸萎縮、精子減少以及生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。且對胚胎發(fā)育有一定毒作用。目前，PAEs在全球主要工業(yè)國的環(huán)境中已普遍檢出。在土壤、河流、湖泊、海洋底質(zhì)、飲用水、垃圾場乃至食品中都有檢測到PAEs的存在。鄰苯二甲酸酯類化合物在環(huán)境中的水解、光解速率非常緩慢，屬于難降解物質(zhì)。因此，微生物降解被認(rèn)為是自然環(huán)境中PAEs完全礦化的主要過程。生長細(xì)胞受到外界化學(xué)或物理作用后會相應(yīng)地發(fā)生變化，如基因表達(dá)、蛋白穩(wěn)定性的變化等。而采用休止細(xì)胞則可以避免這種影響，利用微生物自身生長代謝產(chǎn)酶或誘導(dǎo)產(chǎn)酶的特點將微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長末期，分離菌體并以一定的濃度懸于生理緩沖液中，此時微生物已經(jīng)基本停止生長代謝，但保持酶的活性，其主要優(yōu)點是反應(yīng)專一性強(qiáng)，可以提高底物轉(zhuǎn)化率，不易染雜菌，可以減少產(chǎn)物對菌體生長及酶合成的抑制。為了獲得高效的鄰苯二甲酸酯降解菌株，有效解決鄰苯二甲酸酯類化合物的環(huán)境污染，發(fā)明人以DBP為模式化合物，從杭州河道污水出口的淤泥中分離出I株DBP降解菌Arthrobacter sp. ZJUTff,研究了其休止細(xì)胞對DBP與DEP的降解特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株具有降解鄰苯二甲酸酯降解能力的菌株一節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,及其在微生物降解鄰苯二甲酸酯中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一株鄰苯二甲酸酯降解菌-節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,保藏于中國
典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M2012246，保藏日期2012年6月24日。本發(fā)明還涉及所述的節(jié)桿菌ZJUTW在微生物降解鄰苯二甲酸酯(PAEs)中的應(yīng)用。所述鄰苯二甲酸酯為下列之一鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，其中以對DBP的降解能力為最優(yōu)。所述降解在pH7 10、30 37°C下進(jìn)行。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明篩選得到一株對鄰苯二甲酸酯具有高效降解能力的菌株Arthrobacter sp. ZJUTW,該菌株可降解4種不同的PAEs,該菌株在休止細(xì)胞濃度為2 6X108cell/mL，pH7. 0，30°C，180rpm條件下，6h內(nèi)可將118mg/L的DEP完全降解，8h內(nèi)可將125mg/L的DBP完全降解，37 °C下的降解效率也無明顯差異，休止細(xì)胞對118 1436mg/L的DEP表現(xiàn)出較高的降解能力，并可在20h內(nèi)將濃度為1200mg/L的DBP完全降解，為有效解決鄰苯二甲酸酯類化合物的環(huán)境污染問題提供可能。


圖I為為菌株ZJUTW的掃描電鏡圖片；圖2為菌株ZJUTW不同生長時間形態(tài)圖(X 1000) ；a.菌株ZJUTW生長4h的形態(tài)圖；b.菌株ZJUTW生長24h的形態(tài)圖；圖3菌株ZJUTW的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹；圖4菌株ZJUTW對不同PAEs底物的降解；圖5溫度(a)及pH (b)對休止細(xì)胞降解DEP的影響；圖6菌體濃度(a)及Tween-80對休止細(xì)胞(b)降解DEP的影響；圖7不同底物濃度對休止細(xì)胞(a)及生長細(xì)胞(b)降解DEP的影響；圖8溫度對休止細(xì)胞降解DBP的影響；圖9pH對休止細(xì)胞降解DBP的影響； 圖10不同底物濃度對休止細(xì)胞降解DBP的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例I :I材料與方法I. I試劑與儀器DMP及DEP購于上海凌峰試劑有限公司，DBP購于浙江臨平化工試劑廠，DEHP購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，甲醇(色譜級，天津四友化工有限公司)，其余試劑均為分析純。JEOL JEM-1230型透射電子顯微鏡(日本)，AgilentllOO高效液相色譜儀(美國)。1.2
培養(yǎng)基基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基=K2HPO4· 3H20 I. Og/L, NaCl I. Og/L, (NH4)2SO4O. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 4g/L, CaCl2 0. 0755g/L, FeCl3 · 6H20 0. 0143g/L, pH7. 0。選擇培養(yǎng)基每升無機(jī)鹽培養(yǎng)基加適量DBP的甲醇溶液，使DBP終濃度為125mg/L0LB培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水IOOOmL, pH 7. 0,121°C滅菌20minoI. 3 方法I. 3.1降解菌的篩選取杭州市河道污水出口處游泥Ig置于IOOmL水中，混勻，靜置,然后取ImL加入到250mL選擇培養(yǎng)基中，DBP初始質(zhì)量濃度為125mg/L，30°C，180r/min培養(yǎng)4d，重復(fù)多次馴化。將有明顯生長的培養(yǎng)液稀釋涂布培養(yǎng)，同時測DBP降解情況，平板涂布法分離得到單菌落，觀察菌落形態(tài)并挑取單菌落做進(jìn)一步鑒定。1.3.2菌株對不同PAEs的降解將菌株接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接種量為2%，向培養(yǎng)基中加入DEP、DMP、DBP及DEHP，每種底物濃度均為50mg/L，將培養(yǎng)基置于30°C、180r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，不同時間測定各種底物的濃度，分析菌株對不同底物的降解能力。I. 3. 3休止細(xì)胞的制備將菌株接種到LB培養(yǎng)基，30°C，180r/min培養(yǎng)到對數(shù)末期，4000r/min離心收集細(xì)胞，用無菌水洗I次，沉淀懸浮于PH 7. O的O. lmol/L磷酸鉀緩沖液中，加入少量葡萄糖，制成菌懸液，使其菌體濃度約為2飛X 108cell/mL。 I. 3. 4不同條件下休止細(xì)胞對DEP與DBP降解的影響通過改變溫度、pH、底物濃度、休止細(xì)胞濃度及Tween-80等條件，考察不同降解條件下休止細(xì)胞對DEP與DBP降解的影響。I. 3. 5PAEs 檢測方法取5mL培養(yǎng)液，置于具塞試管中，加入等體積石油醚，劇烈振蕩，靜置2. 5h，將上層有機(jī)相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干后用ImL甲醇溶解，用HPLC Agilent 1100HPLC檢測，檢測條件Hypersil BDS C18色譜柱,流動相為甲醇H20=9O :10,流速I. OmL/min,進(jìn)樣量20 μ L,二極管陣列(DAD)檢測器，檢測波長235nm。2結(jié)果與分析2. I菌株的形態(tài)及生理生化特征將經(jīng)多次馴化后的菌液稀釋涂布，挑取形態(tài)不同的單菌落接入選擇培養(yǎng)基進(jìn)一步檢測，其中菌株ZJUTW的降解效果最優(yōu)。菌株ZJUTW在固體平板上形成的菌落為圓形，淡黃色，菌落表面光滑，中間凸起。通過透射電鏡觀察(如圖I所示)，菌株ZJUTW呈短桿狀，無鞭毛。在LB培養(yǎng)基上初期桿狀居多，在穩(wěn)定期細(xì)菌形態(tài)為球狀(如圖2a，2b)，表現(xiàn)出桿球變化特性。菌體的大小為(0.4、. 6) μ mX (O. 7 1.0) μ m，革蘭氏染色陽性，不產(chǎn)芽孢。菌株生理生化特性測定結(jié)果為淀粉水解、明膠水解、接觸酶實驗和檸檬酸鹽實驗等呈陽性，而葡萄糖發(fā)酵、木糖利用，H2S實驗，甲基紅實驗，V-P實驗、吲哚實驗等呈陰性。對該菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以細(xì)菌16S rDNA通用引物，擴(kuò)增到1579bp的DNA片段，GenBank中登錄號為JN968374。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示該菌株與節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的序列同源性最高,采用MEGA4. I軟件將該菌株的16S rDNA序列與Genbank中的若干個相關(guān)種的16S rDNA序列進(jìn)行分析比對，以Pimelobacter simplex(NR039616)為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所不,該菌株與Arthrobacter sp. S15(EU747703)位于同一個系統(tǒng)發(fā)育的分支。根據(jù)該菌株形態(tài)特征、桿球變化特性、生理生化特征及16S rDNA序列分析,并參考《常見細(xì)菌鑒定手冊》,該菌株與Arthrobacter屬特征相符，故將該菌株命名為Arthrobacter sp. ZJUTW。2. 2菌株ZJUTW生長細(xì)胞對不同PAEs的降解圖4為菌株ZJUTW生長細(xì)胞對不同底物(DEP、DMP、DBP、DEHP)的降解曲線。培養(yǎng)4h后，DBP的降解率已達(dá)到91.8%，在24h內(nèi)，菌株ZJUTW能夠?qū)EP和DMP完全降解，但是對于DEHP，菌株ZJUTW只能降解20%左右。2. 3不同因素對休止細(xì)胞降解DEP的影響2. 3. I溫度對休止細(xì)胞降解DEP的影響采用休止細(xì)胞濃度為2 6 X 108cel 1/mL，DEP初始濃度為118mg/L，30°C，180r/min，不同溫度對休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖5a所示，在37°C和30°C下DEP降解效率無明顯差異，在6h均能快速有效完全降解DEP。2. 3. 2pH對休止細(xì)胞降解DEP的影響pH 4.0,5.0的降解體系采用HAC-NaAC緩沖液，pH6. 0,7.0,8.0降解體系采用PB緩沖液，休止細(xì)胞濃度為2 6X108cell/mL，DEP初始濃度為118mg/L，30°C，180r/min，菌株ZJUTff的休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖5b所示，pH 7. O時降解最快，6h將DEP完全降解。 而pH4. O及5. O時，2h時DEP被降解20%左右，但在2h以后DEP幾乎不被降解。Walker等曾對難降解有機(jī)物處理過程中產(chǎn)生的生物吸附作用進(jìn)行過研究與分析，認(rèn)為細(xì)菌在對污染物降解的同時對其有吸附作用，吸附作用可在幾分鐘到幾小時完成，而在降解過程中，這2種作用同時存在并相互影響，推測在pH 4. O與5. O條件下，2h內(nèi)可降解20%，但其后則不再降解的現(xiàn)象可能與菌體對DEP的吸附有關(guān)。 2. 3. 3休止細(xì)胞濃度對DEP降解的影響分別將休止細(xì)胞濃度調(diào)為O. 4 I. 2X 108cell/mL、0. 8 2· 4X 108cell/mL、
I.2 3. 6 X 108cel 1/mL、I. 6 4. 8 X 108cell/mL 及 2 6 X IO8CelΙ/mL，其他降解條件為 118mg/L DEP, 30°C，180r/min,菌株ZJUTW的休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖6a所示，休止細(xì)胞濃度為2 6 X 108cell/mL略優(yōu)于濃度I. 6 4. 8 X 108cell/mL的降解效率，在4h已接近完全降解DEP0隨著菌液濃度的減少，降解效率也隨之降低，但均能在6h完全降解DEP。2. 3. 4Tween-80對休止細(xì)胞降解DEP的影響添加表面活性劑，可以促進(jìn)DEP與水相形成微乳液，提高傳質(zhì)效果，從而有利于DEP的降解。取適量表面活性劑Tween-80并且加入DEP，混合后加入45mL pH 7. O的磷酸緩沖液，使Tween-80終濃度為O. 01g/L,休止細(xì)胞濃度為2-6 X 108cell/mL, DEP濃度為118mg/L，30°C，180r/min,以未加入Tween-80的DEP磷酸緩沖液為對照。休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖6b所示，添加Tween-80對休止細(xì)胞的降解效率產(chǎn)生了一定的抑制，在IOh將DEP完全降解，而對照的完全降解時間為6h。其原因可能Tween-80對菌體有一定的毒害作用，從而對降解產(chǎn)生抑制。2. 3. 5底物濃度對休止細(xì)胞及生長細(xì)胞降解DEP的影響分別采用不同DEP濃度的磷酸緩沖液，休止細(xì)胞濃度2-6X108Cell/mL，30°C，180r/min，底物濃度對休止細(xì)胞降解DEP的影響如圖7a所示，結(jié)果表明休止細(xì)胞對各濃度的DEP均能有效降解，其中118mg/L和236mg/L的DEP均在6h內(nèi)完全降解。隨著DEP濃度的增加，降解效率也隨之下降，DEP被完全降解時間也延長，24h可將1436mg/L的DEP的完全降解。此外，為了比較休止細(xì)胞與生長細(xì)胞對DEP降解能力的差異，還分別添加不同濃度DEP于無機(jī)培養(yǎng)基中，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)基中DEP殘留率，結(jié)果表明(圖7b)菌株ZJUTW的生長細(xì)胞對1062mg/L的DEP已無降解能力，當(dāng)DEP濃度低于944mg/L以下時，隨DEP初始濃度的降低而其完全降解所需時間也縮短，但與其休止細(xì)胞相比，無論是完全降解所需的時間還是最高耐受濃度，休止細(xì)胞均遠(yuǎn)優(yōu)于生長細(xì)胞。2. 4不同因素對休止細(xì)胞降解DBP的影響2. 4. I溫度對休止細(xì)胞降解DBP的影響采用休止細(xì)胞濃度為2X 108-6X 108cell/mL，DBP初始質(zhì)量濃度為125mg/L，30°C，180rpm，不同溫度對休止細(xì)胞降解DBP的影響如圖8所示，在37°C和30°C下DBP降解效率無明顯差異，在8h均能快速有效完全降解DBP。在25°C下對DBP的降解速率變慢，但還是能在16h將DBP降解完全，但當(dāng)溫度為42°C時，DBP降到65%左右便不再繼續(xù)下降，這可能是因為溫度太高，酶的活性受到影響所致。2. 4. 2pH對休止細(xì)胞降解DBP的影響
pH5. O的降解體系采用HAC-NaAC緩沖液，pH6. O, 7. O, 8. O降解體系采用PB緩沖液，PH9降解體系采用硼酸-硼砂緩沖液，PHlO降解體系采用硼酸-氯化鉀緩沖液，休止細(xì)胞濃度為 2X 108-6 X 108cel 1/mL，DBP 初始濃度為 125mg/L，30°C，180rpm，菌株 ZJUTW 的休止細(xì)胞降解DBP的影響如圖9所示，在pH6 10范圍內(nèi)，休止細(xì)胞都能夠?qū)BP完全降解。其中pH7. O降解最快，8h將DBP完全降解。pH5. O時，2h的DBP可降解20%左右，但在2h以后DBP幾乎不被降解。通過不同pH的降解結(jié)果可推測，反應(yīng)中的關(guān)鍵酶對堿性環(huán)境比較穩(wěn)定。2. 4. 3底物濃度對休止細(xì)胞降解DBP的影響分別采用含不同DBP質(zhì)量濃度的磷酸緩沖液，休止細(xì)胞濃度2X 108-6X IO8Cell/mL，30°C，180rpm，底物濃度對休止細(xì)胞降解DBP的影響如圖10所示，結(jié)果表明，休止細(xì)胞對各質(zhì)量濃度的DBP均能有效降解，其中125mg/L和250mg/L的DEP均在8h內(nèi)完全降解。隨著DBP濃度的增加，降解效率也隨之下降，DBP被完全降解的時間也延長，但是，對于初始質(zhì)量濃度為1200mg/L的DBP，休止細(xì)胞也可在20h內(nèi)將之完全降解。3 結(jié)論(I)以DBP為唯一碳源，從杭州市河道污水出口處淤泥中篩選到一株DBP降解菌，經(jīng)鑒定該菌株與Arthrobacter屬特征相符,故將該菌株命名為Arthrobacter sp. ZJUTW。該菌株的生長細(xì)胞可降解4種不同的PAEs，其中以DBP降解效果最好。(2)基于休止細(xì)胞在生物降解中的優(yōu)點，制備了 Arthrobacter sp. ZJUTff的休止細(xì)胞，考察了不同因子對休止細(xì)胞降解DEP的影響，結(jié)果表明在休止細(xì)胞濃度為2^6 X IO8Cel 1/mL, pH 7· O，30°C，180rpm條件下，可在 6h 內(nèi)將 118mg/L 的 DEP完全降解,37°C下的降解效率也無明顯差異，加入O. 01g/L Tween-80則對降解效率產(chǎn)生了一定的抑制。此夕卜，休止細(xì)胞對1436mg/L的DEP表現(xiàn)出較高的降解能力，可在24h內(nèi)將其完全降解，而生長細(xì)胞則對1062mg/L的DEP已無降解能力。(3)休止細(xì)胞對DBP的降解實驗表明，在休止細(xì)胞濃度為2 6X IO8Cel 1/mL，pH7. 0，30°C，180rpm條件下，可在8h內(nèi)將125mg/L的DBP完全降解，可在20h內(nèi)將1200mg/L的DBP完全降解，表現(xiàn)出較高的降解能力。
權(quán)利要求
1.一株鄰苯二甲酸酯降解菌-節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. ) ZJUTW,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M2012246，保藏日期2012年6月24日。
2.如權(quán)利要求I所述的節(jié)桿菌ZJUTW在微生物降解鄰苯二甲酸酯中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述鄰苯二甲酸酯為下列之一鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在pH6 10、3(T37°C下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株具有高效降解鄰苯二甲酸酯降解能力的菌株Arthrobacter sp.ZJUTW及其應(yīng)用，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC NOM 2012246，保藏日期2012年6月24日。本發(fā)明提供了對鄰苯二甲酸酯有較高降解能力的新菌株，并對其休止細(xì)胞降解DEP及DBP條件進(jìn)行了優(yōu)化，為有效解決鄰苯二甲酸酯類化合物的環(huán)境污染問題提供可能。
文檔編號A62D3/02GK102864102SQ20121031995
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者邱樂泉, 陳陽, 鐘衛(wèi)鴻, 吳石金, 李烜楨, 鐘莉, 王子超 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)