專(zhuān)利名稱(chēng)：：一株降解石油烴的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株降解石油烴的菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：石油是一種粘稠易燃的天然存在于地表之下的混合物。從成分上看，是含有多種烴類(lèi)(正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、脂環(huán)烴)及少量其他有機(jī)物(硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類(lèi))的復(fù)雜混合物。一個(gè)典型的石油樣品含有不同的烴類(lèi)化合物可多達(dá)200-300中，分子量從16到1000左右。其物理狀態(tài)包括氣態(tài)、揮發(fā)性液體、高沸點(diǎn)液體以及固體。一般油田利用的原油按化學(xué)組成分為石蠟基(烷烴>70%);環(huán)烷基(環(huán)烷烴>60%);中間基(烷、環(huán)烷、芳烴含量接近)和瀝青基(瀝青質(zhì)>60%)。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，石油成為我國(guó)的主要能源，需求量在日益增大，油田生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)土壤的污染也日益嚴(yán)重，面積不斷擴(kuò)大。目前全球年產(chǎn)22億噸石油中80%產(chǎn)自?xún)?nèi)陸油田。在我國(guó)目前已勘探和開(kāi)發(fā)的油田共有400多個(gè)，覆蓋地區(qū)面積達(dá)到32萬(wàn)平方千米，可能已有480萬(wàn)平方千米的土壤層石油含量超過(guò)安全值。并且，在石油生產(chǎn)以及運(yùn)輸過(guò)程中不可避免地會(huì)造成含油污泥污染，以至在我國(guó)，該行業(yè)平均每年生產(chǎn)80萬(wàn)噸含油污泥。落地原油在重力和毛細(xì)作用下容易發(fā)生平面擴(kuò)散，由于其粘度大，粘滯性強(qiáng)，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)形成小范圍的高濃度污染。采油廢水在水動(dòng)力作用下，一般造成深度較大的污染，甚至?xí)斐傻叵滤奈廴?。土壤的石油?lèi)污染多集中在20cm的表層，影響土壤的通透性，直接阻礙植物根系的呼吸與吸收，引起根系腐爛，影響其生長(zhǎng)。石油富含的反應(yīng)基能與無(wú)機(jī)氮、磷結(jié)合并限制硝化作用和脫磷酸作用，從而使土壤有效氮、磷的含量減少，影響作物的營(yíng)養(yǎng)吸收。石油中所含的多種多環(huán)芳烴被認(rèn)為具有"三致"效應(yīng)；一些揮發(fā)組分能引起人體麻醉、窒息和化學(xué)性肺炎等疾病。因此石油污染對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和人體健康都有很大的危害。目前石油污染物的凈化處理主要有化學(xué)、物理和生物三種途徑?；瘜W(xué)方法主要利用化學(xué)萃取劑消除石油污染物。特別是在郵輪或鉆井平臺(tái)發(fā)生事故初期是很有效的做法。但是化學(xué)萃取劑對(duì)于水生生態(tài)物種來(lái)說(shuō)大多是有害的，其副作用比石油污染泛濫的直接經(jīng)濟(jì)損失還要嚴(yán)重，因此不少?lài)?guó)家已經(jīng)禁止使用這一方法。物理方法是通過(guò)一些器械或添加物對(duì)石油污染進(jìn)行吸附收集等，這類(lèi)裝置已經(jīng)發(fā)展了許多類(lèi)型，去除效果好，但是昂貴的設(shè)備費(fèi)用限制了其廣泛使用，且在寒冷的季節(jié)效果較低。另外還可以投家一些對(duì)石油污染具有一定凈化能力、本身對(duì)動(dòng)植物沒(méi)有損害的物質(zhì)進(jìn)行吸附，普遍使用的投加劑為鋸末、粉碎的浮石粉和玉米粉等。生物方法及石油污染生物修復(fù)，是指利用微生物及其他生物，將存在于土壤的石油污染物降解成二氧化碳和水或轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)的工程技術(shù)系統(tǒng)。與物理、化學(xué)修復(fù)相比，生物修復(fù)具有非破壞性、經(jīng)濟(jì)性和安全性的特點(diǎn)，生物修復(fù)被認(rèn)為是修復(fù)污染土壤的最優(yōu)選擇。為了取得高效、徹底的生物修復(fù)效果，分離和篩選污染物的高效降解菌是生物修復(fù)的必然要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株可降解石油烴的菌株。本發(fā)明所提供的菌株為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTS，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.3253。該菌株WTS已于2009年8月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3253，分類(lèi)命名為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解石油烴的菌劑。該菌劑的活性成份為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種降解石油烴的固體菌劑。本發(fā)明所提供的固體菌劑，由檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253、銨鹽、可溶性鎂鹽和碳源組成，其中碳源、銨鹽、可溶性鎂鹽和擰檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253的比例為15-25g碳源:0.9-1.2g銨鹽0.02-0.lg可溶性鎂鹽15X109-20X109CFU檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253;所述碳源為含油量高的農(nóng)作物粉碎得到的粉，如大豆粉、蛋白粉、玉米粉和/或花生粉；所述銨鹽可為(NH4)2HP04、NH4H2P04和/或NH4C1;所述可溶性鎂鹽可為MgCl2、Mg(N03)2禾口/或MgS04。菌劑中所用的碳源起到的主要作用是提供菌種發(fā)酵的溫床，提供碳源和微量元素，其中的大豆粉價(jià)格便宜且易獲得；無(wú)機(jī)鹽是為了提供細(xì)菌發(fā)酵所需無(wú)機(jī)成分，主要提供氮源；鎂鹽是為酶的合成提供原料。檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253或上述任一所述菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253或上述任一所述菌劑在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253或上述任一所述菌劑在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的菌株具有很強(qiáng)的降解石油烴的能力。對(duì)柴油降解實(shí)驗(yàn)表明，WTS菌株在第2、4、6、8、IO天對(duì)柴油的降解速率依次為16.57mg*L—^d—\10.91mg*L—^d—\8.49mg*L—^d—\8.53mg*L—^d—\7.96mg*L—^d—、在第二天降解速率達(dá)到最大。在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)污染土壤進(jìn)行模擬修復(fù)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分別在第ll天、第25天、第38天、第50天時(shí)，菌株對(duì)土壤中石油烴降解速率依次為1.816mg*g—^d—\1.175mg*g—^d—\0.942mg*g—^d—\0.759mg*g—^d—、在11天時(shí)達(dá)到最大值，高達(dá)1.816mg*g—^d—、污染土壤生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，半衰期結(jié)果表明，空白對(duì)照組的土壤中油降解的半衰期是139天，投加WTS的土壤樣品中油降解的半衰期是30天。投加菌的土壤半衰期比自然土壤的半衰期縮短了4倍多。用加有滅菌柴油的生理鹽水富集本發(fā)明固體菌劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富集后菌液濃度可達(dá)1.3X109CFU/ml、2.4XlQ9CFU/ml禾P1.7X109CFU/ml，說(shuō)明本發(fā)明固體菌劑中4菌的活性高，繁殖快。固體菌劑的制備，便于本發(fā)明菌株的實(shí)際應(yīng)用，大大減少了實(shí)際污染土壤修復(fù)工作的復(fù)雜度和安全性，具有很大的突破。因此，本發(fā)明的菌株、菌劑及其應(yīng)用方法為我國(guó)進(jìn)行石油污染土壤的生物修復(fù)工作提供理論依據(jù)，對(duì)我國(guó)油田地區(qū)環(huán)境保護(hù)工作以及石油運(yùn)輸過(guò)程中因泄漏而造成污染的修復(fù)工作具有重大意義，加快石油污染生物修復(fù)工作的進(jìn)展，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。圖1為擴(kuò)增16SrDNA基因的產(chǎn)物凝膠電泳圖。圖2為菌株WTS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖3為反應(yīng)體系中柴油含量變化曲線(xiàn)。圖4為柴油降解率的變化曲線(xiàn)。圖5為菌株WTS對(duì)石油烴的降解速率。圖6為土壤石油烴含量變化曲線(xiàn)。圖7為土壤中石油烴降解率變化曲線(xiàn)。圖8為菌株對(duì)石油烴的降解速率。圖9為空白對(duì)照樣品土壤含油量變化。圖10為投加WTS的土壤中含油量變化。圖11為柴油降解的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基的組成如下LB培養(yǎng)基蛋白胨1.0g，酵母浸膏0.5g，NaC11.0g，蒸餾水100ml。調(diào)節(jié)pH為7.0。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏0.5g，蛋白胨lg，NaC10.5g，蒸餾水100ml，調(diào)節(jié)pH為7.5左右。固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂。MSM培養(yǎng)基KH2P041.33g，K2HP04.3H201.75g，NH4C11.00g，Na2SO42.00g，KNO32.00g，MgS04.7H200.02g，F(xiàn)eS047H200.00556g，ZnS047H200.0023g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH7.5左右。固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂。淀粉培養(yǎng)基蛋白胨lg，NaC10.5g，牛肉膏0.5g，可溶性淀粉0.2g，瓊脂1.8g，蒸餾水100ml，調(diào)節(jié)pH為7.2左右。葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(M.R.和V.P.試驗(yàn))葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，K2HPO40.5g，蒸餾水100ml。調(diào)節(jié)pH7.27.4。檸檬酸鹽培養(yǎng)基檸檬酸鈉0.2g，K2HPO40.05g，NH4N030.2g，瓊脂1.8g，蒸餾水100ml，0.04%苯酚紅lml。調(diào)節(jié)pH6.87.0。蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨lg，NaC10.5g，蒸餾水100ml。調(diào)節(jié)pH為7.6。苯丙氨酸培養(yǎng)基酵母浸膏0.3g，Na2HPO40.1g，DL-苯丙氨酸0.2g，NaC10.5g，瓊脂1.8g，蒸餾水100ml。調(diào)節(jié)pH7.0左右。實(shí)施例l、菌株的分離及鑒定—、分離土壤來(lái)源選取山東油田的污染土壤樣品，此處油田是目前我國(guó)石油的主要產(chǎn)區(qū)，其石油污染也是最嚴(yán)重的，因而土壤中嗜油菌的含量以及降解能力也應(yīng)該是很強(qiáng)的。平板培養(yǎng)富集、篩選嗜油菌取5.0g石油污染土壤樣品接入裝有100mlMSM培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于3(TC、150r.min—1條件下在搖床中培養(yǎng)4d;然后取一定量的上層澄清液接入裝有100ml新鮮培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C、160r.min—1條件下?lián)u床中培養(yǎng)7d;如此重復(fù)3次。用接種環(huán)沾取富集培養(yǎng)液于平板上劃線(xiàn)；經(jīng)多次劃線(xiàn)純化后，將純化菌株接種于平板后保存于冰箱。在此基礎(chǔ)上，采用降解柴油實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)上述純化菌株進(jìn)行篩選。結(jié)果得到對(duì)柴油具有較高降解能力的菌株，將該菌株命名為WTS。該菌株在柴油培養(yǎng)基介質(zhì)中生長(zhǎng)良好，可以利用柴油為唯一碳源生長(zhǎng)；對(duì)柴油乳化完全，菌液濃稠；菌落扁平，圓邊，變透明，沒(méi)有突起；培養(yǎng)3天后菌落直徑8mm;菌體呈桿狀，培養(yǎng)10d后生物除油率為75.11%，高于石油降解菌BOl對(duì)勝利油田石油類(lèi)的降解率(25.8%32.8%)，也高于0-8-3假單胞菌屬、海洋細(xì)菌SJ-06W、SJ-6及SJ-16A-2對(duì)石油類(lèi)的降解率(40.89%57.65%)。二、鑒定微生物生理生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果第一是使自然界的有機(jī)分子都有可能得到分解；第二是使不同微生物之間有了互相作用和互相依賴(lài)的基礎(chǔ)。例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物，或者一種微生物的產(chǎn)物可抑制或殺死另一種微生物。所以微生物的生理生化也被作為細(xì)菌鑒定和分類(lèi)的內(nèi)容。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用已經(jīng)建立起來(lái)的基因庫(kù)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌菌種的鑒定已經(jīng)成為一種很成熟的手段。(—)生理生化鑒定根據(jù)常用的細(xì)菌鑒定方法(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類(lèi)組.1978.—般細(xì)菌常用鑒定方法[M].北京科學(xué)出版社)進(jìn)行鑒定，具體如下1)細(xì)菌表形特征鑒定利用革蘭氏染色法，對(duì)純化的菌株WTS進(jìn)行染色，觀(guān)察菌的形態(tài)。2)接觸酶的測(cè)定方法如文獻(xiàn)(徐金蘭，黃廷林，唐智新，等.2007.高效石油降解菌的篩選及石油污染土壤生物修復(fù)特性的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，27(4):622-628)中所述。具體如下取一干凈的載玻片，在上面滴一滴5%的過(guò)氧化氫溶液，挑取培養(yǎng)1824h的菌苔在過(guò)氧化氫溶液中涂抹。若有氣泡產(chǎn)生，則為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)；無(wú)氣泡出現(xiàn)，則為過(guò)氧化氫酶陰性反應(yīng)。3)M.R.試驗(yàn)方法如文獻(xiàn)(王平宇，張樹(shù)華.2001.硅酸鹽細(xì)菌的分離及生理生化特性的鑒定[J].南昌航空工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，15(2):78-81)中所述。具體如下將菌株WTS接種于葡萄6糖蛋白胨培養(yǎng)基中，3(TC下培養(yǎng)46天，從第二天起，每天取培養(yǎng)液2ml，加入甲基紅試劑。若出現(xiàn)鮮紅色，則為陽(yáng)性反應(yīng)；出現(xiàn)淡紅色，則為弱陽(yáng)性反應(yīng)；若為黃色，則是陰性反應(yīng)。直到第五天仍為陰性，停止。4)V.R試驗(yàn)方法如文獻(xiàn)(王平宇，張樹(shù)華.2001.硅酸鹽細(xì)菌的分離及生理生化特性的鑒定[J].南昌航空工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，15(2):78-81)中所述。具體如下將菌株WTS接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中加入40XKOH1020滴，再加入等量的a-萘酚溶液，震蕩，水浴5(TC條件下保溫1530min。若培養(yǎng)液中出現(xiàn)紅色，則為陽(yáng)性反應(yīng)；沒(méi)有變化，則為陰性反應(yīng)。5)淀粉水解試驗(yàn)方法如文獻(xiàn)(徐金蘭，黃廷林，唐智新，等.2007.高效石油降解菌的篩選及石油污染土壤生物修復(fù)特性的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，27(4):622-628)中所述。具體如下制備淀粉培養(yǎng)基平板，接種菌株WTS，培養(yǎng)24h以后，打開(kāi)培養(yǎng)皿，滴加少量碘液，旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻平鋪于整個(gè)平板上。平板呈藍(lán)色，而菌落周?chē)缬袩o(wú)色透明圈出現(xiàn)，說(shuō)明淀粉已被水解。6)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)方法如文獻(xiàn)(錢(qián)存柔，黃儀秀.2000.微生物實(shí)驗(yàn)教程[M].北京北京大學(xué)出版社，85-96)中所述。具體如下接種菌株WTS于檸檬酸培養(yǎng)基，培養(yǎng)35d，如果該菌能夠利用檸檬酸鹽，則可生長(zhǎng)，并將培養(yǎng)基由原來(lái)的淡粉色變?yōu)槊倒迳?，為?yáng)性反應(yīng)；不變色，則為陰性反應(yīng)。7)噴哚試驗(yàn)方法如文獻(xiàn)(錢(qián)存柔，黃儀秀.2000.微生物實(shí)驗(yàn)教程[M].北京北京大學(xué)出版社，85-96)中所述。具體如下將菌株WTS接種于蛋白胨水培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)液中加入乙醚，充分震蕩，使吲哚溶于乙醚中，待形成乙醚層以后，沿管壁加入吲哚試劑10滴。若乙醚層出現(xiàn)玫瑰色，則證明有吲哚產(chǎn)生，為陽(yáng)性反應(yīng)。8)苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)方法如文獻(xiàn)(錢(qián)存柔，黃儀秀.2000.微生物實(shí)驗(yàn)教程[M].北京北京大學(xué)出版社，85-96)中所述。具體如下將菌株WTS接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h，在生長(zhǎng)比較好的平板上滴加23滴FeC13溶液，自培養(yǎng)基上方留到下方。若呈藍(lán)綠色，則為陽(yáng)性反應(yīng)；否則為陰性反應(yīng)。生理生化反應(yīng)鑒定結(jié)果如表1所示。表l、分離菌株的生化特征及鑒定結(jié)果菌株革蘭氏染色M.R.V.P.檸檬酸鹽利用淀粉水解口引哚接觸酶苯丙氨酸脫氫酶WTS陰性陰性陽(yáng)性能利用不水解陽(yáng)性陽(yáng)性陰性WTS為革蘭氏陰性菌，氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性。這可能是由于革蘭氏陰性菌細(xì)胞外層是脂多糖，而脂多糖是由脂類(lèi)和多糖組成的復(fù)合物，可以為細(xì)胞提供一個(gè)既親水又親7油的兩親分子層；這一方面使其細(xì)胞與油滴表面接觸，使石油烴易于進(jìn)入細(xì)胞，另一方面，能降低水-油界面張力，使柴油變?yōu)橛杉?xì)小油滴構(gòu)成的乳劑，并擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，加速油的降解。(二)16SrDNA基因片段分析1.細(xì)菌總DNA的提取方法本實(shí)驗(yàn)采用TIANGEN試劑盒對(duì)菌體總DNA進(jìn)行提取，提取過(guò)程中所用的試劑有緩沖液GA、GB、TE;去蛋白液GD;蛋白酶K;漂洗液PW;提取操作步驟如下1)取1.5ml經(jīng)LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，10000rpm離心lmin，盡量吸凈上清液，收集菌體。2)向菌體沉淀中加入200iiL緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮。3)向離心管中加入20iiL蛋白酶K溶液，混勻，以出去蛋白質(zhì)。4)加入220iiL緩沖液GB，震蕩15s，7(TC放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以出去管蓋內(nèi)壁水珠。(注加入緩沖液GB時(shí)有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般7(TC放置會(huì)消失，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如溶液未變清涼，說(shuō)明細(xì)胞破裂不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取的DNA不純。)5)加入220iiL無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。6)將上一步所有溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp離心lmin，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入500iiL去蛋白液GD(使用前請(qǐng)檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rmp離心lmin，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入700iiL漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rmp離心lmin，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。9)向吸附柱CB3中加入500yL漂洗液PW，12000rmp離心lmin，倒掉廢液。10)吸附柱CB3放回收集管中，12000rmp離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱CB3于室溫放置5敏，以徹底晾干殘余的漂洗液。(注漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn))11)將吸附柱CB3放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱膜的中間部位懸空滴加60iiL洗脫緩沖液TE，室溫放置25min，12000rmp離心2min。12)離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rmp離心2min。(洗脫緩沖液的提起最好不少于50iiL，體積過(guò)小影響回收效率)。2.16SrDNA基因體外擴(kuò)增技術(shù)引物設(shè)計(jì)如下27F:5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'1492R:5'TACGGTTACCTTGTTACGACTT3'PCR反應(yīng)體系的建立本實(shí)驗(yàn)選用的是TIANGEN的PCRmixloadingbuffer(包括dNTPs、高保真pfo酶、Mg2+、優(yōu)化劑、染料等)，反應(yīng)體系為50iiL，方便PCR產(chǎn)物測(cè)序，采用的反應(yīng)體系見(jiàn)表2，8表2、PCR反應(yīng)體系體系物質(zhì)體積(PL)PCRmixloadingbuffer25ddH2022引物27F1引物1492R1DNA模板1總體系50PCR反應(yīng)循環(huán)溫度設(shè)定95'C預(yù)變性95"C變形56。Cfi火2minlrnin，lminh共邀行30個(gè)循壞72。C延伸lmin最后72"終延伸15min，4"保存。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)4.測(cè)序、拼接和對(duì)比PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度以后，送到天根生化公司進(jìn)行雙向測(cè)序，引物采用27F和1492R。將雙向測(cè)序的結(jié)果在軟件Bioedit下進(jìn)行格式編輯，再通過(guò)VectorNTISuite7軟件進(jìn)行序列拼接。去掉載體或峰形較差的序列，得到該菌株的16SrRNA片段序列。再將拼接序列導(dǎo)入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)進(jìn)行同源性比較。將序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中一些相近的相關(guān)菌株的16SrRNA序列一并導(dǎo)入到Bioedit軟件中進(jìn)行編輯。然后再導(dǎo)入到MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，采用相鄰連接法(Neighbor-Joiningmethod,NJ)及最大復(fù)合似然法(MaximumCompositeLikelihood,MCL)來(lái)構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，并估算進(jìn)化距離。采用自引導(dǎo)法(Bootstrap)1000次重復(fù)取樣來(lái)評(píng)估進(jìn)化樹(shù)。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度。結(jié)果如圖l所示。其結(jié)果顯示菌株WTSPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度達(dá)到約1500bp，長(zhǎng)度足夠。而且沒(méi)有雜質(zhì)條帶出現(xiàn)，適合進(jìn)行序列測(cè)定。將PCR產(chǎn)物送到天根生化公司進(jìn)行測(cè)序，并經(jīng)過(guò)拼接，得到WTS的16SrRNA的序列，其長(zhǎng)度是1425bp(序列表中序列1)，達(dá)到分析要求。在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中選取序列相近的菌株，將其16SrRNA序列導(dǎo)入Bioedit軟件后，再導(dǎo)入MEGA4.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，其中關(guān)于WTS的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果如圖2所示，分析表明菌株WTS為檸檬酸桿菌(Citrobacter)。該菌株WTS已于2009年8月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3253，分類(lèi)命名為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)。實(shí)施例2、菌株的培養(yǎng)及固體菌劑的制備在很多進(jìn)行油泥生物修復(fù)中，菌體的添加是個(gè)很麻煩的步驟，因?yàn)橄蛴湍嘀刑砑拥氖蔷海蔷鹤畲蟮娜毕菥褪遣焕谵D(zhuǎn)移，即不容易安全快速的把菌體從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到實(shí)際用地?！?、菌劑I的組成及其制備1、組成:菌劑I是由大豆粉、WTS菌、(NH4)2HP04和MgS04混合而成的組合物，其中，大豆粉、(NH4)2HP04、MgS04和菌的比例是15g大豆粉0.9g(NH4)2HPO4:0.02gMgS04:15X1()9CFU菌。2、菌劑的制備步驟(l)菌的培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基、在3(TC、130rpm的條件下培養(yǎng)WTS菌24-48h，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WTS菌液；培養(yǎng)基的組成蛋白胨1.0g，酵母浸膏0.5g，NaC11.0g，蒸餾水100ml，調(diào)節(jié)pH為7.0左右。(2)將滅菌的大豆粉與菌液混合(比例是15g大豆粉15X10tFU菌)，再向其中加入(NH4)2HP04((NH4)2HP04與菌的比例是0.9g(NH4)2HPO4:15X109CFU菌)和MgS04(MgS04與菌的比例是0.02gMgS04:15X109CFU菌)，得到混合物；將混合物在室溫(30°C)發(fā)酵2448h，發(fā)酵是為了讓細(xì)菌適應(yīng)混合物的環(huán)境，讓其生殖產(chǎn)生孢子。3(tc烘干，研磨，得到固體菌劑。二、菌劑II的組成及其制備1、組成:菌劑II是由玉米粉、WTS菌、NH4H2P04和MgCl2混合而成的組合物，其中，玉米粉、NH4H2P04、MgCl2和菌的比例是20g玉米粉1.2gNH4H2P04:0.05gMgCl2:18X1。9CFU菌。2、菌劑的制備步驟(l)菌的培養(yǎng)同實(shí)驗(yàn)一中所述相同。(2)將滅菌的玉米粉與菌液混合(比例是20g玉米粉18Xl(fCFU菌)，再向其中加入NH4H2P04(NH4H2P04與菌的比例是1.2gNH4H2P04:18X1()9CFU菌)和MgCl2(MgCl2與菌的比例是0.0SgMgCl2:isxi(^cfu菌)，得到混合物；將混合物在室溫(30°c)發(fā)酵2448h，3(TC烘干，研磨，得到固體菌劑。三、菌劑III的組成及其制備1、組成:菌劑III是由花生粉、WTS菌、NH4Cl和Mg(NO^混合而成的組合物，其中，花生粉、NH4C1、Mg(N03)2和菌的比例是25g花生粉l.OgNH4C1:Q.04g10Mg(N03)2:20X1()9CFU菌。2、菌劑的制備步驟(l)菌的培養(yǎng)同實(shí)驗(yàn)一中所述相同。(2)將滅菌的花生粉與菌液混合(比例是2Sg花生粉加X(jué)109CFU菌)，再向其中加入NH4C1(NH4C1與菌的比例是l.OgNH4C1:20X109CFU菌)和Mg(N03)2(Mg(N03)2與菌的比例是0.04gMg(NO3)2:20Xl(fCFU菌)，得到混合物；將混合物在室溫(30°C)發(fā)酵2448h，3(TC烘干，研磨，得到固體菌劑。四、菌劑I、II、III的效果加有滅菌柴油的生理鹽水的組成及各組分含量NaC10.9g，蒸餾水100ml，滅菌柴油0.2ml。將上述三種固體菌劑分別接種于加有滅菌柴油的生理鹽水，在3(TC、130rpm的條件下富集培養(yǎng)2448h，觀(guān)察菌液濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，富集菌劑I后得到的菌液濃度平均為1.3X109CFU/ml;集菌劑II后得到的菌液濃度平均為2.4X109CFU/ml;集菌劑III后得到的菌液濃度平均為1.7X109CFU/ml。表明上述三種菌劑的效果好。實(shí)施例3、菌株的應(yīng)用—、菌株WTS對(duì)柴油的降解采用紅外分光光度法(GB/T16488-1996)來(lái)進(jìn)行菌株降解率的測(cè)定。具體步驟如下取50ml三角瓶，加入20mlMSM培養(yǎng)液，0.2ml滅菌柴油，以及l(fā)ml濃度約為109CFU/ml的新鮮菌液，30°C、150rmin—1條件下培養(yǎng)10天，每?jī)商鞙y(cè)定一次三角瓶中(即反應(yīng)體系中)柴油含量。測(cè)定時(shí)，將三角瓶中的液體放入離心機(jī)，10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min。倒出全部上清液轉(zhuǎn)入125ml分液漏斗中。加3滴1:1硫酸酸化，少量NaCl作為破乳劑，用5ml精制CCl4溶液清洗原三角瓶，倒入分液漏斗，同時(shí)加入10ml左右精制CC14溶液，震蕩萃取。下層四氯化碳相經(jīng)裝有無(wú)水Na2S04脫水柱除水后，歸入25ml比色管中，萃取兩次后定容至25ml，取0.5ml重新定容于25ml比色管中。用lcm石英比色管在紅外分光光度儀(吉林北光生產(chǎn)，型號(hào)JDS-105U)下進(jìn)行測(cè)定，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和空白值比較得到降解率。具體的做法是將測(cè)定的結(jié)果直接帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式，計(jì)算得到的結(jié)果才是實(shí)際上的降解率，前者是測(cè)定值，后者是計(jì)算值，作圖還有做對(duì)比時(shí)，采用的計(jì)算值。標(biāo)準(zhǔn)四氯化碳購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠(chǎng)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)四氯化碳，比色管，100ml容量瓶，實(shí)驗(yàn)過(guò)程準(zhǔn)確稱(chēng)取10#柴油l.Olllg，至lj100ml容量瓶中，用四氯化碳將其配制成終濃度為10.111g/L的柴油溶液；所述終濃度為柴油在柴油溶液中的濃度。取10.111g/L的溶液2.5ml，加入到25ml的比色管中，用四氯化碳將其稀釋成終濃度為1.0111g/L的柴油溶液，此溶液為標(biāo)準(zhǔn)油。因?yàn)椴捎靡焕迕椎臉?biāo)準(zhǔn)溶液，所以配置的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度要稍微濃度大一些。分別取1.0111g/L的標(biāo)準(zhǔn)油0，0.5，1，2，4，8毫升置入各個(gè)25ml的比色皿中，用四氯化碳稀釋到刻度，濃度分別是0，20.0222，40.0444，80.0888，160.1776，320.3552mg/L。將JDS-105U的參數(shù)調(diào)到適合1厘米比色皿，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定，掃描空白以后進(jìn)行測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的結(jié)果如圖ll所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的函數(shù)關(guān)系式為y=0.905x-1.214，R2=0.999.柴油降解率=(w。-wnyw。xioo%，w。為開(kāi)始實(shí)驗(yàn)當(dāng)天即第o天時(shí)反應(yīng)體系中柴油濃度，Wn為第n天時(shí)反應(yīng)體系中柴油濃度；菌株對(duì)柴油的降解速率(W。-Wn)/n，W。為開(kāi)始實(shí)驗(yàn)當(dāng)天即第0天時(shí)反應(yīng)體系中柴油濃度，W。為第n天時(shí)反應(yīng)體系中柴油濃度，n為天數(shù)；空白值(KB):用水取代菌液進(jìn)行上述檢測(cè)，得到的體系中的柴油含量值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)體系中柴油含量的測(cè)定結(jié)果如表3所示。表3、柴油測(cè)量值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>反應(yīng)體系中柴油含量的變化如圖3所示，反應(yīng)體系中柴油降解率的變化如圖4所示。由圖中我們可以看到，在菌株WTS的作用下，反應(yīng)體系中柴油的含量逐漸的降低，其降解率逐漸的變大，降解率隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。加入菌株WTS的反應(yīng)體系與不加入菌株WTS的反應(yīng)體系相對(duì)比發(fā)現(xiàn)，空白反應(yīng)體系中柴油含量大于加入菌株WTS的反應(yīng)體系的柴油含量，菌株WTS有較高的石油降解能力。培養(yǎng)10d后菌株WTS的降解率達(dá)到75%，遠(yuǎn)高于不加菌的空白降解率(37%)，表明在降解過(guò)程中，發(fā)揮主導(dǎo)作用的是菌株WTS。菌株對(duì)柴油的降解速率能反映出該菌株對(duì)柴油的降解能力。菌株WTS對(duì)柴油的降解速率如圖5。WTS菌株在第2、4、6、8、10天的降解速率依次為16.57mg—^L—^d—\lO.gimg-1*!;1*^,S.Agmg-1*!;1*^,S.SSmg-1*!;1*^,7.96mg-^L-4d—1，在第二天降解速率達(dá)到最大，表明菌株WTS都能迅速的降解石油烴。二、菌株降解土壤中石油烴取長(zhǎng)慶油田的污染土壤，過(guò)篩后混勻，秤取2kg放入圓形瓷盆中?！策M(jìn)行了7種不同條件的對(duì)比試驗(yàn)1)不添加菌不翻耕不澆水不加麩皮的空白對(duì)照樣；2)不添加菌不翻耕不澆水加麩皮的土樣；3)不添加菌不翻耕澆水加麩皮的土樣；4)不添加菌翻耕澆水加麩皮的土樣；5)不添加菌不翻耕澆水不加麩皮的土樣；6)不添加菌翻耕澆水不加麩皮的土樣；7)添加WTS菌翻耕澆水加麩皮的土樣。其中，澆水處理為每隔兩天澆一次水，保持土壤含水率在20%左右；翻耕處理為每天翻耕土壤；加麩皮處理為向土壤中加入小麥麩皮，麩皮與土壤的質(zhì)量比為i:7;添加菌劑的處理為加菌液，土壤與菌的配比為2000g土壤100Xl(fCFU菌。各實(shí)驗(yàn)組處理情況如表4所示。表4、各實(shí)驗(yàn)組處理措施<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>采用紅外分光光度法測(cè)定土壤中石油烴的含量，方法具體如下前后一共進(jìn)行50天的試驗(yàn)，期間一共取5次樣品，其時(shí)間分別是第l天、第11天、第25天、第38天、第50天。每次取土樣2.5g，放入碾缽中，滴加3滴1:l鹽酸，加入適量無(wú)水硫酸鈉研磨均勻后，倒入50ml玻璃離心管中。用移液管取25mlCCl4至離心管，蓋蓋后，放入超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲萃取，萃取時(shí)間為40min。完畢以后，6000rpm離心，取上層澄清液0.5ml于25ml比色管中，加入CC^定容，等待測(cè)量。測(cè)量得到土壤中石油烴含量，將此結(jié)果與空白值相比較得到降解率。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)?？瞻字导淳幪?hào)為1)的空白對(duì)照組的值。土壤中石油烴降解率的計(jì)算公式(W。-Wn)/W。，其中W。是第1天土壤中石油烴濃度，W。是第n天土壤石油烴濃度。菌株對(duì)土壤中石油烴降解速率的計(jì)算公式(W。-Wn)/n，其中W。是第1天土壤中石油烴濃度，W。是第n天土壤石油烴濃度，n為天數(shù)。下述的圖6、圖7和圖8中，"油泥"表示編號(hào)為1)的對(duì)照組結(jié)果，"WTS"表示編號(hào)為7)的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果。土壤中石油含量變化如圖6所示、石油烴降解率的變化如圖7所示。由圖中我們可以看到，在菌的作用下，土壤中的石油烴含量逐漸降低，其降解率逐漸變大。降解率隨著時(shí)間的推移逐漸增加。經(jīng)過(guò)50天的修復(fù)試驗(yàn)，在菌的作用下，土壤中的石油降解率達(dá)到69.0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不做任何處理的空白對(duì)照組的石油降解率(27.62%)。油泥空白對(duì)照組的石油烴含量也會(huì)發(fā)生變化是由于土壤中原來(lái)就含有的土著嗜油菌以及揮發(fā)所造成的。菌株對(duì)土壤中石油烴降解速率的結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，分別在第ll天、第25天、第38天、第50天時(shí)，菌株對(duì)土壤中石油烴降解速率依次為1.816mg*g1*d—\131.175mg*g—^d—\0.942mg*g—^d—\0.759mg*g—^d—、在11天時(shí)達(dá)到最大值，高達(dá)1.816mg承g(shù)-^d—1。根據(jù)美國(guó)環(huán)境保護(hù)局的報(bào)告(PrinceM.Bioremediationofpetroleumwastefromtherefiningoflubricantoils[J].EnvironmentalProgress,1993，12(1):5-1l.)(JongeHD.Relationbetweenbioavailabilityandfueloilhydrocarboncompositionincontaminatedsoils[J].EnvironSciTechnol，1997，31:771-775)，土壤微生物對(duì)石油類(lèi)污染物的降解遵循一級(jí)反應(yīng)關(guān)系，即XyC戯式中C為土壤中油含量(mg/g);KT為基質(zhì)去除常數(shù)(d—"。由上式可得C/C。=exp(-KTt)將上式變形為InC=InC0-KTt以時(shí)間為橫坐標(biāo)，lnC為縱坐標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做線(xiàn)性回歸，則直線(xiàn)的截距為lnC。，斜率為KT。推導(dǎo)土壤中油的半衰期公式t1/2=In2/KT。加入菌的樣品土壤中含油量隨時(shí)間變化見(jiàn)圖10。其線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)為y=-0.023x+3.904，R2=0.951?；|(zhì)去除常數(shù)是0.023，t1/2=30。不做任何處理的空白對(duì)照樣品土壤中含油量隨時(shí)間變化見(jiàn)圖9。其線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)為y=-0.005x+3.962，R2=0.843?；|(zhì)去除常數(shù)是0.005，t1/2=139。因此空白對(duì)照組的土壤中油降解的半衰期是139天，投加WTS的土壤樣品中油降解的半衰期是30天。投加菌劑的土壤半衰期比自然土壤的半衰期縮短了4倍多。判定該菌對(duì)石油烴的降解途徑應(yīng)為產(chǎn)生生物表面活性物質(zhì)乳化烴類(lèi)，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行吸收利用。上述7個(gè)組中，土壤中石油烴含量變化的結(jié)果如表5所示。顯示加入菌劑的實(shí)驗(yàn)組在每次檢測(cè)中，石油烴含量均低于其它各對(duì)照組，表明該菌在石油烴降解方面發(fā)揮了重要作用。表5、各處理的土壤中石油烴含量單位是(mg/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>0183]序列表0184]<110>北京大學(xué)0185]<120>—株降解石油烴的菌株及其應(yīng)用0186]<160>10187]<210>10188]<211>14250189]<212>DNA0190]<213>擰檬酸桿菌(Citrobactersp.)0191]<223>0192]<400>10193]ggcctaccatgcaagtcgaacggtaacaggaagcagcttgctgctttgctgacgagtggc600194]ggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggt1200195]agctaataccgcataatgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcg1800196]gatgtgcccagatgggattagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatccc2400197]tagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccacactcctacg3000198]ggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcacccatgccgcgtg3600199]tatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggggttaaggttaa4200200]taaccttagccattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagcc■0201]gcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtagagcgcacgcaggc5400202]ggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactgg6000203]caggcttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagaga6600204]tctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcga7200205]aagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctat7800206]ttggaggttgtgcccttgaggtgtggcttccggagctaacgcgttaaatagaccgcctgg(3400207]ggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtgga■0208]gcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaac9600209]ttggcagagatgccttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtc10200210]agctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgtt10800211]gccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggg11400212]gatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcata12000213]tacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccgga12600214]ttggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgc1320racggtg礎(chǔ)acgttcccgggccttglararaccgcccgtcaracc啤gg敏gggttg1380caaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactt142權(quán)利要求檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTS，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.3253。2.—種降解石油烴的菌劑，其活性成份為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253。3.—種降解石油烴的固體菌劑，由權(quán)利要求1中所述檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253、銨鹽、可溶性鎂鹽和碳源組成，其中碳源、銨鹽、可溶性鎂鹽和擰檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253的比例為15-25g碳源0.9-1.2g銨鹽0.02-0.lg可溶性鎂鹽15X109-20X109CFU擰檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTSCGMCCNo.3253。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于所述碳源為大豆粉、蛋白粉、玉米粉和/或花生粉；所述銨鹽為(NH4)2HP04、NH4H2P04和/或NH4C1;所述可溶性鎂鹽為MgCl2、Mg(N03)2禾口/或MgS04。5.權(quán)利要求1中所述菌或權(quán)利要求3或4中所述固體菌劑在降解石油烴中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求1中所述菌或權(quán)利要求3或4中所述固體菌劑在生物修復(fù)石油污染中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1中所述菌或權(quán)利要求3或4中所述固體菌劑在生物修復(fù)石油污染的土壤中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一株降解石油烴的菌株及其應(yīng)用。該菌株為檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)WTS，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.3253。本發(fā)明的菌株具有很強(qiáng)的降解石油烴的能力。本發(fā)明的菌株、菌劑及其應(yīng)用方法為我國(guó)進(jìn)行石油污染土壤的生物修復(fù)工作提供理論依據(jù)，對(duì)我國(guó)油田地區(qū)環(huán)境保護(hù)工作以及石油運(yùn)輸過(guò)程中因泄漏而造成污染的修復(fù)工作具有重大意義，加快石油污染生物修復(fù)工作的進(jìn)展，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。文檔編號(hào)A62D101/20GK101691552SQ20091009320公開(kāi)日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年9月15日優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日發(fā)明者汪杰,禮曉,黃藝申請(qǐng)人:北京大學(xué)