專利名稱：爪哇青霉h2在降解甲醛中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲醛降解菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種爪哇青霉H2在 甲醛降解中的應(yīng)用。
技術(shù)背景關(guān)于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究很早以前就有報(bào)道，早期 人們著手于低濃度降解甲醛的研究，近年來高濃度降解甲醛時(shí)有報(bào) 道。Adroer等(1990)分離的Pseudomonas putida A2能降解甲醛 250mg'L"; Azachil等(1995)分離了的Halomonas sp. MAC僅能耐 受甲醛75-100 mg'L"; Doronina等(1997)分離的Pseudomonas. alcaligenes能降解甲醛200 mg'L—、菌株P(guān)seudomonas putida J3能降 解甲醛450 mg'I/1 ， Methylobacterium extorquens能降解甲醛500-1000 mg*L—、 一株P(guān)seudomonas alcaligenes培養(yǎng)3天后能降解甲醛 2000mg'L1。 Mirdamadi等(2005),艮道Methylobacterium extorquens (ESS禾Q PSS)和四株P(guān)seudomonas pseudoalcaligenes (LSW， SSW， NSW， OSS)能降解甲醛1850 mg'L-1，其中菌株P(guān)seudomonas pseudoalcaligenes OSS培養(yǎng)24 h3700 mg"L—1甲醛被100%消耗，培養(yǎng) 72h消耗5920mg'L1甲醛70%， Methylobacterium extorquens ESS和 Methylobacterium extorquens PSS還能完全降解甲醛2960 mg'L1。 Bonastre等(1986)報(bào)道在C甲醛為2300 mg*dnf3的活性污泥做基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧條件下被好氧菌降解；當(dāng)以 甲醛為碳源時(shí)降解甲醛400 mg，dm—3，在活性污泥廠的廢水處理中完 全降解甲醛2300mg*dirf3和苯酚2400mg'dm-3(Zagomaya et al， 1990)。 Yamazaki等(2001)從海水里分離了一株甲醛耐受細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)它在3% 的氯化鈉里能降解甲醛400 mg*dm—3，在Eiroa等(2004)設(shè)計(jì)的模型里， 指出硝化作用可以降解甲醛，當(dāng)以甲醛為碳源、甲醇為伴生碳源時(shí)， 硝化細(xì)菌可以降解甲醛的濃度是30-3890 mg*dm—3，而反硝化細(xì)菌在 有甲醛和甲醇存在時(shí)可以降解1360mgnim-3甲醛(Eiroaetal， 2006)。 然而大部分是降解甲醛細(xì)菌和降解甲醛酵母菌的研究，霉菌的研究報(bào) 道很少，Kondo等(2002)從土壤中分離了一株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomius IRI013，它能生長(zhǎng)在最高w (甲醛)=0.45%里并把它 完全消耗掉。無論是低濃度還是高濃度，然而大部分是甲醛降解細(xì)菌 和甲醛降解酵母菌的研究，霉菌的研究報(bào)道很少，Kondo等(2002)從 土壤中分離了一株甲醛耐受真菌Aspergillus nomius IRI013，它能生長(zhǎng) 在最高w (￥嗎=0.45%里并把它完全消耗掉。有關(guān)爪哇青霉H2的報(bào)道見于1995年的Berbee, M丄.和A. Yos himura等人，(Berbee, M丄.，A. Yoshimura， J. Sugiyama， and J.W. Taylor. 1995. Is Penicillium monophyletic an evaluation of phylog eny in the family Trichocomaceae from 18S， 5.8S and ITS ribosom al DNA sequence data. Mycologia 87: 210-222.)。但是有關(guān)爪哇青 霉H2能降解甲醛的研究并未見有報(bào)道。本發(fā)明的目的是提供一種爪哇青霉H2在降解甲醛中的應(yīng)用，可 以有效、快速地降解甲醛。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一、甲醛降解菌一爪哇青霉H2的分離與鑒定1、 培養(yǎng)基配方基本培養(yǎng)基配方為1.0免(w.v")葡萄糖，0.29Hw.一)NaN03， 0.1免(w.v")K2HP04， 0.059Kw'v,MgS04.7H20 ， 0.05呢(w.v力KCl ， 0.001免(w.一)FeS04.7H20， 0.019Kw.v")酵母膏，0.1免(w.v")甲醛(甲 醛用市售甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0。(如沒有特別說 明，以下基本培養(yǎng)基均為此配方培養(yǎng)基)察氏培養(yǎng)基配方3.0%(w.v")蔗糖，0.3免(w.v")NaN03 ， 0.1%(w'v")K2HPO4， 0.05免(w.v")MgS04.7H20 ， 0.05%(w.v-^KC1 ， 0.001%(w.v")FeSO4.7H2O， 1.5—2.0呢(w.v")瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.0呢(wv,麥芽浸膏，0.1呢(wv")蛋白胨， 2.0免(w.v")葡萄糖，1.5—2.0免(w.v")瓊脂。PDA培養(yǎng)基配方20免(w.v")土豆(去皮)，2.0免(w.v")葡萄糖， 1.5—2.0% (w.v")瓊脂。(土豆切碎，加水煮沸30min，用雙層紗布過 濾，取其濾液。)2、 分離純化樣品采自未經(jīng)過處理的家具廠出水口的淤泥，其甲醛氣味濃烈， 甲醛污染嚴(yán)重，從而保證了甲醛降解目的菌的存在。將上述樣品接種于基本培養(yǎng)基里，搖床上160r.min"3(TC培養(yǎng)5d， 生長(zhǎng)起來的霉菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫線，經(jīng)多次純化，分離 到一株霉菌，編號(hào)H2。然后將該菌株分別接種于察氏培養(yǎng)基、麥芽 汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上，25'C培養(yǎng)8d，觀察其菌落特征的同時(shí)， 顯微鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)，并記錄好結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合提取DNA，檢測(cè) DNA濃度和純度，PCR 18S rDNA擴(kuò)增等一系列的分子鑒定手段得出 結(jié)論本發(fā)明分離到的降解甲醛菌株的18SrDNA序列與己報(bào)道的爪 哇青霉H2 (尸em'c!7/^m jaww!'o/m)同源率達(dá)99.4%，其培養(yǎng)特征及 顯微特征也與爪哇青霉(尸em'"7/z'"mymw2z'o/w)最相似。爪哇青霉H2的報(bào)道文獻(xiàn)為Berbee， M丄.,A. Yoshimura， J. Sugiyama， and J.W. Taylor. 19 95. Is Penicillium monophyletic an evaluation of phylogeny in the family Trichocomaceae from 18S， 5.8S and ITS ribosomal DNA s equence data, Mycologia 87: 210-222.由此可見，本發(fā)明篩選到的降解甲醛菌為爪哇青霉H2， 18SrDNA 序列長(zhǎng)度為1660bp，上傳GenBank申請(qǐng)?zhí)柎a為bankit890497。 二、爪哇青霉H2的最佳生長(zhǎng)pH值爪哇青霉H2—般喜好生長(zhǎng)在偏酸的環(huán)境里，但其嗜酸性的程度 差別很大，因此了解其最佳生長(zhǎng)的pH，有利于對(duì)其進(jìn)行快速培養(yǎng)和 應(yīng)用。1、 一級(jí)種子的制取選取產(chǎn)孢良好的爪哇青霉H2，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2 3d，當(dāng)霉菌進(jìn)入快速生長(zhǎng)期時(shí)，定時(shí)測(cè)定(9/)475值，當(dāng)OZ)475值快速上升時(shí)，此菌液即可作為一級(jí)種子。2、 樣品制備選取大口 150mL三角瓶，配制pH分別為4.0， 4.5， 5.0， 5.5，6.0的液體基本培養(yǎng)基，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口 (無菌封口培養(yǎng) 膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑0.6cm的圓孔兩個(gè)，中間有直 徑3cm的、孔徑小于0.2^1的無菌濾紙片，多用于組培生產(chǎn))，培養(yǎng) 一級(jí)種子(OA仍值為0.168)，除空白外接入一級(jí)種子5mL，置搖床 上30。Cl60r.min"培養(yǎng)，在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， l線 取樣，每次取2瓶測(cè)量菌絲干重，OZ)值測(cè)定用北京普析通用儀器有 限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，菌絲干重用重量法測(cè) 量，結(jié)果取其平均值作圖。3、 結(jié)果分析爪哇青霉H2在5種不同pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)144h，菌絲干重分 別從0.0026、 0.0024、 0.0027、 0.0024、 0.0024 mg.1/1上升到0.0116、 0.0122、 0.0152、 0.0131、 0.0117mg.L1，菌絲干重最大的是pH5.0。 所以爪哇青霉H2的最適pH是pH5.0。 三、爪哇青霉H2對(duì)甲醛的降解能力 選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，C(w)按約0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (wv")加入，pH分別選取已經(jīng)測(cè)得的最適pH (pH5.0)，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一級(jí)種子(0/)475值為 0.172)，除空白外每瓶接入5mL,置搖床上3(rC160r.min—1培養(yǎng)，并在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取3瓶，其 中一瓶為空白，7000X離心15min、過濾，濾液用AHMT分光光度 法檢測(cè)C( )，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測(cè)菌絲干重， 菌絲干重用重量法測(cè)量，結(jié)果取其平均值作圖。C)的檢測(cè)用AHMT分光光度法，結(jié)果以實(shí)際測(cè)量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)， 并取其平均值作圖。爪哇青霉H2接種后144h，處理0.1% C(甲接)從1059mg.L"下降 到317mg-L1，降解率為70.1%，空白1102-1134mg.L";處理0.15免C (甲整)從1528mg.L"下降到712 mg，L—1，降解率為53.4%，空白 1578-1612mg.L";處理0.20% C(甲瞎)從ZWYmg'L-1下降到1069 mg.1/1， 降解率為51.3%，空白2209-2243 mg.L—1;處理0.25免C(甲瞎)從 3152mg-L—1下降到2264 mg.L—1，降解率為28.2%,空白3195-3223 mg.L1;菌絲干重分別從0.0027 、 0.0024、 0.0026、 0.0024g'l/1上升 為0.0147、 0.0115、 0.0087、 0細(xì)6g'L1，在4個(gè)不同濃度的處理中， 揮發(fā)損失很少，C(鴨)沒有快速下降期，菌絲干重上升也很平緩。當(dāng)甲醛與一級(jí)種子幾乎同時(shí)加入分離基本培養(yǎng)基時(shí)，Oh時(shí)取樣 加有甲醛和5mL —級(jí)種子的Cw^都比只加甲醛不加菌的空白要低 4% 10%左右，這就說明有少量的甲醛剛和菌絲體接觸就被爪哇青 霉H2吸收或吸附。四、爪哇青霉H2的碳源代謝及最佳碳源選取4種常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，按 培養(yǎng)基體積的10免添加(w.v—1)，設(shè)置5種不同處理的碳源，分別為0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培養(yǎng)基，pH值 Hl為4.5， H2為5.0， H4為5.5，選用大口 150mL三角瓶分裝，瓶 口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，接入一級(jí)種子5mL ((9/)475值為0.210)， 置搖床上3(TC160r.min"培養(yǎng)，并在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取2瓶，測(cè)CV，)和菌絲干重值，H4培養(yǎng)基里 有葡萄糖的處理，加測(cè)C\ )，并帶只加葡萄糖不加菌的培養(yǎng)基空 白。OZ)值測(cè)定用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可 見分光光度計(jì)，取樣后7000X離心15min、過濾，濾液用來測(cè)量CV甲 醛)和C^萄糖)，C^s)用AHMT分光光度法檢測(cè)，C，糖)用蒽酮比色 法檢測(cè)，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測(cè)菌絲干重。結(jié)果以 實(shí)際測(cè)量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，并取其平均值作圖。爪哇青霉H2在5種不同的碳源里都能有效的降解甲醛，菌絲干 重分別從0.0033、 0036、 0.0034、 0.0035、 0.0036 g'L—1上升到0.0041、 0.0164、 0.0171、 0.0165、 0.0172 g'L1，在處理0.1%甲醛+10%蔗糖、 0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛+10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖 中，CV甲醛)分別從1213、 1204、 1257、 1141mg L—1下降到282、 246、 315、 248mg'L1，降解率分別為76.8、 79.6、 74.9、 78.3%, 96h內(nèi)，C wsi)下降較快，菌絲增長(zhǎng)較慢。在只有甲醛作為碳源的處理中，培養(yǎng)144h時(shí)H2的C沖醒)從 1214mg《1下降到436mg'L—1，降解率為64.1%， 24h后C啷)下降速 度加快，所以爪哇青霉H2能單獨(dú)利用甲醛為碳源并降解甲醛，但降解緩慢，效果不如加復(fù)合碳源。葡萄糖的加入量為13926 mg'L—1， C憤萄糖)呈加速度下降，48h 前稍慢，每隔24h消耗的量為657、 1229、3551 ^(M^ZSA^SSlOmg'L-1, 到144h C糖)是381mg'I/1。只加葡萄糖沒加菌的空白，C^萄糖)穩(wěn) 定，計(jì)算葡萄糖消耗量時(shí)可忽略此空白。爪哇青霉H2以甲醛和葡萄糖為碳源的的利用規(guī)律是降解曲線 C伸酸,下降幾近均速，24h內(nèi)C^萄糖)內(nèi)下降稍緩，爪哇青霉H2先以 甲醛和葡萄糖同時(shí)為碳源，并優(yōu)先利用甲醛；24h后，C^萄糖)下降速 度快，菌絲干重72h后上升較快，爪哇青霉H2繁殖迅速，以甲醛和 葡萄糖同時(shí)為碳源；沒有測(cè)到C押瞎)緩慢下降期。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn) 已有菌種爪哇青霉H2具有降解甲醛的能力，同時(shí)提供了爪哇青霉 H2在降解甲醛的應(yīng)用中的一系列數(shù)據(jù)，如最適生長(zhǎng)pH、碳源和甲醛 降解能力等，極大地補(bǔ)充了降解甲醛菌的資料庫，并且填補(bǔ)了國內(nèi)甲 醛降解菌研究的空白；2.本發(fā)明提供的爪哇青霉H2在降解甲醛中的 應(yīng)用，為甲醛污染的生物處理工程，提供了強(qiáng)有力的幫助。


圖1為爪哇青霉H2在察氏培養(yǎng)基(25°C， 7d)上的菌落形態(tài)； 圖2為爪哇青霉H2在在麥芽汁培養(yǎng)基(25°C， 7d)上的菌落形態(tài)；圖3為爪哇青霉H2在PDA培養(yǎng)基(加有孟加拉紅，25°C， 7d) 上的菌落形態(tài)；圖4為爪哇青霉H2的分生孢子梗掃帚狀分枝和球形分生孢子圖5為爪哇青霉H2在不同pH時(shí)的生長(zhǎng)曲線；圖6為爪哇青霉H2在不同C押薛)時(shí)的降解曲線；圖7為爪哇青霉H2在不同C申酵時(shí)的生長(zhǎng)曲線；圖8為爪哇青霉H2在不同碳源里的C瞎)的降解曲線；圖9為爪哇青霉H2在不同復(fù)合碳源里的生長(zhǎng)曲線；圖10為爪哇青霉H2的C 的下降曲線；圖11為爪哇青霉H2C押整)和Cm萄糖)的下降曲線比較；其中，l為甲醛，2為甲醛+蔗糖，3為甲醛+麥芽糖，4為甲醛+淀粉，5為甲醛+葡萄糖，6為葡萄糖，ck為空白對(duì)照。通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l甲醛降解菌的分離與鑒定 1、培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基配方1.0免(w-v")葡萄糖，0.2%(w-v")NaNO3 ， 0.19Kw.v")K2HP04， 0.05免(w.v-i)MgSCV7H20 ， 0.05免(w.v")KCl ， 0.001免(w.v")FeSCV7H20， 0.01免(w.v")酵母膏，0.1呢(w.v")的甲醛(甲 醛用市售甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0。察氏培養(yǎng)基配方3.0%(w-v")蔗糖，0.3%(w-v—、NaN03 ， 0.19Kw.v")K2HP。4 ， 0.059Kw.v")MgSCV7H20 ， 0.059Kw.v")KCl ， 0-001呢(w.v")FeSO4.7H20, 1.5 2.0呢(w.v")瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.09Kw.v")麥芽浸膏，0.1免(WV")蛋白胨， 2.0%(w.v—b葡萄糖，1.5 2.0%(w.v—i)瓊脂。PDA培養(yǎng)基配方20% (w.v")土豆，2.0免(w.v")葡萄糖，1.5 2.0% (w-v")瓊脂。(土豆去皮切碎，加水煮沸30，用雙層紗布過濾，取其 濾液。)2、 分離樣品采自未經(jīng)過處理的家具廠出水口的淤泥，其甲醛氣味濃烈， 甲醛污染嚴(yán)重，從而保證了甲醛降解目的菌的存在。在超凈工作臺(tái)上，取10g上述淤泥樣置于90mL無菌水中，振蕩 15 min，放置20秒，取lmL上清液接種于培養(yǎng)液里，在搖床上 160r.min"3(TC培養(yǎng)5d，生長(zhǎng)起來的真菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫 線，經(jīng)過多次純化，分離到一株霉菌，編號(hào)H2。3、 鑒定(1) 平板觀察選取察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，將接種針經(jīng)火 焰滅菌并冷卻后，蘸取極少量的孢子，點(diǎn)植于平板的中間位置，將平 板置于25X:培養(yǎng)8d，觀察菌落的特征并記錄。(2) 顯微觀察用解剖針從培養(yǎng)皿的菌落上，挑取少許菌體，置載玻片的水滴中， 于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征并記錄。(3) 分子鑒定DNA的提取參照CTAB法進(jìn)行，DNA濃度和純度的檢測(cè)，采用核酸/蛋白分析儀于Nucleic Acid程序下測(cè)定。PCR采用真菌18S rDNA擴(kuò) 增通用引物(上游引物GATCCTGCCAGTAGTCATATGC;下游引 物GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，反應(yīng)條件為94。C 5min， 30個(gè) 循環(huán)(94°C lmin、 56°C lmin、 72°C lmin) ， 72。C反應(yīng)7min。用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳40min，于UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果在 Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性 最高的模式菌株。4、結(jié)果與分析經(jīng)平板觀察和顯微觀察，該菌株在察氏培養(yǎng)基上菌落直徑20mm， 平薄，與基質(zhì)緊貼，細(xì)絨狀，顏色不均，點(diǎn)種處為黃棕色，外圍淡紫 色至淡灰藍(lán)色。有大量細(xì)小黃色滲出液滴，無輻射紋，反面紅黃色(圖 1);在麥芽汁培養(yǎng)基上菌落直徑24mm，極細(xì)絨狀或氈狀，后稍呈粉 狀，灰綠色或灰藍(lán)色，表面有較深的溝紋，干燥無滲出液，反面近芥 黃色，基質(zhì)有輻射狀溝紋(圖2);在PDA培養(yǎng)基上，呈粉狀，綠色， 有輻射狀條紋，無滲出液，反面淡黃色(圖3)。分生孢子梗無足細(xì) 胞，其先端有掃帚狀分枝，帚狀枝一般為單輪型，不分枝或分枝不規(guī) 貝U，每個(gè)分枝只有一輪小梗，小梗5-8個(gè)，5-10*2.3-3.8^，分生孢子 球形，1.8-2.5拜，壁近于光滑(圖4)。該菌株的18SrDNA序列與已報(bào)道的爪哇青霉H2 (/^m'd肌Mm jVzvam'ci/m)的有性世代爪哇正青霉(五M/ em'c/版m力v"m'c腦)同源 率達(dá)99.4%，其培養(yǎng)特征及顯微特征也與爪哇青霉H2 (尸em'd/^my"vam'cwm)最相似。結(jié)合上述的平板觀察、顯微觀察和分子鑒定結(jié)果，得出如下結(jié)論:本發(fā)明篩選到的降解甲醛菌H2為爪哇青霉，18SrDNA序列長(zhǎng)度為 1660bp，上傳GenBank申請(qǐng)?zhí)柎a為banki劇497。實(shí)施例2爪哇青霉H2的最佳生長(zhǎng)pH值霉菌一般喜好生長(zhǎng)在偏酸的環(huán)境里，但其嗜酸性的程度差別很 大，因此了解其最佳生長(zhǎng)的pH，有利于對(duì)其進(jìn)行快速培養(yǎng)和應(yīng)用。1、 一級(jí)種子的制取選取產(chǎn)孢良好的爪哇青霉H2，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床 160r*min—、 3(TC培養(yǎng)2 3d，當(dāng)霉菌進(jìn)入快速生長(zhǎng)期時(shí)，定時(shí)測(cè)定 OZ)475值，當(dāng)0/)475值快速上升時(shí)，此菌液即可作為一級(jí)種子。2、 樣品制備選取大口 150mL三角瓶，配制pH分別為4.0， 4.5， 5.0， 5.5，6.0的液體基本培養(yǎng)基，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口 (無菌封口培養(yǎng) 膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑0.6cm的圓孔兩個(gè)，中間有直 徑3cm的、孔徑小于0.2p的無菌濾紙片，多用于組培生產(chǎn))，培養(yǎng) 一級(jí)種子(0/)475值為0.168)，除空白外接入接入一級(jí)種子5mL，置 搖床上30。C160r.min"培養(yǎng)，在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取2瓶測(cè)量菌絲干重，OD值測(cè)定用北京普析通用儀 器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)，菌絲干重用重量 法測(cè)量，結(jié)果取其平均值作圖。3、 菌絲干重的測(cè)量燒杯在105。C烘lh至恒重，記錄稱量結(jié)果，將菌液用濾紙過濾 后，連同濾紙一起轉(zhuǎn)入已恒重的燒杯中，于8(TC烘至恒重，每次帶 空白兩個(gè)以上。菌絲干重(g.L—1)=[(燒杯+菌的重量+紙)-(燒杯+紙)]*1000/ 樣品量。菌絲干重取其平均值作圖。4、 結(jié)果與分析爪哇青霉H2在5種不同pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)144h (圖5)，菌絲 干重分別從0.0026、 0.0024、 0.0027 、 0.0024、 0.0024 mg.L1上升到 0.0117、 0.0131、 0.0152、 0.0122、 0.0116 mg.L1，菌絲干重最大的是 pH5.0。實(shí)施例3爪哇青霉H2對(duì)甲醛的降解能力 1、樣品制取選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，C(甲醒)按約0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (w.v")加入，pH分別選取已經(jīng)測(cè)得的最適pH (pH5.0)，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一級(jí)種子(6>1)475值為 0.172),除空白外每瓶接入5mL，置搖床上30。C160r.min—1培養(yǎng)，并 在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取3瓶，其 中一瓶為空白，7000X離心15min、過濾，濾液用AHMT分光光度 法檢測(cè)C( )，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測(cè)菌絲干重， 菌絲干重用重量法測(cè)量，結(jié)果取其平均值作圖。Cw^的檢測(cè)用AHMT分光光度法，結(jié)果以實(shí)際測(cè)量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)， 并取其平均值作圖。2、 檢測(cè)C(￥S)的檢測(cè)用AHMT分光光度法，原理為甲醛與4-氨基-3聯(lián) 氨-5-巰基-l，2，4-三氮雜茂(簡(jiǎn)稱AHMT)在堿性條件下縮合，然后經(jīng) 高碘酸鉀氧化成6-巰基-5-三氮雜茂[4，3-b]-S-四氮雜苯紫紅色化合物， 其色澤深淺與甲醛含量成正比。上述樣品經(jīng)7000X離心15min、并過濾后，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已 稱至恒重的燒杯中測(cè)菌絲干重，取其平均值作圖；濾液用AHMT分 光光度法檢測(cè)C(TO)，具體步驟如下取100ml容量瓶，吸取l.Oml稀釋了 100倍的上述濾液，加入 5mol'l/氫氧化鉀溶液1.0ml， 0.5%AHMT溶液l.Oml，蓋上管塞， 顛倒混勻三次，放置20min，加入1.5免高碘酸鉀0.3ml，充分振搖， 放置5min，定容至100ml。用lcm比色皿，波長(zhǎng)550nm,隨樣品帶空 白，測(cè)量吸光值，甲醛標(biāo)液購自百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。甲醛標(biāo)線 的操作步驟，跟樣品的相同，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)線方程，樣品含 量由標(biāo)線方程換算得出。3、 結(jié)果與分析算出空白和樣品的C(￥S)，并取空白和兩個(gè)樣品的平均值分別作 圖，作圖例標(biāo)識(shí)用0.1%、 0.15%、 0.2%、 0.25%表示，實(shí)際C(申酸)以 測(cè)量結(jié)果為準(zhǔn)。如圖6、7所示，爪哇青霉H2接種后144h，處理0.1免p(申酵)從1059mg-L—1下降到317 mg.L1，降解率為70.1%，空白1102-1134 mg.L";處理0.15%p (to)從1528mg.l/下降到712 mg.L—、降解率為 53.4%，空白1578-1612mg.L";處理0.20%p (甲醛)從21971^丄"下降 到1069 mg丄-1，降解率為51.3%，空白2209-2243 mg.L—1;處理0.25%p (甲瞎)從3152mg.L—1下降到2264 mg.L—1，降解率為28.2%，空白 3195-3223 mg.L1;菌絲干重分別從0.0027、 0.0024、 0.0026、 0.0024g 'L"上升為0.0147、 0.0115、 0.0087、 0.0046g'I/1，在4個(gè)不同濃度 的處理中，p(申g)沒有快速下降期，菌絲干重上升也很平緩?？瞻?44h 揮發(fā)很少，在衡量或計(jì)算降解甲醛量時(shí)完全可以將揮發(fā)忽略不記。當(dāng)甲醛與一級(jí)種子幾乎同時(shí)加入分離基本培養(yǎng)基時(shí)，Oh時(shí)取樣 加有甲醛和5mL —級(jí)種子的C(甲瞎)都比只加甲醛不加菌的空白要低 4% 10%左右，這就說明有少量的甲醛剛和菌絲體接觸就被爪哇青 霉H2吸收或吸附。在本實(shí)施例的4個(gè)不同甲醛濃度處理中，爪哇青霉H2的Cc甲醒) 沒有快速下降期，菌絲干重沒有快速上升期。實(shí)施例4爪哇青霉H2的碳源代謝及最佳碳源 選取4種常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，按 培養(yǎng)基體積的10免添加(wv-1)，設(shè)置5種不同處理的碳源，分別為 0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培養(yǎng)基，pH值 Hl為4.5， H2為5.0， H4為5.5，選用大口 150mL三角瓶分裝，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，接入一級(jí)種子5mL (0/)475值為0.210)， 置搖床上3(TC160r.min"培養(yǎng)，并在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120, 144h取樣，每次取2瓶，測(cè)C伸K)和菌絲干重值，H4培養(yǎng)基里 有葡萄糖的處理，加測(cè)C ，ffi)，并帶只加葡萄糖不加菌的培養(yǎng)基空 白。OZ)值測(cè)定用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1800型紫外可 見分光光度計(jì)，取樣后7000X離心15min、過濾，濾液用來測(cè)量Cw 接)和C 萄糖)，C (甲醒)用AHMT分光光度法檢測(cè)，C f葡萄糖)用蒽酮比色 法檢測(cè)，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測(cè)菌絲干重。結(jié)果以 實(shí)際測(cè)量數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，并取其平均值作圖。如圖8、 9所示，爪哇青霉H2在5種不同的碳源里都能有效的 降解甲醛，在處理0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1% 甲醛+10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖中，C r甲醛)分別從1214、 1213、 1204、 1257mg，L:下降到282、 424、 315、 248mg'L1，降解率分別為 76.8、 80.0、 74.9、 78.3%， 96h內(nèi)，菌絲干重分別從0.0036、 0.0034、 0.0035、 0.0036 g'l/上升到0.0164、 0.0171、 0.0165、 0.0172g'L1， C(甲整)下降較快，菌絲增長(zhǎng)較慢。在只有甲醛作為碳源的處理中，培養(yǎng)144h時(shí)H2的C^s)從 1214mg'L"下降到436mg'I/1，降解率為64.1%,菌絲干重從0.0033 上升到0.0041g.L"， 24h后CV甲醛)下降速度加快，所以爪哇青霉H2 能單獨(dú)利用甲醛為碳源并降解甲醛，但降解緩慢，效果不如加復(fù)合碳 源。如圖10所示，葡萄糖的加入量為13926 mg*L"， C ^萄糖)的下降呈加速度下降，48h前稍慢，每隔24h消耗的量為657、 1229、 3551、 3049、 2549、 2510mg.L1，到144h C纖)是381mg'L—1。只加葡萄糖 沒加菌的空白，C凍萄糖)穩(wěn)定，計(jì)算葡萄糖消耗量時(shí)可忽略此空白。爪哇青霉H2以甲醛和葡萄糖為碳源的的利用規(guī)律是如圖11 所示，降解曲線C押醒)下降幾近均速，24h內(nèi)C 內(nèi)下降稍緩， 爪哇青霉H2先以甲醛和葡萄糖同時(shí)為碳源，并優(yōu)先利用甲醛；24h 后，Cm萄糖)下降速度快，菌絲干重72h后上升較快，爪哇青霉H2繁 殖迅速，以甲醛和葡萄糖同時(shí)為碳源；沒有測(cè)到C，⑥緩慢下降期。由以上數(shù)據(jù)可見，爪哇青霉H2應(yīng)該是對(duì)甲醛抑制相對(duì)敏感，甲 醛利用率相對(duì)較少，能夠利用復(fù)合碳源并降解甲醛，也能利用甲醛為 唯一碳源但菌絲干重增長(zhǎng)緩慢，降解效果也不如復(fù)合碳源。
權(quán)利要求
1、爪哇青霉H2在降解甲醛中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供爪哇青霉H2在降解甲醛中的應(yīng)用。關(guān)于甲醛降解菌的研究很早以前就有報(bào)道，然而大部分是關(guān)于甲醛降解細(xì)菌和甲醛降解酵母菌的研究，甲醛降解霉菌的研究報(bào)道很少，國內(nèi)目前尚無甲醛降解菌的報(bào)道，本發(fā)明公開了已有菌株——爪哇青霉H2在降解甲醛中的應(yīng)用，同時(shí)提供了爪哇青霉H2在降解甲醛的應(yīng)用中的一系列數(shù)據(jù)，如最適生長(zhǎng)pH、碳源和甲醛降解能力等，極大地補(bǔ)充了降解甲醛菌的資料庫，此外，本發(fā)明提供的爪哇青霉H2在降解甲醛中的應(yīng)用，為甲醛污染的生物處理工程，提供了強(qiáng)有力的幫助。
文檔編號(hào)A62D101/28GK101250488SQ200810027400
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日
發(fā)明者周建民, 畢鴻亮, 陳能場(chǎng), 黃賽花 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所