專利名稱：一種消除殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合酶制劑,特別涉及消除蔬菜、茶葉和瓜果中殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制 劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國需以占世界7%的土地養(yǎng)活占世界20%的人口，因而非常依賴農(nóng)藥。特別是為了 減少因病蟲害造成的損失，使用了大量的殺蟲劑。但農(nóng)藥一方面抑制病蟲害的發(fā)生；另一 方面，它也帶來了極大的生態(tài)和社會(huì)問題。
絕大多數(shù)農(nóng)藥均具毒性，且缺乏選擇性，常對(duì)非靶標(biāo)生物造成直接的毒害。此外，由 于農(nóng)藥較難降解，有部分殘留在作物、牧草、土壤和水體中，并隨食物鏈轉(zhuǎn)移和富集作用， 使處于食物鏈的最高位置的人類受到的農(nóng)藥危害最嚴(yán)重。
農(nóng)藥對(duì)人的危害主要有急性中毒、慢性中毒、遲發(fā)性神經(jīng)中毒、致癌、致畸和致突 變、生殖毒性，如損害精子，使受孕和生育能力降低，并可導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙、子代發(fā)育 不良或死亡等。
我國蔬菜、水果的農(nóng)藥殘留問題相當(dāng)嚴(yán)重，甚至有因食用含殘留農(nóng)藥的蔬菜、水果造 成急性中毒的報(bào)道?，F(xiàn)在通常采用清水洗滌、浸泡或者用清洗劑清洗的方法清除蔬菜、水 果表面殘留的農(nóng)藥。農(nóng)藥一般難溶于水，僅用清水清洗不能得到滿意的效果。
清洗劑雖可較有效地去除殘留農(nóng)藥，但并未真正清除殘留農(nóng)藥，農(nóng)藥隨污水再次進(jìn)入 環(huán)境循環(huán)并積累。也可采用堿水洗滌，農(nóng)藥在堿性條件下容易分解，但堿性過強(qiáng)容易破壞 蔬菜、水果的營養(yǎng)和風(fēng)味，另外堿對(duì)農(nóng)藥的分解也相對(duì)有限。
目前，應(yīng)用最廣泛三類農(nóng)藥是有機(jī)磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯，它們都對(duì)哺乳動(dòng)物 有神經(jīng)毒作用。與已禁用的有機(jī)氯相比，它們較易自然降解或被酶水解。
有機(jī)磷農(nóng)藥多為磷酸酯類或硫代磷酸酯類，含有三個(gè)磷酯鍵。其致毒機(jī)理是磷?；?酰膽堿酯酶，使機(jī)體喪失分解乙酰膽堿的能力。蓄積的乙酰膽堿使膽堿能神經(jīng)受到持續(xù)沖 動(dòng)，導(dǎo)致先興奮后衰竭的一系列神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。只要斷裂一個(gè)磷酯鍵，有機(jī)磷農(nóng)藥就失去抑制乙酰膽堿酯酶的能力，喪失或大大降低對(duì)動(dòng)物的毒性作用。 氨基甲酸酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)基于毒扁豆堿，骨架為氨基甲酸，常用的是N-甲酰氨基甲 酸酯。其毒理機(jī)制也是抑制乙酰膽堿酯酶活性，阻斷正常神經(jīng)傳導(dǎo)。但同有機(jī)磷類的機(jī)制 有所不同1.它不需經(jīng)代謝活化，可直接與乙酰膽堿酯酶形成疏松復(fù)合體，抑制后者的 活性。2.與乙酰膽堿酯酶可逆結(jié)合，形成的復(fù)合物可迅速分解，故癥狀較輕，恢復(fù)較快。 酯鍵斷裂后氨基甲酸酯類農(nóng)藥失去毒性作用。
擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是在天然除蟲菊酯結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上開發(fā)的高效、廣譜、快速擊倒、神 經(jīng)致毒性殺蟲劑。傳統(tǒng)擬除蟲菊酯均為羧酸酯，由醇和菊酸縮合而成。菊酸部分通常為含 不同側(cè)鏈分子的二甲基環(huán)丙烷，醇部分通常為帶氰基的芳香環(huán)。擬除蟲菊酯的致毒機(jī)制是 通過延遲神經(jīng)元電壓門控性鈉通道的關(guān)閉，導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞鈉、鈣離子流增加，引起胞 內(nèi)鈉、鈣離子濃度增高，膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性和功能改變，造成中樞神 經(jīng)系統(tǒng)損傷。同氨基甲酸酯類農(nóng)藥一樣，酯鍵斷裂后擬除蟲菊酯類農(nóng)藥即失去毒性作用。 從中國學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫和維普全文數(shù)據(jù)庫收集1998 - 2006年度所有關(guān) 于蔬菜、水果農(nóng)藥殘留的文章。剔除重復(fù)文獻(xiàn)，抽出其中定量分析農(nóng)藥殘留的文章，對(duì)其 中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，歸納。中國現(xiàn)階段蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留的大致現(xiàn)狀為(見表1):檢 出率最高的三種有機(jī)磷農(nóng)藥是甲胺磷、氧樂果和對(duì)硫磷；檢出率最高的兩種氨基甲酸酯類 農(nóng)藥是呋喃丹和西維因；檢出率最高的三種擬除蟲菊酯農(nóng)藥是氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰 菊酯。檢出率均為相對(duì)檢出率，以每類農(nóng)藥中檢出率最高的那種為IOO計(jì)。
表1. 1998 - 2006年度中國蔬菜水果農(nóng)藥檢出率統(tǒng)計(jì)
有機(jī)磷類氨基甲酸酯類擬除蟲菊酯類甲胺磷氧樂果對(duì)硫磷呋喃丹西維因氯氰溴氰氰戊
10065.958.510066.710091.641.6
降解農(nóng)藥使其失效的方法主要有化學(xué)降解、光降解和微生物降解。常用的化學(xué)降解法 有氧化法、堿水解法和酸水解法，化學(xué)法雖然能有效降解農(nóng)藥，但僅適用于農(nóng)藥廠生產(chǎn)廢 水的處理，且酸、堿容易腐蝕管道，成本高，具有一定危險(xiǎn)性。光降解是利用日光降解植 物表面、.土壤表面和空氣中的農(nóng)藥。不同的化合物在光照下穩(wěn)定性不同，光照強(qiáng)度、土壤類型也會(huì)影響降解效果，因而光降解的作用較為有限。環(huán)境中的微生物能降解和轉(zhuǎn)化農(nóng)藥。 事實(shí)上，農(nóng)藥在環(huán)境中的降解和轉(zhuǎn)化主要由微生物引起。微生物對(duì)農(nóng)藥的代謝多通過一系 列酶促反應(yīng)完成，包括水解作用。
不過，上述方法無一適合蔬菜和瓜果上殘留農(nóng)藥的清除?；瘜W(xué)法所需的酸、堿及氧化 條件已足以破壞蔬菜瓜果的營養(yǎng)成分；光降解法需要很長時(shí)間；微生物處理降解農(nóng)藥，對(duì) 蔬菜瓜果也有損害。即使沒有影響，這樣處理的蔬菜瓜果估計(jì)很難被人們所接受。
因此，迫切需要能夠簡便、安全的清除蔬菜、瓜果上殘留農(nóng)藥的方法和產(chǎn)品，以滿足 人們?nèi)粘Ｉ畹男枰?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是為了提供一種降解譜廣的清除蔬菜和瓜果上殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制 劑,將殘留在蔬菜和水果上農(nóng)藥分解為無毒或低毒的產(chǎn)物，降低其對(duì)人和非靶標(biāo)生物的毒 害及對(duì)環(huán)境的污染。
本發(fā)明目的之二在于提供上述復(fù)合酶制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種消除殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制劑，包含有機(jī)磷水解酶、氨 基甲酸酯水解酶、擬除蟲菊酯水解酶，所述的有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、擬除蟲 菊酯水解酶的質(zhì)量比例為l:27 40: 120 240。所述的復(fù)合酶制劑為水溶液或緩沖溶液， 反應(yīng)體系的pH值為7.5 8.5。
優(yōu)選地，有機(jī)磷水解酶，氨基甲酸酯水解酶和擬除蟲菊酯水解酶的比例為1:40:240。
所述的有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶和擬除蟲菊酯水解酶是由來源于微生物的基 因表達(dá)的，有機(jī)磷水解酶選自opd基因、opdA基因、mpd基因、ophC2基因表達(dá)產(chǎn)物的 一種或組合；氨基甲酸酯水解酶選自cehA基因、caha基因產(chǎn)物中的一種或組合；擬除蟲 菊酯水解酶為estP基因表達(dá)產(chǎn)物。
較優(yōu)地，有機(jī)磷水解酶由opd基因及/或ophC2基因表達(dá)，氨基甲酸酯水解酶由cehA 基因及/或caha基因表達(dá)，擬除蟲菊酯水解酶由estP基因表達(dá)。
最優(yōu)地，有機(jī)磷水解酶由opd基因(genbank登錄號(hào)M20392)表達(dá)，氨基甲酸酯 水解酶由cehA基因(genbank登錄號(hào)Ab069723)表達(dá)，擬除蟲菊酯水解酶由estP基因 (genbank登錄號(hào)AY995176)表達(dá)。所述的復(fù)合酶制劑，其反應(yīng)體系還含有終濃度為萬分之零至二的烷基酚聚氧乙烯醚 (op-10)及/或終濃度為萬分之零至萬分之一點(diǎn)五的椰子油烷基二乙醇酰胺(6502)。 本發(fā)明的復(fù)合酶制劑，通常含有有效量的農(nóng)藥降解酶以及可接受的載體或賦形劑。這
類載體包括但不限于水、緩沖液、甘油、蔗糖、淀粉……及其組合。本發(fā)明的復(fù)合制劑 可被制成液態(tài)或固態(tài)。液態(tài)制劑可用水或磷酸緩沖溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備，例如，可 以制成濃縮溶液，使用時(shí)加水稀釋到使用濃度。固態(tài)制劑可以將水解酶、淀粉等混合后通 過常規(guī)方法制備成片劑、顆粒劑，也可以將水解酶溶解后凍干，制備成凍干粉劑等。本發(fā) 明的復(fù)合酶制劑的添加劑，包括但不限于去污劑、二價(jià)金屬離子等，可以預(yù)先與降解酶混 合，也可獨(dú)立包裝，在使用時(shí)混合。本發(fā)明并不限于某一種具體的制劑類型。
本發(fā)明的第二方面，提供了上述復(fù)合酶制劑的應(yīng)用，用于降解蔬菜和瓜果上殘留農(nóng)藥， 所述的農(nóng)藥包括但不限于，有機(jī)磷類農(nóng)藥及/或氨基甲酸酯類農(nóng)藥及/或擬除蟲菊酯類農(nóng) 藥。
本發(fā)明根據(jù)國內(nèi)農(nóng)藥使用狀況，有針對(duì)性地選擇降解譜廣，降解活性強(qiáng)的三種來源于 微生物的農(nóng)藥降解酶，優(yōu)選了三種酶的配比、水解酶和添加劑的配比，制備成復(fù)合酶制劑。 其有益效果體現(xiàn)在
(1) 該復(fù)合酶制劑降解譜廣，覆蓋性強(qiáng)，能同時(shí)降解目前國能使用最廣泛的三種類 型的農(nóng)藥，可以給家庭、餐館等用戶提供一種方便的清除農(nóng)藥殘留的方案；
(2) 三種酶可產(chǎn)生協(xié)同作用，通過有機(jī)磷水解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解，克服了有機(jī) 磷農(nóng)藥對(duì)氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯水解酶的抑制；
(3) 通過對(duì)三種酶的比例優(yōu)化、添加劑的優(yōu)選、反應(yīng)條件的優(yōu)選，使得本發(fā)明的復(fù) 合酶制劑酶活高，清除農(nóng)藥殘留效果優(yōu)異；
(4) 本發(fā)明的復(fù)合酶制劑，所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制備，產(chǎn)量高， 成本低，有利于大規(guī)模推廣。
(5) 本發(fā)明的復(fù)合酶制劑，采用酶發(fā)降解農(nóng)藥殘留，不僅清除效果好，而且簡單、 安全、所需反應(yīng)條件溫和且極易隨蔬菜水果清洗而去除，不沾染蔬菜瓜果也不影響其的口 味和營養(yǎng)。


圖1是有機(jī)磷水解酶的活性與pH的關(guān)系。
圖2是擬除蟲菊酯水解酶的活性與pH的關(guān)系。
圖3是氨基甲酸酯水解酶的活性與pH關(guān)系。
圖4是添加去污劑對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶的影響。
圖5是添加去污劑對(duì)氨基甲酸酯水解酶活性的影響。
圖6是添加去污劑對(duì)擬除蟲菊酯水解酶活性的影響。
具體實(shí)施例方式
農(nóng)藥降解酶
酶法降解農(nóng)藥殘留具有反應(yīng)條件溫和，降解效率高的特點(diǎn)。可選擇的農(nóng)藥降解酶包括: 微生物來源、昆蟲來源、動(dòng)物來源的農(nóng)藥降解酶。
可通過模擬昆蟲解毒機(jī)制開發(fā)降解農(nóng)藥的酶產(chǎn)品，即重構(gòu)昆蟲的解毒體系。昆蟲參與
解毒的酶類主要有混合功能氧化酶(MFO)、酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等，其中 MFO的作用需要NADPH，而GST發(fā)揮作用則需谷胱甘肽。在氨基甲酸酯類農(nóng)藥抗性的 昆蟲如按蚊、小菜蛾和蚜蟲中，羧酸酯酶是造成抗藥性的原因。但昆蟲羧酸酯酶水解農(nóng)藥 的能力十分有限(馬拉硫磷例外)，抗性昆蟲不是通過表達(dá)水解活性大大提高的羧酸酯酶， 而是通過表達(dá)大量的羧酸酯酶與殺蟲劑結(jié)合，使殺蟲劑不能到達(dá)靶標(biāo)，從而保護(hù)體內(nèi)靶標(biāo) -乙酰膽堿酯酶免受抑制。此外，羧酸酯酶能也在一定程度上降解擬除蟲菊酯，但昆蟲對(duì) 擬除蟲菊酯類的抗性機(jī)制主要是因?yàn)樯窠?jīng)膜上Na+通道的敏感性降低。因而重構(gòu)昆蟲的解 毒體系來清除殘留的農(nóng)藥并不經(jīng)濟(jì)。
從動(dòng)物體內(nèi)獲得的磷酸三酯酶也能分解有機(jī)磷農(nóng)藥，獲得的酯酶也有水解氨基甲酸酯 和擬除蟲菊酯的能力，但相比之下，它們對(duì)農(nóng)藥的分解能力比較低。
相比之下，微生物來源的水解酶具活性高、易篩選等優(yōu)點(diǎn)，成為尋找農(nóng)藥降解酶的熱 點(diǎn)。即從自然界中篩選能降解特定農(nóng)藥的菌株，并從中分離相應(yīng)的水解酶基因。研究較多 且卓有成效的是有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶opd是最早發(fā)現(xiàn)且研究最為透徹的有機(jī)磷水解酶基 因，后來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多能水解有機(jī)磷的基因，如opaA、 opdA等。國內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷 水解酶基因的報(bào)道，如范云六等發(fā)現(xiàn)ophC2，李順鵬等發(fā)現(xiàn)mpd基因。還有氨基甲酸酯 類農(nóng)藥水解酶基因，如pcd、 cehA、 mcd、 cahA等和一些擬除蟲菊酯水解酶，如estP。復(fù)合酶制劑
當(dāng)前許多有關(guān)解決農(nóng)藥殘留問題的專利主要集中在篩選農(nóng)藥水解酶基因，尤其是有機(jī) 磷農(nóng)藥水解酶基因，并用得到的基因清除蔬菜、水果中殘留的農(nóng)藥。僅用有機(jī)磷水解酶對(duì) 殘留的氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類幾乎沒有清除效果。也有用有機(jī)磷水解酶和昆蟲的酯酶 復(fù)配使用的，但如前所述，昆蟲的酯酶解毒的機(jī)理主要是結(jié)合，水解是次要的。
由于蔬菜水果品種多樣，生產(chǎn)過程中使用的農(nóng)藥種類各不相同，因此日常生活中遇到 的農(nóng)藥殘留往往不是一種，而是不同種類的多種農(nóng)藥。因而采用單一降解一種或一類農(nóng)藥 的方法并不能很好解決農(nóng)藥殘留問題，必須采用具有降解廣譜性的復(fù)合制劑。
據(jù)調(diào)查1998-2006年間，在我國蔬菜、水果中檢出率最高的3種有機(jī)磷農(nóng)藥為甲胺 磷，氧樂果和對(duì)硫磷；兩種氨基甲酸酯類農(nóng)藥為呋喃丹和西維因；三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥 為氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯，因此，應(yīng)將這些農(nóng)藥作為優(yōu)先分解的對(duì)象。
本發(fā)明的復(fù)合酶制劑選擇包括機(jī)磷水解酶，氨基甲酸酯水解酶，擬除蟲菊酯水解酶。 較優(yōu)地，三種酶來源微生物的有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶和擬除蟲菊酯水解酶。
可選擇的酶種類很多，比如有機(jī)磷水解酶就有Opd， Opda， OphC2等選擇。不同的 酶具有不同的底物譜和活性，沒有一種酶能很好水解所有的農(nóng)藥。因此，應(yīng)優(yōu)先選擇對(duì)最 常見的殘留農(nóng)藥種類有降解優(yōu)勢(shì)的酶或酶組合。同時(shí)，由于不同的酶需要不同的反應(yīng)條件， 協(xié)調(diào)這些條件也絕非易事。需要在酶的廣譜性和活性之間找個(gè)平衡點(diǎn)，用一種或少數(shù)幾種 酶實(shí)現(xiàn)對(duì)某一類或幾類殘留農(nóng)藥的分解。
本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)用現(xiàn)有的opd(genbank登錄號(hào)M20392)、 ceha (genbank登錄號(hào)Ab069723)和estp (genbank登錄號(hào)AY995176)三種酶組合能 很好降解所列的需優(yōu)先降解的農(nóng)藥。這樣組合的原因不是簡單地將能分解三類農(nóng)藥的酶混 合，其最大的優(yōu)勢(shì)之一是能消除有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯水解酶的抑制。作 為優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明選擇來源于微生物的opd、 ceha和estp基因組合來實(shí)現(xiàn)對(duì)所列需優(yōu) 先降解農(nóng)藥的清除。
由于各種酶比活不同，各種農(nóng)藥的使用劑量也不同，因而不能簡單地將幾種酶混合。 按農(nóng)藥的實(shí)際殘留量來確定酶的比例在理論上是最佳的，但由于各種農(nóng)藥的穩(wěn)定性不同， 蔬菜水果的上市時(shí)間不同，農(nóng)藥的實(shí)際殘留比例千差萬別，很難得出一個(gè)具有一般性的 數(shù)據(jù)。農(nóng)藥的施用劑量相對(duì)固定，因而，可以其為參考來計(jì)算復(fù)合酶制劑中各種酶的比 例。據(jù)調(diào)查，農(nóng)藥的施用劑量均在同一數(shù)量級(jí)，至少我們所考慮的這幾種農(nóng)藥如此，因而決定各種酶比例的主要因素是酶的比活。本發(fā)明中所采用的有機(jī)磷水解酶(opd表達(dá))、 氨基甲酸酯水解酶(ceh表達(dá))和擬除蟲菊酯水解酶(estP表達(dá))以本發(fā)明所列三類農(nóng)藥 為底物時(shí)，其平均比活約分別為1000—1200IU/mg， 30—45IU/mg禾H 5— 10IU/mg。因 而，在本發(fā)明中三種水解酶的比例為l:27—40:120—240。
此外，農(nóng)藥多為水不溶性物質(zhì)，常吸附在蔬菜、水果表面，不易與水解酶相互作用。 添加去污劑有助于農(nóng)藥從蔬菜、水果表面脫離，還有助于農(nóng)藥分散在水溶液中，促進(jìn)農(nóng)藥 與水解酶相互作用。因而，復(fù)合酶反應(yīng)體系中還含有能促進(jìn)農(nóng)藥消除的去污劑。較優(yōu)地， 選擇允許在食品洗滌劑中使用的去污劑。更優(yōu)地，添加的去污劑為垸基酚聚氧乙烯醚 (叩-lO)和椰子油垸基二乙醇酰胺(6502)。 農(nóng)藥降解酶的制備
微生物來源的農(nóng)藥降解酶，可以通過培養(yǎng)產(chǎn)生該種酶的微生物得到，也可以通過基因 工程方法制備。例如，可通過將編碼農(nóng)藥降解酶的基因克隆在原核表達(dá)載體如大腸桿菌表 達(dá)載體或真核表達(dá)載體如酵母表達(dá)載體中進(jìn)行重組蛋白的生產(chǎn)，這是本領(lǐng)域工作人員熟知 的。
體外消除殘留農(nóng)藥的酶，其純度的要求遠(yuǎn)較蛋白質(zhì)藥品低。為簡化純化工藝，降低成 本，可在蛋白N端或C端加上便于純化的標(biāo)簽，如FLAG， 6XHis等，其中以6XHis更 為成熟、有效。作為優(yōu)選，本發(fā)明選擇在酶的N端引入6XHis標(biāo)簽。
大腸桿菌具有生長速度快、操作簡單、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，因而，較優(yōu)地，本發(fā)明通過 將基因克隆在原核表達(dá)載體中，在大腸桿菌中生產(chǎn)水解酶。
本發(fā)明opd基因、cehA基因、cehA基因由上海生物工程有限公司合成，表達(dá)質(zhì)粒 pET30a(+)購于Novagen公司，大腸桿菌BL21(DE3)購于Stratagene公司，限制性內(nèi)切酶 購于上海生物工程有限公司。采用基因工程技術(shù)方法，得到上述基因的蛋白酶表達(dá)產(chǎn)物。 對(duì)硫磷、西維因和氯氰菊酯購于上海市農(nóng)藥研究所，去污劑烷基酚聚氧乙烯醚(op-10)、 椰子油烷基二乙醇酰胺(6502)為國產(chǎn)，其他試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的功效和方法，現(xiàn)用具體的實(shí)施方式來加以說明。下列實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，《分子克隆實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件， 或《國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T761 - 2004》限定的方法和條件，或按照制造廠商所建議的條件。應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例l、 opd基因產(chǎn)物的制備 (1)表達(dá)和純化
A、 按照genbank登錄號(hào)M20392公布的基因序列，在5'端引入Nde I位點(diǎn)，在終止 密碼子后加上Eco RI位點(diǎn)設(shè)計(jì)opd表達(dá)基因；
B、 將基因克隆在pET30a(+)質(zhì)粒的Nde I和Eco RI位點(diǎn)之間，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；
C、 用CaCl2法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，挑選卡那抗性的克隆， 獲得工程菌；
D、 接種步驟(2)的工程菌于含50pg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 。C搖床培養(yǎng) 過夜。按l: IOO轉(zhuǎn)接于含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600-0.8，加入 IPTG至使用濃度為0.5 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，離心收集菌體備用，棄上清；
E、 用PB (50mmol/L， pH7.5)重懸菌體，超聲波破碎細(xì)胞，18000Xg離心15分收 集上清，將上清上用PB (50mmol/L， pH7.5)預(yù)平衡的Ni - Chelating Sepharose FastFlow 柱，然后以同樣的PB再平衡Ni - Chelating Sepharose FastFlow柱，用洗脫緩沖液(50 mmol/L PB， 100mmol/L咪唑，pH7.5)洗脫，收集洗脫峰，將收集的洗脫峰用Sephadex G-25 對(duì)50腿ol/LPB， pH8.0脫鹽。
本次試驗(yàn)共收獲目標(biāo)蛋白溶液75ml。
(2) 純度鑒定
凝膠掃描法確定表達(dá)產(chǎn)物的蛋白純度，Bradford法確定其濃度，并用所得濃度乘以 相應(yīng)的純度折算純品的濃度。
經(jīng)測(cè)定，本次制備的opd基因產(chǎn)物純度為82.0%，濃度為3.2mg/ml。
(3) 活性測(cè)定
按如下方法測(cè)定活性基本反應(yīng)體系為lml含2.5mmol/L底物對(duì)硫磷的Tris-HCl緩 沖液(50mmol/L， pH9.0)，加入約1嗎酶，室溫下反應(yīng)10分鐘。加入1 ml 10%的三氯 乙酸終止反應(yīng)。設(shè)立對(duì)照組，除不加酶外，別的與試驗(yàn)組完全一致。
反應(yīng)結(jié)束后，按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T761 -2004用氣相色譜法分析對(duì)照組和試 驗(yàn)組的有機(jī)磷峰。按下式計(jì)算酶活(1-A1/A0) /酶量X100。/。。其中A1是試驗(yàn)組有機(jī)磷 峰面積，AO為對(duì)照組有機(jī)磷峰面積。經(jīng)測(cè)定，本次制備的opd基因產(chǎn)物的比活為1000_1200IU/mg。 實(shí)施例2 、 cehA基因產(chǎn)物的制備
按照genbank澄錄號(hào)Ab069723公布的基因序列，在5'端引入Nde I位點(diǎn)，在終止 密碼子后加上Eco RI位點(diǎn)設(shè)計(jì)cehA表達(dá)基因；
按實(shí)施例1相同的方法制備、表征cehA基因表達(dá)產(chǎn)物，共獲得共收獲目標(biāo)蛋白溶 液67ml.;純度為85.4%，濃度為2.7mg/ml。
按如下方法測(cè)定活性基本反應(yīng)體系為lml含2 mmol/L相應(yīng)底物西維因的PB緩沖 液(50mmol/L， pH7.5)，加入約5嗎酶，室溫反應(yīng)10分鐘后，用稀硫酸終止反應(yīng)。也同 樣設(shè)立對(duì)照組。反應(yīng)結(jié)束后，按NY/T 761 - 2004用氣相色譜法分析對(duì)照組和試驗(yàn)組的氨 基甲酸酯峰面積，同實(shí)施例1方法計(jì)算活性。
本次制備的cehA基因產(chǎn)物的比活為30_45IU/mg。
實(shí)施例3、 estP基因產(chǎn)物的制備
按照genbank登錄號(hào)AY995176公布的基因序列，在5'端引入Nde I位點(diǎn)，在終止 密碼子后加上Eco RI位點(diǎn)設(shè)計(jì)cehA表達(dá)基因；
按實(shí)施例1相同的方法制備、表征cehA基因表達(dá)產(chǎn)物，共收獲目標(biāo)蛋白溶液90ml.; 純度為74.2%，濃度為1.9mg/ml。
按如下方法測(cè)定活性基本反應(yīng)體系為lml含2mmol/L相應(yīng)底物氯氰菊酯的Tris-HCl 緩沖液(20mmol/L， pH8.0)，加入約10嗎酶，室溫反應(yīng)10分鐘后用三氯乙酸終止反應(yīng)， 也設(shè)立對(duì)照組。同上，按NY/T 761 -2004用氣相色譜法分析對(duì)照組和試驗(yàn)組的擬除蟲菊 酯農(nóng)藥的峰面積，同實(shí)施例1方法計(jì)算活性。
本次制備的estP基因產(chǎn)物的比活為5 —10IU/mg。
實(shí)施例4、反應(yīng)體系pH對(duì)三種酶活性的影響
按實(shí)施例1-3測(cè)活方法準(zhǔn)備反應(yīng)體系，不過緩沖液換為50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH = 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5， 8.0, 8.5)，底物分別選擇對(duì)硫磷、西維因和氯氰菊酯，酶分別 為opd， cehA和estP。測(cè)定酶活，分別以每個(gè)酶得到的最高活性為100繪制活性一pH曲 線，見圖l-3。結(jié)果顯示，三種酶在pH在8.0 — 8.5之間是都具有相對(duì)較高的酶活性。 實(shí)施例5、去污劑對(duì)水解酶活性的影響
同實(shí)施例l-3準(zhǔn)備反應(yīng)體系，緩沖液為50mMPB (pH8.0)，除含相應(yīng)底物(對(duì)硫磷， 西維因和氯氰菊酯)，作為對(duì)照組；在對(duì)照組基礎(chǔ)上每管加入去污劑——使用濃度為萬分 之一點(diǎn)五的烷基酚聚氧乙烯醚(op-lO)，作為實(shí)驗(yàn)組。
每隔五分鐘取出一管，終止反應(yīng)。
同實(shí)施例l-3檢測(cè)殘留的農(nóng)藥，以殘留農(nóng)藥的峰面積對(duì)時(shí)間作圖，以不加酶管為100， 結(jié)果見圖4-6。
實(shí)施例6、去污劑對(duì)水解酶活性的影響
同實(shí)施例5，試驗(yàn)組去污劑換成使用濃度為萬分之一的椰子油烷基二乙醇酰胺 (6502)，得到與實(shí)施例5相似的結(jié)果。
實(shí)施例7、用復(fù)合酶制劑消除蔬菜、瓜果上的殘留農(nóng)藥
在體積為1000 ml的50mM PB (pH 8.0)中分別加入實(shí)施例1-3制備的酶溶液lpl、 5(Hil、 5ml，使得實(shí)施例l-3制備的三種水解酶的質(zhì)量比1: 40: 240;在上述溶液中加入 使用濃度為使用濃度為萬分之一點(diǎn)五的烷基酚聚氧乙烯醚(op-10)，制成復(fù)合酶溶液。
有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯農(nóng)藥和擬除蟲菊酯農(nóng)藥按其使用劑量分別混配，每組農(nóng)藥分 別噴生菜6棵，油麥菜6棵，花菜6棵，噴蘋果6個(gè)。頭天下午噴施，次日上午取樣。
將上述各類蔬菜平分為兩組，一組用前述實(shí)施例所確定的復(fù)合酶制劑溶液室溫浸泡處 理15分鐘，另一組則不處理。按照NY/T 761 - 2004進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析。
結(jié)果表明，未經(jīng)處理的蔬菜、瓜果檢測(cè)出強(qiáng)烈的農(nóng)藥殘留，而經(jīng)處理的蔬菜、瓜果未 檢測(cè)出農(nóng)藥殘留或殘留很低。
本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原 理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和 改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等 效物界定。
權(quán)利要求
1、一種消除殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制劑，其特征在于，所述的復(fù)合酶制劑包含有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、擬除蟲菊酯水解酶，其質(zhì)量比例依次為1∶27～40∶120～240。
2、 如權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于，所述的復(fù)合酶制劑為水溶液或緩沖溶 液，反應(yīng)體系的pH值為7.5 8.5。
3、 如權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于，所述的有機(jī)磷水解酶，氨基甲酸酯水 解酶和擬除蟲菊酯水解酶的比例為1: 40: 240。
4、 如權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于，所述的有機(jī)磷水解酶、氨基甲酸酯水 解酶和擬除蟲菊酯水解酶由來源于微生物的基因編碼表達(dá)，有機(jī)磷水解酶選自opd基因、 opdA基因、mpd基因、ophC2基因表達(dá)產(chǎn)物的一種或組合；氨基甲酸酯水解酶選自cehA 基因、caha基因產(chǎn)物中的一種或組合；擬除蟲菊酯水解酶為estP基因表達(dá)產(chǎn)物。
5、 如權(quán)利要求4所述的酶制劑，其特征在于，有機(jī)磷水解酶由opd基因及/或ophC2 基因表達(dá)，氨基甲酸酯水解酶由cehA基因及/或caha基因表達(dá)，擬除蟲菊酯水解酶由estP 基因表達(dá)。
6、 如權(quán)利要求4所述的酶制劑，其特征在于，有機(jī)磷水解酶由opd基因表達(dá)，genbank 登錄號(hào)M20392;氨基甲酸酯水解酶由cehA基因表達(dá)，genbank登錄號(hào)Ab069723;擬 除蟲菊酯水解酶由estP基因，genbank登錄號(hào)AY995176。
7、 如權(quán)利要求1所述的酶制劑構(gòu)成的組合物，其特征在于，所述的酶制劑組合物中 還包含去污劑，包括但不限于為，含終濃度為萬分之零至二的烷基酚聚氧乙烯醚，及/或 終濃度為萬分之零至萬分之一點(diǎn)五的椰子油烷基二乙醇酰胺(6502)。
8、 如權(quán)利要求1-7中的任一項(xiàng)所述的復(fù)合酶制劑的應(yīng)用，用于降解蔬菜、茶葉和瓜 果上殘留農(nóng)藥，所述的農(nóng)藥包括但不限于，有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和擬除蟲菊 酯類農(nóng)藥。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種降解譜廣，可以清除涵蓋日常常見的蔬菜和瓜果上殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制劑，將殘留在蔬菜和水果上農(nóng)藥分解為無毒或低毒的產(chǎn)物，降低其對(duì)人和非靶標(biāo)生物的毒害及對(duì)環(huán)境的污染。本發(fā)明還提供了上述復(fù)合酶制劑的應(yīng)用。本發(fā)明的一種消除殘留農(nóng)藥的復(fù)合酶制劑，包括有機(jī)磷水解酶，氨基甲酸酯水解酶，擬除蟲菊酯水解酶。優(yōu)選地，上述的三種酶來源于微生物的基因表達(dá)。與傳統(tǒng)方法比較，此法不僅簡單、安全、所需反應(yīng)條件溫和，不影響蔬菜瓜果的口味和營養(yǎng)，復(fù)合酶制劑本身極易清洗去除，同時(shí)真正意義清除了殘留的農(nóng)藥。
文檔編號(hào)A62D101/04GK101293131SQ20071009380
公開日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者楊柏成, 勇 蘇 申請(qǐng)人:上海普天欣生物技術(shù)有限公司