專利名稱：防止、去除、減少或破壞生物膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜生成的方法。
背景技術(shù)：
生物膜(biofilms)是產(chǎn)生并持續(xù)存在于含水環(huán)境中的生物或非生物性物體表面上的生物膜，它是微生物細(xì)胞吸附到所述固體表面上造成的。這種吸附使這些微生物具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兡軌蚍敝?，能夠獲得更多樣的營(yíng)養(yǎng)物和氧條件，不被沖走，而且對(duì)抗微生物劑的敏感性降低。生物膜的形成還伴隨著外泌性(exo-)聚合物質(zhì)(多糖、聚糖醛酸、藻酸鹽、糖蛋白和蛋白質(zhì))的產(chǎn)生，其與細(xì)胞一道形成由充水的空間分隔的厚層的分化結(jié)構(gòu)。居留的微生物可以是單個(gè)物種的微生物細(xì)胞，或者是微生物細(xì)胞的混合群落，這些微生物細(xì)胞可包括好氧和厭氧的細(xì)胞，藻類、原生動(dòng)物，和真菌。因此，生物膜是活的微生物的復(fù)雜的集合，這些微生物被包埋在由居留的微生物分泌的一種或多種基質(zhì)聚合物所構(gòu)成的有機(jī)結(jié)構(gòu)中。
生物膜可發(fā)展為厚達(dá)數(shù)毫米或厘米，并覆蓋廣大表面區(qū)域的宏觀結(jié)構(gòu)。這些形成物可能是管道系統(tǒng)中限制或完全阻斷流動(dòng)，熱交換器中減少熱傳遞，或在城市供水系統(tǒng)、食品加工、醫(yī)療設(shè)備(例如導(dǎo)管、整形外科設(shè)備、植入物、內(nèi)窺鏡)中造成病原性問(wèn)題的因素。另外，生物膜通過(guò)其包埋的微生物介導(dǎo)的腐蝕作用經(jīng)常縮短材料的壽命。在工業(yè)水處理系統(tǒng)、紙漿和紙生產(chǎn)過(guò)程、冷卻水系統(tǒng)、油回收用的注入井、冷卻塔、多孔介質(zhì)(砂和土壤)、海洋環(huán)境、空調(diào)系統(tǒng)，以及任何封閉的水再循環(huán)系統(tǒng)中，生物結(jié)垢(biological fouling)是嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)性問(wèn)題。在醫(yī)療科學(xué)和工業(yè)中，生物膜也是嚴(yán)重的問(wèn)題，其造成牙垢(dental plaques)、感染(Costerton，1999等人，Science 2841318-1322)，內(nèi)窺鏡和隱形眼鏡污染，假體裝置的定殖(colonisation)，及醫(yī)用植入物上生物膜的形成。
常規(guī)上，去除或防止生物膜需要使用分散劑、表面活性劑、去污劑、酶制劑、抗微生物劑(anti-microbials)、殺生物劑(biocides)、煮沸(boil-out)方法，和/或腐蝕性化學(xué)品，例如堿。使用這些手段的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，在紙漿和造紙工業(yè)中，去除造紙機(jī)中的生物膜積聚常規(guī)上需要沉積物控制程序(deposit control program)，包括合理的保養(yǎng)(housekeeping)，以保持表面上沒(méi)有濺上的原料，對(duì)新鮮的水和添加物作抗微生物處理，使用殺生物劑減少機(jī)器上的微生物生長(zhǎng)，和按方案進(jìn)行煮沸以去除確實(shí)產(chǎn)生的沉積物。
在生物膜中生長(zhǎng)的細(xì)菌對(duì)抗生素和消毒劑的抗性比浮游的細(xì)胞更強(qiáng)，而且該抗性隨著生物膜的年齡而增加。生物膜還對(duì)干燥、極端溫度或光顯示更高的物理抗性。如已提到的，生物膜的形成造成工業(yè)上、環(huán)境上和醫(yī)學(xué)上的問(wèn)題，而且在很多產(chǎn)業(yè)中，用化學(xué)品清除和消毒細(xì)菌生物膜是人們十分關(guān)心的問(wèn)題。另外，消毒和清潔組合物趨向變得更溫和，以減輕其環(huán)境影響，這樣可能使得對(duì)覆蓋生物膜的表面的清潔更加不足。
本發(fā)明的目的是提供防止或去除表面上存在的生物膜的改進(jìn)的方法。


圖1顯示三種不同的α-淀粉酶對(duì)粗小麥淀粉的總水解的百分率(％)的比較。
圖2是比較1)α-淀粉酶A；2)單獨(dú)的去污劑；3)α-淀粉酶C的生物膜去除的色譜圖。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜的方法，包括使所述表面與來(lái)自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。
術(shù)語(yǔ)“表面”在本文中定義為任何可能被生物膜覆蓋或傾向于形成生物膜的表面。表面的例子包括任何硬表面，例如金屬、塑料、橡膠、板、玻璃、木、紙、混凝土、巖石、大理石、石膏和陶瓷材料，這些材料可選地被包被，例如用油漆或瓷漆包被；任何軟表面，例如任何種類的纖維(例如紗線、織物、植物纖維、礦棉(rock wool)和毛)；或任何多孔表面；皮膚(人或動(dòng)物的)；角質(zhì)材料(例如甲(nails))；和內(nèi)部器官(例如肺)。所述硬表面可以作為冷卻塔、水處理設(shè)備、水槽、乳品間(dairy)、食品加工設(shè)備、化學(xué)或制藥過(guò)程設(shè)備，或醫(yī)療裝置(例如導(dǎo)管、整形外科裝置、植入物)的部分存在。多孔表面可以存在于濾器，例如膜濾器中。
術(shù)語(yǔ)“有效量”在本文中定義為足以降解由微生物所產(chǎn)生且包含α-1，4-葡糖苷鍵的生物膜的一種或多種α-淀粉酶的量。一種或多種α-淀粉酶的有效量依賴于包括下列的因素所述α-淀粉酶，目標(biāo)是否是防止、去除或減少表面上存在的生物膜，和用來(lái)例如降解微生物產(chǎn)生的生物膜的所希望的時(shí)間。一般而言，較高量/濃度的酶需要較短的處理時(shí)間，而較低量/濃度的酶需要較長(zhǎng)的處理時(shí)間。另外，例如，在易于形成生物膜的表面上防止生物膜通常比從相應(yīng)的污染的表面上實(shí)際去除生物膜需要更低量/濃度的酶。但是，典型的有效使用水平是0.005到500mg α-淀粉酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01-100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液。術(shù)語(yǔ)“生物膜控制溶液”是指根據(jù)本發(fā)明用于防止、去除、減少或破壞表面上存在的生物膜的溶液。以下面實(shí)施例4給出的條件下的平均平板計(jì)數(shù)計(jì)，本發(fā)明的方法可使生物膜減少到10-108分之一(10-108-fold)，優(yōu)選103-106分之一。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜的改進(jìn)方法，包括使所述表面與如下定義的有效量的α-淀粉酶接觸。本發(fā)明的方法可以用來(lái)防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜形成。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這樣的方法可以在生物膜形成的不同階段使用。
通過(guò)對(duì)表面使用有效量的α-淀粉酶，生物膜的防止和/或去除得到了改善，特別是當(dāng)生物膜中的某些微生物產(chǎn)生α-1，4連接的葡萄糖多糖，例如直鏈淀粉、支鏈淀粉、這兩種多糖的混合物(例如淀粉)、和糖原時(shí)。
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種防止或去除表面上的生物膜的方法，包括使該表面與源自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌α-淀粉酶來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)。
α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明所使用的α-淀粉酶來(lái)自細(xì)菌，優(yōu)選來(lái)自芽孢桿菌屬菌種的菌株，特別是選自WO 00/60060中作為SEQ ID NO2公開(kāi)的AA560α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO2)，美國(guó)專利申請(qǐng)10/877,847中公開(kāi)的黃熱芽孢桿菌，WO 95/26397中公開(kāi)的芽孢桿菌屬菌種的α-淀粉酶，來(lái)自芽孢桿菌屬菌種NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513，DSM 9375，DSMZ no.12649，KSM AP1378(WO 97/00324)，KSM K36或KSM K38(EP1022334)的α-淀粉酶，和Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31所公開(kāi)的#707α-淀粉酶。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是本文SEQ IDNO2的中所示的AA560α-淀粉酶和/或本文SEQ ID NO4中所示的AMY1048α-淀粉酶，或與本文SEQ ID NO2或4所示的任何序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的α-淀粉酶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的α-淀粉酶是作為親本的本文中SEQID NO2所公開(kāi)的α-淀粉酶的變體，其在D183和/或G184位置具有缺失，優(yōu)選其中所述α-淀粉酶變體還含有在N195F位置或相應(yīng)的位置上具有取代，特別是其中親本α-淀粉酶在本文SEQ ID NO2中具有一種或多種下列的缺失/取代Δ(R81-G182)；Δ(D183-G184)；Δ(D183-G184)+N195F；R181Q+N445Q+K446N；Δ(D183-G184)+R181Q，Δ(D183-G184)和一種或多種下列的取代R118K，N195F，R320K，R458K，特別是其中所述親本α-淀粉酶具有下列突變?chǔ)?D183+G184)+R118K+N195F+R320K+R458K(即，在本文的SEQ IDNO2中)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是SEQ ID NO2中所示的AA560α-淀粉酶，或其變體，該變體還含有一種或多種下列的取代M9L，M202L，V214T，M323T，M382Y或M9L，M202L，V214T，M323T和E345R。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶在40℃、3mg酶蛋白每g淀粉，pH8.0下5小時(shí)后的水解粗淀粉百分率(％)高于15，優(yōu)選25，特別是35(見(jiàn)實(shí)施例2和圖1)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶在其N末端氨基酸區(qū)域中包含Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp。這樣的α-淀粉酶的例子包括實(shí)施例2中使用的α-淀粉酶A和α-淀粉酶B。
在一個(gè)實(shí)施方案中所述α-淀粉酶來(lái)自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的菌株，其序列如本文SEQ ID NO6所示；或者是與本文SEQID NO6所示的任何序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的α-淀粉酶，優(yōu)選在對(duì)應(yīng)于M197位的位置上具有取代，優(yōu)選M197L，T，I，N，D，Q，E，P，W，特別是M197L或T。
可商購(gòu)的α-淀粉酶產(chǎn)品或包含α-淀粉酶的產(chǎn)品包括以下列商品名出售的產(chǎn)品STAINZYMETM，DURAMYLTM(Novozymes A/S，丹麥)，BIOAMYLASE D(G)，BIOAMYLASETML(Biocon India Ltd.)，KEMZYMTMAT 9000(Biozym Ges.m.b.H，奧地利)，PURASTARTMST，PURASTARTMHPAmL，PURAFECTTMOxAm，RAPIDASETMTEX(Genencor Int.Inc，美國(guó))，KAM(KAO，日本)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在生成任何生物膜之前對(duì)易于產(chǎn)生生物膜的表面使用本發(fā)明的方法作為預(yù)防性手段，從而沒(méi)有生物膜生成?；蛘撸诔霈F(xiàn)生物膜生成的最初征象時(shí)，可以使用所述方法來(lái)防止進(jìn)一步的生成，并去除已經(jīng)沉積在表面上的生物膜。另外，在表面上積聚了大量生物膜的情況下，可以使用所述方法來(lái)降低生物膜的水平，或部分地或全部地去除它。
生物膜可包含一種或兩種微生物的整體化的群落，或者主要包含某種特定的微生物(Palmer和White，1997，Trends in Microbiology 5435-440；Costerton等人，1987，Annual Reviews of Microbiology 41435-464；Mueller，1994，TAPPI Proceedings，1994 Biological Sciences Symposium 195-201)。在本發(fā)明的方法中，所述一種或多種微生物可以是任何參與生物膜形成的微生物，包括但不限于，好氧細(xì)菌或厭氧細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性)、真菌(酵母或絲狀真菌)、藻類、和/或原生動(dòng)物?？紤]到的細(xì)菌包括選自下列的細(xì)菌假單胞菌屬(Pseudomonas)的一些種，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；維涅蘭德固氮菌(Azotobacter vinelandii)；大腸桿菌(Escherichia coli)；白喉棒桿菌(Corynebacterium diphteriae)；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；鏈球菌屬(Streptococcus)的一些種；醋桿菌屬(Acetobacter)；明串珠菌屬(Leuconostoc)；貝塔桿菌屬(Betabacterium)；肺炎球菌屬(Pneumococci)；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)；氣單胞菌屬(Aeromonas)；伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderie)；黃桿菌屬(Flavobacterium)；沙門氏菌屬(Salmonella)；葡萄球菌屬(Staphylococcus)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是好氧細(xì)菌。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是氣單胞菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是伯克霍爾德氏菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是黃桿菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是微桿菌屬(Microbacterium)菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是假單胞菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是沙門氏菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是葡萄球菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是來(lái)自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(包括例如大腸桿菌)。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderie cepacia)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為蛾微桿菌(Microbacterium imperiale)或結(jié)核分枝桿菌。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為銅綠假單胞菌。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是厭氧細(xì)菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述厭氧細(xì)菌是脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)菌株。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述厭氧細(xì)菌是脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是真菌例如酵母或絲狀真菌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是假絲酵母(Candida)菌株。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是白色假絲酵母(Candida albicans)。
如上所述的，防止或去除生物膜的處理時(shí)間取決于α-淀粉酶的劑量、表面上的或所述區(qū)域傾向形成的生物膜的水平，但優(yōu)選地，所述處理時(shí)間應(yīng)該與用抗生素、殺生物劑、殺菌劑(bactericides)、殺真菌劑(fungicides)、漂白劑(bleaching agents)、表面活性劑(surfactants)、腐蝕劑(caustic)合伙生物聚合物降解劑進(jìn)行常規(guī)處理所正常使用的時(shí)間相適應(yīng)。因此，α-淀粉酶的劑量可以根據(jù)常規(guī)處理中所用的時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)。但是，當(dāng)α-淀粉酶處理是加工中的單獨(dú)的步驟時(shí)，α-淀粉酶的劑量取決于完成處理所希望的時(shí)間。
從α-淀粉酶活性方面來(lái)說(shuō)，防止或去除生物膜的合適的α-淀粉酶劑量表面上的或所述區(qū)域傾向形成的生物膜的量。技術(shù)人員可決定合適的α-淀粉酶單位劑量。該劑量可以表示為α-淀粉酶單位。α-淀粉酶單位可作為“KNU”測(cè)定，使用下面的“材料和方法”部分描述的測(cè)定方法。被生物膜污染的或易于產(chǎn)生生物膜的區(qū)域優(yōu)選以0.005到500mg α-淀粉酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01到100mg α-淀粉酶蛋白每升生物膜控制溶液的α-淀粉酶劑量處理1分鐘到2天，優(yōu)選10分鐘到1天，優(yōu)選1到15小時(shí)，更優(yōu)選少于10小時(shí)。
所述α-淀粉酶可以是本發(fā)明的方法中要使用的組合物的部分。所述組合物可以是任何適于所述用途的形式，例如，干粉、聚結(jié)粉末(agglomeratedpowder)，或顆粒(granulate)，特別是非粉化(non-dusting)顆粒，液體，特別是穩(wěn)定化的液體，或被保護(hù)的α-淀粉酶。顆粒和聚結(jié)粉末可以用常規(guī)方法制備，例如通過(guò)在流化床制粒機(jī)中將α-淀粉酶噴霧到載體上。所述載體可由具有合適粒度的顆粒物核心(particulate core)組成。載體可以是可溶的或不可溶的，例如，鹽(例如氯化鈉或硫酸鈉)，糖(例如蔗糖或乳糖)，糖醇(例如山梨糖醇)，或淀粉。α-淀粉酶可包含于緩釋制劑中。制備緩釋制劑的方法是本領(lǐng)域公知的。液體α-淀粉酶制備可以，例如，根據(jù)已建立的方法，通過(guò)加入營(yíng)養(yǎng)上可接受的穩(wěn)定劑諸如糖、糖醇或另一多元醇，和/或乳酸或另一有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定化。
該組合物還可添加一種或多種防止或去除生物膜生成的藥劑。這些藥劑可包括，但不限于，分散劑、表面活性劑、去污劑、其它的酶，抗微生物劑，和殺生物劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥劑是表面活性劑。所述表面活性劑可以是非離子型包括半極性和/或陰離子型和/或兩性離子型的表面活性劑。
所考慮的陰離子表面活性劑包括線性苯磺酸烷基酯、α-烯屬磺酸酯、硫酸烷基酯(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、二級(jí)鏈烷磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。
所考慮的非離子表面活性劑包括脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺(“葡萄糖胺”(“glucamides”))的N-?；鵑-烷基衍生物。
表面活性劑的可以以所述酶生物膜去除組合物的重量的0.1％到60％的水平存在。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表面活性劑是十二烷基硫酸鈉、季銨化合物、溴化烷基吡啶(alkyl pyridinium iodides)，Tween 80，Tween，85，Triton X-100，Brij 56，生物表面活性劑、鼠李糖脂、表面活性蛋白、visconsin或磺酸鹽或酯(sulfonates)。
生物膜的形成還伴隨產(chǎn)生外泌性聚合物質(zhì)(多糖、聚糖醛酸、藻酸鹽、糖蛋白和蛋白質(zhì))，其與細(xì)胞一道形成由充水的空間分隔的厚層的分化結(jié)構(gòu)(McEldowney和Fletcher，1986，Journal of General Microbiology 132513-523；Sutherland，Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell，AcademicPress，New York，1977，pp.27-96)。在本發(fā)明的方法中，所述α-淀粉酶組合物可以還包含一種或多種能夠降解所述外泌性聚合物質(zhì)例如多糖、聚糖醛酸、藻酸鹽、糖蛋白和蛋白質(zhì)的其它的酶。
其它的酶活性在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述一種或多種其它的酶可選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、氧化酶，包括糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
所述其它的酶可根據(jù)要去除的特定生物膜的性質(zhì)來(lái)選擇，或者可以選擇具有不同酶活性的數(shù)種酶的組合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶選自1，2-1，3-α-D-甘露聚糖甘露糖水解酶(1，2-1，3-alpha-D-mannan mannohydrolase)，1，3-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(1，3-beta-D-xylan xylanohydrolase)，1，3-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1，3-beta-D-glucan glucanohydrolase)，1，3(1，3；1，4)-α-D-葡聚糖3-葡聚糖水解酶(1，3(1，3；1，4)-alpha-D-glucan 3-glucanohydrolase)，1，3(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖3(4)-葡聚糖水解酶(1，3(1，3；1，4)-beta-D-glucan 3(4)-glucanohydrolase)，1，3-1，4-α-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(1，3-1，4-alpha-D-glucan4-glucanohydrolase)，1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1，4-alpha-D-glucanglucanehydrolase)，1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶(1，4-alpha-D-glucanglucohydrolase)，1，4-(1，31，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(1，4-(1，31，4)-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase)，1，4-β-D-葡聚糖葡萄糖水解酶(1，4-beta-D-glucan glucohydrolase)，1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(1，4-beta-D-xylan xylanohydrolase)，1，4-β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶(1，4-beta-D-mannan mannanohydrolase)，1，5-α-L-阿聚糖1，5-α-L-阿聚糖水解酶(1，5-alpha-L-arabinan 1，5-alpha-L-arabinanohydrolase)，1，4-α-D-葡聚糖麥芽糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan maltohydrolase)，1，6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶(1，6-alpha-D-glucan 6-glucanohydrolase)，2，6-β-D-果聚糖果聚糖水解酶(2，6-beta-D-fructan fructanohydrolase)，α-糊精6-葡聚糖水解酶(alpha-Dextrin 6-glucanohydrolase)，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(alpha-D-galactoside galactohydrolase)，α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(alpha-D-glucoside glucohydrolase)，α-D-甘露糖苷甘露糖水解酶(alpha-D-mannoside mannohydrolase)，酰基神經(jīng)氨酰水解酶(acylneuraminylhydrolase)，氣桿菌(Aerobacter)-莢膜多糖半乳糖水解酶(Aerobacter-capsular-polysaccharide galactohydrolase)，β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶(beta-D-fructofuranoside fructohydrolase)，β-D-巖藻糖苷巖藻糖水解酶(beta-D-fucoside fucohydrolase)，β-D-果聚糖果糖水解酶(beta-D-fructan fructohydrolase)，β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(beta-D-galactoside galactohydrolase)，β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)，β-D-葡糖醛酸苷葡糖醛酸苷水解酶(beta-D-glucuronoside glucuronosohydrolase)，β-D-甘露糖苷甘露糖水解酶(beta-D-mannoside mannohydrolase)，β-N-乙酰-D-氨基己糖苷N-乙酰己糖胺水解酶(beta-N-acetyl-D-hexosaminide N-acetylhexosamino hydrolase，)，硫酸纖維素磺基水解酶(cellulose-sulfate sulfohydrolase)，膠原酶(collagenase)，糊精6-α-D-葡聚糖水解酶(dextrin6-alpha-D-glucanohydrolase)，糖蛋白-磷脂酰肌醇磷脂酰水解酶(glycoprotein-phosphatidylinositol phosphatidohydrolase)，透明質(zhì)酸4-聚糖水解酶(hyaluronate 4-glycanohydrolase)，透明質(zhì)酸葡糖醛酸糖苷酶(hyaluronoglucuronidase)，果膠果膠酰水解酶(pectin pectylhydrolase)，肽聚糖N-乙酰胞壁酰水解酶(peptidoglycan N-acetylmuramoylhydrolase)，磷脂酰膽堿2-酰基水解酶(phosphatidylcholine 2-acylhydrolase)，磷脂酰膽堿1-?；饷?phosphatidylcholine 1-acylhydrolase)，聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶(poly(1，4-alpha-D-galacturonide)，聚(1，4-(N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷))-聚糖水解酶poly(1，4-(N-acetyl-beta-D-glucosaminide))-glycanohydrolase)，蔗糖α-葡糖苷酶(sucrose alpha-glucosidase)，三?；视王；饷?triacylglycerol acylhydrolase)，和三酰基甘油蛋白?；饷?triacylglycerol protein-acylhydrolase)。
蛋白水解酶(proteolytic enzyme)所述其它酶可以是任何在實(shí)際過(guò)程條件下具有蛋白水解活性的酶。因此，所述酶可以是植物來(lái)源的蛋白水解酶，例如木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶，或動(dòng)物來(lái)源的蛋白水解酶，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，或微生物來(lái)源，即細(xì)菌、酵母或絲狀真菌來(lái)源的蛋白水解酶。應(yīng)當(dāng)理解，多種蛋白水解酶中的任何混合物都可適用于本發(fā)明的過(guò)程。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述其它酶是蛋白水解酶，例如絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶。
絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞類通常被稱為枯草蛋白酶(subtilisins)。枯草蛋白酶是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶。已經(jīng)測(cè)定了多種枯草蛋白酶的氨基酸序列，包括至少6種來(lái)自芽孢桿菌屬菌株的枯草蛋白酶，即枯草蛋白酶168，枯草蛋白酶BPN，枯草蛋白酶Carlsberg，枯草蛋白酶DY，枯草蛋白酶amylosacchariticus，和mesentericopeptidase，一種來(lái)自放線菌目(actinomycetales)的枯草蛋白酶，來(lái)自普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)的thermitase，和一種真菌枯草蛋白酶，來(lái)自Tritirachium album的蛋白酶K。Subtilases是更新近被承認(rèn)的枯草蛋白酶的另一亞類。Subtilases被描述為高度堿性的枯草蛋白酶，包括例如枯草蛋白酶PB92(MAXACAL，Gist-Brocades NV)，枯草蛋白酶309(SAVINASE，Novozymes A/S)，和枯草蛋白酶147(ESPERASE，Novozymes A/S)。
“枯草蛋白酶變體或突變的枯草蛋白酶蛋白酶”在本文中定義為由表達(dá)來(lái)自親本微生物的突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草蛋白酶，所述親本微生物具有原基因或稱親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)的親本酶，所述親本基因已經(jīng)被突變以產(chǎn)生突變基因，該突變基因在合適的宿主中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生所述突變的枯草蛋白酶蛋白酶。這些被提到的枯草蛋白酶和其變體構(gòu)成在本發(fā)明的方法中有用的優(yōu)選蛋白酶類群。有用的枯草蛋白酶變體的例子有枯草蛋白酶309變體(SAVINASE)，其中在195位上甘氨酸被取代為苯丙氨酸(G195F或195Gly到195Phe)。
本發(fā)明的方法中可使用可商購(gòu)的蛋白酶。這樣的商品化蛋白酶的例子有ALCALASE(地衣芽孢桿菌菌株深層發(fā)酵生產(chǎn)的)，ESPERASE(芽孢桿菌屬的嗜堿性菌種深層發(fā)酵生產(chǎn)的)，RENNILASE(Mucor miehei的非病原性菌株深層發(fā)酵生產(chǎn)的)，SAVINASE(遺傳修飾的芽孢桿菌屬菌株深層發(fā)酵生產(chǎn)的)，例如在公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 92/19729中披露的變體，以及DURAZYM(SAVINASE的蛋白質(zhì)工程變體)，POLARZYMETM，和EVERLASETM。上述所有的商品化蛋白酶都可以從Novozymes A/S，DK-2880Bagsvrd，丹麥獲得。
其它優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶有來(lái)自曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、Bacillus vulgatus、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoide)和根霉屬(Rhizopus)的蛋白酶，和來(lái)自芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，特別是來(lái)自擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)菌種，例如Nocardiopsis natto和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)(參見(jiàn)WO 88/03947)，特別是來(lái)自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌NRRL 18133的蛋白酶。其它優(yōu)選的蛋白酶有來(lái)自國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK89/00002和WO 91/00345中公開(kāi)的芽孢桿菌屬枯草蛋白酶的突變體的絲氨酸蛋白酶，和EP 415 296中公開(kāi)的蛋白酶。
另一類優(yōu)選的蛋白酶是微生物來(lái)源的金屬蛋白酶。本發(fā)明中可以使用常規(guī)的發(fā)酵的商品化金屬蛋白酶，例如NEUTRASE(Zn)(由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌株深層發(fā)酵生產(chǎn))，可獲自Novozymes A/S，DK-2880Bagsvrd，丹麥；BACTOSOLWO和BACTOSOLSI，可獲自Sandoz AG，Basle，瑞士；TOYOZYME，可獲自Toyo Boseki Co.Ltd.，日本；及PROTEINASE K(由芽孢桿菌屬菌種KSM-K16的菌株深層發(fā)酵生產(chǎn))，可獲自Kao Corporation Ltd.，日本。
該蛋白酶可以0.005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01到100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。
脂肪酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶是脂肪酶，特別是微生物脂肪酶。就此而言，所述脂肪酶可選自酵母，例如假絲酵母；細(xì)菌，例如假單胞菌或芽孢桿菌；或絲狀真菌，例如腐質(zhì)霉屬(Humicola)或根毛霉屬(Rhizomucor)。更具體地，合適的脂肪酶可以是Rhizomucor miehei脂肪酶(例如，如EP 238 023描述地制備的)，Thermomyces lanuginosa脂肪酶，例如按EP 305 216的描述制備的，Humicola insolens脂肪酶，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)脂肪酶，洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶、Candida antarctica脂肪酶A或B，或來(lái)自rGPL，Absidia blakesleena，傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)，茄病鐮孢(Fusarium solani)，尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)，圓弧青霉(Penicillum cyclopium)，皮落青霉(Penicillum crustosum)，擴(kuò)展青霉(Penicillum expansum)，Rhodotorulaglutinis，Thiarosporella phaseolina，小孢根霉(Rhizopus microsporus)，Sporobolomyces shibatanus，出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)，異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)，Geotricum penicillatum，彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)，熱殺索絲菌(Brochothrix thermosohata)，Coprinuscinerius，Trichoderma harzanium，Trichoderma reesei，日本根霉(Rhizopusjaponicus)，或植物假單胞菌(Pseudomonas plantari)的脂肪酶。其它合適的脂肪酶的例子可以是上面提到的任何一種脂肪酶的變體，例如WO92/05249或WO 93/11254中描述的。
可商購(gòu)的脂肪酶的例子包括LIPOLASETM，LIPOLASE ULTRATM，LIPOPRIMETM，和LIPEXTM，來(lái)自Novozymes，丹麥。
所述脂肪酶可以使用的劑量為0.005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01-100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液。
纖維素酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶是纖維素酶(cellulase)或纖維素水解酶(cellulolytic enzyme)，其指催化纖維素降解為葡萄糖、纖維二糖、三糖和其它纖維寡糖(cellooligosaccharides)的酶。優(yōu)選地，所述纖維素酶是內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)，更優(yōu)選微生物內(nèi)切葡聚糖酶，特別是細(xì)菌或真菌內(nèi)切葡聚糖酶。細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的例子有從選自假單胞菌屬的細(xì)菌或燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)得到的或可由其產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶。
纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶可以是酸性、中性或堿性的纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，即，分別在酸性、中性或堿性的pH范圍表現(xiàn)最大的纖維素水解活性。因此，有用的纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶是酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選真菌酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選在酸性條件下具有顯著的纖維素水解活性的真菌酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述酶是從選自木霉屬(Trichoderma)、放線菌屬(Actinomyces)、漆斑菌屬(Myrothecium)、曲霉屬和葡萄孢屬(Botrytis)的真菌得到或可由其產(chǎn)生的。
優(yōu)選的酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶是從由黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)、灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)，疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，Trichoderma longibrachiatum，Trichodermareesei，和綠色木霉(Trichoderma viride)構(gòu)成的組得到的。
另一種有用的纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶是中性或堿性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選真菌中性或堿性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選在中性或堿性條件下具有顯著的纖維素水解活性的真菌中性或堿性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述酶從選自支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、毛殼霉屬(Chaetomium)、頭孢屬(Cephalosporium)、鐮孢屬(Fusarium)、膠霉屬(Gliocladium)、腐質(zhì)霉屬、耙菌屬(Irpex)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、疣孢霉屬(Mycogone)，漆斑菌屬，絲葚霉屬(Papulospora)，青霉屬(Penicillium)，帚霉屬(Scopulariopsis)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，和輪枝孢屬(Verticillium)的真菌獲得或可由其產(chǎn)生。
優(yōu)選的堿性纖維素酶或葡聚糖酶是從頭孢屬的菌種、尖孢鐮孢，Humicola insolens，或Myceliopthora thermophila，或優(yōu)選從頭孢屬菌種RYM-202，F(xiàn)usarium oxysporum，DSM 2672，Humicola insolens，DSM 1800，或Myceliopthora thermophila，CBS 117.65獲得的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶是木聚糖酶，例如內(nèi)切1，3-β-木糖苷酶(endo-1，3-β-xylosidase)(EC 3.2.1.32)，木聚糖1，4-β-木糖苷酶(xylan 1，4-β-xylosidase)(EC 3.2.1.37)，和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)(EC 3.2.1.55)。優(yōu)選地，所述木聚糖酶選自Aspergillus aculeatus(一種表現(xiàn)木聚糖酶活性的酶，該酶與針對(duì)來(lái)自Aspergillus aculeatus CBS 101.43的純化的木聚糖酶的抗體有免疫反應(yīng)性，參見(jiàn)例如WO 94/21785)；米曲霉(參見(jiàn)例如SU 4610007)；出芽短柄霉(參見(jiàn)例如EP 0 373 107 A2)；環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)(WO 91/18978)；短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(參見(jiàn)例如WO 92/03540)；嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)(參見(jiàn)例如WO 91/18976，WO 91/10724)；芽孢桿菌屬菌種AC13(特別是NCIMB 40482菌株，參見(jiàn)例如WO 94/01532)；Humicola insolens(參見(jiàn)例如WO 92/17573)；紅嗜熱鹽菌屬(Rhodothermus)(參見(jiàn)例如WO 93/08275)；淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)(參見(jiàn)例如WO 93/03155)；綠孢鏈霉菌(Streptomyces viridosporus)(參見(jiàn)例如EP 496 671A)；地衣芽孢桿菌(參見(jiàn)例如JP 9213868)；橙色熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,966,850)；Trichoderma longibrachiatum和Chainia屬的菌種(參見(jiàn)例如EP 0 353 342 A1)；Trichoderma harzianum andTrichoderma reseei(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,725,544)；Thermomyces lanuginosus(參見(jiàn)例如EP 0 456 033 A2)；褐色熱單胞(Thermomonospora fusca)(參見(jiàn)例如EP 0 473 545 A2)；Trichoderma longibrachiatum(參見(jiàn)W.J.J.van denTweel等編，Stability of Enzymes，Proceedings of an International Symposiumheld in Maastrich，The Netherlands，1992.11.22-25，F(xiàn)isk，R.S.和Simpson，pp.323-328)；網(wǎng)球菌屬(Dictyoglomus)(參見(jiàn)例如WO 92/18612)；鏈霉菌屬(Streptomyces)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,116,746)；和/或棲熱袍菌屬(Thermotoga)(參見(jiàn)例如WO 93/19171)。其它合適的木聚糖酶的例子有上述任一種酶具有木聚糖水解活性的變體(衍生物或同源物)。
可商購(gòu)的含纖維素酶產(chǎn)品的例子包括NOVOZYMTM342，CELLUZYMETM，CAREZYMETM，RENOZYMETM(都來(lái)自Novozymes，丹麥)。
該纖維素酶可以0.005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01到100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。
果膠酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它的酶是果膠酶，例如多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)(EC 3.2.1.15)、果膠酯酶(pectinesterase)(EC3.2.1.11)，或膠質(zhì)裂合酶(pectin lyase)(EC4.2.2.10)。果膠酶的合適的來(lái)源生物可以是黑曲霉。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶組合物中的其它酶包括由真菌棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，優(yōu)選棘孢曲霉，CBS 101.43所產(chǎn)生的水解性酶的組合物。已知該菌株產(chǎn)生包含果膠分解(pectinolytic)和多種半纖維素分解(hemicellulolytic)酶活性。
可商購(gòu)的含果膠酶的產(chǎn)品的例子包括BioPrepTM，SCOURZYMETM和PECTAWASHTM(Novozymes，丹麥)。
該果膠酶可以0.005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01到100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。
氧化還原酶在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶與氧化還原酶，例如氧化酶、過(guò)氧化物酶或漆酶組合。
a)漆酶作用于分子氧，產(chǎn)生水(H2O)，而不需任何過(guò)氧化物(例如H2O2)，
b)氧化酶作用于分子氧，產(chǎn)生過(guò)氧化物(H2O2)，c)過(guò)氧化物酶作用于過(guò)氧化物(例如H2O2)，產(chǎn)生水(H2O)。
漆酶(E.C.1.10.3.2)的例子包括來(lái)自多孔菌屬(Polyporus)菌種的菌株，特別是Polyporus pinsitus或變色多孔菌(Polyporus versicolor)的菌株，或毀絲霉屬菌種的菌株，特別是M.thermophila，Scytalidium屬菌種的菌株，特別是S.thermophilium，絲核菌(Rhizoctonia)屬菌種的菌株，特別是Rhizoctonia praticola或茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，或Rhus屬菌種的菌株，特別是Rhus vernicifera。所述漆酶還可以來(lái)自真菌例如金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)，曲霉屬，脈孢霉屬(Neurospora)，Podospora屬，射脈菌屬(Phlebia)，例如輻射射脈菌(P.radiata)(WO 92/01046)，革蓋菌屬(Coriolus)的菌種，例如毛革蓋菌(C.hirsitus)(JP 2-238885)，或葡萄孢屬。
在具體考慮的實(shí)施方案中，所述漆酶可以選自WO 96/00290中描述的Polyporus pinisitus漆酶(也稱為Trametes villosa漆酶)，WO 95/33836中描述的Myceliophthora thermophila漆酶，WO 95/33837中描述的Scytalidiumthermophilium漆酶，可從SIGMA購(gòu)買的商品名為SIGMA no.L5510的Pyricularia oryzae漆酶，WO 96/06930中描述的Coprinus cinereus漆酶，及WO 95/07988中描述的茄屬絲核菌漆酶。
過(guò)氧化物酶(1.11.1.7)的例子包括來(lái)自植物的過(guò)氧化物酶(例如辣根過(guò)氧化物酶)或來(lái)自微生物的過(guò)氧化物酶，包括真菌和細(xì)菌，例如Coprinus屬菌種，諸如Coprinus cinereus或Coprinus macrorhizus的菌株，或細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬，諸如短小芽孢桿菌。
在特別考慮的實(shí)施方案中，所述過(guò)氧化物酶可選自WO 95/10602中公開(kāi)的Coprinus cinereus IFO8371過(guò)氧化物酶或其變體，以及來(lái)源于WO97/04102中描述的Curvularia verruculosa CBS 147.63菌株的鹵素過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)。
考慮到的氧化酶特別包括糖氧化酶(carbohydrate oxidases)，這些酶被歸類為EC 1.1.3。糖氧化酶包括葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)，己糖氧化酶(E.C.1.1.3.5)，木糖醇氧化酶，半乳糖氧化酶(E.C.1.1.3.9)，吡喃糖氧化酶(E.C.1.1.3.10)，醇氧化酶(E.C.1.1.3.13)。
糖氧化酶可來(lái)自任何來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動(dòng)物來(lái)源。
葡萄糖氧化酶的例子包括來(lái)自曲霉屬的菌種，例如黑曲霉的菌株，或來(lái)自Cladosporium屬的菌種，尤其是Cladosporium oxysporum，特別是WO95/29996中描述的Cl.oxysporum CBS 163的葡萄糖氧化酶。
己糖氧化酶的例子包括由紅色海藻Chondrus crispus(通常稱為角叉菜(Irish moss)產(chǎn)生的己糖氧化酶(Sullivan和Ikawa，(1973)，Biochim.Biophys.Acts，309，p.11-22；Ikawa，(1982)，Meth.in Enzymol.89，carbohydratemetabolism part D，145-149)，其氧化廣譜的糖類，以及產(chǎn)生容易提取的己糖氧化酶的紅色海藻Iridophycus flaccidum所產(chǎn)生的己糖氧化酶，其氧化數(shù)種不同的單糖和雙糖(Bean和Hassid，(1956)，J.Biol.Chem，218，p.425；Rand et al.(1972)，J.of Food Science 37，p.698-710)。
該氧化還原酶可以0.005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0.01到100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。
本發(fā)明的最后一方面涉及使用芽孢桿菌α-淀粉酶來(lái)防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜生成物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶，優(yōu)選上面的“α-淀粉酶”部分提到的α-淀粉酶。
下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，它們不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
材料和方法作為緩沖劑和試劑使用的化學(xué)品都是商品化的產(chǎn)品，至少為試劑級(jí)。
酶α-淀粉酶-A是作為親本的WO 00/60060的SEQ ID NO2所描述的芽孢桿菌屬菌種的α-淀粉酶的變體。所述α-淀粉酶的氨基酸序列具有下面6個(gè)氨基酸缺失/取代D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K。
該變體在WO 01/66712也有公開(kāi)。該堿性α-淀粉酶以批號(hào)03AGE014-4生產(chǎn)。
α-淀粉酶B來(lái)自黃熱芽孢桿菌菌株，并在SEQ ID NO4中公開(kāi)。
α-淀粉酶C來(lái)自地衣芽孢桿菌菌株，并在WO 99/19467的SEQ ID NO6中顯示。
蛋白酶E是Bacillus clausii(舊名遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)C360＝NCIB 10309)的一種枯草蛋白酶，具有取代M222S，并被EP專利396,608-B1所覆蓋(可從Novozymes，丹麥索取)。
脂肪酶A是源自Humicola lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶變體，其具有下列突變T231R，N233R，公開(kāi)于美國(guó)專利6,939,702-B(可從Novozymes索取)。
纖維素酶A是來(lái)自Humicola insolens的多組分纖維素酶(可從Novozymes索取)。
細(xì)菌菌株得自ATCC 10774的枯草芽孢桿菌大腸桿菌ATCC#11229和ATCC#25922生物膜培養(yǎng)基 根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)制備胰胨豆胨肉湯(Tryptic SoyBroth，TSB，購(gòu)自VWR，P/N DF0370-07)培養(yǎng)基，再用水稀釋到5％。每升加入2ml微量元素。
瓊脂 根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)使用胰胨豆胨瓊脂(Tryptic Soy Agar，TSA，購(gòu)自VWR，P/N DF0369-17)。
微量元素溶液 每升1.5g CaCl2，1.0g FeSO4·7H2O，0.35gMnSO4·2H2O，0.5g NaMoO4不銹鋼試片(coupons)不銹鋼試片No.304自Metal Samples Company(Munford，AL)獲得。
BioLC離子色譜系統(tǒng) 該IC系統(tǒng)由下列組件構(gòu)成GP50梯度泵(P/N 059493)ED50A電化學(xué)檢測(cè)器(P/N 059499)AS50溫控自動(dòng)進(jìn)樣器(P/N 056565)用于積分電流檢測(cè)(Integrated Amperometry)的電化學(xué)檢測(cè)池(Electrochemical Cell)，備全了金電極和Ag/AgCl參比電極(P/N 060386)Chromelion數(shù)據(jù)控制軟件CHM-1-IC(P/N 060930)CDC生物膜反應(yīng)器購(gòu)自Biosurface Technologies，Inc.(P/N CBR 90-2)，備全了聚碳酸鹽試片(每個(gè)反應(yīng)器24個(gè)，P/N RD 128-PC)。
去污劑清潔基料(Detergent Cleaner Base)，得自Weiman Products(IL，美國(guó))，品名為Burnishine ME-多酶去污劑。在使用前通過(guò)微波爐高檔位(high setting)加熱1分鐘來(lái)使酶變性。
方法α-淀粉酶活性(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物測(cè)定淀粉水解活性。該方法基于酶降解變性的(modified)馬鈴薯淀粉，通過(guò)將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合來(lái)追蹤該反應(yīng)。開(kāi)始，生成藍(lán)黑色，但在淀粉降解的過(guò)程中藍(lán)色變?nèi)?，并逐漸變成紅棕色，將其與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)比較。
1千Novo α-淀粉酶單位(KNU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；pH 5.6)糊精化(dextrinize)5260mg的Merck Amylum solubile淀粉干物質(zhì)的酶量。
更詳細(xì)地描述這種分析方法的小冊(cè)子EB-SM-0009.02/01可從Novozymes A/S，丹麥索取，在此將該小冊(cè)子并入本文作為參考。
兩個(gè)序列之間的同一性程度的確定為了本發(fā)明的目的，可以通過(guò)Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)確定兩個(gè)氨基酸序列間的同一性程度，其中上述方法使用的是LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，該軟件帶有同一性列表以及以下多個(gè)比對(duì)參數(shù)空位罰分(gap penalty)10，空位長(zhǎng)度罰分(gap length penalty)10。配對(duì)比對(duì)參數(shù)如下Ktuple＝1，空位罰分＝3，windows＝5，diagonals＝5。
實(shí)施例實(shí)施例1使用α-淀粉酶A和α-淀粉酶C去除生物膜生物膜反應(yīng)器由400ml燒杯、磁力攪拌器和2個(gè)不銹鋼試片(coupon)組成。將試片垂直地用膠帶固定(taped)在燒杯的壁上，并使試片的底邊落在燒杯的底上。加入攪拌子，用圓形鋁箔覆蓋燒杯并高壓蒸汽滅菌。向每個(gè)燒杯中加入200ml無(wú)菌的生物膜培養(yǎng)基。為了培養(yǎng)接種物，將每種細(xì)菌菌株(來(lái)自枯草芽孢桿菌)在平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar)上28℃培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌的拭子將每種菌株懸浮在無(wú)菌水中至OD686為0.100，然后進(jìn)一步稀釋至10-1。每個(gè)測(cè)試由4個(gè)沒(méi)有酶的對(duì)照燒杯、2個(gè)具有50mg酶蛋白每升溶液的燒杯，和2個(gè)具有100mg酶蛋白每升溶液的燒杯組成。首先在37℃攪拌下將燒杯溫育過(guò)夜以在不銹鋼試片上生長(zhǎng)生物膜。該溫育步驟后，以上述的2種劑量按照下表加入酶，在40℃下再溫育2小時(shí)。然后，用無(wú)菌水小心地洗滌每個(gè)燒杯和不銹鋼試片，用結(jié)晶紫染色，用無(wú)菌水清洗，用乙酸溶解殘余的生物膜，然后用分光光度計(jì)在600nm下測(cè)量等份的每種溶液的吸光度。所測(cè)得的這些溶液的吸光度直接地指示不銹鋼試片上殘余的生物膜的量。低的吸光度對(duì)應(yīng)于酶的效用良好，幾乎沒(méi)有生物膜殘余；高的吸光度對(duì)應(yīng)于酶的效用差(或沒(méi)有)，有顯著的生物膜殘余。

實(shí)施例2使用α-淀粉酶A、B和C溶解粗淀粉測(cè)量不同的α-淀粉酶溶解粗的(raw)、非水化的(unhydrated)小麥淀粉的速率。該研究中分別使用α-淀粉酶A、B和C。
將具有pH 8Tris緩沖液、15°dH的1％粗小麥淀粉溶液25毫升倒入帶蓋的管中，放在40℃水浴中。在加入酶之前，測(cè)量“還原端”(reducing ends)的初始水平。該研究中所用的酶濃度為3mg酶蛋白每g粗小麥淀粉。在不同的時(shí)間取出1ml的樣品。加入20微升的1M HCl，然后在99℃溫育10分鐘。酸和熱的聯(lián)合作用使淀粉酶失活。加入20μL的1M NaOH以確保樣品不再為酸性。然后將樣品稀釋，與顯色試劑(color reagent)(PHABH，酒石酸鈉鉀鹽，NaOH)在95℃下共同溫育10分鐘，最后離心，再測(cè)量上清在410nm處的OD。將1M HCl中的粗小麥淀粉的1％溶液在110℃的烘箱中溫育4小時(shí)來(lái)制備對(duì)照(100％水解的淀粉)。使用該處理來(lái)計(jì)算每克粗小麥淀粉所能夠產(chǎn)生的最大量的葡萄糖。該值在圖1所示圖表中設(shè)為100％。
對(duì)α-淀粉酶A和B而言，可見(jiàn)在最初的5小時(shí)中觀察到的粗小麥淀粉溶解初始速率顯著地快于α-淀粉酶C。因此，在整個(gè)這段時(shí)間中，被前兩種α-淀粉酶溶解的淀粉的百分率高于后一種酶。
實(shí)施例3使用α-淀粉酶A和C與蛋白酶E和去污劑組合的生物膜去除在預(yù)先滅菌的CDC生物膜反應(yīng)器中，在聚碳酸酯試片上生長(zhǎng)大腸桿菌(ATCC#11229)的單組分生物膜。在實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始，在胰胨豆胨瓊脂(TSA)上37℃過(guò)夜生長(zhǎng)大腸桿菌培養(yǎng)物。次日早晨，用1微升無(wú)菌接種環(huán)從平板上挑取單菌落，加到40g TSB每升水的溶液中。將該溶液在37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使培養(yǎng)物長(zhǎng)起。第二天，將1毫升的該培養(yǎng)物加到CDC生物膜反應(yīng)器中所含的400ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0.30g TSB每升無(wú)菌水)中。以130rpm緩慢地?cái)嚢柙撊芤?，并以非補(bǔ)料分批模式在22℃下生長(zhǎng)2天。2天的生長(zhǎng)期后，將試片固定桿(holder rods)和試片從反應(yīng)器移出，在無(wú)菌的稀釋水中洗去浮游的細(xì)胞，從桿上小心地移下試片，并在40℃下，在下列溶液中(每種30毫升)溫育1小時(shí)A單獨(dú)的去污劑清潔基料，0.21g去污劑，于無(wú)菌水中。
B去污劑清潔基料，0.21g+0.51mg酶蛋白的蛋白酶E+0.06mg酶蛋白的α-淀粉酶A。
C去污劑清潔基料，0.21g+0.51mg酶蛋白的蛋白酶E+0.16mg酶蛋白的α-淀粉酶C。
在溫育步驟后，移去試片。將溶液通過(guò)0.45μm尼龍注射器式濾器過(guò)濾，并用離子色譜分析其糖含量。并使用PA100保護(hù)柱(guard)和分析柱(P/N043055)來(lái)分離。用60/40去離子水/100mM NaOH與100％100mMNaOH/1M乙酸鈉之間的流動(dòng)相梯度(指數(shù)梯度從進(jìn)入分離后10分鐘開(kāi)始到85分鐘為止)來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。圖2顯示本實(shí)驗(yàn)的3個(gè)色譜圖的重疊。當(dāng)使用α-淀粉酶A時(shí)，相對(duì)于單獨(dú)的去污劑或使用α-淀粉酶C，生成了顯著更高水平的低分子量糖類(葡萄糖＝glu，麥芽糖＝mal，麥芽三糖＝DP3，麥芽四糖＝DP4，麥芽五糖＝DP5)。這顯示通過(guò)對(duì)大腸桿菌細(xì)菌產(chǎn)生的支鏈淀粉外泌多糖(exopolysaccharides)的降解的增加，生物膜去除的水平增加。
實(shí)施例4使用α-淀粉酶A和C與蛋白酶E、纖維素酶A、脂肪酶A和去污劑組合的生物膜去除將兩個(gè)裝有聚碳酸酯試片的CDC生物膜反應(yīng)器高壓滅菌，注入無(wú)菌的1/10濃度的胰胨豆胨肉湯(TSB，3g/l的濃度)，并接種1ml大腸桿菌(ATCC#25922)的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物。反應(yīng)器中的起始細(xì)胞計(jì)數(shù)平均為5×108cfu/mL。將兩個(gè)反應(yīng)器都以分批模式在37℃下運(yùn)行24小時(shí)(沒(méi)有流入或流出)。這段時(shí)間以后，開(kāi)始以12ml/min的流速、37℃連續(xù)流加1/10TSB。將大腸桿菌生物膜生長(zhǎng)4天。此時(shí)，從每個(gè)反應(yīng)器(標(biāo)為反應(yīng)器1或2)拉出一個(gè)桿，放在含有200毫升下列經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的溶液的燒杯中A單獨(dú)的去污劑清潔基料，1.4g去污劑，于無(wú)菌水中。
B去污劑清潔基料，1.4g+3.4mg酶蛋白的蛋白酶E+0.48mg酶蛋白的脂肪酶A+0.23mg酶蛋白的纖維素酶A+0.40mg酶蛋白的α-淀粉酶A。
C去污劑清潔基料，1.4g+3.4mg酶蛋白的蛋白酶E+0.48mg酶蛋白的脂肪酶A+0.23mg酶蛋白的纖維素酶A+0.40mg酶蛋白的α-淀粉酶C。
每個(gè)燒杯中的溶液在溫和攪拌下40℃溫育30分鐘，然后用無(wú)菌水輕柔地清洗每個(gè)桿。最后，用胰胨豆胨瓊脂(TSA)對(duì)每個(gè)桿的3個(gè)試片中的2個(gè)上的大腸桿菌計(jì)數(shù)。該研究得到的平均平板計(jì)數(shù)結(jié)果如下

本文所描述并要求保護(hù)的發(fā)明并不限于本文所公開(kāi)的具體實(shí)施方案，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意在作為本發(fā)明的一些方面來(lái)說(shuō)明。意圖將任何等價(jià)的實(shí)施方案都將包括本發(fā)明的范圍中。事實(shí)上，除了本文中示出并描述的那些以外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員從前面的描述將顯而易見(jiàn)地想到多種對(duì)本發(fā)明的修改。所附的權(quán)利要求也意在將這些修改包括在其范圍之內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義的本公開(kāi)為準(zhǔn)。
本文引用了多種文獻(xiàn)，在此將它們?nèi)康墓_(kāi)并入本文作為參考。
序列表<110>諾維信北美公司(Novozymes North America，Inc.)諾維信公司(NOVOZYMES A/S)Deinhammer，RandyAndersen，Carsten<120>防止、去除、減少或破壞生物膜的方法<130>10648<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1455<212>DNA<213>芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)<220>
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<221>mat_peptide<222>(1)..()<400>1cac cat aat ggt acg aac ggc aca atg atg cag tac ttt gaa tgg tat 48His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr1 5 10 15cta cca aat gac gga aac cat tgg aat aga tta agg tct gat gca agt 96Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser20 25 30aac cta aaa gat aaa ggg atc tca gcg gtt tgg att cct cct gca tgg144Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45aag ggt gcc tct caa aat gat gtg ggg tat ggt gct tat gat ctg tat192Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60gat tta gga gaa ttc aat caa aaa gga acc att cgt aca aaa tat gga240Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80acg cgc aat cag tta caa gct gca gtt aac gcc ttg aaa agt aat gga288Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly85 90 95att caa gtg tat ggc gat gtt gta atg aat cat aaa ggg gga gca gac336Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110
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<221>CDS<222>(1)..(1857)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(99)<220>
<221>mat_peptide<222>(100)..(1857)<220>
<221>misc_feature<222>(100)..(1551)<223>催化結(jié)構(gòu)域<220>
<221>misc_feature<222>(1552)..(1857)<223>糖類結(jié)合區(qū)<400>3atg tcc cta ttc aaa aaa agc ttt ccg tgg att tta tcc cta ctt ctt 48Met Ser Leu Phe Lys Lys Ser Phe Pro Trp Ile Leu Ser Leu Leu Leu-30 -25 -20ttg ttt tcg ttt att gct cct ttt tcc att caa aca gaa aaa gtc cga 96Leu Phe Ser Phe Ile Ala Pro Phe Ser Ile Gln Thr Glu Lys Val Arg-15 -10 -5gct gga agt gtg ccg gta aat ggc aca atg atg caa tat ttc gaa tgg144Ala Gly Ser Val Pro Val Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp
-1 1 5 10 15tac ctt cca gac gat gga aca cta tgg acg aaa gta gca aat aac gct192Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Asn Ala20 25 30caa tct tta gcg aat ctt ggc att act gcc ctt tgg ctt ccc cct gcc240Gln Ser Leu Ala Asn Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala35 40 45tat aaa gga aca agc agc agt gac gtt gga tat ggc gtt tat gat tta288Tyr Lys Gly Thr Ser Ser Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu50 55 60tat gac ctt gga gag ttt aat caa aaa gga act gtc cga aca aaa tac336Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr65 70 75ggg aca aaa aca caa tat atc caa gca atc caa gcg gcg cat aca gca384Gly Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Thr Ala80 85 90 95ggg atg caa gta tat gca gat gtc gtc ttt aac cat aaa gcc ggt gca432Gly Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala100 105 110gat gga aca gaa cta gtc gat gca gta gaa gta aat cct tct gac cgc480Asp Gly Thr Glu Leu Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg115 120 125aat caa gaa ata tca gga aca tat caa atc caa gcg tgg aca aaa ttt528Asn Gln Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe130 135 140gat ttt cct ggt cgt gga aac acc tat tct agt ttt aaa tgg cgt tgg576Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp145 150 155tat cat ttc gat gga acg gac tgg gat gag agt aga aaa cta aat cgt624Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg160 165 170 175att tac aag ttc cgc ggc acg gga aaa gca tgg gat tgg gaa gta gat672Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190aca gaa aac ggg aat tat gac tat ctc atg tat gca gat tta gat atg720Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met195 200 205gat cat cca gag gtt gta tcc gaa cta aaa aat tgg gga aag tgg tat768Asp His Pro Glu Val Val Ser Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr210 215 220gta acc aca acc aat atc gac gga ttc cgt ctg gat gca gtg aag cat816Val Thr Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His225 230 235att aaa tat agc ttt ttc ccg gac tgg cta tcg tac gta cga acc caa864
Ile Lys Tyr Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Thr Gln240 245 250 255aca caa aag cct ctt ttt gcc gtt ggg gaa ttt tgg agc tat gac att 912Thr Gln Lys Pro Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Ile260 265 270agc aag ttg cac aac tat att aca aag acg aac ggc tct atg tcc cta 960Ser Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu275 280 285ttc gat gcc ccg ctg cat aac aat ttt tat ata gca tcg aaa tca ggc1008Phe Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Lys Ser Gly290 295 300ggt tat ttt gat atg cgc aca tta ctc aac aac aca ttg atg aaa gat1056Gly Tyr Phe Asp Met Arg Thr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp305 310 315cag cct aca tta gca gtc aca tta gtg gat aat cac gat act gag cca1104Gln Pro Thr Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro320 325 330 335ggg caa tct ctg cag tca tgg gtc gag cca tgg ttt aaa ccg tta gct1152Gly Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350tac gca ttt atc ttg acc cgc caa gaa ggt tat cct tgc gtc ttt tat1200Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr355 360 365gga gat tac tat ggt att cca aaa tac aac att cct gcg ctg aaa agc1248Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Ala Leu Lys Ser370 375 380aaa ctt gat ccg ctg tta att gcc aga aga gat tat gcc tat gga aca1296Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr385 390 395cag cac gac tat att gac agt gcg gat att atc ggt tgg acg cgg gaa1344Gln His Asp Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu400 405 410 415gga gtg gct gaa aaa gca aat tca gga ctg gct gca ctc att acc gac1392Gly Val Ala Glu Lys Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp420 425 430ggg cct ggc gga agc aaa tgg atg tat gtt gga aaa caa cac gct ggc1440Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly435 440 445aaa acg ttt tat gat tta acc ggc aat cga agt gat aca gtg aca atc1488Lys Thr Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile450 455 460aat gct gat gga tgg gga gaa ttt aaa gtc aat gga ggg tct gta tcc1536Asn Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475
ata tgg gtt cca aaa ata tca acc act tcc caa ata aca ttt act gta1584Ile Trp Val Pro Lys Ile Ser Thr Thr Ser Gln Ile Thr Phe Thr Val480 485 490 495aat aac gcc aca acc gtt tgg gga caa aat gta tac gtt gtc ggg aat1632Asn Asn Ala Thr Thr Val Trp Gly Gln Asn Val Tyr Val Val Gly Asn500 505 510att tcg cag ctg ggg aac tgg gat cca gtc cac gca gtt caa atg acg1680Ile Ser Gln Leu Gly Asn Trp Asp Pro Val His Ala Val Gln Met Thr515 520 525ccg tct tct tat cca aca tgg act gta aca atc cct ctt ctt caa ggg1728Pro Ser Ser Tyr Pro Thr Trp Thr Val Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly530 535 540caa aac ata caa ttt aaa ttt atc aaa aaa gat tca gct gga aat gtc1776Gln Asn Ile Gln Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Ala Gly Asn Val545 550 555att tgg gaa gat ata tcg aat cga aca tac acc gtc cca act gct gca1824Ile Trp Glu Asp Ile Ser Asn Arg Thr Tyr Thr Val Pro Thr Ala Ala560 565 570 575tcc gga gca tat aca gcc agc tgg aac gtg ccc tag1860Ser Gly Ala Tyr Thr Ala Ser Trp Asn Val Pro580 585<210>4<211>619<212>PRT<213>黃熱芽孢桿菌(Bacillus flavothermus)<400>4Met Ser Leu Phe Lys Lys Ser Phe Pro Trp Ile Leu Ser Leu Leu Leu-30 -25 -20Leu Phe Ser Phe Ile Ala Pro Phe Ser Ile Gln Thr Glu Lys Val Arg-15 -10 -5Ala Gly Ser Val Pro Val Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp-1 1 5 10 15Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Asn Ala20 25 30Gln Ser Leu Ala Asn Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala35 40 45Tyr Lys Gly Thr Ser Ser Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu50 55 60Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr65 70 75Gly Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Thr Ala
80 85 90 95Gly Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala100 105 110Asp Gly Thr Glu Leu Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg115 120 125Asn Gln Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe130 135 140Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp145 150 155Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg160 165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Val Ser Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr210 215 220Val Thr Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His225 230 235Ile Lys Tyr Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Thr Gln240 245 250 255Thr Gln Lys Pro Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Ile260 265 270Ser Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu275 280 285Phe Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Lys Ser Gly290 295 300Gly Tyr Phe Asp Met Arg Thr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp305 310 315Gln Pro Thr Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro320 325 330 335Gly Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Ala Leu Lys Ser370 375 380Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr385 390 395
Gln His Asp Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu400 405 410 415Gly Val Ala Glu Lys Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp420 425 430Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly435 440 445Lys Thr Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475Ile Trp Val Pro Lys Ile Ser Thr Thr Ser Gln Ile Thr Phe Thr Val480 485 490 495Asn Asn Ala Thr Thr Val Trp Gly Gln Asn Val Tyr Val Val Gly Asn500 505 510Ile Ser Gln Leu Gly Asn Trp Asp Pro Val His Ala Val Gln Met Thr515 520 525Pro Ser Ser Tyr Pro Thr Trp Thr Val Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly530 535 540Gln Asn Ile Gln Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Ala Gly Asn Val545 550 555Ile Trp Glu Asp Ile Ser Asn Arg Thr Tyr Thr Val Pro Thr Ala Ala560 565 570 575Ser Gly Ala Tyr Thr Ala Ser Trp Asn Val Pro580 585<210>5<211>1920<212>DNA<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)<220>
<221>CDS<222>(421)..(1872)<400>5cggaagattg gaagtacaaa aataagcaaa agattgtcaa tcatgtcatg agccatgcgg 60gagacggaaa aatcgtctta atgcacgata tttatgcaac gttcgcagat gctgctgaag 120agattattaa aaagctgaaa gcaaaaggct atcaattggt aactgtatct cagcttgaag 180aagtgaagaa gcagagaggc tattgaataa atgagtagaa gcgccatatc ggcgcttttc 240ttttggaaga aaatataggg aaaatggtac ttgttaaaaa ttcggaatat ttatacaaca 300tcatatgttt cacattgaaa ggggaggaga atcatgaaac aacaaaaacg gctttacgcc 360
cgattgctga cgctgttatt tgcgctcatc ttcttgctgc ctcattctgc agcagcggcg420gca aat ctt aat ggg acg ctg atg cag tat ttt gaa tgg tac atg ccc 468Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro1 5 10 15aat gac ggc caa cat tgg agg cgt ttg caa aac gac tcg gca tat ttg 516Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu20 25 30gct gaa cac ggt att act gcc gtc tgg att ccc ccg gca tat aag gga 564Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45acg agc caa gcg gat gtg ggc tac ggt gct tac gac ctt tat gat tta 612Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60ggg gag ttt cat caa aaa ggg acg gtt cgg aca aag tac ggc aca aaa 660Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80gga gag ctg caa tct gcg atc aaa agt ctt cat tcc cgc gac att aac 708Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn85 90 95gtt tac ggg gat gtg gtc atc aac cac aaa ggc ggc gct gat gcg acc 756Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr100 105 110gaa gat gta acc gcg gtt gaa gtc gat ccc gct gac cgc aac cgc gta 804Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val115 120 125att tca gga gaa cac cta att aaa gcc tgg aca cat ttt cat ttt ccg 852Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro130 135 140ggg cgc ggc agc aca tac agc gat ttt aaa tgg cat tgg tac cat ttt 900Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe145 150 155 160gac gga acc gat tgg gac gag tcc cga aag ctg aac cgc atc tat aag 948Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys165 170 175ttt caa gga aag gct tgg gat tgg gaa gtt tcc aat gaa aac ggc aac 996Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn180 185 190tat gat tat ttg atg tat gcc gac atc gat tat gac cat cct gat gtc 1044Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205gca gca gaa att aag aga tgg ggc act tgg tat gcc aat gaa ctg caa 1092Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln210 215 220
ttg gac ggt ttc cgt ctt gat gct gtc aaa cac att aaa ttt tct ttt1140Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240ttg cgg gat tgg gtt aat cat gtc agg gaa aaa acg ggg aag gaa atg1188Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met245 250 255ttt acg gta gct gaa tat tgg cag aat gac ttg ggc gcg ctg gaa aac1236Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn260 265 270tat ttg aac aaa aca aat ttt aat cat tca gtg ttt gac gtg ccg ctt1284Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285cat tat cag ttc cat gct gca tcg aca cag gga ggc ggc tat gat atg1332His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300agg aaa ttg ctg aac ggt acg gtc gtt tcc aag cat ccg ttg aaa tcg1380Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser305 310 315 320gtt aca ttt gtc gat aac cat gat aca cag ccg ggg caa tcg ctt gag1428Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335tcg act gtc caa aca tgg ttt aag ccg ctt gct tac gct ttt att ctc1476Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350aca agg gaa tct gga tac cct cag gtt ttc tac ggg gat atg tac ggg1524Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365acg aaa gga gac tcc cag cgc gaa att cct gcc ttg aaa cac aaa att1572Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile370 375 380gaa ccg atc tta aaa gcg aga aaa cag tat gcg tac gga gca cag cat1620Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His385 390 395 400gat tat ttc gac cac cat gac att gtc ggc tgg aca agg gaa ggc gac1668Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415agc tcg gtt gca aat tca ggt ttg gcg gca tta ata aca gac gga ccc1716Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430ggt ggg gca aag cga atg tat gtc ggc cgg caa aac gcc ggt gag aca1764Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445tgg cat gac att acc gga aac cgt tcg gag ccg gtt gtc atc aat tcg1812Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser450 455 460
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Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln210 215 220Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His385 390 395 400Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser450 455 460Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480Val Gln Arg
權(quán)利要求
1.一種防止、去除、減少或破壞表面上存在的生物膜的方法，包括使表面與源自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述α-淀粉酶源自芽孢桿菌屬的菌株，優(yōu)選來(lái)自芽孢桿菌屬菌種NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375，或DSMZ no.12649，KSM AP1378，或KSM K36或KSM K38的菌株。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述α-淀粉酶源自具有SEQ ID NO2，4或6中所示序列的芽孢桿菌屬菌株，或者與SEQ ID NO2，4或6具有60％同一性的α-淀粉酶。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶在D183和/或G184位置(SEQ ID NO2中)具有缺失。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶在N195F位置(SEQ ID NO2中)具有取代。
6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶在D183+G184位置具有缺失，優(yōu)選其中所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶變體還具有一種或多種下列的取代R118K，N195F，R320K，R458K，特別是其中所述α-淀粉酶具有下面的突變?chǔ)?D183+G184)+R118K+N195F+R320K+R458K(在SEQ ID NO2中)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中使被生物膜污染或易于產(chǎn)生生物膜的表面接觸1分鐘到2天。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法，其中還存在表面活性劑。
9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-淀粉酶在其N末端氨基酸區(qū)域中包含Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp。
10.權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-淀粉酶以0.005-500mg酶蛋白，優(yōu)選0.01-100mg酶蛋白每升生物膜控制溶液的濃度使用。
11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-淀粉酶在40℃、3mg酶蛋白每g淀粉、pH 8.0下5小時(shí)后，具有高于15，優(yōu)選25，特別是35的水解淀粉百分率(％)。
12.權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的方法，其中還存在其它的酶，這些酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化還原酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述果膠分解酶選自果膠反式消除酶(pectintranseliminase)、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述纖維素酶是多組分纖維素酶制劑或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選腐質(zhì)霉屬內(nèi)切葡聚糖酶，特別是Humicola insolens內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選來(lái)自Humicolas insolens DSM 1800的EG I或EG V內(nèi)切葡聚糖酶或其變體或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選Thielavia屬內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選Thielavia terrestris內(nèi)切葡聚糖酶，或其變體。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述果膠分解酶是蛋白酶，優(yōu)選絲氨酸蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬菌株，例如遲緩芽孢桿菌或Bacillus clausii，或其變體。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中還存在選自分散劑、表面活性劑、抗微生物劑和殺生物劑的一種或多種試劑。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面是硬、軟或多孔表面。
18.權(quán)利要求18的方法，其中所述表面是膜(membrane)。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物膜去除是在10-70℃，優(yōu)選40-60℃的溫度下進(jìn)行的。
20.α-淀粉酶在防止或去除表面的生物膜中的用途。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述α-淀粉酶是權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)定義的α-淀粉酶。
22.權(quán)利要求20或21的用途，其中使用權(quán)利要求1-19中定義的其它酶和試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜的方法，包括使所述表面與來(lái)自細(xì)菌的α－淀粉酶接觸。
文檔編號(hào)D06M16/00GK101040052SQ200580030095
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者蘭迪·戴因哈默, 卡斯滕·安德森 申請(qǐng)人:諾維信北美公司, 諾維信公司