一種濕法提取純化微藻藻油的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種濕法來提取純化微藻藻油的方法，包括如下步驟：1)向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，快速攪拌均勻，離心，收集沉淀，獲得脫水處理后的藻泥；2)向步驟1)獲得的脫水處理后的藻泥中加入無毒性或微毒性的有機溶劑或其水溶液，同時對藻泥進行細胞破壁處理，提取微藻中的粗油；3)離心，收集步驟2)提取得到的粗油，向其中加入水和無機鹽，攪拌均勻，形成粗油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均勻后靜置分層或離心分層，共形成三層，分別是上層溶液、中間層固形物和下層溶液，收集上層溶液；4)將上層溶液進行脫溶劑處理，獲得微藻藻油。本發(fā)明的方法提取純化微藻藻油，其可酯化油脂得率高，容易操作，能耗低。
【專利說明】一種濕法提取純化微藻藻油的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能源和微藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種通過乙醇脫水-濕法提 油-正己烷萃取來獲得純化微藻藻油的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人口的增長及生活水平的提高，世界范圍內(nèi)對能源，尤其是運輸能源的需求 量不斷增大；與此同時，全球氣候變暖及石油儲量減少的問題日益突出。作為一種可本土供 應(yīng)的、容易生物降解的，以及可直接應(yīng)用于現(xiàn)存柴油機并減少尾氣排放的能源，生物柴油被 廣泛的認為是最具潛力的石油替代品。
[0003] 目前，生物柴油開發(fā)面臨的一個主要障礙是可再生原料的獲得。據(jù)估計，原料成本 占生物柴油總生產(chǎn)成本的45?58% (Energy Policy, 2006, 34(17) :3268-3283)。因此，廉 價的、且不影響食品市場的原料是未來可再生生物柴油發(fā)展的關(guān)鍵。而微藻，作為一種水生 非食物作物，被認為最理想的生物柴油煉制原料，其產(chǎn)油能力是傳統(tǒng)陸生作物的15?300 倍（Biotechnology Advances, 2007, 25 (3) : 294-306)，在理想條件下，其每畝的產(chǎn)能可達到 5000?15000加侖每年，且不爭地、爭水、爭糧。
[0004] 如今，微藻中的甘油三酯通過酯交換反應(yīng)制備生物柴油的技術(shù)已取得重大的突 破，而微藻生物質(zhì)的綜合利用以及高成本的油脂提取技術(shù)是微藻生物柴油規(guī)?；_發(fā)的主 要障礙。尤其是油脂提取過程，傳統(tǒng)方法通常需要對微藻進行干燥處理，并涉及有毒溶劑的 使用，導(dǎo)致藻類基質(zhì)的污染問題。
[0005] 普通小球藻（Chlorella vulgaris)用于煉制生物柴油的生命周期評估 顯示，傳統(tǒng)的以干燥藻粉為原料的有機溶劑提取法中，小球藻的采收和干燥占整 個煉制過程能源消耗的 60 % 以上（The International Journal of Life Cycle Assessment, 2010, 15(7) :704-714),使得微藻生物柴油的煉制成本至少是傳統(tǒng)柴油的10 倍以上。
[0006] 近年來，國內(nèi)外科研工作者對從微藻培養(yǎng)池或藻泥中濕法提取油脂的技術(shù)進行了 廣泛地研究。但由于微藻堅韌的細胞壁，一些物種甚至還有額外的礦物質(zhì)層，如硅藻，能夠 抵御外界高強度的破壞作用，使得濕法提取過程需要高強度的能源消耗。
[0007] 酸喊水提法（Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2000, 75 (5): 348-352)作為一種無需干燥且避免使用有機溶劑的提取方法，曾廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)能源的 開發(fā)。但該方法存在以下不足：1、油脂提取過程把蛋白質(zhì)等其它成分也一并提取出來，造成 營養(yǎng)物質(zhì)的浪費；2、由于油脂在水中的溶解度小，酸堿水提法的油脂提取率往往僅有40? 70% ;3、由此產(chǎn)生的酸堿廢水處理成本較高。
[0008] 超臨界流體萃?。⊿FE)(如超臨界水、乙醇、甲醇等）是一種利用化合物在流體中 的溶解度在高壓和高溫條件下顯著性增加的提取方法[34]。雖然該方法避免了微藻干燥過 程，且提取率高，可綜合利用微藻生物質(zhì)，但保持高壓和高溫所需的設(shè)備及能源投入巨大， 限制了其在生物能源方面規(guī)?；膽?yīng)用。
[0009] Teixeira等人提出了通過離子液體高效破壞細胞壁提取油脂的方法（Green Chemistry, 2012, 14 (2) : 419-427)，常壓 10CTC下，蛋白核小球藻（Chlore 11a pyrenoidosa) 在[BMM]C1中處理15min后，95%以上的細胞消失，該方法可直接應(yīng)用于含水量90%以上 的藻泥。但離子液體價格高昂，且回收難度大。
[0010] 膜分離原位萃取法利用具有生物相容性溶劑（如十二烷、右旋檸檬烯和對傘花烴 等），微藻培養(yǎng)的同時進行油脂的提取，無需破壞細胞壁即可萃取培養(yǎng)池中微藻細胞中的油 月旨（Bioresource Technology, 2013, 134 (2013) : 271-275)，但該方法提取效率低，且需要進 一步的研究以確定其對微藻細胞活力及油脂合成是否具有長期的影響。
[0011] 在目前的大多數(shù)濕法提取微藻油脂的方法中，或需要高能耗的微藻干燥過程，或 需要高昂的設(shè)備及能源投入，或無法利用微藻中除油脂外的其它營養(yǎng)物質(zhì)，或油脂提取率 低等。對于微藻生物柴油的開發(fā)，高成本的生物質(zhì)干燥和油脂提取過程，以及微藻生物質(zhì)的 綜合利用是其規(guī)?；_發(fā)的主要障礙。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為彌補現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提出一種乙醇脫水-濕法提 油-正己烷萃取純化以獲得較純凈的微藻藻油的方法，該方法提取純化微藻藻油，其可酯 化油脂得率高，容易操作，能耗低。
[0013] 本發(fā)明為達到其目的，采用的技術(shù)方案如下：
[0014] 一種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來獲得純化微藻藻油的方法，包括如下 步驟：
[0015] 1)脫水處理：向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，快速攪拌均勻，離心，收集沉 淀，獲得脫水處理后的藻泥；
[0016] 2)濕法提油：向步驟1)獲得的脫水處理后的藻泥中加入無毒性或微毒性的有機 溶劑或其水溶液，同時對藻泥進行細胞破壁處理，提取微藻中的粗油；
[0017] 3)離心，收集步驟2)提取得到的粗油，向其中加入水和無機鹽，攪拌均勻，形成粗 油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均勻后靜置分層或離心分層，共形成三層， 分別是上層溶液、中間層固形物和下層溶液，收集上層溶液；
[0018] 4)將上層溶液進行脫溶劑處理，獲得微藻藻油。
[0019] 進一步的，步驟1)中，乙醇溶液的加入量為所述采收的微藻藻泥中所含水量的 0. 1?5倍體積的量，所述的乙醇溶液為濃度在30% (v/v)以上的乙醇水溶液。
[0020] 優(yōu)選的，乙醇溶液的加入量為所述采收的微藻藻泥中所含水量的0. 5?2倍體積 的量，所述乙醇溶液為濃度在70?90% (v/v)的乙醇水溶液。采用該優(yōu)選條件，脫水效果 最佳，而且微藻中脂肪酸甲酯（FAME)的損失率較小。而乙醇溶液添加量的繼續(xù)增加，脫水 后藻泥含水量不會明顯的減少更多，但是，微藻中FAME的損失率會大大增加。
[0021] 進一步的，步驟2)中，所述的無毒性或微毒性的有機溶劑或其水溶液的加入量 為，相對每毫克脫水處理后藻泥干重，向其中加入5?50mL所述的無毒性或微毒性的有 機溶劑或其水溶液（例如體積分數(shù)為95%的乙醇水溶液），步驟2)中進行提取的溫度為 90°C，提取的時間為80min。
[0022] 優(yōu)選的，相對每毫克脫水處理后藻泥干重，加入10?20mL所述的無毒性或微毒性 的有機溶劑或其水溶液。
[0023] 進一步的，步驟2)中所述無毒性或微毒性的有機溶劑選自乙醇、丙醇、異丙醇中 的一種或多種組合。
[0024] 步驟2)中，對藻泥進行細胞破壁處理采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常用的細胞破壁處理方法 即可，并無特別限制，例如可以高壓均質(zhì)、微波、超聲波、脈沖電場、凍融、研磨、酸處理、堿處 理中的一種或多種組合的方式，這些均是本【技術(shù)領(lǐng)域】常用的細胞破壁方式。在一種具體實 施方式中，步驟2)具體可按如下方法操作：將步驟1)脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐中，相 對每毫克脫水處理后藻泥干重，向其中加入5?50mL所述的無毒性或微毒性的有機溶劑或 其水溶液，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時間為80min。
[0025] 優(yōu)選的，步驟3)中，向粗油中加入水的量為使粗油水溶液中水的體積分數(shù)達到 10 %?90%，向粗油中加入無機鹽的量為使其在粗油水溶液中的濃度達到0. 01?5mol/L ; 向所述粗油水溶液中加入正己烷的量為所述粗油水溶液的〇. 01?4倍體積的量。加入一 定濃度的無機鹽，對油/水乳狀液具有反乳化作用，促進油水分離，有助于提高油脂在正己 烷層的溶解效率。
[0026] 更為優(yōu)選的，步驟3)中，向粗油中加入水的量為使粗油水溶液中水的體積分數(shù)達 到40 %?60%，向粗油中加入無機鹽的量為使其在粗油水溶液中的濃度達到0. 05?2mol/ L ;向所述粗油水溶液中加入正己烷的量為所述粗油水溶液的0. 2?0. 8倍體積的量。采用 該更為優(yōu)選的條件，正己烷萃取油脂的效果更好，可更好的提高FAME回收率。所述無機鹽 選自氯化鈣、氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨中的一種或多種的組合。其中，以氯化鈣最佳。
[0027] 可選的，步驟1)和步驟3)分別重復(fù)操作兩次或多次。
[0028] 本發(fā)明的方法中，所述微藻沒有特別的限制，譬如為微綠球藻等。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 1、濕法提油前對采收的微藻藻泥進行乙醇脫水處理，不僅有效降低了微藻干燥所 需的能耗，并大幅減少了濕法提油過程中藻泥含水量對可酯化油脂提取率的影響，同時，脫 水處理后獲得的色素等物質(zhì)可用于進行綜合利用。
[0031] 2、以無毒性或微毒性的有機試劑為提取溶劑，使得提取后的藻渣可作為其它營養(yǎng) 物質(zhì)提取的原料，或用于動物飼料的開發(fā)。
[0032] 3、正己烷萃取過程中，粗油中的蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)的去除率高，可酯化油脂的損 失小，且該過程不改變油脂中脂肪酸的組成。
[0033] 4、本發(fā)明的方法可酯化油脂的得率高，設(shè)備及能源成本低，容易操作，便于工業(yè)化 應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1是本發(fā)明的乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取純化獲得較純凈的微藻藻油的 基本流程不意圖；
[0035] 圖2是實施例4?8中藻泥經(jīng)不同濃度乙醇溶液脫水后，藻泥中含液率和含水量 的變化，及脫水前后微藻中FAME損失率的情況；
[0036] 圖3是實施例6和9?11中藻泥經(jīng)添加不同量乙醇溶液脫水后，藻泥中含液率和 含水量的變化，及脫水前后微藻中FAME損失率的情況；
[0037] 圖4是實施例6和12?13中藻泥經(jīng)乙醇溶液脫水不同次數(shù)后，藻泥中含液率和 含水量的變化，及脫水前后微藻中FAME損失率的情況；
[0038] 圖5是實施例14?19中藻泥的含水量對微波輔助濕法提油過程可酯化油脂得率 的影響；
[0039] 圖6是實施例20?25中添加的無機鹽種類對FAME回收率的影響；
[0040] 圖7是實施例20和26?30中粗油水溶液中氯化鈣的濃度對FAME回收率的影 響；
[0041] 圖8是實施例27和31?36中粗油水溶液中水的體積分數(shù)對FAME回收率的影 響；
[0042] 圖9是實施例27和37?43中添加的正己烷與粗油水溶液的體積比對FAME回收 率的影響；

【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明：
[0044] 以下實施例選用的原料均為海洋微綠球藻（Nannochloris sp.)藻泥，由中國科學(xué) 院南海海洋研究所戶外跑道池培養(yǎng)獲得。離心獲得的藻泥用去離子水洗滌震蕩后，l〇〇〇〇r/ min離心8min，去掉上清，重復(fù)2次后，收集藻泥作為采收的微藻藻泥，備用。
[0045] 實施例1
[0046] 一種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來提取純化微藻藻油的方法，按照如下 步驟進行：
[0047] 1)脫水處理：稱取5g采收的微藻藻泥于50mL無菌離心管，向微藻藻泥中加入 乙醇溶液，該乙醇溶液的加入量為微藻藻泥中所含有的水的1倍體積的量，該乙醇溶液為 83% (V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后進行渦旋0. 5min，10000r/min離心5min，收集沉 淀，獲得脫水后的藻泥；
[0048] 經(jīng)檢測，脫水后藻泥中含水量由剛采收的藻泥的90%降至37. 41%。在該脫水處 理過程中，F(xiàn)AME損失率僅為6. 02%。
[0049] 2)濕法提油：將步驟1脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐（Milestone ETHOS A)中， 相對每毫克脫水處理后的藻泥干重，向其中加入20mL95% (v/v)的乙醇水溶液作為提取溶 齊[J，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時間為80min。
[0050] 3)油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水 和氯化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的體積分數(shù)為 50%為準，氯化鈣的加入量以使粗油水溶液中氯化鈣的濃度為0. lmol/L為準。然后向粗油 水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量為所述粗油水溶液的〇. 4倍體積的量，混勻后靜置 720min，收集上層溶液。
[0051] 4)將收集的上層溶液進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以脫除溶劑，獲得微藻藻油。
[0052] 經(jīng)實施例1提取純化后的微藻油脂，經(jīng)檢測，其中葉綠素 a、葉綠素 b、胡蘿卜素 和蛋白質(zhì)的含量分別減少為原步驟2獲得的粗油中含量的20. 28%、32. 11 %、30. 35%和 1. 21 %，同時脂肪酸的濃度濃縮為粗油的1. 60倍，脂肪酸組成無顯著性變化（p > 0. 05)，即 沒有改變油脂的組成。FAME的回收率達到95. 8%。
[0053] 實施例2
[0054] -種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來提取純化微藻藻油的方法，按照如下 步驟進行：
[0055] 1)脫水處理：稱取5g采收的微藻藻泥于50mL無菌離心管，向微藻藻泥中加入乙 醇溶液，該乙醇溶液的加入量為微藻藻泥中所含有的水的〇. 5倍體積的量，該乙醇溶液為 72% (V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后進行渦旋0. 5min，10000r/min離心5min，收集沉 淀，獲得脫水后的藻泥；
[0056] 經(jīng)檢測，脫水后藻泥中含水量由剛采收的藻泥的90%降至54. 47%。在該脫水處 理過程中，F(xiàn)AME損失率為4. 21 %。
[0057] 2)濕法提油：將步驟1脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐（Milestone ETHOS A)中， 相對每毫克脫水處理后的藻泥干重，向其中加入10mL95% (v/v)的乙醇水溶液作為提取溶 齊[J，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時間為80min。
[0058] 3)油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和 氯化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的體積分數(shù)為40 % 為準，氯化鈣的加入量以使粗油水溶液中氯化鈣的濃度為0. 05mol/L為準。然后向粗油 水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量為所述粗油水溶液的〇. 2倍體積的量，混勻后靜置 720min，收集上層溶液。
[0059] 4)將收集的上層溶液進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以脫除溶劑，獲得微藻藻油。
[0060] 經(jīng)實施例1提取純化后的微藻油脂，經(jīng)檢測，其脂肪酸的濃度濃縮為粗油的1. 3 倍，脂肪酸組成無顯著性變化（P >0.05)，即沒有改變油脂的組成。FAME的回收率達到 51. 3%。
[0061] 實施例3
[0062] 一種以乙醇脫水-濕法提油-正己烷萃取來提取純化微藻藻油的方法，按照如下 步驟進行：
[0063] 1)脫水處理：稱取5g采收的微藻藻泥于50mL無菌離心管，向微藻藻泥中加入 乙醇溶液，該乙醇溶液的加入量為微藻藻泥中所含有的水的2倍體積的量，該乙醇溶液為 90% (V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后進行渦旋0. 5min，10000r/min離心5min，收集沉 淀，獲得脫水后的藻泥；
[0064] 經(jīng)檢測，脫水后藻泥中含水量由剛采收的藻泥的90%降至48. 34%。在該脫水處 理過程中，F(xiàn)AME損失率僅為16. 12%。
[0065] 2)濕法提油：將步驟1脫水后的藻泥置于微波反應(yīng)罐（Milestone ETHOS A)中， 相對每毫克脫水處理后的藻泥干重，向其中加入50mL95% (v/v)的乙醇水溶液作為提取溶 齊[J，微波頻率范圍調(diào)節(jié)為800MHZ?1000MHZ，提取溫度為90°C，提取時間為80min。
[0066] 3)油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和 氯化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的體積分數(shù)為60 % 為準，氯化鈣的加入量以使粗油水溶液中氯化鈣的濃度為2mol/L為準。然后向粗油水溶液 中加入正己燒，加入正己燒的量為所述粗油水溶液的〇. 8倍體積的量，混勻后靜置720min, 收集上層溶液。
[0067] 4)將收集的上層溶液進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以脫除溶劑，獲得微藻藻油。
[0068] 經(jīng)實施例1提取純化后的微藻油脂，經(jīng)檢測，其脂肪酸的濃度濃縮為粗油的1. 2 倍，脂肪酸組成無顯著性變化（P >0.05)，即沒有改變油脂的組成。FAME的回收率達到 47. 1%。
[0069] 本申請發(fā)明人還通過多個實驗對本發(fā)明所提供的方法中的多個影響因素進行了 研究，詳細內(nèi)容如下：
[0070] 實施例4?8為研究在脫水處理步驟中乙醇溶液的濃度對脫水效果的影響的實施 例。
[0071] 實施例4
[0072] 海洋微綠球藻藻泥用去離子水洗滌震蕩后，10000r/min離心8min，去掉上清，重 復(fù)2次后，收集藻泥備用。
[0073] 乙醇脫水處理：稱取5g藻泥于50mL無菌離心管，按乙醇溶液與原藻泥中的水的體 積比1:1添加60% (V/V)的乙醇水溶液，潤旋0. 5min，10000r/min離心5min，脫水后的藻 泥轉(zhuǎn)入15mL無菌離心管待測。
[0074] 實施例5?8
[0075] 實施例5?8與實施例4均基本相同，其不同點在于添加的乙醇溶液的濃度不同， 實施例5?8的乙醇溶液的濃度依次分別為72% (V/V)、83% (V/V)、90% (V/V)和100%。
[0076] 實施例4?8脫水效果分析
[0077] 未經(jīng)乙醇脫水處理的藻泥含水量為89%，不同濃度的乙醇溶液，在相同的添加量 下，對藻泥脫水效果表現(xiàn)出顯著性（P > 0.05)差異，參見圖2。當(dāng)添加的乙醇濃度小于等 于83% (V/V)時，隨著添加的乙醇濃度增加，脫水后藻泥中含液率及含水量下降，這是因 為隨著添加的乙醇濃度增加，脫水過程中乙醇的含量增加，藻泥中的水被乙醇取代的量增 力口。添加60% (V/V)、72% (V/V)、83% (V/V)的乙醇溶液時，藻泥中的含水量分別下降至 55. 63%、50· 98%和37. 41%。而當(dāng)添加的乙醇濃度為90. 00% (V/V)和100. 00%時，由于疏 水性過大，脫水時濕藻泥結(jié)團，導(dǎo)致添加的乙醇溶液無法與藻泥內(nèi)部的水進行順利的交換， 乙醇脫水的效果有所下降。此外，隨著添加的乙醇濃度增加，微藻中FAME損失率增加，這是 由于脫水過程中，乙醇濃度的增加導(dǎo)致油脂在溶液中的溶解度增加，當(dāng)乙醇濃度為90. 00% (V/V)和100. 00%時，F(xiàn)AME的損失率分別達到14. 49%和18. 31%。綜合比較下，實施例3 的脫水效果較好，脫水后藻泥中水的質(zhì)量分數(shù)為37. 41%，F(xiàn)AME的損失率為6. 02%。
[0078] 實施例9?11為研究在脫水處理步驟中乙醇溶液的加入量對脫水效果的影響的 實施例。
[0079] 實施例9?11與實施例6均基本相同，其不同點在于添加的乙醇溶液與原藻泥中 水的體積比不同，實施例9?11添加的乙醇溶液與原藻泥中水的體積比依次分別為1:2、 2:1 和 5:1。
[0080] 實施例6和9?11脫水效果分析
[0081] 如圖3所示，隨著乙醇溶液的添加量增加，脫水后藻泥的含液率減少，這是因為， 濾餅或以其它方式脫水后物質(zhì)中液體的含量與液體的表面張力成正比，而隨著乙醇溶液添 加量的增加，脫水過程中乙醇濃度增加，引起液體整體的表面張力減小，從而導(dǎo)致藻泥中保 留的液體含量減少。當(dāng)添加的乙醇溶液與原藻泥中的水的體積比為1:1時，脫水后，藻泥含 水量下降至37. 41%，微藻中FAME的損失率為6. 02%。隨著乙醇溶液添加量的繼續(xù)增加， 脫水后藻泥含水量減少則趨于緩慢，與此同時，微藻中FAME的損失率呈直線升高趨勢。綜 合考慮后，實施例6的脫水效果最好。
[0082] 實施例12?13為研究在脫水處理步驟的重復(fù)次數(shù)對脫水效果的影響。
[0083] 實施例12?13與實施例6均基本相同，其不同點在于脫水步驟的重復(fù)次數(shù)不同， 實施例6為脫水1次，而實施例12?13的脫水的次數(shù)依次分別為2和3。
[0084] 實施例6和12?13脫水效果分析
[0085] 由于采收后的藻泥含水量較高（82. 17%?95.88% )，需要進行乙醇的多級脫 水才能達到理想含水量的藻泥，如圖4所示，濕藻泥經(jīng)過一次、二次和三次乙醇脫水后，藻 泥中含水量分別降至37. 42%、25. 32 %和19. 61%，同時，微藻中FAME的損失率分別達到 6. 02%、18. 31 %和25. 28%。為減少FAME的損失，實施例6的脫水方案為最佳。
[0086] 實施例14?19為研究濕法提油步驟中，藻泥脫水程度（或含水量）對提取效果 的影響。
[0087] 實施例14
[0088] 微藻粗油提?。悍Q取生物質(zhì)干重為lg含水量為95 %的藻泥于50mL微波反應(yīng)罐， 按料液比1:20添加95% (V/V)的乙醇溶液作為提取溶劑，提取條件：Milestone ETHOS A采 用溫度控制模式，微波頻率范圍800MHZ?1000MHZ自動調(diào)節(jié)，提取溫度為90°C，提取時間為 80min。油脂提取完成后，10000r/min離心8min，收集提取的粗油，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用氯仿 定容至10mL，取2mL的定容液，測定可酯化油脂的含量。
[0089] 可酯化油脂得率=提取的可酯化油脂含量/微藻生物質(zhì)干重X 100%
[0090] 實施例15?19
[0091] 實施例15?19與實施例14均基本相同，其不同點在于所用藻泥的含水量不同， 實施例15?19的所用藻泥的含水量依次分別為10%、20%、40%、60%和80%。
[0092] 實施例14?19可酯化油脂提取效果分析
[0093] 如圖5所示，藻泥含水量對微波輔助濕法提取微藻中的可酯化油脂具有較大的影 響，當(dāng)含水量從10%上升至95%時，F(xiàn)AME的得率下降了 75. 19%。因此，需要對新鮮采收的 藻泥（含水量約80?95%)進行一定程度的脫水，當(dāng)藻泥中的含水量降到20%?40%時， 藻泥中的含水量對可酯化油脂的提取率無顯著性影響（P > 〇. 05)，該含水量可作為藻泥提 取前脫水的目標值。由實施例6可知，新鮮采收的含水率為89%的藻泥，經(jīng)83%的乙醇溶 液一次脫水后，藻泥中的水的質(zhì)量分數(shù)即可下降至37. 42%，能夠滿足微波輔助濕法提油過 程對藻泥含水率的需要。
[0094] 實施例20?25為研究在萃取步驟中無機鹽對油脂純化效果。
[0095] 實施例20
[0096] 微藻油脂的萃取純化：準確量取5mL實施例17提取的微藻粗油，加入水和氯 化鈣，攪拌均勻后，形成粗油水溶液，使粗油水溶液中水的體積分數(shù)為〇. 5,氯化鈣的濃 度為0.5mol/L，再按正己烷與粗油水溶液的體積比為1的量添加正己烷溶液，混勻后靜 置1440min，收集上層溶液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用氯仿定容至10mL，準確量取2mL定容液， 測定可酯化油脂的含量。再準確量取2mL定容液，分別按Lowry (Journal of Biological Chemistry, 1951，193(1) :265-275)和 Stein (CUP Archive, 1979)的方法測定蛋白質(zhì)和色素 含量。
[0097] 可酯化油脂回收率=萃取獲得的可酯化油脂含量/粗油中的可酯化油脂含 量 X100%
[0098] 實施例21?25
[0099] 實施例21?25與實施例20均基本相同，其不同點在于無機鹽的種類不同，實施 例21?24的所用無機鹽依次分別為氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀和硫酸銨。實施例25則不加 任何無機鹽。
[0100] 實施例20?25可酯化油脂純化效果分析
[0101] 由圖6可知，以不加任何無機鹽的純化過程為對照，添加一定量無機鹽后，F(xiàn)AME的 回收率提高了 12. 31?45. 88%，這是因為加入一定濃度的無機鹽對油/水乳狀液具有反乳 化作用，促進油水分離，提高油脂在正己烷層的溶解效率。其中，實施例20獲得的FAME回 收率最高，達84. 99%。
[0102] 實施例26?30為研究無機鹽濃度對油脂純化效果的影響。
[0103] 實施例26?30與實施例20均基本相同，其不同點在于氯化鈣的濃度不同，實施 例26?30的氯化鈣濃度依次分別為(λ 05、0· 1、0· 25、0· 5和2mol/L。
[0104] 實施例20和26?30可酯化油脂純化效果分析
[0105] 由圖7可知，氯化鈣的濃度為0. 00?0. 10mol/L時，F(xiàn)AME回收率隨氯化鈣濃度 的增加而增加，當(dāng)氯化鈣濃度為〇. l〇mol/L時，F(xiàn)AME回收率最高，而繼續(xù)提高氯化鈣濃度， FAME回收率無顯著性增加。綜合考慮生產(chǎn)投入及FAME回收率，實施例27的效果較好。
[0106] 實施例31?36為研究萃取步驟中加入水的量對油脂純化效果的影響。
[0107] 實施例31?36與實施例27均基本相同，其不同點在于加入水的量不同，實施例 31?36的粗油水溶液中水的體積分數(shù)依次分別為0. 2、0. 3、0. 4、0. 6、0. 7和0. 8。
[0108] 實施例27和31?36可酯化油脂純化效果分析
[0109] 由圖8可知，當(dāng)粗油水溶液中水的體積分數(shù)從0. 2增加到0. 5時，F(xiàn)AME的回收率 從25. 91%逐漸增加至最大值83. 06%，提高了 2. 21倍。這是由于粗油水溶液的極性隨著 水的體積分數(shù)增加而增大，使油脂更傾向溶于正己烷中。當(dāng)水的體積分數(shù)繼續(xù)從50%增加 到80%時，F(xiàn)AME回收率隨著水的體積分數(shù)增加而下降，這是由于當(dāng)粗油水溶液中水的體積 分數(shù)超過50%后，乳狀液形成，且其穩(wěn)定性隨著水的體積分數(shù)增加而增加，導(dǎo)致正己烷萃取 油脂越來越困難。實施例27的效果較好。
[0110] 實施例37?43為研究萃取步驟中正己烷的加入量對油脂純化效果的影響。
[0111] 實施例37?43與實施例27均基本相同，其不同點在于正己烷的添加量不同，實 施例37?43的正己烷與粗油水溶液的體積比依次分別為0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、2和4。
[0112] 實施例27和37?43可酯化油脂純化效果分析
[0113] 由圖9可知，隨著正己烷與粗油水溶液的體積比，油脂在兩相中的分布平衡向 正己烷層移動，F(xiàn)AME的回收率增加，當(dāng)體積比為0. 4和0. 6時，F(xiàn)AME的回收率分別達到 95. 49%和96. 92%，但兩者無顯著性差異（p > 0. 05)。而繼續(xù)增加正己烷的用量，F(xiàn)AME的 回收率不斷降低。綜合考慮正己烷的用量和FMAE的回收率，實施例39的效果較好。
[0114] 實施例中涉及的部分測定方法介紹如下：
[0115] 藻泥中含水量的測定：即水占藻泥的質(zhì)量分數(shù)，稱取5g藻泥于快速水分分析儀的 托盤中，105°C烘干至恒重，計算差值。
[0116] 微藻中可酯化油脂含量的測定：微藻中的可酯化油脂，即可轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯 (FAME)的油脂，以樣品經(jīng)甲酯化后，采用氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測得的FAME的含量計算。 原藻泥及脫水后的藻泥，冷凍干燥后，以BF3為催化劑進行甲酯化：準確稱取0. Olg藻粉 于10mL螺口玻璃管中，加0. lmL濃度為lmg/mL的C19:0二氯甲烷溶液，氮氣吹干后，力口 2mL 濃度為（λ 5mol/L 的 Na0H-CH30H 溶液，75 °C 水浴 15min，冷卻后，加入 2mL BF3-CH30H 溶液，75°C水浴15min，冷卻后，加入lmL飽和NaCl溶液，2mL正己烷溶液，4000r/min離 心8min，取lmL上層液，經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，放入氣相色譜進樣瓶中。分析條 件：Agilent6890N-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，以高純氦氣作為載氣，恒流流速為lmL/min。 進樣量Ιμ?，分流比2:1，進樣口和檢測器溫度分別為235°C和240°C。升溫程序：110°C 保持2min，然后以5°C /min升至220°C保持lOmin。質(zhì)譜分析采用掃描方式，掃描范圍 33.00-450.00u。各峰型的鑒定采用NIST05a譜庫自動檢索。根據(jù)各脂肪酸相對于C19:0 內(nèi)標的峰面積，計算各脂肪酸組分的絕對含量，再換算出在總脂干重中的脂肪酸含量。
[0117] FAME損失率=(原微藻中FAME含量-脫水后微藻中FAME含量）/原微藻中FAME 含量X 100%
[0118] FAME的回收率=萃取獲得的產(chǎn)物中可酯化油脂含量/粗油中的可酯化油脂含 量 X 100%
[0119] 文中未特別說明之處，均可采用本【技術(shù)領(lǐng)域】現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進行，在此不再贅述。
[0120] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故 凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修 改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種濕法提取純化微藻藻油的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 脫水處理：向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，攪拌均勻，離心，收集沉淀，獲得脫 水處理后的藻泥； 2) 濕法提油：向步驟1)獲得的脫水處理后的藻泥中加入無毒性或微毒性的有機溶劑 或其水溶液，同時對藻泥進行細胞破壁處理，提取微藻中的粗油； 3) 離心，收集步驟2)提取得到的粗油，向其中加入水和無機鹽，攪拌均勻，形成粗油水 溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均勻后靜置分層或離心分層，收集上層溶液； 4) 將上層溶液進行脫溶劑處理，獲得純化微藻藻油。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，乙醇溶液的加入量為所述采收 的微藻藻泥中所含水量的〇. 1?5倍體積的量，所述的乙醇溶液為濃度在30% (v/v)以上 的乙醇水溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，乙醇溶液的加入量為所述采收的微藻藻 泥中所含水量的〇. 5?2倍體積的量，所述乙醇溶液為濃度在70?90% (v/v)的乙醇水溶 液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的無毒性或微毒性的有機 溶劑或其水溶液的加入量為，相對每毫克脫水處理后藻泥干重，向其中加入5?50mL所述 的無毒性或微毒性的有機溶劑或其水溶液，步驟2)中進行提取的溫度為90°C，提取的時間 為 80min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，相對每毫克脫水處理后藻泥干重，加入 10?20mL所述的無毒性或微毒性的有機溶劑或其水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或4或5所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述無毒性或微毒性 的有機溶劑選自乙醇、丙醇、異丙醇中的一種或多種組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或4或5所述的方法，其特征在于，步驟2)中，對藻泥進行細胞破壁 處理采用高壓均質(zhì)、微波、超聲波、脈沖電場、凍融、研磨、酸處理、堿處理中的一種或多種組 合的方式。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，向粗油中加入水的量為使粗油 水溶液中水的體積分數(shù)達到10%?90%，向粗油中加入無機鹽的量為使其在粗油水溶液 中的濃度達到〇. 01?5mol/L ;向所述粗油水溶液中加入正己烷的量為所述粗油水溶液的 0. 01?4倍體積的量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述無機鹽選自氯化鈣、氯化鎂、氯化 鈉、氯化鉀、硫酸銨中的一種或多種的組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)和步驟3)分別重復(fù)操作兩次或 多次。
【文檔編號】C11B1/00GK104059773SQ201410312879
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】魏東, 袁顯淵 申請人:華南理工大學(xué)