檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用，還提供了一種含檸檬精油祛斑化妝品制備方法。檸檬精油在祛斑化妝品中的質量百分比為1%～30%。上述祛斑化妝品的制備方法是先將檸檬精油與液態(tài)油脂溶解均勻，然后加入司盤80和吐溫80攪拌均勻得到油相，接著將甘油和去離子水混合均勻作為水相，均質水相，將油相倒入水相中，均質后形成乳液，最后將該乳液攪拌均勻得到均一乳液。本發(fā)明中檸檬精油作為天然的酪氨酸酶抑制劑，通過體外抑制實驗，從時間和濃度兩方面來研究抑制酪氨酸酶的活性，考察黑色素生成量的多少來證明檸檬精油祛斑的功效。檸檬精油對人體無副作用，安全可靠，在祛斑化妝品的開發(fā)和應用中具有較大的市場潛能。
【專利說明】檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于化工領域，尤其涉及一種檸檬精油的用途，特別是檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用。
【背景技術】
[0002]酪氨酸酶是導致水果，蔬菜發(fā)生酶褐變反應以及動物眼睛色素堆積和表皮以及毛發(fā)中黑色素產生的關鍵酶。酪氨酸酶在結構上屬于第三類銅蛋白家族，在酶活性中心具有兩個銅離子絡合點，并且分別與組氨酸相連，這兩個銅離子與不同的催化反應直接相關，如單酚羥基化為二酚(甲酚酶活性)和二酚氧化為二醌(鄰苯二酚氧化酶活性)。在哺乳動物表皮的基底層存在著黑色素細胞，細胞內存在著大量的酪氨酸酶，酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下生成多巴，接著被催化生成多巴醌，最后多巴醌發(fā)生一系列的羥化，脫氫以及聚合反應生成所謂的褐色素以及黑色素，以上就是哺乳動物表皮和毛發(fā)黑色素生成的途徑，其中酪氨酸酶為關鍵酶。如果酪氨酸酶的活性增高則黑色素生成的速度以及數量會隨之增加，從而導致黑色素沉積，出現所謂的“斑”，所以酪氨酸酶成為祛斑美白化妝品中的研究熱點，抑制酪氨酸酶的活性就能減緩或阻斷黑色素的生成。
[0003]目前市場上有許多物質能夠不同程度減輕皮膚色素沉著，大部分活性成分通過抑制酪氨酸酶的活性來影響黑素的形成，氫醌是傳統(tǒng)治療色素沉著的活性成分，已被使用40多年由于氫醌的氧化性損傷導致不可逆的皮膚色素減輕，形成永久性白斑，氫醌在血管系統(tǒng)里面的運輸速度非常迅速并且在肝臟等人體腎臟器官內的解毒性差具有一定的細胞毒性(BUCKS D A, MCMAS TER J R, GUY R H, MAIBAVH H 1.P.J Toxicol EnvironHealth 24(1998):79 - 289 ；WESTER R C, MELENDRES J, HUI X et al.J Toxicol EnvironHealth A 54(1998):301 - 317)因此成為禁用產品，隨之大量的祛斑劑就涌現，最為熟悉的是熊果苷，曲酸，白黎蘆醇以及一些維生素C衍生物，熊果苷的不穩(wěn)定性人們通過化學合成或者生物酶解產生穩(wěn)定性好的熊果苷衍生物如脫氧熊果苷，α，β-熊果苷(D0NG-H0SE0, J0NG-HYUN JUNG, JAE-EUN LEE, EUN-JUNG JEON, WOOKI KIM, CHE0N-SE0K PARK.J.ApplMicrobiol Biotechnol 95 (2012): 1417 - 1425),白黎醇和維生素衍生物的穩(wěn)定性較差，容易被氧化，天然成分的不穩(wěn)定性導致人們通過化學技術合成，從而使天然成分轉為化學成分。曲酸雖為常用的祛斑活性成分但長期使用會引起接觸性皮炎，過敏性皮炎和紅斑(BADRESHIA-BANSAL S, DRAEL0S Z D.J Drugs Dermatol 6 (2007): 32 - 39)?；瘜W合成物質帶來的不安全性，使消費者選擇化妝品時更注重于天然而又安全的天然植物提取物，植物提取物在化妝品中的應用就成為化妝品行業(yè)發(fā)展熱點，各種植物被大量提取做為祛斑劑，精油類產品也不例外，已有研究人員對甜橙精油和薰衣草精油祛斑機理進行研究(RITAR0M, HIROYUKI U and MASAYOSHI S.J.Agric.Food Chem 54(2006):2309-2313; DanielaFj Daniela F， Laura F， Stefania B，Giulia 0， Federica P and Anna G.FlavourFragr.J26(2011):441 - 446)，實驗證明植物精油對酪氨酸酶具有良好的抑制效果并且應用與化妝品中安全可靠。檸檬精油屬于柑橘類精油，通過水蒸氣蒸餾，冷軋或者冷磨等技術從檸檬的果實或者果皮中提取出來，由30多種物質構成的混合物，其中烯萜類化合物占據主要。檸檬精油在日常生活中主要用于抑菌，食品中的加香以及芳香療法，但對于其祛斑功效的未見報道。由于朽1檬精油精油中的成分主要偏于弱酸性并且含有極少量的α-羥基酸，這些產品中的檸檬精油直接接觸人體肌膚若加入的含量過高會產生一定的刺痛感，所以檸檬油需要借助一個脂質體系作用于人體肌膚，從而提高它的利用率。

【發(fā)明內容】
[0004]針對現有技術中存在的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種檸檬精油的新用途，即檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用，檸檬精油可以應用于美白祛斑化妝品的生產。
[0005]本發(fā)明提供了檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用。
[0006]具體的，如上所述的應用，所述的檸檬精油在祛斑化妝品中的質量百分比1%~30%。
[0007]本發(fā)明還提供了一種含檸檬精油祛斑化妝品，所述的檸檬精油在祛斑化妝品中的質量百分比為1%~30%。
[0008]進一步的，上述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，由下列成分組成，各成分的質量百分比如下:
檸檬精油I~30%
液態(tài)油脂I~15%
司盤802~10%
吐溫802~20%
甘油5~15%
去離子水余量。
[0009]進一步的，上述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，由下列成分組成，各成分的質量百分比如下:
檸檬精油1%
辛酸/癸酸三甘油酯1%
吐溫802%
司盤802%
甘油5%
去離子水89%。
[0010]進一步的，上述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，由下列成分組成，各成分的質量百分比如下:
檸檬精油15%
鱷梨油7.5%
吐溫806%
司盤8011%
甘油10%
去尚子水50.5%進一步的，上述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，由下列成分組成，各成分的質量百分比如下:
檸檬精油30%
橄欖油15%
吐溫8010%
司盤8020%
甘油15%
去離子水10%。
[0011]本發(fā)明還提供了上述的祛斑化妝品的制備方法，先將檸檬精油用油脂溶解，然后加入的司盤80和吐溫80攪拌均勻，混合為油相，再將甘油和余量的去離子水作為水相，均質水相，將油相緩慢倒入水相中，均質5~20分鐘，均質速度15000~30000rpm，然后形成乳液，該乳液經轉速為300~1000rpm的機械攪拌10~30min,形成均勻乳液。
[0012]本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發(fā)明將檸檬精油作為天然的酪氨酸酶抑制劑，通過抑制人體中的酪氨酸酶的活性從而減少黑色素的生成而起到祛斑的功效，經研究證明，檸檬精油對于酪氨酸酶的抑制具有較強的抑制效果，并且檸檬精油取自于天然的檸檬果實中，屬于當今化妝品行業(yè)中熱衷的天然祛斑物質的范疇內，對人體無副作用，安全可靠，在祛斑化 妝品的開發(fā)和應用中具有較大的市場潛能。
[0013]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1所示的是檸檬精油的成分分析表。
[0015]圖2所示的是檸檬精油中幾個主要成分的抑制作用的比較柱狀圖。
[0016]圖3所示的是檸檬精油與混合物抑制作用的比較柱狀圖。
[0017]圖4所示的是檸檬精油對酪氨酸酶的抑制影響圖。
[0018]圖5所不的是Lineweaver — Burk雙倒數圖。
[0019]注，上述各圖中，*為P < 0.05，表示各組樣品比較具有顯著性差異；#P < 0.01，
表示各組樣品比較具有極顯著性差異。
【具體實施方式】
[0020]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但實施例只是為了說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0021]為了更好的理解本發(fā)明的實質，下面就檸檬精油抑制酪氨酸酶的測定，及抑制機理來說明其抑制活性。
實施例1 酪氨酸酶活性測定的方法
本發(fā)明通過測定酪氨酸酶的鄰苯二酚氧化酶活性來計算酪氨酸酶的活性"酪氨酸酶可催化底物L 一 DOPA形成多巴醌，而多巴醌在475nm波長處有最大吸收峰〃因此通過測定酶催化反應體系的A=475nm隨時間的增長直線，該直線的斜率即為酪氨酸酶的活力，即以L 一 DOPA為底物通過酶標儀法在波長475nm處測定多巴醌的產生速度來計算酪氨酸酶活力的大小。具體測定方法為:10μ1? — DOPA底物體系中加入10μ1酪氨酸酶溶液，迅速混勻，通過瑞士 TECAN公司的Infinite M200 PRO檢測475nm處每分鐘吸光值變化來指示反應速度V值，從而表征酶活性的大小”所有動力學反應和檢測的緩沖液均采用50Mm磷酸緩沖液。
[0022]實施例2 檸檬精油成分分析的測定
本發(fā)明中涉及的檸檬精油是一種含有多種單一物質的混合物，通過GC-MS定性以及定量分析來確定檸檬精油中具體的物質名稱和含量，從而對于組成檸檬精油成分了解更加確切為后期研究單一物質和檸檬精油的抑制關系提供了單一物質定量的基礎具體測定方法為:分別用移液搶取50μ1的檸檬精油和15μ1的內標物于體積為3ml的子彈頭內，再用無水乙醇稀釋到1.5ml (最后的混合體積),然后用Agilent的GC-MS對該混合也進行檢測,其結果見圖1。由圖1得知該檸檬精油可被檢測出來的物質為32種其中烯萜類物質占據主要(大約為90%左右)，還有極少量不揮發(fā)性物質不能通過GC-MS檢測，本發(fā)明對該類物質不做深入研究。
[0023]實施例3 檸檬精油所含單一物質對酪氨酸酶抑制作用比較的測定
本發(fā)明采用測定檸檬精油所含單一物質對酪氨酸酶抑制作用比較的測定來探討檸檬精油該混合物對酪氨酸酶抑制過程中其各種物質起著如何的抑制作用以及其作用強弱為多少。選取含量較高的以及以前被報道過具有祛斑作用的幾種物質進行研究。分別配制濃度為30(^g/ml的D-檸檬烯，乙酸橙花酯，甲酸香葉酯，乙位菔烯，莰烯和檸檬醛，將上述樣品溶液分別取30μ1加入含有80μ1緩沖溶液，10μ1的酶溶液的96孔板中，在30°C的情況下孵育15min后再往該體系中加入10μ1的2.5MmL-D0PA溶液?；旌暇鶆蚝?，通過瑞士 TECAN公司的Infinite M 200 PRO檢測475nm處吸光值來指示初始值，反應20min后再檢測475nm處吸光值來指示終值，通過公示Inhibition。/。= (1-Λ A/Λ B) X 100%,其結果見圖2，其中ΛA為含有樣品溶液的吸光度終值與初始值之差，△ B為含與樣品溶液等體積的無水乙醇的吸光度終值與初始值之差。將六種單一的物質通過GC-MS定量分析后所占檸檬精油質量比來配制相應的六種單物質溶液并按照體積比為I混合，混合均勻后的混合液與檸檬精油進行酪氨酸酶抑制實驗，具體測定步驟與前面測試六種單一物質溶液的抑制作用相同，其結果見圖3。由圖2可以看出檸檬精油中含有較多對酪氨酸酶具有抑制作用的物質，這些物質對酪氨酸酶的抑制效果各不相同，其中乙酸橙花酯和甲酸香葉酯的抑制效果一般，D-檸檬烯和莰烯的抑制效果顯著，檸檬醛和乙位菔烯的抑制效果極為明顯。又由圖3可知當這六種物質按照一定質量比混合時與檸檬精油的抑制效果相差不大，說明該幾種物質在檸檬精油抑制酪氨酸酶的過程中起著協同的作用，從而導致檸檬精油具有較強的抑制作用。
[0024]實施例4 檸檬精油對酪氨酸酶抑制作用的測定
本發(fā)明采用測定酪氨酸酶活性的方法來計算檸檬精油對酪氨酸酶活性的抑制能力，配制5mg/ml的檸檬精油溶液，用無水乙醇逐級稀釋成不同濃度，將不同濃度的檸檬精油30μ1與10μ1的酪氨酸酶液混合，30°C保溫15min后測定酶活力，測定時酪氨酸酶的活力為500U，底物L 一 DoPA濃度為2.5mM,底物中含相應濃度抑制劑檸檬精油。檸檬精油濃度與酪氨酸酶活力(用相應的抑制率表示)的關系如圖，4所示。由圖4可知酪氨酸酶活力被檸檬精油以濃度依賴的方式顯著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半時檸檬精油的濃度(IC5tl)為 194.572±9.72μ g /ml。
[0025]實施例5 檸檬精油對酪氨酸酶的抑制類型的研究為了評估朽1檬精油對酪氨酸酶抑制的類型，用Lineweaver — Burk雙倒數法作圖。本發(fā)明采用測定不同濃度檸檬精油對酪氨酸酶的抑制，檸檬精油的濃度分別為Oμg/ml (口)200μg/ml (.),500μg/ml (A)0當酪氨酸酶的加入量不變時，改變底物L-DOPA的濃度，其中L-DOPA的濃度選定為IMm，1.5mM, 2Mm, 2.5Mm.圖5中縱坐標V值代表在475nm波長每分鐘吸光值的變化，橫坐標代表底物[S]的濃度。圖中三條直線交于橫坐標的同一點說明朽1檬精油的抑制常數不變并且與縱坐標的交點逐漸增大說明反應速度不斷減少，從以上兩個特征可以看出檸檬精油對酪氨酸酶的抑制屬于可逆抑制中的非競爭性抑制。其中根據非競爭性抑制的公式l/V=Km/VmaX(l/[S])+l/VmaX得到以下三條直線的方程式見表1:
表1為不同濃度朽1檬精油的Lineweaver — Burk方程，Vmax和Km值
【權利要求】
1.檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用。
2.如權利要求1所述的檸檬精油作為酪氨酸酶抑制劑在祛斑化妝品中的應用，其特征在于:所述的檸檬精油在祛斑化妝品中的質量百分比1%~30%。
3.—種祛斑化妝品，其特征在于:含有檸檬精油，所述的檸檬精油在祛斑化妝品中的質量百分比1%~30%。
4.如權利要求3所述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，其特征在于由下列成分組成，各成分的質量百分比如下: 檸檬精油I~30% 液態(tài)油脂I~15% 司盤802~10% 吐溫802~20% 甘油5~15% 去離子水余量。
5.如權利要求3所述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，其特征在于由下列成分組成，各成分的質量百分比如下:檸檬精油1% 辛酸/癸酸三甘油酯1%吐溫802%司盤802%甘油5% 去離子水89%。
6.如權利要求3所述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，其特征在于由下列成分組成，各成分的質量百分比如下: 檸檬精油15% 鱷梨油7.5%吐溫806%司盤8011%甘油10% 去尚子水50.5% 如權利要求3所述的一種含檸檬精油祛斑化妝品，其特征在于由下列成分組成，各成分的質量百分比如下: 檸檬精油30%橄欖油15% 吐溫8010% 司盤8020%甘油15% 去離子水10%。
7.權利要求3所述的一種含檸檬精油祛斑化妝品的祛斑化妝品的制備方法，其特征在于:先將檸檬精油用油脂溶解， 然后加入司盤80和吐溫80攪拌均勻，混合為油相，再將甘油和去離子水混合作為水相，均質水相，將油相倒入水相中，均質5~20分鐘，均質速度15000~30000rpm，然后形成乳液，該乳液經轉速為300~1000rpm的機械攪拌10~30min，形成均勻乳 液。
【文檔編號】A61Q19/02GK103690427SQ201310673769
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權日:2013年12月12日
【發(fā)明者】張婉萍, 胡君姣, 劉曉慧, 繆玉蓮 申請人:上海應用技術學院