麥角硫因應(yīng)用于活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種麥角硫因的用途，是應(yīng)用于制備活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物，特別是經(jīng)由紫外線照射后的損傷細(xì)胞，以提高損傷細(xì)胞的抗氧化分子的表達(dá)及促進(jìn)Nrf2入核。
【專利說明】
麥角硫因應(yīng)用于活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種麥角硫因的用途，特別是麥角硫因應(yīng)用于活化細(xì)胞的Nrf2信號 通路的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫外線照射為人類生活中最常接觸的氧化刺激之一，過度曝曬甚至?xí)斐砂變?nèi) 障、皮膚癌等嚴(yán)重的疾病，即便不同人種對紫外線的容忍度不同，但只要日照量累積到極 限，就會造成人體的傷害。
[0003] 皮膚為人體最大的器官，為隔絕外來傷害的重要屏障，而紫外線照射過量為環(huán)境 所造成的皮膚損傷主因之一，形成紅斑或曬傷，長期暴露于紫外線下，會導(dǎo)致皮膚光老化生 成皺紋、松弛甚至形成皮膚癌。紫外線非肉眼可見，但所造成的傷害卻不容忽視。故對紫外 線造成的傷害預(yù)防以及治療是相當(dāng)重要的。
[0004] 紫外線照射會生成自由基，當(dāng)所產(chǎn)生的自由基無法和體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)維持恒定 狀態(tài)時，則會產(chǎn)生氧化壓力。已有研究證實，抗氧化物質(zhì)能夠清除體內(nèi)的自由基、減少氧化 壓力并且可以預(yù)防及治療疾病。日常所接觸的紫外線分為波長為320-400nm的UVA、波長 為280-320nm的UVB和波長為100-280nm的UVC，其中UVC波長較短，大部分被大氣層中的 臭氧層所隔離，僅有極少量到達(dá)地面，而UVA波長較長能量較低，雖然能量較低但穿透力較 UVB強(qiáng)，能夠深達(dá)真皮層造成急性和慢性傷害，使皮膚曬黑及降解膠原蛋白使皮膚老化形成 皺紋，且UVA為皮膚癌的主因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一方面涉及一種麥角硫因的用途，其是應(yīng)用于制備活化細(xì)胞的Nrf2信 號通路的藥物。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的一實施例，其中細(xì)胞包含正常細(xì)胞和損傷細(xì)胞，而上述損傷細(xì)胞是 經(jīng)由紫外線照射而產(chǎn)生的損傷，特別是波長為320至400nm的UVA。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，其中活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物抑制UVA刺激所 造成的細(xì)胞凋亡。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，其中活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物提升如酶型抗 氧化分子血紅素氧化酶（heme oxygenase-1 ;H0_1)、NAD(P)H:醌受體氧化還原酶（NAD(P) H:quinone acceptor oxidoreductase 1;NQ0_1)和谷胺酰半胱胺酸連接酶催化亞基 (Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)等的表達(dá)，或提升如谷脫甘肽 (Glutathione ;GSH)的非酶型抗氧化分子的表達(dá)。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施例，其中活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物促使Nrf2進(jìn)入 細(xì)胞核。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的再一實施例，其中活化損傷細(xì)胞的Nrf2信號通路的該藥物的有效 量為125至500nM。
[0011] 藉此，本發(fā)明實施例的麥角硫因能活化細(xì)胞的Nrf2信號通路，促進(jìn)Nrf2入核，以 提升酶型抗氧化分子及非酶型抗氧化分子的表達(dá)，且能抑制經(jīng)UVA刺激所造成的細(xì)胞凋 亡，適用于制備活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物，特別是經(jīng)由紫外線照射后的損傷細(xì)胞， 所制備的藥物僅需125至500nM即能達(dá)到有效劑量。
[0012] 上述
【發(fā)明內(nèi)容】
旨在提供本揭示內(nèi)容的簡化摘要，以使閱讀者對本公開內(nèi)容具備基 本的理解。此
【發(fā)明內(nèi)容】
并非本揭示內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實施例的 重要/關(guān)鍵組件或界定本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0013] 為了使本發(fā)明的上述和其它目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，提供附圖， 其中：
[0014] 圖1為麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞存活率影響。
[0015] 圖2為麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧物質(zhì)的影響。
[0016] 圖3為麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放的影響。
[0017] 圖4為麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的DNA損傷的影響。
[0018] 圖5為麥角硫因?qū)VA引發(fā)人類角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響。
[0019] 圖6為麥角硫因?qū)VA引發(fā)人類角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。
[0020] 圖7為麥角硫因?qū)θ祟惤琴|(zhì)細(xì)胞的Nrf2信號通路相關(guān)蛋白的影響。
[0021] 圖8為麥角硫因?qū)VA照射人類角質(zhì)細(xì)胞的Nrf2信號通路相關(guān)蛋白的影響。
[0022] 圖9 (A)和圖9 (B)部分為麥角硫因?qū)VA照射人類角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中 Nrf2的蛋白表達(dá)。
[0023] 圖10為麥角硫因?qū)VA照射人類角質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)谷胱甘肽含量的影響。
[0024] 圖11為麥角硫因?qū)RE轉(zhuǎn)錄活性的影響。
[0025] 圖12為麥角硫因誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)的抗氧化信號傳遞通路。
[0026] 圖13(A)為以siNrf2抑制Nrf2基因表達(dá)觀察麥角硫因?qū)rf2蛋白生成量的影 響；圖13(B)為以siNrf2抑制Nrf2基因表達(dá)觀察麥角硫因?qū)?xì)胞存活率的影響；圖13(C) 為以siNrf2抑制Nrf2基因表達(dá)觀察麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的活性氧化物質(zhì)生 成量的影響；圖13(D)為以siNrf2抑制Nrf2基因表達(dá)觀察麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì) 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響。
【具體實施方式】
[0027] 本說明書揭露內(nèi)容提出了麥角硫因的新穎用途，以人類角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞試驗，證 明麥角硫因能通過活化Nrf2信號通路，提升人類角質(zhì)細(xì)胞抗光氧化的能力，并進(jìn)一步驗證 麥角硫因能促進(jìn)Nrf2入核，以提升下游抗氧化基因的表達(dá)，且麥角硫因能抑制UVA刺激所 造成的細(xì)胞凋亡。
[0028] 本發(fā)明前述所稱的「麥角硫因」指Ergothioneine ;2_mercaptohistidine trimethylbetain，是一種稀有的氨基酸，僅會在某些細(xì)菌及真菌中形成，人體僅能由食物 來供應(yīng)而無法合成，主要是經(jīng)由食用菇的攝取。研究顯示麥角硫因具有輻射保護(hù)捕捉單線 態(tài)氧、羥自由基及脂質(zhì)過氧化自由基，并具抗發(fā)炎、抗致突變及保護(hù)神經(jīng)損傷作用，但于先 前研究中，需使用較高濃度如0. 5mM的麥角硫因方能達(dá)到其效用。
[0029] 本發(fā)明前述所稱的「Nrf2 (核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)」為一對氧化還原敏感（redox-sensitive)的轉(zhuǎn)錄因子， 會與抗氧化酶基因上的調(diào)控序列ARE (抗氧化應(yīng)答元件，antioxidant response element) 結(jié)合，以啟動下游抗氧化酶的基因表達(dá)。在一般生理情況下，Nrf2會與keap-1 (klech-like ECH-associated protein 1)在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，緊接著會被泛素化標(biāo)定進(jìn)而降解。Nrf2受 到活化后，和keap-Ι所形成的復(fù)合體即會降解，使Nrf2轉(zhuǎn)位入核，與小Maf形成異二聚體， 并接上ARE序列而提高啟動子轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促使下游的抗氧化基因表達(dá)。
[0030] 下文提出多個試驗例來說明本發(fā)明的某些方面，用以有利于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 中的技術(shù)人員可在不需過度解讀的情形下完整利用并實踐本發(fā)明，而不應(yīng)將這些試驗例視 為對本發(fā)明范圍的限制。
[0031] 第一部分：麥角硫因?qū)θ祟惼つw角質(zhì)細(xì)胞的抗光氧化能力
[0032] 試驗例1-1 :麥角硫因以及UVA對人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響
[0033] 為確定麥角硫因?qū)φ＜?xì)胞的安全性和安全劑量，以不同劑量的麥角硫因?qū)θ祟?角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT進(jìn)行細(xì)胞存活檢測。
[0034] 人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT培養(yǎng)于含10 %加熱去活化的胎牛血清（FBS)的細(xì)胞培養(yǎng) 液（Dulbecco, s modified Eagle's medium/high glucose)，置于 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。
[0035] 細(xì)胞存活率（cell viability)的測定是以細(xì)胞存活率分析（Method of transcriptional and translational assay ;MTT assay)進(jìn)行。將人類角質(zhì)細(xì)胞株 HaCaT 以IXlO5細(xì)胞/孔的密度接種于12孔盤，將細(xì)胞置于37°C、5% CO2培養(yǎng)至隔天細(xì)胞貼壁 后，分別加入濃度為0、125、250、500、10001^的麥角硫因，置于37°(：、5%〇) 2再培養(yǎng)24小時 后，以PBS清洗3次，接著照射15J/cm2UVA的后將PBS移除，加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4小時。 將細(xì)胞培養(yǎng)液移除后以PBS清洗3次，每個孔各加入450 yL的IX MTT試劑，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)2小時后，移除MTT試劑，再加入450 μ L異丙醇，以溶解MTT-formazan使溶 液顯色。取200 μ L混合溶液置于96孔盤中，以波長570nm吸光值測定。
[0036] 參照圖1(A)，圖為量化圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照 組相比ρ〈〇. 05，#表示與照射UVA組別相比ρ〈0. 05。結(jié)果顯示，試驗濃度為以125-1000 μ M 的麥角硫因預(yù)處理人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT 24小時后，以UVA劑量15J/cm2照射或未照射后， 培養(yǎng)4小時。濃度為125-500nM的麥角硫因都不具細(xì)胞毒性，而人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì) 胞照射UVA后，存活率相對于對照組降至46. 6%，隨著麥角硫因添加濃度增加，細(xì)胞存活率 具劑量依賴性的回復(fù)，在麥角硫因濃度為500nM時，細(xì)胞存活率回復(fù)到75. 5%。
[0037] 為探討不同劑量UVA對人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT的細(xì)胞存活率影響，以麥角硫因不 具細(xì)胞毒性的最高濃度500nM給予細(xì)胞24小時后，分別照射劑量為5、10、15J/cm 2的UVA， 以MTT試驗測定細(xì)胞存活率。
[0038] 參照圖I (B)，圖為量化圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3，*表示同一 UVA 照射劑量未添加及添加麥角硫因組別的間相比Ρ〈〇. 05。結(jié)果顯示，未添加麥角硫因照射的 UVA組別的細(xì)胞存活率，隨著UVA劑量的增加細(xì)胞存活率也隨之降低。當(dāng)照射UVA劑量15 J/ cm2時，對細(xì)胞毒性最強(qiáng)（IC50 = 15. 1)，而預(yù)先添加麥角硫因500ηΜ的組別，細(xì)胞的存活率 顯著提升。故以UVA 15J/cm2作為后續(xù)實驗的使用劑量。
[0039] 試驗例1-2 :麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)活性氧物種含量的影響
[0040] 照射UVA后，細(xì)胞會大量刺激活性氧物質(zhì)（Reactive oxygen species, R0S)生成， 為探討麥角硫因是否具有抑制ROS生成的能力以及本身是否會生成R0S，以2, 7-二氯熒光 素二乙酸鹽（2,7-dichlorofluorescein diacetate，H2DCF_DA)產(chǎn)生焚光來測量 ROS 的產(chǎn) 生，并以熒光顯微照相及ELISA測定的。
[0041] H2DCF-DA為脂溶性的熒光染劑，具有細(xì)胞膜通透性，與胞內(nèi)的 乙酰脂酶（esterase)結(jié)合形成不具熒光的2'，7' -二氯氫化熒光素 (2'，7' -dichl〇r〇flu〇resCin，DCFH)，進(jìn)而被H 2O2氧化形成具有熒光的2'，7' -二氯熒光 素（2'，7'-dichlorofluorescein, DCF)，并聚集在線粒體中，所發(fā)散焚光則可反映出細(xì)胞內(nèi) H2O2的濃度。
[0042] 將人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT以I X IO5細(xì)胞/孔的密度接種于12孔盤，將細(xì)胞置于 37°C、5% 0)2培養(yǎng)至隔天細(xì)胞貼壁后，加入500nM的麥角硫因再培養(yǎng)24小時后，以PBS清洗 3次，接著照射15J/cm 2UVA，照射完將PBS移除。每個孔各加入ImL濃度為10 μ M的氏00?-0八， 并以鋁箱紙包覆12孔盤，于培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)30分鐘。移除染劑，并以PBS清洗3次去除 多余染劑，于倒立式顯微鏡下拍照觀察其熒光強(qiáng)度。拍照后，每個孔加入500 μ L的0. 25% Triton-100反應(yīng)10分鐘，以打破細(xì)胞膜使其釋放出綠色熒光，取200 μ L的細(xì)胞液至96孔 黑色孔盤，以熒光光譜儀測定吸光值。
[0043] 參照圖2,（A)部分為熒光顯微鏡下ROS表達(dá)及細(xì)胞型態(tài)變化（200Χ)，（B)部分為 定量圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3，*表示與對照組相比ρ〈0. 05。結(jié)果顯示，單 獨添加500ηΜ麥角硫因不造成細(xì)胞表達(dá)ROS的影響。在單獨照射15J/cm2UVA的組別與未 添加麥角硫因及未照射UVA的對照組相比，熒光表達(dá)量明顯大量增加。而細(xì)胞預(yù)先處理麥 角硫因后，再照射15J/cm 2UVA刺激，其熒光表達(dá)量明顯下降，即可得知UVA刺激細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS可被麥角硫因所抑制。
[0044] 試驗例1-3 :麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷的影響
[0045] 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH)在正常生理狀態(tài)下存于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng) 細(xì)胞受到過量的活性氧化物質(zhì)攻擊時，會使細(xì)胞膜受損或破裂，原本存于細(xì)胞內(nèi)的LDH會 釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液。因此檢測LDH釋出量可觀察細(xì)胞膜的受損情形。
[0046] 將人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT以I X IO5細(xì)胞/孔的密度接種于12孔盤，將細(xì)胞置于 37°C、5% 0)2培養(yǎng)至隔天細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為0、125、250、500nM的麥角硫因，置于 37°C、5% CO2再培養(yǎng)24小時后，以PBS清洗3次，每個孔加入ImL不含F(xiàn)BS的無酚紅培養(yǎng) 液，接著照射15J/cm 2UVA的后，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時。取培養(yǎng)液于超高速離心機(jī)以 400 X g離心5分鐘，吸取50 μ L上清液至96孔盤中，每個孔加入50 μ L的受質(zhì)混合液，于室 溫避光反應(yīng)20分鐘后，每個孔再加入50 μ L終止液（IN HC1)以終止反應(yīng)，于波長490nm測 定吸光值。
[0047] 參照圖3,為麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放的影響，圖3為 量化圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3，*表示與對照組相比p〈0. 05，#表示與照射 UVA組別相比p〈0. 05。結(jié)果顯示，單獨照射15J/cm2UVA的組別與對照組相比，LDH釋出至培 養(yǎng)液的量有明顯的上升。而預(yù)先處理麥角硫因再照射15J/cm 2UVA的組別，LDH釋出的情形 有顯著降低。因此推測細(xì)胞前處理麥角硫因，可以抑制UVA刺激造成的細(xì)胞膜損傷。
[0048] 試驗例1-4 :麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)的DNA損傷的影響
[0049] 照射UVA會造成DNA的損傷，為探討麥角硫因?qū)τ赨VA所造成的DNA損傷的影響， 利用彗星電泳法（Comet assay)分析DNA的損傷。
[0050] 彗星電泳法是將細(xì)胞懸浮于洋菜凝膠中，在堿性環(huán)境中進(jìn)行DNA裂解，于電場中 進(jìn)行短時間的電泳，并用熒光染料染色，電泳運(yùn)行時，受損細(xì)胞其細(xì)胞核中會溢出DNA裂解 片段，此片段在電場中移動速度較無受損的細(xì)胞核快，會產(chǎn)生拖尾，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗 星式圖案。
[0051] 人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT先分別以濃度為125、250、500nM的麥角硫因處理24小時 后，照射15J/cm 2UVA，的后進(jìn)行彗星電泳法，并用紅色熒光染料染色，細(xì)胞若有破損會使DNA 形成分解片段，使細(xì)胞核顯現(xiàn)出一種慧星式的圖案，而正常無 DNA斷裂的細(xì)胞核在泳動時 保持圓球形。
[0052] 參照圖4和表一，為麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞的DNA損傷的影響，圖4為 熒光顯微鏡下所拍攝的表達(dá)（200X)，表一為DNA損傷程度，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土 SD值表示， η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05, #表示與照射UVA組別相比p〈0. 05。
[0053] 表一、DNA損傷程度
[0055] 由熒光顯微鏡所拍攝的結(jié)果，將細(xì)胞核DNA損傷依拖尾情形分為0-4級，級數(shù)越 高表DNA損傷越嚴(yán)重，并將不同組別所拍攝的結(jié)果，依據(jù)圖4的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，統(tǒng)計的結(jié)果 如表一所示。結(jié)果顯示，單獨照射15J/cm 2UVA后會造成細(xì)胞核DNA斷裂而尾部有拖尾的現(xiàn) 象，其評分分?jǐn)?shù)為356. 3±2. 1，而預(yù)先添加麥角硫因再照射UVA，可有效減少其拖尾的程度 以及數(shù)量，其評分分?jǐn)?shù)可降低至59. 0±7. 0,顯示麥角硫因可抑制了 DNA損傷情形，具有明 顯的保護(hù)效果。
[0056] 試驗例1-5 :麥角硫因?qū)VA引發(fā)的細(xì)胞凋亡的影響
[0057] 細(xì)胞凋亡會造成DNA斷裂產(chǎn)生片段，為探討麥角硫因?qū)τ赨VA所引發(fā)的細(xì)胞凋亡 的影響，利用DNA斷裂端標(biāo)記試驗（TUNEL assay)以及Western印跡法觀察Caspase-3、 Caspase-9、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)，分析由UVA所引發(fā)的細(xì)胞凋亡是否可經(jīng)由預(yù)先添加 麥角硫因改善。
[0058] 由于細(xì)胞萎縮的初期會使染色體DNA斷裂，而在DNA斷裂口（Nick)產(chǎn)生能被脫 氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)作用的大量 3' -OH末端，因斷裂而露出的3' -OH末端可與帶有熒光的三磷酸脫氧尿嘧啶（dUTP)結(jié)合，經(jīng) 過顯色之后，便可辨識細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
[0059] 人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT先以濃度為500nM的麥角硫因處理24小時后，照射15J/ Cm2UVA后再培養(yǎng)4小時，之后加入檢測細(xì)胞凋亡的TUNEL染劑，并以倒立式熒光顯微鏡觀察 和拍照。參照圖5,（A)部分為熒光顯微鏡下所拍攝的表達(dá)（200X)，（B)部分為定量圖，數(shù)據(jù) 結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3，*表示與對照組相比p〈0. 05。結(jié)果顯示，單獨照射15J/ Cm2UVA的組別相對于未照射UVA的對照組，所產(chǎn)生的熒光表達(dá)量明顯增加，而預(yù)先添加麥角 硫因再照射UVA的組別，熒光表達(dá)量相較于單獨照射UVA的組別明顯降低許多。
[0060] 另將人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT先分別以濃度為125、250、500nM的麥角硫因處理24 小時后，照射15J/cm 2UVA后再培養(yǎng)4小時，利用Western印跡法觀察Caspase-3、Caspase-9、 Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)。參照圖6,（A)部分為Western印跡法的結(jié)果，（B)部分為 Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)定量圖，（C)部分為Bax/Bcl-2比率定量圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以 平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05。結(jié)果顯示，單獨照射15J/cm2UVA的 組別相對于未照射UVA的對照組，Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)量以及Bax/Bcl-2比率 明顯增加。而預(yù)先添加麥角硫因再照射UVA的組別，相較于單獨照射UVA的組別，Caspase-3 和Caspase-9蛋白表達(dá)量以及Bax/Bcl-2比率，隨著麥角硫因濃度增加而減少。由上述結(jié) 果得知，預(yù)先給予人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT麥角硫因，可以減少UVA刺激所造成的細(xì)胞凋亡的 情況。
[0061] 第二部分：麥角硫因活化損傷細(xì)胞的Nrf2信號通路
[0062] 試驗例2-1 :麥角硫因?qū)θ祟惼つw角質(zhì)細(xì)胞的Nrf2信號通路相關(guān)蛋白的影響
[0063] 以Western印跡法觀察于人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT添加麥角硫因后，對Nrf2蛋白及 其下游蛋白的影響，檢測的下游蛋白為血基質(zhì)氧化酶（heme oxygenase-1 ;H0-1)、谷胱肽合 成酶催化亞甲基（y_glutamylcysteine ligase catalytic subunit ;y_GCLC)及醌氧化 酶（NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase 1;NQ0_1)。分別添加 125、250、500nM 麥 角硫因培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT I小時以及4小時后，收集蛋白。參照圖7,（A)部分為以 不同濃度的麥角硫因處理人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT 1小時后，取總蛋白質(zhì)觀察Nrf2和Keap-I 的表達(dá)量。（B)部分為以不同濃度的麥角硫因處理人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT 4小時后，取總 蛋白質(zhì)觀察H0-1、γ-GCLC和NQ0-1的表達(dá)量。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, * 表示與對照組相比Ρ〈〇. 05。結(jié)果顯示，細(xì)胞給予麥角硫因1小時后，其Nrf2蛋白表達(dá)量上 升，尤其當(dāng)麥角硫因濃度為500nM時，Nrf2蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。而給予麥角硫因4小時 后，受Nrf2轉(zhuǎn)錄因子所影響的下游蛋白H0-1、γ-GCLC與NQ0-1也可以觀察到增加的情形。 固可得知，麥角硫因通過Nrf2信號通路活化Nrf2轉(zhuǎn)錄因子。
[0064] 接著探討在照射UVA的情況的下，麥角硫因?qū)θ祟惤琴|(zhì)細(xì)胞株HaCaT的Nrf2及其 相關(guān)蛋白表達(dá)量的情形。先分別以125、250、500nM麥角硫因培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT 24 小時后，再照射15J/cm2UVA刺激人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT，照射后細(xì)胞再培養(yǎng)1小時以及4小 時后，收集蛋白，以Western印跡法觀察蛋白質(zhì)表達(dá)量。參照圖8,（A)部分為以UVA照射完 細(xì)胞培養(yǎng)1小時，取總蛋白質(zhì)觀察Nrf2和Keap-I的表達(dá)量，（B)部分為以UVA照射完細(xì)胞 培養(yǎng)4小時，取總蛋白質(zhì)HO-I、γ -GCLC和NQO-I的表達(dá)量。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表 示，η = 3, *表示與對照組相比ρ〈0. 05, #表示與照射UVA組別相比ρ〈0. 05。結(jié)果顯示，細(xì) 胞照射UVA后，Nrf2蛋白表達(dá)量有略微提尚，給予麥角硫因后表達(dá)量提升更尚，其下游抗氧 化基因 HO-I、GCLC與NQ0-1也隨的提升。
[0065] 試驗例2-2 :麥角硫因影響Nrf2入核的表達(dá)
[0066] 于試驗例2-1已知麥角硫因能活化Nrf2的表達(dá)，本試驗例接著進(jìn)一步探討麥角硫 因?qū)τ贜rf2入核表達(dá)的影響。預(yù)先添加麥角硫因培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞24小 時后，照射15J/cm 2UVA的后培養(yǎng)1小時，以Western印跡法觀察細(xì)胞核Nrf2蛋白及細(xì)胞質(zhì) Nrf2蛋白表達(dá)量，以及以免疫熒光染色檢測人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT的Nrf2表達(dá)情形。
[0067] 參照圖9,㈧部分為Western印跡法的結(jié)果，⑶部分為熒光顯微鏡下所拍攝的 表達(dá)（200X)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05。結(jié)果 顯示，單獨添加麥角硫因與對照組相比，其在細(xì)胞核中Nrf2的蛋白量略有上升。而比較對 照組與單獨照射UVA組，單獨照射UVA亦會使細(xì)胞核中Nrf2增加。而預(yù)先添加麥角硫因再 照射UVA刺激后的細(xì)胞，細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)量明顯增加，且較單獨添加麥角硫因以及 單獨照射UVA的組別表達(dá)量增加更多，同時細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2表達(dá)量相對于對照組也明顯降 低，給予人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞麥角硫因可以促使Nrf2從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，因此 而活化Nrf2-Keapl信號通路。而免疫熒光染色，以DAPI染劑顯示細(xì)胞核位置，綠色熒光標(biāo) 定Nrf2表達(dá)量以及位置。結(jié)果顯示單獨添加麥角硫因其Nrf2熒光表達(dá)量有略微增加，同 時已有少量Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，照射UVA后，Nrf2也有少量入核，而當(dāng)細(xì)胞預(yù)處理麥角硫因 的后再照射UVA，由熒光照相圖可以得知有大量Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。上述結(jié)果顯示麥角硫 因可以少量增加細(xì)胞中的Nrf2。當(dāng)受到外界壓力刺激的下，細(xì)胞本身保護(hù)機(jī)制會產(chǎn)生少量 Nrf2進(jìn)入核內(nèi)，而添加細(xì)胞給予麥角硫因后受到刺激，則會促使大量的Nrf2由細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn) 移至細(xì)胞核內(nèi)。
[0068] 試驗例2-3 :麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)的氧化傷害的影響
[0069] 谷胱甘肽（Glutathione，GSH)為動物細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑，可以保護(hù)DNA使其不受 外界壓力進(jìn)行氧化，于前述試驗結(jié)果，已知給予人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT麥角硫因后確實減 少了 DNA的損傷，本試驗例進(jìn)一步探討細(xì)胞受到UVA刺激以及給予麥角硫因?qū)SH含量的 影響，來評估UVA所造成的氧化損傷。
[0070] 谷胱甘肽氧化型（GSSG)為GSH的氧化形式，GSSG被谷胱甘肽還原 酶（GSH Reductase)還原成GSH，而GSH和5, 5' -二硫代-雙（硝基苯甲酸） (5, 5'-dithiobis-(2_nitrobenzoic acid, DTNB)反應(yīng)會產(chǎn)生黃色的 5-疏基 _2_ 硝基苯酸 (5-thi〇-2-nitrobenzoic acid, TNB)和GSTNB，兩個反應(yīng)合并起來GSSG+GSH為顏色產(chǎn)生的 限速因素，故GSSG+GSH的量和黃色產(chǎn)物TNB形成量呈正相關(guān)。因此透過吸光值測定即可以 得出總谷胱甘肽（GSSG+GSH)的量。
[0071] 將人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT種于10厘米培養(yǎng)盤，每盤細(xì)胞密度為IX IO6細(xì)胞/盤， 將細(xì)胞置于37°C、5 % 0)2培養(yǎng)至隔天細(xì)胞貼壁后，加入濃度為125、250、500nM的麥角硫因， 培養(yǎng)24小時后，以PBS清洗3次，接著照射15J/cm 2UVA后將PBS移除，加入細(xì)胞培養(yǎng)液再培 養(yǎng)4小時。收集細(xì)胞于I. 5mL微量離心管，以ImL MES緩沖液將細(xì)胞打散并用超音波震蕩 器打破細(xì)胞，以超高速離心機(jī)以10, OOOXg于4°C離心15分鐘并收集上清液，分別于96孔 盤中加入50mL/孔的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品上清液，并于每個孔加入150 μ L Assay Cocktail，于避 光環(huán)境反應(yīng)25分鐘，于波長405nm下測定吸光值并計算樣品中總GSH的含量。其中Assay Cocktail依下述比例預(yù)先配制好：8. 156mL MES緩沖液、0. 326mL輔因子混合物（cofactor mixture)、I. 522mL酶混合物、I. 667mL去離子水和0. 326mL DTNB混合均勻，液體總體積共 12mL〇
[0072] 參照圖10,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05， #表示與照射UVA組別相比p〈0. 05。結(jié)果顯示，照射UVA 15J/cm2后相對于對照組，GSH的 總含量有明顯減少，而隨著麥角硫因濃度的增加，GSH的總含量也隨之提高，證實麥角硫因 具有保護(hù)細(xì)胞的作用，可以維持細(xì)胞內(nèi)GSH的總含量，減少了氧化損傷。
[0073] 試驗例2-4 :麥角硫因?qū)寡趸皋D(zhuǎn)錄的影響
[0074] Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核后會和小Maf結(jié)合，并和ARE序列相接，提高啟動子的轉(zhuǎn)錄活 性，活化了 Nrf2_Keapl信號通路抗氧化防御體系。于前述試驗例確定給予人類角質(zhì)細(xì)胞 株HaCaT麥角硫因后，確實會促進(jìn)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，因此以熒光素酶報告基因檢測分析 (luciferase gene reporter assay)進(jìn)一步探討ARE序列是否會被啟動。將帶有ARE基因 和熒光素酶作為報導(dǎo)基因的質(zhì)體轉(zhuǎn)染送進(jìn)人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT，并以β -半乳糖苷酶作 為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，再利用Dual Light Kit(Applied Biosystems)測其焚光表達(dá)。
[0075] 參照圖11，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05。 結(jié)果顯示，給予人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT麥角硫因4小時后，其轉(zhuǎn)錄入細(xì)胞內(nèi)的ARE熒光素酶 活性（luciferase activity)表達(dá)量相對于對照組有明顯提升，證實給予麥角硫因后確實 使ARE啟動子的轉(zhuǎn)錄活性提高。
[0076] 試驗例2-5 :麥角硫因活化Nrf2信號通路探討
[0077] 根據(jù)前述試驗結(jié)果，已證明麥角硫因可以活化Nrf2使其下游抗氧化基因表達(dá)。接 著進(jìn)一步探討麥角硫因活化Nrf2的路徑，而已有研究證實，活化蛋白質(zhì)激酶ΜΑΡΚ、PI3K和 PKC路徑可以使Nrf2磷酸化，使Nrf2與Keapl分離而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)活化。
[0078] 人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT分別預(yù)先處理蛋白激酶抑制劑（p38抑制劑： SB20358020 μ M、ERK 抑制劑：PD9805920 μ M、JNK 抑制劑：SP60012520 μ Μ、PI3K 抑制劑： LY29400220 μ M、PKC 抑制劑：GF109203X 2. 5 μ m、ROS 抑制劑：NAC ImM) 30 分鐘后，添加 500nM的麥角硫因 1小時后，收取質(zhì)核蛋白，觀察Nrf2的入核表達(dá)。請參照圖12,數(shù)據(jù) 結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05,結(jié)果顯示，PI3K抑制劑 (LY294002)與PKC抑制劑（GF109203X)明顯抑制了 Nrf2的入核表達(dá)。
[0079] 試驗例2-6 :以siNrf2探討麥角硫因的保護(hù)機(jī)制和Nrf2的間的關(guān)系
[0080] Nrf2為重要的轉(zhuǎn)錄因子，下游抗氧化酶是經(jīng)由Nrf2轉(zhuǎn)錄基因所調(diào)控。為了證實麥 角硫因?qū)θ祟惤琴|(zhì)細(xì)胞株HaCaT的保護(hù)機(jī)制確實為透過Nrf2,本試驗例運(yùn)用RNA干擾技術(shù)， 使Nrf2基因沉默，并觀察給予麥角硫因后下游抗氧化基因的表達(dá)，以及麥角硫因的保護(hù)能 力是否會受到影響。
[0081] RNA干擾技術(shù)實驗步驟為，將人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT以4X IO5細(xì)胞/孔密度接種 于6孔盤，將細(xì)胞置于37°C、5% 0)2培養(yǎng)至隔天細(xì)胞貼壁后，移除原有細(xì)胞培養(yǎng)液后，每個 孔再加入ImL不含抗生素和FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液。利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, U. S. A.)將siNrf2和對照組siRNA分別轉(zhuǎn)染入人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT中，轉(zhuǎn)染反應(yīng)時間為4-6 小時。轉(zhuǎn)染反應(yīng)后以含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2-3次，更換成含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng) 液再培養(yǎng)細(xì)胞12-16小時。
[0082] 人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT處理siRNA后，添加 500nM麥角硫因培養(yǎng)細(xì)胞24小時，于 培養(yǎng)后1小時收取總蛋白質(zhì)，以Western印跡法觀察Nrf2蛋白的表達(dá)量，以及培養(yǎng)后4小 時收取總蛋白質(zhì)，以Western印跡法觀察H0-1、γ-GCLC和NQ0-1蛋白的表達(dá)量。參照圖 13(A)，結(jié)果顯示，給予人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT麥角硫因后，siNrf2與對照組siRNA組別的 Nrf2的表達(dá)量相比，有明顯的降低，證實了人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞內(nèi)的Nrf2基因確實 已被沉默，接著進(jìn)一步探討Nrf2下游的抗氧化基因，H0-UNQ0-1以及γ-GCLC也隨著Nrf2 不表達(dá)而沒有增加其蛋白表達(dá)量，即H0-UNQ0-1以及γ-GCLC抗氧化基因已不被活化。
[0083] 進(jìn)一步探討麥角硫因是否為通過Nrf2而具有對抗光氧化的能力。人類角質(zhì)細(xì)胞 株HaCaT處理siRNA后，添加500nM麥角硫因培養(yǎng)細(xì)胞24小時，照射或未照射15J/cm 2UVA， 再培養(yǎng)4小時后，以MTT測定細(xì)胞存活率，觀察麥角硫因在Nrf2基因沉默后是否仍具有保 護(hù)作用。參照圖13(B)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3，*表示與對照組相比p〈0. 05。 結(jié)果顯示，以對照組siRNA處理過的細(xì)胞，添加麥角硫因后仍可保護(hù)UVA所造成的細(xì)胞存活 率降低。而在siNrf2組別的部分，給予麥角硫因后其照射15J/cm 2UVA所造成的細(xì)胞存活 率降低則無法回復(fù)。
[0084] 接著測定人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT給予麥角硫因后照射15J/cm2UVA，其ROS的表達(dá) 量。人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT處理siRNA后，添加500nM麥角硫因培養(yǎng)細(xì)胞24小時，照射或 未照射15J/cm 2UVA，培養(yǎng)4小時后，再測定細(xì)胞內(nèi)ROS生成量。參照13圖（C)，數(shù)據(jù)結(jié)果以 平均值土SD值表示，η = 3, *表示與對照組相比p〈0. 05。結(jié)果顯示，于對照組siRNA的組 另IJ，給予麥角硫因后再照射UVA，其ROS表達(dá)量相對于未添加麥角硫因而單獨照射UVA的組 別有明顯降低，而siNrf2的組別，ROS熒光表達(dá)量卻并未降低，證實麥角硫因?qū)τ赨VA刺激 人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT誘導(dǎo)的ROS表達(dá)量降低的能力為透過Nrf2信號通路所調(diào)控。
[0085] 最后再以DNA斷裂端標(biāo)記試驗測定麥角硫因?qū)VA誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT產(chǎn) 生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的保護(hù)能力。參照圖13 (D)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值土SD值表示，η = 3, *表示 與對照組相比Ρ〈〇. 05。結(jié)果顯示，于對照組siRNA的組別，給予麥角硫因后再照射UVA，因 UVA所造成的細(xì)胞凋亡相對單獨照射UVA的組別有明顯降低，而siNrf2的組別，因 UVA所造 成的細(xì)胞凋亡未因添加麥角硫因而有所改善，證實麥角硫因?qū)τ谝种芔VA刺激所造成的細(xì) 胞凋亡的能力，為透過Nrf2信號通路所調(diào)控。
[0086] 根據(jù)上述，本發(fā)明實施例的麥角硫因能活化人類角質(zhì)細(xì)胞的Nrf2信號通路，并促 進(jìn)Nrf2入核，提升下游酶型抗氧化分子及非酶型抗氧化分子的表達(dá)，以提升人類角質(zhì)細(xì)胞 抗光氧化能力。故適用于制備活化細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物，以及制備抑制UVA刺激所 造成的細(xì)胞凋亡、提升酶型抗氧化分子表達(dá)、非酶型抗氧化分子表達(dá)和促進(jìn)Nrf2入核的藥 物，所制備的藥物僅需125至500nM即能達(dá)到有效劑量。
[0087] 雖然本發(fā)明已以實施方式揭露如上，然而其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技 術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作各種修改與改變，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍以 權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種麥角硫因的用途，其應(yīng)用于制備活化一細(xì)胞的Nrf2信號通路的藥物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麥角硫因的用途，其中該細(xì)胞包含正常細(xì)胞和損傷細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥角硫因的用途，其中該損傷細(xì)胞是經(jīng)由紫外線照射而產(chǎn)生的 損傷。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述麥角硫因的用途，其中該紫外線為波長為320至400nm的UVA。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麥角硫因的用途，其中活化該細(xì)胞的Nrf2信號通路的該藥物是 抑制UVA刺激所造成的細(xì)胞凋亡。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麥角硫因的用途，其中活化該細(xì)胞的Nrf2信號通路的該藥物是 提升酶型抗氧化分子的表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述麥角硫因的用途，其中該酶型抗氧化分子為血紅素氧化酶 HO-1、NAD(P)H:醌受體氧化還原酶NQO-1或谷胺酰半胱胺酸連接酶催化亞基GCLC。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麥角硫因的用途，其中活化該細(xì)胞的Nrf2信號通路的該藥物是 提升非酶型抗氧化分子的表達(dá)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述麥角硫因的用途，其中該非酶型抗氧化分子為谷胱甘肽GSH。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麥角硫因的用途，其中活化該細(xì)胞的Nrf2信號通路的該藥物 是促使Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麥角硫因的用途，其中活化該細(xì)胞的Nrf2信號通路的該藥物 的有效量為125nM至500nM。
【文檔編號】A61P17/16GK105982890SQ201510097792
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月5日
【發(fā)明人】許游章, 楊新玲
【申請人】中國醫(yī)藥大學(xué)