GnRH I型拮抗劑在抑制孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種GnRH I型拮抗劑在抑制孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。通過(guò)試驗(yàn)證明：GnRH I拮抗劑單獨(dú)使用或者與MPA聯(lián)合應(yīng)用，可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞尤其是孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且可以通過(guò)上調(diào)PR表達(dá)，抑制PI3K信號(hào)通路等機(jī)制，逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥，增加孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株對(duì)孕激素的敏感性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
GnRH I型括抗劑在抑制孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞増殖中的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及Gn畑I型括抗劑在抑制孕激素耐藥子宮內(nèi)膜 癌細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道Ξ大惡性腫瘤之一，占女性全身惡性腫瘤的7%，生殖道 惡性腫瘤的25~30%。近10~20年中子宮內(nèi)膜癌發(fā)生率約為上世紀(jì)70年代早期的兩倍，并 且發(fā)病具有年輕化趨勢(shì)。約75 %為早期，診斷時(shí)病變尚局限于子宮。
[0003] 子宮內(nèi)膜癌的治療，除了常規(guī)的手術(shù)治療、放療和化療W外，內(nèi)分泌治療也成為一 種重要的輔助治療手段。目前在國(guó)內(nèi)外內(nèi)分泌治療多被用于晚期、復(fù)發(fā)子宮內(nèi)膜癌患者W 及要求保留生育能力的早期子宮內(nèi)膜癌患者的治療中。臨床最常用的內(nèi)分泌治療藥物為孕 激素。但長(zhǎng)期孕激素治療可造成PR表達(dá)下調(diào)從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供Gn畑I型括抗劑的新用途。
[0005] 本發(fā)明提供了GnRH I型括抗劑在制備預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品中的應(yīng) 用。其中的子宮內(nèi)膜癌可W是無(wú)耐藥性的子宮內(nèi)膜癌，也可W是有耐藥性的子宮內(nèi)膜癌，耐 藥具體可為耐孕激素。
[0006] 本發(fā)明還提供了GnRH I型括抗劑在制備具有如下（1)-(5)中至少一種功能的產(chǎn)品 中的應(yīng)用：
[0007] (1)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素受體mRNA的表達(dá)；
[000引（2)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖；
[0009] (3)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AKT的憐酸化水平；
[0010] (4)抑審巧宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活；
[0011] (5)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的成瘤能力。
[0012] 上述應(yīng)用中，
[0013] 所述抑審巧宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的成瘤能力具體體現(xiàn)在減小子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞腫瘤體積 和/或降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞瘤體重量。
[0014] 上述應(yīng)用中，
[001引所述Gn畑I型括抗劑為西曲瑞克。
[0016] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌的物質(zhì)。
[0017] 本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌的物質(zhì)的活性成分為如下1)或2):
[001引 l)Gn畑I型括抗劑；
[0019] 2)由Gn畑I型括抗劑和醋酸甲地孕酬組成的組合物。
[0020] 上述物質(zhì)中
[0021] 所述Gn畑I型括抗劑為西曲瑞克。
[0022] 上述物質(zhì)中，
[0023] 所述2)中，所述Gn畑I型括抗劑和所述醋酸甲地孕酬的摩爾比為1:1。
[0024] 上述物質(zhì)在制備具有如下（1)-(6)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用：
[002引（1)預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌；
[0026] (2)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素受體mRNA的表達(dá)；
[0027] (3)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖；
[0028] (4)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AKT的憐酸化水平；
[0029] (5)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活；
[0030] (6)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的成瘤能力。
[0031 ]上述應(yīng)用或上述物質(zhì)或上述應(yīng)用中，所述子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞可W是無(wú)耐藥性的子宮 內(nèi)膜癌細(xì)胞，也可W是有耐藥性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，耐藥具體可為耐孕激素。所述子宮內(nèi)膜 癌細(xì)胞具體為孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。
[0032] 上述應(yīng)用或上述物質(zhì)或上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品或物質(zhì)為藥物。
[0033] 通過(guò)試驗(yàn)證明：GnRH I型括抗劑（西曲瑞克)單獨(dú)使用或者與MPA聯(lián)合應(yīng)用，可有效 抑制孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且GnRH I型括抗劑（西曲瑞克）與MPA聯(lián)合應(yīng)用的 抑制效果更明顯。Gn畑I型括抗劑(西曲瑞克)可W通過(guò)上調(diào)PR表達(dá)和抑制PI3K信號(hào)通路等 機(jī)制逆轉(zhuǎn)孕激素耐藥，增加孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株對(duì)孕激素的敏感性。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為Ce化orelix和T巧torelix-1 (培養(yǎng)基中含/不含MPA)對(duì)IsMkawa-MPA細(xì)胞增 殖的影響。圖1A為Ce化orelix和化ptorel ix-1 (培養(yǎng)基中含/不含MPA)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖 的影響（生長(zhǎng)曲線圖）；圖1B為Cetrorelix和Trptorelix-1(培養(yǎng)基中含/不含MPA)對(duì) Ishikawa-MPA細(xì)胞增殖的影響（生長(zhǎng)曲線圖）；圖1C為Cehorelix和T;rptorelix-l(培養(yǎng)基 中含/不含MPA)對(duì)兩種細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響（與生長(zhǎng)曲線圖相應(yīng)的柱狀圖）；圖1D為 Cetrorelix和Trptorelix-1 (培養(yǎng)基中含/不含MPA)對(duì)兩種細(xì)胞抑制率的比較。其中 Control為不含任何藥物組;Μ為加 MPA組;C為Cetrorel ix組;C+M為Cetrorel ix和MPA聯(lián)合用 藥組;T為T(mén)巧torelix-1組;T+M為T(mén)巧torelix-1和MPA聯(lián)合用藥組。
[0035] 圖2為裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線。其中，圖2A為IsMkawa細(xì)胞的裸鼠皮下移植 瘤的生長(zhǎng)曲線；圖2B為IsMkawa-MPA細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線；圖2C為不同藥物 處理后各細(xì)胞21天后的瘤體重量(*:P<0.05)。
[0036] 圖3為Gn畑括抗劑單獨(dú)或者聯(lián)合MPA使用對(duì)人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤的體積 的影響。
[0037] 圖4為Realtime-PCR檢測(cè)不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PR mRNA表達(dá)水平。圖4A為 Realtime-PCR(實(shí)時(shí)巧光定量PCR)檢測(cè)不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PR mRNA表達(dá)水平；圖4B為 Cehorelix和化ptorelix-1作用于Ishikawa-MPA細(xì)胞不同時(shí)間后，PR mRNA表達(dá)水平的變 化(與對(duì)照組相比*:?<〇. 05 ;**:?<0.01)。
[0038] 圖5為Gn畑括抗劑在不同時(shí)間作用IsMkawa-MPA細(xì)胞對(duì)P-AKT/AKT信號(hào)通路的影 響。其中，圖5A為Cetrorelix(lOyM)在不同時(shí)間作用Ishikawa-MPA細(xì)胞對(duì)P-AKT/AKT信號(hào)通 路的影響；圖5B為Τ巧tore 1 ix-1 (ΙΟμΜ)在不同時(shí)間作用Ishikawa-MPA細(xì)胞對(duì)ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ信 號(hào)通路的影響。
[0039] 圖 6 為Ce 化 orelix 和TYptorelix-l (培養(yǎng)基中含/不含 ΜΡΑ)對(duì) IsMkawa-MPA 細(xì)胞 30min后PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 下述實(shí)施例中的人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系Ishikawa( ISK)為高分化腺癌，ERa、β和PR 均為陽(yáng)性，來(lái)源于日本，在文獻(xiàn)"趙麗君，魏麗惠，李小平，王建六.促性腺激素釋放激素 I型 激動(dòng)劑和II型對(duì)不同ΡΤΕΝ基因表達(dá)狀態(tài)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用.中華婦產(chǎn)科雜志.2009，44 (1) : 45-49"中公開(kāi)過(guò)，由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室保存。
[0043] 下述實(shí)施例中的I sh i kawa-MPA細(xì)胞株(ISK-MPA)是前期誘導(dǎo)獲得PR表達(dá)下調(diào)的孕 激素耐藥Ishikawa細(xì)胞株、長(zhǎng)期培養(yǎng)于含ΜΡΑ(ΙΟμΜ)的DMEM-F12高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone 公司）中，在文獻(xiàn)"人子宮內(nèi)膜癌耐醋酸甲徑孕酬細(xì)胞株的建立，中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志， 2014,15(4)期:341-344"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京大學(xué)人民醫(yī)院獲得。
[0044] 下述實(shí)施例中的Gn畑I型括抗劑：西曲瑞克Ce化ore 1 ix(Cet)，其結(jié)構(gòu)式為:4(3-0- 化1 (2)-D曲e (4C1)-D-Pa 1 (3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pr〇-D-Ala-NH2;由上海紫域有限 公司合成。
[0045] 下述實(shí)施例中的GnRHn型括抗劑：TYptorelix-1 (?Υρ-1)，其結(jié)構(gòu)式為：Ac-D-化1 (2) -D陸e(4C1)-D-Pal (3)-Ser-Tyr-D-Cit-T巧-Tyr-Pr〇-D-Ala-NH2;由上海紫域有限公司 合成。
[0046] 下述實(shí)施例中的醋酸甲地孕酬(MPA)是青島國(guó)海生物制藥有限公司的產(chǎn)品;化學(xué) 名稱(chēng):6-甲基-17曰-徑基孕醬-4，6-二締-3，20-二酬17-醋酸醋；分子式：C2姐32〇4;分子量： 384.52。
[0047] 下述實(shí)施例中的Ce化orelix、化ptorelix-1和MPA，在使用時(shí)，均先用DMS0溶解成 10-2M的干液，再用完全培養(yǎng)基（含10%FBS的DMEM-F12高糖培養(yǎng)基）稀釋1000倍，使 Cetrorelix、T巧 torelix-1 或 MPA 的終濃度為 10-日Μ(10μΜ)。
[004引下述實(shí)施例中DMEM-F12高糖培養(yǎng)基是美國(guó)Hyclone公司的產(chǎn)品。
[0049] 實(shí)施例l、GnR田吉抗劑在抑制Ishikawa和Ishikawa-MPA細(xì)胞增殖中的應(yīng)用
[(K)加]本實(shí)施例中的細(xì)胞株:IsWkawa-MPA細(xì)胞和Ishikawa細(xì)胞。
[0化1 ] 本實(shí)施例中的GnR田吉抗劑：Cetrorelix和T巧torelix-1。
[005^ 1、鋪板
[0053] (1)待Ishikawa(ISK)和孕激素耐藥細(xì)胞株（ISK-MPA)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種 %孔板；
[0054] (2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶溶液(0.25g膜蛋白酶和0.02g抓TA溶解到100ml PBS溶液)分別消化處理步驟（1)中的各個(gè)細(xì)胞，再用含10 % FBS的DMEM-F12高糖培養(yǎng)基終止 消化，并吹打制成單細(xì)胞懸液，取1〇μ1單細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10 %FBS的DMEM- F12高糖培養(yǎng)基稀釋?zhuān)垢鱾€(gè)細(xì)胞的終濃度均為5000個(gè)/ml，每孔加入10化1;
[0055] (3)每種細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種7個(gè)96孔板；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔即空白組(僅加培養(yǎng) 基），邊孔加入滅菌PBS，W保證中間細(xì)胞的水分飽和;37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0056] (4)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁起計(jì)時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中隔天換液，分別于第1-7天每天終止一板， 用MTS法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。
[0化7] 2、藥物處理
[005引細(xì)胞接種后，培養(yǎng)2地，按照加入的藥物不同，分成如下六組：
[0059] 第一組(簡(jiǎn)稱(chēng)Control):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入DMS0,作為對(duì)照;使 DMS0在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的體積分?jǐn)?shù)均為0.1 %。
[0060] 第二組(簡(jiǎn)稱(chēng)M):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPA溶液(溶劑是DMS0，MPA 溶液濃度為ΙΟμΜ)，使MPA在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度為ΙΟμΜ;
[0061 ]第Ξ組(簡(jiǎn)稱(chēng)C):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Ce化orelix溶液(溶劑是 DMS0，Cetrorelix溶液濃度為ΙΟμΜ)，使Ce化orelix在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為10μ Μ；
[0062] 第四組（簡(jiǎn)稱(chēng)C+M):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPA溶液和Ce化orelix 溶液，使MPA和Cetrorel ix在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為ΙΟμΜ;
[0063] 第五組（簡(jiǎn)稱(chēng)Τ):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Trptorelix-1溶液，使 化ptorelix-1在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為ΙΟμΜ;
[0064] 第六組(簡(jiǎn)稱(chēng)Τ+Μ):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPA溶液和化ptorelix- 1溶液，MPA和Trptorelix-1在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為ΙΟμΜ。
[0065] 每種細(xì)胞設(shè)立5個(gè)平行對(duì)照，加藥后隔天換液，第1-7天分別取出一板，每孔加入 MTS溶液20μ1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(96孔酶標(biāo)儀)上測(cè)定各 孔吸光度值(〇〇490?)。
[0066] 3、IsWkawa-MPA細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果
[0067] 結(jié)果如圖1所示：?jiǎn)为?dú)使用MPA(M)對(duì)Ishikawa-MPA細(xì)胞增殖沒(méi)有抑制作用，對(duì) IsWkawa細(xì)胞增殖有抑制作用。Gn畑括抗劑Cet;rorelix(C)或Trptorelix-l(T)單獨(dú)使用可 抑制Ishikawa和Ishikawa-MPA細(xì)胞的增殖。在Ishikawa細(xì)胞中，Cet;rorelix(C)或 T巧torelix-l(T)單獨(dú)使用對(duì)細(xì)胞增殖的抑制比運(yùn)兩種藥物與MPA(M)聯(lián)用的抑制作用強(qiáng)(P <0.05)。而在Ishikawa-MPA細(xì)胞中，Cet;rorelix(C)和Trptorelix-l(T)與MPA(M)聯(lián)用運(yùn)種 抑制作用更強(qiáng)(P<0.05)，說(shuō)明Gn畑括抗劑可W使Ishikawa-MPA細(xì)胞恢復(fù)對(duì)孕激素的敏感 性，從到抑制細(xì)胞增殖。
[006引實(shí)施例2、GnR田吉抗劑在抑制裸鼠移植瘤中的應(yīng)用
[0069] -、實(shí)驗(yàn)材料
[0070] Ishikawa(ISK)、孕激素耐藥細(xì)胞株（IsMkawa-MPA)、受體動(dòng)物5-6周齡BALB/C遺 傳背景雌性裸鼠。
[0071] 二、裸鼠移植瘤模型的建立
[0072] 1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（13]1化日￥日、131111?1￥日-]\^7\)分別制備成單細(xì)胞 懸液（5X106個(gè)細(xì)胞懸浮于0.5ml的生理鹽水中），分別得到Ishikawa單細(xì)胞懸液和 Ishikawa-MPA單細(xì)胞懸液；
[0073] 2、于無(wú)菌條件下將步驟1制備的IsMkawa單細(xì)胞懸液和Ishikawa-MPA單細(xì)胞懸液 分別接種于5只5-6周齡BALB/C遺傳背景雌性裸鼠雙側(cè)前肢肩背部皮下（每種細(xì)胞接種5 只）；
[0074] 3、接種后10-20天100%成瘤，頸椎脫白致死，消毒操作部位皮膚，切開(kāi)皮膚，剝離 出瘤塊，置于平皿(平皿應(yīng)放在冰塊上，內(nèi)置少許滅菌的PBS)上，剔除非腫瘤組織和壞死組 織，選取生長(zhǎng)良好無(wú)壞死的紅色、魚(yú)肉狀瘤組織，并剪成2mm3小塊；
[0075] 4、將步驟3得到的瘤組織分別接種于5只5-6周齡BALB/C遺傳背景雌性裸鼠雙側(cè)前 肢肩背部皮下(共60只）。
[0076] 5、待瘤體體積約75mm3時(shí)，每種細(xì)胞成瘤的裸鼠被隨機(jī)分成如下6組(n = 5只/組） 進(jìn)行藥物治療處理(藥物處理方式為腹腔注射）：
[0077] 第一組(Con):空白溶劑(DMS0);
[007 引第二組(M):MPA(100mg/kg 體重）；
[00巧]第Ξ組（C) :Cetrorelix(100yg/只）；
[0080] 第四組(C+M) :MPA和Cetrorelix聯(lián)合治療組；
[0081] 第五組(T) :Τ巧torelix-l(100yg/只）；
[0082] 第六組(T+M) :MPA和T巧torelix-1聯(lián)合治療組；
[0083] 藥物處理具體方式如下:MPA通過(guò)MPA溶液(溶劑為DMS0，濃度為1 ΟμΜ)進(jìn)行處理，腹 腔注射20化1每周3次（共9次）；Ce化orelix與化ptorelix-1通過(guò)Ce化orelix溶液（溶劑為 DMS0,濃度為ΙΟμΜ)與Trptorelix-1溶液(溶劑為DMS0,濃度為ΙΟμΜ)每日腹腔注射200μ1 (共 21次）。對(duì)照組裸鼠只注射相同體積藥物溶劑。
[0084] 6、成瘤后每周2次測(cè)量腫瘤體積(體積計(jì)算公式= l/2ab2,其中，a、b分別為移植瘤 的長(zhǎng)、短徑）。腫瘤細(xì)胞自打藥后第21天處死裸鼠，取瘤測(cè)量Ξ組腫瘤平均體積、瘤重，采集 腫瘤標(biāo)本。清洗、固定。并在給藥過(guò)程中監(jiān)測(cè)裸鼠體重W評(píng)估藥物副作用。
[0085] Ξ、內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0086] 內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示:與只給藥物溶劑的對(duì)照組 (Con)相比，Ishikawa細(xì)胞移植瘤中說(shuō)且瘤體生長(zhǎng)最緩慢（圖2A)，Ishikawa-MPA細(xì)胞中，（C+ M)組抑瘤效果最明顯（圖2B)。
[0087] 不同給藥組的移植瘤大小和重量結(jié)果如圖2C所示：（C+M)組在孕激素耐藥子宮內(nèi) 膜癌細(xì)胞（Ishikawa-MPA)中的抑瘤效果最為顯著；Cetrorelix單獨(dú)用藥組（C)對(duì)Ishikawa 和13^43*3-1?4腫瘤體積抑制率為71%和38%，而瘤體重量分別減少為48%和25%。 Ce化orelix和MPA聯(lián)合用藥組（C+M)對(duì)IsMkawa和IsMkawa-MPA腫瘤體積抑制率為66%和 78%，瘤體重量分別減少46%和80%。說(shuō)明Cetrorelix和MPA聯(lián)合用藥可增強(qiáng)MPA的敏感性， 對(duì)于孕激素耐藥細(xì)胞(I sh i kawa-MPA)移植瘤抑制效果明顯。
[008引 Trptorelix-1單獨(dú)用藥組(T)對(duì)IsMkawa和Ishikawa-MPA腫瘤體積抑制率為32% 和27%，而瘤體重量分別減少為36%和16%。1'巧扣'611《-1和]\0^4聯(lián)合用藥組（了+]\〇對(duì) 13]114日￥日和131114日￥日-]\^7\腫瘤體積抑制率為62%和42%，而瘤體重量分別減少為41%和 40%。說(shuō)明Trptorelix-1和MPA聯(lián)合用藥可增強(qiáng)MPA的敏感性，對(duì)于孕激素耐藥細(xì)胞 (I sh i kawa-MPA)移植瘤抑制效果明顯。
[0089] 上述結(jié)果說(shuō)明Ce化orelix和化ptorelix-1均可W抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抑制子宮 內(nèi)膜癌細(xì)胞成瘤能力，且和MPA聯(lián)合用藥可增強(qiáng)MPA的敏感性，對(duì)于孕激素耐藥細(xì)胞 (I sh i kawa-MPA)移植瘤抑制效果更加明顯
[0090] 實(shí)施例3、GnR田吉抗劑對(duì)不同細(xì)胞株中PR mRNA和GnRHR mRNA表達(dá)水平的影響
[0091] 本實(shí)施例中所用的細(xì)胞株：IsMkawa(ISK)、孕激素耐藥細(xì)胞株（IsMkawa-MPA， ISK-MPA)。本實(shí)施例中所用的Gn畑括抗劑：Cetrorelix和T巧torelix-1。
[OOW] 1、鋪板
[0093] (1)待Ishikawa(ISK)和孕激素耐藥細(xì)胞株（ISK-MPA)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種 %孔板；
[0094] (2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶溶液(0.25g膜蛋白酶和0.02g抓TA溶解到100ml PBS溶液)分別消化處理步驟（1)中的各個(gè)細(xì)胞，再用含10 % FBS的DMEM-F12高糖培養(yǎng)基終止 消化，并吹打制成單細(xì)胞懸液，取1〇μ1單細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10 %FBS的DMEM- F12高糖培養(yǎng)基稀釋?zhuān)垢鱾€(gè)細(xì)胞的終濃度均為5000個(gè)/ml，每孔加入10化1;
[00M] (3)每種細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種7個(gè)96孔板；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔即空白組(僅加培養(yǎng) 基），邊孔加入滅菌PBS，W保證中間細(xì)胞的水分飽和;37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0096] (4)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁起計(jì)時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中隔天換液，分別于第1-7天每天終止一板， 用MTS法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。
[0097] 2、藥物處理
[0098] 細(xì)胞接種96孔板后，培養(yǎng)2地，按照藥物處理種類(lèi)的不同分成如下3組：
[0099] (1)向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Gn畑I型括抗劑Cetrore 1 iX(藥物的溶 劑是DMSO)，使Cetrorelix在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的終濃度均為10yM，DMS0在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的 體積分?jǐn)?shù)均為0.1 %。
[0100] (2)向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入GnRHΠ 型括抗劑化ptore 1 ix-1 (藥物的 溶劑是DMS0)，使化ptorelix-1在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的終濃度均為10yM，DMS0在細(xì)胞培養(yǎng)體系 中的體積分?jǐn)?shù)均為0.1 %。
[0101] (3)向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入DMS0，作為陰性對(duì)照Control)，使DMS0 在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的體積分?jǐn)?shù)均為0.1 %。
[0102] 3、生長(zhǎng)曲線測(cè)定
[0103] 兩種細(xì)胞Ishikawa(ISK)和孕激素耐藥細(xì)胞株(ISK-MPA)細(xì)胞分別接種96孔板后， 培養(yǎng)2地后按照上述步驟2的藥物處理方式加藥，培養(yǎng)過(guò)程中隔天更換含上述藥物的新鮮培 養(yǎng)液，分別于第1-7天每天終止一板，用MTS法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
[0104] 4、RT-PCR 檢測(cè)
[0105] RT-PCR檢測(cè)藥物處理后2地、4她、7化和96h后的I shikawa (ISK)和孕激素耐藥細(xì)胞 株(ISK-MPA)細(xì)胞中PR (孕激素受體)mRNA的表達(dá)水平。PR的PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物及內(nèi)參引物的 序列如表1所示，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如表2所示。
[0106] 表1、PCR 引物
[0107]
[010引表2、擴(kuò)增條件 始υ 5分鐘
[0W9]誦1秒 讀板 72心5分鐘 條解曲線從6(TC-92t：:，每0.2Γ讀…次板，每一 PCR反應(yīng)至少重復(fù)S次。
[0110] 5、RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果
[0111] 藥物處理前的PR mRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4A所示:從圖中可W看出， IsWkawa細(xì)胞中PR mRNA表達(dá)水平很高，而誘導(dǎo)獲得的Ishikawa-MPA細(xì)胞株的PR mRNA表達(dá) 水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Ishikawa細(xì)胞，說(shuō)明長(zhǎng)期孕激素誘導(dǎo)耐藥過(guò)程中子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PR下調(diào)；
[0112] 不同藥物Cetrorelix和化ptorelix-1對(duì)Ishikawa-MPA細(xì)胞處理不同時(shí)間后的RT- PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4B所不:從圖中可^看出，當(dāng)Cetrorelix和Trptorelix-1對(duì)Ishikawa-MPA 細(xì)胞作用后，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，PR mRNA表達(dá)水平逐漸升高，9化時(shí)顯著增高。
[0113] 實(shí)施例4、GnR田吉抗劑對(duì)Ishikawa-MPA細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響
[0114] 本實(shí)施例中的細(xì)胞株:IsWkawa(ISK)、孕激素耐藥細(xì)胞株(IsWkawa-MPA)。
[0115] 本實(shí)施例中的GnR田吉抗劑：Cetrorelix和T巧torelix-l。
[0116] 一、Ce1:;rorelix和TYptorelix-l不同作用時(shí)間對(duì)Ishikawa-MPA 細(xì)胞 AKT的憐酸化 水平的影響
[0117] 1、鋪板
[0118] (1)待Ishikawa(ISK)和孕激素耐藥細(xì)胞株（ISK-MPA)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種 9巧L板；
[0119] (2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶溶液(0.25g膜蛋白酶和0.02姐DTA溶解到100ml PBS溶液)分別消化處理步驟（1)中的各個(gè)細(xì)胞，再用含10 % FBS的DMEM-Fl 2高糖培養(yǎng)基終止 消化，并吹打制成單細(xì)胞懸液，取1〇μ1單細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10 %FBS的DMEM- F12高糖培養(yǎng)基稀釋?zhuān)垢鱾€(gè)細(xì)胞的終濃度均為5000個(gè)/ml，每孔加入10化1;
[0120] (3)每種細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種7個(gè)96孔板；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔即空白組(僅加培養(yǎng) 基），邊孔加入滅菌PBS，W保證中間細(xì)胞的水分飽和;37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0121] (4)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁起計(jì)時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中隔天換液，分別于第1-7天每天終止一板， 用MTS法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。
[0122] 2、藥物作用
[0123] 細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)2地后分別加入ΙΟμΜ的Ce化orelix和ΙΟμΜ的化ptorelix-1， 分別作用 〇、15111111、3〇111111、化、化、6}1和12}1。
[0124] 3、In cell Western方法檢測(cè)PI3K/AKT蛋白水平
[01巧]In cell Western方法檢測(cè)上述步驟2藥物處理后的各個(gè)細(xì)胞PI3K/AKT蛋白水平 的具體方法如下：
[0126] (1)去除培養(yǎng)基，迅速加入15化1的新鮮3.7%甲醒固定緩沖液固定細(xì)胞(加固定緩 沖液時(shí)，小屯、地用移液器沿管壁加入，避免使細(xì)胞脫落），免搖動(dòng)在室溫條件下解育20min。
[0127] (2)去除固定緩沖液，用化iton洗脫緩沖液分4次洗脫細(xì)胞，每次2(Κ)μ1，Κ保證可 W滲透細(xì)胞，（每次洗脫可在搖床上進(jìn)行，室溫條件下5min)
[012引（3)去除化iton洗脫緩沖液，每個(gè)孔小屯、地從管壁加入150μ1 5%脫脂奶粉封阻 液，在搖床上緩慢搖動(dòng)室溫下解育1.化。
[0129] (4)去除封阻液，每孔加入用封阻液稀釋鼠抗人ρΑΚΤ單抗和兔抗人ΑΚΤ單抗（1: 100)50ιι1，Κ50μ1的封阻液，作為由于近紅外染料標(biāo)記的二抗可能產(chǎn)生背景的對(duì)照。4°C不 搖動(dòng)解育過(guò)夜
[0130] (5)加入0.1%Tween洗脫液20化1，在室溫條件下緩慢搖動(dòng)，洗脫5min，重復(fù)4次W 上。
[0131] (6)每孔加入用封阻液稀釋的巧光二抗，羊抗兔IRDye?800(l:200)，羊抗鼠 I畑ye?680(l:800)各25ml充分混合后加入50ul，同時(shí)背景孔也加入50ul二抗。室溫下避光 緩慢搖動(dòng)，解育60min
[0132] (7)沿管壁加入Tween洗脫液，重復(fù)步驟E4次W上。
[0133] (8)洗脫結(jié)束之后，從孔內(nèi)完全去除洗脫液。翻轉(zhuǎn)微孔板底部朝上，在紙巾輕輕敲 打，去除殘留的洗脫液。
[0134] (9)用700nm和800nm兩個(gè)通道同時(shí)掃描，均選擇中等質(zhì)量、169皿的分辨率、3.0mm 的焦距、亮度為5。
[0135] PI3K/AKT蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示：Ishikawa-MPA細(xì)胞在Cetrorelix作用 15min后明顯抑制AKT的憐酸化水平，并在作用12小時(shí)內(nèi)無(wú)明顯改變（圖5A);IsMkawa-MPA 細(xì)胞在化ptorelix-1作用15min后則明顯激活ΑΚΤ的憐酸化水平并呈持續(xù)激動(dòng)狀態(tài)，12小時(shí) 后有所降低（圖5Β)。說(shuō)明Cetrorelix和化ptorelix-1均可W抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ΑΚΤ的憐 酸化水平。
[0136] 二、Cetrorelix 和 T巧 torelix-1 對(duì) Ishikawa-MPA細(xì)胞中 PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響
[0137] 1、鋪板
[0138] (1)待孕激素耐藥細(xì)胞株(ISK-MPA)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，接種96孔板；
[0139] (2)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的膜酶溶液(0.25g膜蛋白酶和0.02姐DTA溶解到100ml PBS溶液)分別消化處理步驟（1)中的各個(gè)細(xì)胞，再用含10 % FBS的DMEM-F12高糖培養(yǎng)基終止 消化，并吹打制成單細(xì)胞懸液，取1〇μ1單細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用含10 %FBS的DMEM- F12高糖培養(yǎng)基稀釋?zhuān)垢鱾€(gè)細(xì)胞的終濃度均為5000個(gè)/ml，每孔加入10化1;
[0140] (3)每種細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種7個(gè)96孔板；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔即空白組(僅加培養(yǎng) 基），邊孔加入滅菌PBS，W保證中間細(xì)胞的水分飽和;37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0141] (4)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁起計(jì)時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中隔天換液，分別于第1-7天每天終止一板， 用MTS法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。
[0142] 2、藥物作用
[0143] 將IsMkawa-MPA細(xì)胞W4X105個(gè)/ml的密度接種于96孔板中后，培養(yǎng)2地，分成W 下五組，每組中加入不同的藥物各作用30min:
[0144] 第一組(簡(jiǎn)稱(chēng)Control):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入DMS0,作為對(duì)照;使 DMS0在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的體積分?jǐn)?shù)均為01 %。
[0145] 第二組(簡(jiǎn)稱(chēng)M):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPA溶液(溶劑是DMS0，MPA 溶液濃度為ΙΟμΜ)，使MPA在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度為ΙΟμΜ;
[0146] 第Ξ組（簡(jiǎn)稱(chēng)C):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Ce化orelix溶液(溶劑是 DMS0，Cetrorelix溶液濃度為ΙΟμΜ)，使Ce化orelix在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為10μ Μ；
[0147] 第四組（簡(jiǎn)稱(chēng)C+M):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPA溶液和Ce化Orelix 溶液，使MPA和Cetrorel ix在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為ΙΟμΜ;
[0148] 第五組（簡(jiǎn)稱(chēng)Τ):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入Trptorelix-1溶液，使 化ptorelix-1在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為ΙΟμΜ;
[0149] 第六組(簡(jiǎn)稱(chēng)Τ+Μ):向步驟1中的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MPA溶液和化ptorelix- 1溶液，MPA和Trptorelix-1在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的濃度均為ΙΟμΜ。
[01加]3、Ιη Cell Western方法檢測(cè)ΡΙ3Κ/ΑΚΤ蛋白水平
[0151] 檢測(cè)方法同步驟一的3。
[0152] PI3K/AKT蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示:C組的IsMkawa-MPA細(xì)胞30min后抑制 ρΑΚΤ水平明顯高于Control組，且C+M組的IsMkawa-MPA細(xì)胞30min后抑制ρΑΚΤ水平明顯強(qiáng) 于C組，說(shuō)明Ce化orelix可W抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的ΡΙ3Κ/ΑΚΤ信號(hào)通路的激活，與ΜΡΑ聯(lián)用 后抑制效果更加更顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. GnRH I型拮抗劑在制備預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。 2. GnRH I型拮抗劑在制備具有如下（1)-(5)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用： (1) 促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素受體mRNA的表達(dá)； (2) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖； (3) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AKT的磷酸化水平； (4) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活； (5) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的成瘤能力。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述GnRH I型拮抗劑為西曲瑞克。4. 一種預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌的物質(zhì)，其活性成分為如下1)或2): DGnRH I型拮抗劑； 2)由GnRH I型拮抗劑和醋酸甲地孕酮組成的組合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其特征在于： 所述GnRH I型拮抗劑為西曲瑞克。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的物質(zhì)，其特征在于： 所述2)中，所述GnRH I型拮抗劑和所述醋酸甲地孕酮的摩爾比為1:1。7. 權(quán)利要求4-6中任一所述的物質(zhì)在制備具有如下（1)-(6)中至少一種功能的產(chǎn)品中 的應(yīng)用： (1) 預(yù)防和/或治療子宮內(nèi)膜癌； (2) 促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素受體mRNA的表達(dá)； (3) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖； (4) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AKT的磷酸化水平； (5) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活； (6) 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的成瘤能力。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求4-6中任一所述的物質(zhì)或權(quán)利要求7 所述的應(yīng)用，其特征在于:所述子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞為孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求4-6中任一所述的物質(zhì)或權(quán)利要求7 所述的應(yīng)用，其特征在于:所述產(chǎn)品或物質(zhì)為藥物。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105879032SQ201610191443
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年3月30日
【發(fā)明人】趙麗君, 魏麗惠, 李明珠, 李小平, 王建六
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)人民醫(yī)院