顆粒蛋白前體pgrn在治療膿毒癥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及PGRN新的藥物用途。
【背景技術(shù)】
[0002]膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，其病情兇險(xiǎn)，病死率高，且發(fā)病率呈不斷增長的趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有1800萬人發(fā)病。在美國，膿毒癥患者死亡率占住院患者的17%。而在中國，一項(xiàng)多中心的流行病學(xué)調(diào)查顯示ICU嚴(yán)重Sepsis的發(fā)生率是8.68%，死亡率高達(dá)44.7%。近年來，盡管抗感染治療和器官功能支持技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，Sepsis的病死率仍高達(dá)30%?70%，而在休克患者中其死亡率則高達(dá)70%?90% depsis治療花費(fèi)高，醫(yī)療資源消耗大，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量，已經(jīng)對(duì)人類健康造成巨大威脅。對(duì)此，歐洲重癥學(xué)會(huì)、美國重癥學(xué)會(huì)和國際膿毒癥論壇發(fā)起“拯救膿毒癥戰(zhàn)役” (surviving sepsis campain，SSC)，2002年歐美國家多個(gè)組織共同發(fā)起并簽署“巴塞羅那宣言”，并且進(jìn)一步制定基于對(duì)膿毒癥研究的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，不斷更新膿毒癥治療指南即SSC指南，以改進(jìn)Sepsis的治療措施，降低Sepsis的死亡率。
[0003]膿毒癥是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，與其他非感染因素引起的自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程以及病理機(jī)制均不同，膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展常引發(fā)多器官功能障礙綜合征，弓丨起多器官功能衰竭，是引起患者死亡的主要原因。
[0004]由于膿毒癥發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及感染、炎癥、免疫、凝血及組織損害等一系列生理病理過程。感染導(dǎo)致釋放的炎癥因子通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)調(diào)動(dòng)了全身多種細(xì)胞和多個(gè)臟器系統(tǒng)，構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，級(jí)聯(lián)放大，相互制約。因此臨床救治十分困難，目前尚缺乏有效的診治手段。目前的質(zhì)量方法是以抗菌治療和針對(duì)各系統(tǒng)改變的綜合治療為主，但仍然難以取得預(yù)期的效果，死亡率仍居高不下。鑒于膿毒癥是由感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其失控性的炎癥因子導(dǎo)致的免疫功能紊亂是導(dǎo)致患者多器官功能障礙而死亡的主要原因之一。
[0005]顆粒蛋白前體(Progranulin，PGRN)，也叫g(shù)ranulin/epithelin precursor ,proepithelin，acrogranin，或prostate cancer cell-derived growth factor，由GRN基因編碼。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于在膿毒癥復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，尋找到新的治療、診斷、預(yù)防靶點(diǎn)，對(duì)膿毒癥的防治帶來新的突破。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的:
[0008]顆粒蛋白前體(Progranulin，PGRN)在制備治療、診斷或預(yù)防膿毒癥藥物中的用途。
[0009]優(yōu)選地，顆粒蛋白前體(Pr ο gr anu 1 i η，PGRN)在制備治療、診斷或預(yù)防膿毒癥藥物中的用途，劑量為0.1-10g/kg。
[0010]本發(fā)明提供了顆粒蛋白前體(PGRN)在膿毒癥的治療、診斷、預(yù)防中的應(yīng)用，給予外源性的PGRN能夠?qū)δ摱景Y有顯著治療作用，可顯著提高其生存率。
[0011]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PGRN缺失導(dǎo)致機(jī)體清除細(xì)菌的能力減弱，脾臟淋巴細(xì)胞凋亡增加，并使肝肺腎等多器官炎癥損傷加重，通過給予外源性的PGRN蛋白，可以顯著提高小鼠的生存率。
【附圖說明】
[0012]圖1:膿毒癥患者血中PGRN檢測實(shí)驗(yàn):A為成年膿毒癥患者血標(biāo)本，B為兒童膿毒癥患者的血楽標(biāo)本。
[0013]圖2動(dòng)物膿毒癥模型中PGRN檢測實(shí)驗(yàn):A標(biāo)本為血清，B為腹腔灌溪液
[0014]圖3細(xì)菌載量實(shí)驗(yàn):A、B、C分別代表血、腹腔灌溪液和脾臟標(biāo)本
[0015]圖4各器官損傷的病理學(xué)檢測
[0016]圖5小鼠膿毒癥模型中脾臟的淋巴細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
[0017]圖6膿毒癥動(dòng)物模型的生存率檢測
[0018]圖7給予外源性的PGRN蛋白后生存率檢測。其中A實(shí)驗(yàn)對(duì)象為WT小鼠，B為PGRN—^一小鼠
[0019]圖8 CLP建模過程圖
圖9流式細(xì)胞術(shù)檢測PLF中的巨噬細(xì)胞結(jié)果圖10膿毒癥模型給予PGRN后生存率結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。
[0021 ] 實(shí)施例1
[0022]膿毒癥動(dòng)物模型的建立(盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)Cecal ligat1n and puncture,CLP)
[0023]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)所用小鼠為雄性，體重為18_22g，約6-8周齡。飼養(yǎng)在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF(Specific Pathogen Free)級(jí)實(shí)驗(yàn)室。該實(shí)驗(yàn)所用小鼠均為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。野生型C57BL/6小鼠(Wild type，WT)購買自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，C57BL/6背景來源的PGRN基因敲除小鼠(PGRN—Λ)購買自美國的The Jackson Laboratory。
[0024]方法:成年C57小鼠，以100微升1.5%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定于操作板，腹部用寵物電推剪剃毛，消毒皮膚，于腹正中做lcm長的切口，結(jié)扎盲腸，以26號(hào)注射器針頭穿刺，如圖8。最后縫合傷口，消毒皮膚。(具體參考:Daniel Rittirsch，Peter AWard ? et al.1mmunodesign of experimental sepsis by cecal ligat1n andpuncture.Nat Protoc.2009; 4(1): 31-36)。該建模方法是膿毒癥動(dòng)物模型的經(jīng)典建模方法，且該建模方法是目前研究膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型。
[0025]細(xì)菌載量的測定:
[0026]將小鼠建模24小時(shí)后，麻醉小鼠，固定，分別取腹腔灌洗液(Peritoneal lavagefluid，PLF)、心臟血和脾臟，將腹腔灌洗液和血做10倍系列稀釋后取100微升鋪板，脾臟先勻漿，然后做10倍系列稀釋后取100微升鋪板，18-24小時(shí)后計(jì)數(shù)血瓊脂平板上的菌落數(shù)。
[0027]結(jié)果如圖3所示，與WT小鼠相比，PGRN—Λ小鼠在建立膿毒癥模型后，其PLF，血液和脾臟中具有更高的細(xì)菌載量，其機(jī)體清除細(xì)菌的能力減弱，PGRN缺失不利于細(xì)菌清除。
[0028]各器官損傷的病理學(xué)檢測:
[0029]分別將WT小鼠和PGRN—Λ小鼠建膿毒癥模型，在6小時(shí)和24小時(shí)后將小鼠麻醉后處死，取肺、肝、脾、腎，于4%多聚甲醛中固定24-48小時(shí)，分別進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)HE染色后于顯微鏡下鏡檢。
[0030]結(jié)果如圖4所示，與WT相比，PGRNV—小鼠各器官損傷明顯加重，從病理切片可見明顯的炎癥加重，炎癥細(xì)胞浸潤，蛋白炎性滲出，組織充血水腫，細(xì)胞壞死等表現(xiàn)。以下幾個(gè)生化指標(biāo)反映的細(xì)胞損傷情況，其中ALT和AST是反映肝損傷的指標(biāo)，ALT和AST升高提示干細(xì)胞損傷嚴(yán)重。LDH是反映腎臟、肺臟和心肌損傷的指標(biāo)，LDH升高說明損傷較重。
[0031 ] 將WT小鼠和PGRN—Λ小鼠建模后，分別在6h和24h將小鼠麻醉后處死，取脾臟，經(jīng)4 %多聚甲醛固定24小時(shí)后，進(jìn)行脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片，然后用TUNEL法(DAB顯色)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖5所示:與WT小鼠相比，PGRNV—小鼠脾細(xì)胞凋亡顯著增加，且24小時(shí)比6小時(shí)更加明顯，PGRN缺失加劇了膿毒癥時(shí)淋巴細(xì)胞的凋亡。
[0032]生存率實(shí)驗(yàn):
[0033]將小鼠建膿毒癥模型，盲腸大部結(jié)扎，做重癥膿毒癥模型，觀察記錄小鼠的生存情況，每天觀察兩次，連續(xù)觀察2周，至小鼠不再死亡為止。
[0034]結(jié)果如圖6所示，與WT相比，PGRN—Λ小鼠生存率顯著降低。表現(xiàn)為PGRN—Λ小鼠在建立膿毒癥模型三天之內(nèi)全部死亡，生存率降為0，而WT小鼠在建立膿毒癥模型后仍能長期存活。說明PGRN缺失不利于小鼠在膿毒癥中的生存。
[0035]ELISA檢測樣本中的PGRN:結(jié)果如圖1和圖2所示，PGRN在膿毒癥的患者和動(dòng)物體內(nèi)均表達(dá)顯著升高。
[0036]外源PGRN對(duì)膿毒癥的治療效果:
[0037]PGRN(重組的小鼠PGRN蛋白(Recombinant Mouse Progranul in)購買自美國的R&D公司)
[0038]建模后2小時(shí)之內(nèi)經(jīng)腹腔給予建模小鼠注射20ygPGRN，然后將傷口縫合，消毒皮膚。觀察記錄小鼠的生存情況，每天觀察兩次，連續(xù)觀察2周，至小鼠不再死亡為止。
[0039]結(jié)果如圖7所示，建模后，無論是WT小鼠還是PGRN—Λ小鼠，給予外源性的PGRN均能顯著提高小鼠的生存率。
[0040]如圖7(A)，將WT小鼠分為三組，對(duì)照組(假手術(shù)組)、治療組(膿毒癥模型)和非治療組(膿毒癥模型)，從圖中可以看出，非治療組在建模后5天小鼠全部死亡，而PGRN治療組在建模10天后仍能保持大約50%的生存率。
[0041 ]如圖7(B)，用PGRNV—小鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)得出了一致的結(jié)果，即PGRN治療組在建模兩周后仍能保持大約50%的生存率，直至小鼠不在死亡。而非治療組的小鼠建模后最終全部死亡，生存率降為0。
[0042]以上兩組實(shí)驗(yàn)均說明PGRN對(duì)小鼠膿毒癥具有良好的治療效果。
[0043]PLF中巨噬細(xì)胞的檢測:
[0044]將WT小鼠和PGRN—/―小鼠建立膿毒癥模型，分別在6小時(shí)和24小時(shí)取PLF，以PE標(biāo)記的抗F4/80抗體和APC標(biāo)記的抗⑶1 lb抗體標(biāo)記細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測PLF中的巨噬細(xì)胞比例，結(jié)果如圖9所示。然后給予WT小鼠腹腔注射200μ1 Clophosome將小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞敲除掉之后，再建立膿毒癥模型，然后再給予PGRN治療，結(jié)果如圖10所示。
[0045]與WT小鼠相比，PGRN—/―小鼠在建模后，PLF中的巨噬細(xì)胞顯著減少，即PGRN—八小鼠募集巨嗤細(xì)胞的能力減弱。
[0046]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)PGRN作為藥物治療膿毒癥的作用，通過用WT小鼠和PGRN—Λ小鼠建模后細(xì)菌載量和生存率等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PGRN在膿毒癥中發(fā)揮作用的保護(hù)性作用，注入外源性的PGRN能夠?qū)δ摱景Y起到顯著的治療作用，明顯提高其生存率。該治療效果顯著客觀，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.顆粒蛋白前體在制備治療、診斷或預(yù)防膿毒癥藥物中的用途。2.顆粒蛋白前體在制備治療、診斷或預(yù)防膿毒癥藥物中的用途，劑量為0.1-10g/kg。
【專利摘要】本發(fā)明提供了顆粒蛋白前體（PGRN）在制備治療、診斷或預(yù)防膿毒癥的治療中的應(yīng)用，有效提高了膿毒癥的生存率。本發(fā)明為膿毒癥的診斷、治療、預(yù)防尋找到新的靶點(diǎn)，帶來新的技術(shù)突破。
【IPC分類】A61K38/18, A61P31/00, A61P31/04
【公開號(hào)】CN105457017
【申請?zhí)枴緾N201610017964
【發(fā)明人】曹炬, 尹一兵, 宋志新, 徐昉
【申請人】重慶醫(yī)科大學(xué), 曹炬
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月12日