專利名稱：Glp－1或類似物在中風治療中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過控制高血糖來降低中風后死亡率和發(fā)病率的方法和組合物。該方法和組合物特別可用于非胰島素依賴性糖尿病患者，他們面臨新的中風危險，或者具有進行性或復發(fā)性中風。既治愈已有的高血糖，也預防新出現(xiàn)的高血糖。
背景技術：
明顯的糖尿病患者或葡萄糖耐受性降低的患者的心血管疾病的發(fā)病率和死亡率高于沒有這些病癥的患者。糖尿病患者占因懷疑為心肌梗塞而收入冠狀醫(yī)療單位的患者總數(shù)的24％，而他們僅占總?cè)丝诘募s5％(Fuller，1993)。患有心肌梗塞的糖尿病患者的入院死亡率是非糖尿病患者的兩倍(Hamsten，1994，Malmberg and Ryden，1988)。糖尿病患者在急性發(fā)作后的恢復階段的發(fā)病率和死亡率都高于其它階段；這主要是由致命性再梗塞和充血性心力衰竭所引起的(Stone，1989，Karlson，1993，Barbash，1993)。盡管急性心肌梗塞后發(fā)病和死亡的發(fā)生率降低了，中風后糖尿病患者與非糖尿病患者之間的死亡率和發(fā)病率差異仍持續(xù)存在(Granger，1993，Grines，1993)。
糖尿病患者發(fā)生中風的危險已知也顯著升高了。男性非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)患者和NIDDM女性發(fā)生中風的危險分別比相應的非糖尿病患者高約三倍和五倍(Lehto，1966)。在芬蘭進行的另一項研究中，患有早期糖尿病的男性死于中風的危險升高了六倍，而發(fā)展為糖尿病的男性在隨訪過程中的相對危險為1.7。女性各自的相對危險為8.2和3.7(Tuomilehto，1996)。而且，另有研究證明，輕微的和未被確認的高血糖是急性中風的危險因素，與HbA1無關的血糖值升高患者的累積死亡率上升了，HbA1是反映長期血糖控制的數(shù)值(Gray，1987)。
其它研究也已證明了高血糖對中風后果的惡性影響(Cazzato，1991，Kiers，1992，deFalco，1993，Moulin，1997，Weir，1997)。中風過程中應激性激素反應強度顯著促進高血糖的形成(O’Neill，1992)，但是高血糖本身可能主要通過長時間的酸中毒而對局部缺血的腦代謝產(chǎn)生不利影響(Levine，1988，Wass and Lanier，1996)。
動物研究有力地支持這樣的觀點，高血糖顯著惡化中風過程中的腦損害，其原因是局部腦血流減少、明顯的水腫和腦干壓迫、梗塞面積增加、收縮期Ca2+水平增加、乳酸鹽蓄積、血腦屏障瓦解和出血增加(Duckrow，1985，1987，de Courten-Myers，1988，Slivka，1991，Araki，1992，Wagner，1992，Dietrich，1993，Broderick，1995)。
需要使血糖正常化和調(diào)節(jié)加劇糖尿病患者中風損害的代謝級聯(lián)的姑息措施。這可以采取適當輸注胰島素和葡萄糖，和急性期后通過皮下多次注射胰島素來嚴格控制血糖。后者方案在用于急性心肌梗塞過程中的糖尿病患者治療時，與除非認為必要而沒有接受胰島素治療的糖尿病患者對照組相比，心肌梗塞后一年內(nèi)的死亡率降低了30％(Malmberg，1995)。
不過，輸注胰島素產(chǎn)生低血糖的可能性，低血糖的定義是血糖低于0.3mM。低血糖增加心肌梗塞、室性心律失常的危險，是輸注胰島素的危險后果。人們研究了患有中風的糖尿病患者輸注胰島素的算法，以預防低血糖(Hendra，1992)。不過，按照這種算法，有21％的患者發(fā)展為低血糖。在另一項心肌梗塞后葡萄糖控制的研究中，在輸注胰島素和葡萄糖后，有18％的患者發(fā)展為低血糖(Malmberg，1994)。
輸注胰島素還需要頻繁監(jiān)測血糖水平，使低血糖的發(fā)生能夠盡可能快地檢測和矯正。在所述研究(Malmberg，1994)中接受胰島素輸注的患者中，至少每兩小時測量一次血糖，并相應調(diào)整輸注的速率。因此，胰島素-葡萄糖輸注療法的安全性和功效取決于血糖數(shù)據(jù)的簡易和快速獲得。這樣一種對監(jiān)測血糖的強烈需要給保健專家?guī)沓林刎摀?，增加了治療的難度和成本。其結果是，集約醫(yī)療單位經(jīng)常沒有為優(yōu)化糖尿病患者的血糖水平而分配資源，而這可以通過胰島素的靜脈內(nèi)給藥得以實現(xiàn)。鑒于胰島素輸注所固有的危險和負擔，需要另一種在糖尿病患者急性中風過程中控制血糖的替代方法。
腸降血糖素中的胰高血糖素樣肽1簡稱GLP-1，是從腸中胰高血糖素原加工得到的，它促進營養(yǎng)素誘發(fā)的胰島素釋放(Krcymann，1987)。GLP-1的各種截短形式已知可刺激胰島素的分泌(促胰島素作用)和cAMP的生成(例如參見Mojsov，1992)。已經(jīng)建立起對外源性GLP-1、即GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)酸給藥的促胰島素反應的各種體外實驗室實驗與哺乳動物、尤其是人之間的關系(例如參見Nauck，1993 a and b，Gutniak，1992，and Thorens，1993)。GLP-1(7-36)酰胺在生理學濃度下，通過刺激胰島素敏感性和促進葡萄糖誘發(fā)的胰島素釋放，對胰島素依賴性糖尿病患者發(fā)揮顯著的抗糖尿病發(fā)生作用(Gutniak，1992)。在對非胰島素依賴性糖尿病患者給藥時，GLP-1(7-36)酰胺刺激胰島素的釋放，降低胰高血糖素的分泌，抑制胃的排空，并促進葡萄糖的利用(Nauck，1993 a and b，Gutniak，1992)。
GLP-1型分子在糖尿病長期療法中的用途已經(jīng)受到阻礙，因為這種肽的血清半衰期相當短。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期僅有3至5分鐘。當皮下給藥時，GLP-1(7-36)酰胺的半衰期約為50分鐘。因此，這些GLP分子必須以連續(xù)輸液方式給藥，才能達到長期效果(Gutniak，1994)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于降低中風后死亡率和發(fā)病率的方法和組合物。該方法包括將來自GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物及其藥學上可接受的鹽的化合物在必要時對患者給藥，給藥劑量有效地使血糖正?；?。本發(fā)明提供糖尿病患者中風后的死亡率和發(fā)病率降低的有益效果，例如通過減小梗塞面積。本發(fā)明對非胰島素依賴者的治療與用胰島素和葡萄糖輸注的組合治療相比，避免不便又昂貴的頻繁的血糖監(jiān)測以及血糖結果的解釋和胰島素給藥速率的調(diào)整。該治療也避免曾經(jīng)伴隨胰島素輸注而發(fā)生的低血糖危險。本發(fā)明中，有些GLP-1的半衰期較短，但因此對連續(xù)給藥的需要并非是不利的，因為患者通常臥床在集約醫(yī)療單位中，流體可以連續(xù)地通過腸胃外方式給藥。該治療包括高血糖患者，與他們是否診斷為糖尿病無關。
附圖的簡要說明

圖1顯示連續(xù)輸注GLP-1(7-36)酰胺對五名NIDDM患者夜間平均血糖濃度(mM)的作用(----■----)。該圖也描繪連續(xù)輸注胰島素對相同五名NIDDM患者在不同夜間平均血糖濃度的作用(----○----)。
圖2顯示GLP-1(7-36)酰胺輸注對五名NIDDM患者平均血糖濃度(mM)的作用(----■----)，輸注是在白天進行的，從每餐開始持續(xù)三小時。該圖也描繪胰島素的皮下注射對相同五名NIDDM患者在另一天平均血糖濃度的作用(----○----)，注射時間為每餐之前。
發(fā)明的詳細說明方法和組合物、特別是采用胰高血糖素樣肽-1、其類似物或衍生物的藥物(藥物組合物或制劑)有效降低糖尿病患者、特別是非胰島素依賴性糖尿病患者中風后的死亡率和發(fā)病率?？捎糜趯嵤┌l(fā)明的GLP-1類似物和衍生物當對患者給藥時，具有長于GLP-1的半衰期和影響死亡率和發(fā)病率的能力。
中風中風或卒中或腦血管意外(CVA)是以非驚厥性和局灶性神經(jīng)病學虧缺的突然發(fā)作為特征的腦血管疾病。在美國，中風每年導致約200000人死亡以及神經(jīng)病學傷殘。在西方國家，局部缺血-梗塞導致約85-90％的中風，而在其余患者人群發(fā)現(xiàn)有顱內(nèi)出血。腦缺血是由持續(xù)幾秒鐘的血流減少所引起的。如果血流中斷持續(xù)幾分鐘以上，那么發(fā)展為腦組織梗塞。腦缺血和梗塞的最常見原因是伴有血栓栓塞和心原性栓塞的動脈粥樣硬化。局部缺血性中風在臨床上是以其發(fā)生模式和隨后的過程為特征的。關于這一點的證明是動脈粥樣硬化老齡組個體輕偏癱的急性發(fā)作。不過，任何腦機能障礙的癥狀都可能出現(xiàn)。頸動脈系統(tǒng)疾病的癥狀和征兆經(jīng)常影響中腦動脈的分布，患者可能表現(xiàn)為對側(cè)輕偏癱、偏側(cè)感覺虧缺和偏盲。當涉及優(yōu)勢大腦半球時，通常存在一定程度的失語。還可能涉及前(頸動脈)或后(椎底)循環(huán)，它或多或少地導致特殊的臨床癥狀。
對高血糖的定義是血漿葡萄糖濃度為約200mg/dl(11.1mmol/l)或以上，或者禁食的血漿葡萄糖水平為約125mg/dl(7.0mmol或以上)。本發(fā)明在一方面預防高血糖或者降低它到正常值。
化合物GLP-1類似物、衍生物、變體、前體和同系物都適合于實施發(fā)明，只要包括降低中風后死亡率或發(fā)病率的活性片段即可。
“GLP-1”指GLP-1(7-37)。本領域在習慣上，將GLP-1(7-37)的氨基末端標記為7，將羧基末端標記為37。GLP-1(7-37)的氨基酸序列是本領域所熟知的，不過為了讀者方便，也列在下面
NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-COOH“GLP-1類似物”的定義是與GLP-1相比經(jīng)過修飾的分子，包括一個或多個氨基酸的取代、缺失、錯位或增加。本領域已知的GLP-1類似物例如GLP-1(7-34)與GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。優(yōu)選的GLP-1類似物是GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，它們公開在美國專利No.5118666中，以及GLP-1(7-36)。這些化合物是具有促胰島素性質(zhì)的GLP-1的生物學加工形式。其它GLP-1類似物公開在美國專利No.5545618中。
“GLP-1衍生物”的定義是具有GLP-1或GLP-1類似物的氨基酸序列的分子，但是另外在其一個或多個氨基酸側(cè)鏈基團、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸根上具有至少一個化學修飾。化學修飾包括添加化學部分、產(chǎn)生新的鍵和除去化學部分。氨基酸側(cè)鏈基團上的修飾包括賴氨酸ε-氨基的?；?、精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷化、谷氨酸或天冬氨酸羧酸根的烷化和谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰氨基。末端氨基的修飾包括脫氨基、N-低級烷基、N-二低級烷基和N-酰基修飾。末端羧基的修飾包括酰胺、低級烷基酰胺、二烷基酰胺和低級烷基酯修飾。低級烷基是C1-C4烷基。此外，一個或多個側(cè)鏈基團或端基可以被蛋白質(zhì)化學領域的普通技術人員已知的保護基團保護起來。氨基酸的α-碳可以是一或二甲基化的。
本發(fā)明中，一組優(yōu)選用在本發(fā)明中的GLP-1類似物和衍生物由美國專利No.5545618所要求保護的各種GLP-1分子組成?；钚訥LP-1肽的有效類似物7-34、7-35、7-36和7-37在7-10位發(fā)生氨基酸的取代，和/或在C-端被截短，和/或在基本的肽中含有各種其它氨基酸的取代。在7和8位具有D-氨基酸取代和/或在7位具有N-烷化或N-?；被岬念愃莆锾貏e耐受體內(nèi)降解。
顯示胰島素刺激性質(zhì)增強的類似物具有天然GLP-1、7-34、7-35、7-36或7-37序列或其C-端酰胺，并具有至少一個選自下組的修飾(a)26和/或34位的中性氨基酸精氨酸或D型賴氨酸取代為賴氨酸，和/或36位的中性氨基酸賴氨酸或D型精氨酸取代為精氨酸；(b)31位的抗氧化氨基酸取代為色氨酸；(c)下列至少一個16位的Y取代為V；18位的K取代為S；21位的D取代為E；22位的S取代為G；23位的R取代為Q；24位的R取代為A；和26位的Q取代為K；(使用一個字母代表氨基酸)(d)包含下列至少一個的取代8位的另一個小分子中性氨基酸取代為A；9位的另一個酸性氨基酸或中性氨基酸取代為E；10位的另一個中性氨基酸取代為G；和15位的另一個酸性氨基酸取代為D；和(e)7位的另一個中性氨基酸或D型或N-酰化或烷化的組氨酸取代為組氨酸。
關于修飾(a)、(b)、(d)和(e)，取代的氨基酸可以是D型。7位被取代的氨基酸也可以是N-?；騈-烷化的形式。
與GLP-1(7-37)相比顯示血漿內(nèi)抗降解作用增強的肽適合于本發(fā)明的實施。這些類似物中，任意上述GLP-1(7-34)或GLP-1(7-37)的截短形式或其C-端酰氨化形式受到下列修飾(a)7位的D-中性或D-酸性氨基酸取代為H，或(b)8位的D-氨基酸取代為A，或(c)二者皆是，或(d)7位的N-酰化或N-烷化形式的任意天然來源氨基酸取代為H。
因此，耐受降解的類似物包括(N-?；?1-6C)AA)7GLP-1(7-37)和(N-烷基(1-6C)AA)7GLP-1(7-37)，其中當AA是賴氨酰殘基時，一個或兩個氮都可以是烷化或?；?，AA表征與胰島素刺激活性的保留一致的任意氨基酸。
關于7和8位的D-氨基酸取代，任意酸性或中性的D氨基酸殘基都可以用在7位，任意D氨基酸殘基都可以用在8位，并仍然與胰島素刺激活性一致。7和8位之一或二者都可以被D-氨基酸取代；7-位D-氨基酸還可以是酰化或烷化的。這些修飾形式不僅適用于GLP-1(7-37)，而且適用于截短的類似物。
因此，在優(yōu)選的類似物中，GLP-1的(7-34)、(7-35)或(7-37)形式是僅被這樣修飾的，26和/或34位的中性氨基酸精氨酸或D型賴氨酸取代為賴氨酸，和/或36位的中性氨基酸賴氨酸或D型精氨酸取代為精氨酸。特別優(yōu)選的是，在26和34位取代為賴氨酸的氨基酸選自由K+、G、S、A、L、I、Q、R、R+和M組成的組，在36位取代為精氨酸的氨基酸選自由K、K+、G、S、A、L、I、Q、M和R+組成的組(其中+表示D型)。
也是優(yōu)選的類似物中，唯一的修飾是31位的抗氧化氨基酸取代為色氨酸。特別有利的取代選自由F、V、L、I、A和Y組成的組。
在特別優(yōu)選的類似物中，22位的S取代為G，23和24位的R分別取代為Q和A，并且26位的Q取代為K，或者16位的Y取代為V，并且18位的K取代為S，或者這些取代加上21位的D取代為E。
在特別優(yōu)選的類似物中，在8位取代為丙氨酸的小分子中性氨基酸選自由S、S+、GC、C+、Sar、A+、β-ala和Aib組成的組；和/或在9位取代為谷氨酸的酸性或中性氨基酸選自由E+、D、D+、Cya、T、T+、N、N+、Q、Q+、Cit、MSO和乙酰-K組成的組；和/或在10位取代為甘氨酸的另一個中性氨基酸選自由S、S+、Y、Y+、T、T+、N、N+、Q、Q+、Cit、MSO、乙酰-K、F和F+組成的組；和/或15位的D取代為E。
也是優(yōu)選的類似物中，只有7位改變了。在優(yōu)選的取代中，在7位取代為組氨酸的氨基酸選自由H+、Y、Y+、F、F+、R、R+、Orn、Orn+、M、M+、N-甲酰-H、N-甲酰-H+、N-乙酰-H、N-乙酰-H+、N-異丙基-H、N-異丙基-H+、N-乙酰-K、N-乙酰-K+、P和P+組成的組。
除下列特殊的實施方式(類似物)之外，僅有兩類上述修飾形式的組合也是優(yōu)選的實施方式
(H+)7-GLP-1(7-37)；(Y)7-GLP-1(7-37)；(N-乙酰-H)7-GLP-1(7-37)；(N-異丙基-H)7-GLP-1(7-37)；(A+)8-GLP-1(7-37)；(E+)9-GLP-1(7-37)；(D)9-GLP-1(7-37)；(D+)9-GLP-1(7-37)；(F+)10-GLP-1(7-37)；(S)22(R)23(R)24(Q)26-GLP-1(7-37)；(S)8(Q)9(Y)16(K)18(D)21-GLP-1(7-37)。
優(yōu)選的穩(wěn)定性提高的類似物也僅有一個、或最多兩個氨基酸修飾。
優(yōu)選在7位的組氨酸取代包括D-型組氨酸的D-型酸性或中性氨基酸。優(yōu)選為P+、D+、E+、N+、Q+、L+、V+、I+和H+。
7位組氨酸或代替者(D或L)也可以是N-烷化(1-6C)或N-?；?1-6C)的。烷基是直鏈或支鏈(包括環(huán)狀)烴基，具有所示C數(shù)。?；鞘絉CO-?；?，其中R是烷基。優(yōu)選的烷基是t-丙基、α-丙基和乙基；優(yōu)選的?；且阴；捅；?yōu)選可以烷化或?；臍埢―或L型的P、D、E、N、Q、V、L、I、K和H。
優(yōu)選在8位取代為丙氨酸的是D-型P、V、L、I和A；也優(yōu)選為D-型D、E、N、Q、K、T、S和H。
有些特殊的類似物既顯示提高了的胰島素釋放刺激活性，也顯示提高了的穩(wěn)定性。
一組優(yōu)選用在本發(fā)明中的GLP-1類似物和衍生物由下式分子組成R1-X-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Z-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2及其藥學上可接受的鹽，其中R1選自由L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基-組氨酸和α-甲基-組氨酸組成的組；X選自由Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala組成的組；Y選自由Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly組成的組；Z選自由Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly組成的組；R2選自由NH2和Gly-OH組成的組；其前提條件是該化合物的等電點范圍從約6.0至約9.0，進一步的前提條件是若R1是His，X是Ala，Y是Glu，Z是Glu，則R2必須是NH2。
大量等電點在約6.0至約9.0范圍內(nèi)的GLP-1類似物和衍生物已被公開，例如包括GLP-1(7-36)NH2Gly8-GLP-1(7-36)NH2Gln9-GLP-1(7-37)D-Gln9-GLP-1(7-37)乙酰-Lys9-GLP-1(7-37)Thr9-GLP-1(7-37)D-Thr9-GLP-1(7-37)Asn9-GLP-1(7-37)D-Asn9-GLP-1(7-37)Ser22-Arg23-Arg24-Gln26-GLP-1(7-37)Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)Lys18-GLP-1(7-37)Arg23-GLP-1(7-37)Arg24-GLP-1(7-37)另一組優(yōu)選用在本發(fā)明的活性化合物公開在WO 91/11457(與U.S.5545618相關)中，包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，或其酰胺形式，及其藥學上可接受的鹽，具有至少一個包括如下所示的修飾(a)26位和/或34位的甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-賴氨酸取代為賴氨酸；或36位的甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸或D-精氨酸取代為精氨酸；(b)31位的抗氧化氨基酸取代為色氨酸；
(c)下列至少一個16位的酪氨酸取代為纈氨酸；18位的賴氨酸取代為絲氨酸；21位的天冬氨酸取代為谷氨酸；22位的絲氨酸取代為甘氨酸；23位的精氨酸取代為谷氨酰胺；24位的精氨酸取代為丙氨酸；和26位的谷氨酰胺取代為賴氨酸；和(d)下列至少一個8位的甘氨酸、絲氨酸或半胱氨酸取代為丙氨酸；9位的天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代為谷氨酸；10位的絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代為甘氨酸；15位的谷氨酸取代為天冬氨酸；和(e)7位的甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸、或D-型或N-?；蛲榛问降慕M氨酸取代為組氨酸；其中，在(a)、(b)、(d)和(e)的取代中，取代的氨基酸可以可選地是D-型，在7位被取代的氨基酸可以可選地是N-?；騈-烷化的形式。
因為二肽基-肽酶IV(DPP IV)可能負責所觀察到的GLP-1給藥后的快速體內(nèi)失活(Mentlein等，1993)，被保護不受DPP IV活性影響的GLP-1類似物和衍生物的給藥是優(yōu)選的，Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、α-甲基-Ala8-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH和Gly8-GLP-1(7-37)OH或其藥學上可接受的鹽的給藥是更優(yōu)選的。
美國專利No.5188666(‘666)所要求保護的分子在本發(fā)明中的用途也是優(yōu)選的。這樣一種分子包括具有下列氨基酸序列之一的肽NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-X其中X可以是Lys和Lys-Gly；或所述肽的衍生物，其中所述肽可以是所述肽的藥學上可接受的酸加成鹽；所述肽的藥學上可接受的羧酸鹽；所述肽的藥學上可接受的低級烷基酯；或所述肽的藥學上可接受的酰胺，選自由酰胺、低級烷基酰胺和低級二烷基酰胺組成的組。
‘666發(fā)明涉及肽片段，它是促胰島素的，可從天然來源的氨基酸序列衍生。這些片段適合于本發(fā)明的實施。本發(fā)明包含選自下組的化合物(A)包含下列序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X其中X選自由(a)Lys、(b)Lys-Gly、(c)Lys-Gly-Arg組成的組；(B)該肽的衍生物；其中該化合物基本上不含天然污染物，具有超過GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)的促胰島素活性。
本發(fā)明也包括選自下組的化合物(A)包含下列序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X其中X選自由(a)Lys、(b)Lys-Gly、(c)Lys-Gly-Arg組成的組；(B)該肽的衍生物；其中該化合物基本上不含天然污染物，在至少10-10M的濃度下具有促胰島素活性。
特別相關的是下式的肽(1)H2N-X-CO-R1其中R1是OH、OM或-NR2R3；M是藥學上可接受的陽離子或低級支鏈或非支鏈烷基；R2和R3是相同或不同的，選自由氫和低級支鏈或非支鏈烷基組成的組；
X是包含下列序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-ArgNH2是X的氨基末端的胺基；CO是X的羧基末端的羰基；(2)其酸加成鹽；和(3)其被保護或部分被保護的衍生物；其中所述化合物具有超過GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)的促胰島素活性。
另一組優(yōu)選用在本發(fā)明中的分子由美國專利No.5512549所要求保護的化合物組成，具有下列通式R1-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R3|R2及其藥學上可接受的鹽，其中R1可以是4-咪唑丙酰、4-咪唑乙?；?-咪唑-α，α-二甲基-乙酰；R2可以是C6-C10非支鏈酰基，或不存在；R3可以是Gly-OH或NH2；Xaa是Lys或Arg。
更優(yōu)選用在本發(fā)明中的化合物是其中Xaa是Arg且R2是C6-C10非支鏈?；哪切?br> 非常優(yōu)選用在本發(fā)明中的化合物是其中Xaa是Arg、R2是C6-C10非支鏈?；襌3是Gly-OH的那些。
更加非常優(yōu)選用在本發(fā)明中的化合物是其中Xaa是Arg、R2是C6-C10非支鏈酰基、R3是Gly-OH且R1是4-咪唑丙酰的那些。
最優(yōu)選用在本發(fā)明中的化合物是其中Xaa是Arg、R2是C8非支鏈?；?、R3是Gly-OH且R1是4-咪唑丙酰的那些。
美國專利No.5120712所要求保護的分子在本發(fā)明中的用途是非常優(yōu)選的。這樣一種分子包括具有下列氨基酸序列的肽NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH
和所述肽的衍生物，其中所述肽可以是所述肽的藥學上可接受的酸加成鹽；所述肽的藥學上可接受的羧酸鹽；所述肽的藥學上可接受的低級烷基酯；或所述肽的藥學上可接受的酰胺，其中該酰胺可以是酰胺、低級烷基酰胺或低級二烷基酰胺。
GLP-1(7-36)酰胺或其藥學上可接受的鹽在本發(fā)明中的用途是更加非常優(yōu)選的。GLP-1(7-36)酰胺的氨基酸序列為NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2Val8-GLP-1(7-37)OH或其藥學上可接受的鹽在本發(fā)明中的用途是更加非常優(yōu)選的。Val8-GLP-1(7-37)OH的氨基酸序列為NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH化合物的制備本發(fā)明所用活性化合物、即GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物或包括當外周給藥時有效降低中風后死亡率或發(fā)病率的活性片段的任何有關化合物的制備方法是熟知的，描述在美國專利Nos.5118666、5120712和5523549中。
本發(fā)明所用活性化合物的氨基酸部分或其前體是這樣制備的1)固相合成化學；2)從天然來源純化GLP分子；3)重組DNA技術；或4)這些方法的組合。
多肽的固相化學合成是本領域熟知的，可以在本領域的通行教材中找到，例如Dugas and Penney(1981)；Merrifield(1962)；Stewart and Young(1969，1984)。
例如，氨基酸部分可以通過固相方法學加以合成，并利用430A肽合成儀(PE-Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln CenterDrive，F(xiàn)oster City，CA 94404)和由PE-Applied Biosystems提供的合成循環(huán)。BOC-氨基酸和其它試劑在商業(yè)上可從PE-AppliedBiosystems和其它化學品供應商處獲得。采用雙偶聯(lián)方案的連續(xù)BOC化學適用于C-端羧酰胺的制備，從對甲基二苯甲基胺樹脂開始。關于C-端酸的制備，使用相應的PAM樹脂。使用預先生成的羥基苯并三唑酯偶聯(lián)Asn、Gln和Arg?？梢允褂孟铝袀?cè)鏈保護基團Arg甲苯磺?；鵄sp環(huán)己基Glu環(huán)己基Ser芐基Thr芐基Tyr4-溴芐酯基BOC去保護可以用三氟乙酸的二氯甲烷溶液實現(xiàn)。合成完成后，肽可以去保護，用含有10％間甲酚的無水氟化氫(HF)從樹脂裂解。側(cè)鏈保護基團的裂解和肽從樹脂的裂解在-5℃至5℃下進行，優(yōu)選在冰上進行60分鐘。除去HF后，肽/樹脂用乙醚洗滌，肽用冰乙酸萃取，冷凍干燥。
可以采用重組DNA技術領域普通技術人員熟知的工藝，制備本發(fā)明所用活性化合物。事實上，因為收率高，重組DNA法可以是優(yōu)選的。重組法生產(chǎn)的基本步驟是a)分離編碼本發(fā)明GLP-1分子的天然DNA序列或構建合成或半合成的編碼GLP-1分子序列的DNA，b)以適合于表達單獨的蛋白質(zhì)或融合蛋白的方式將編碼序列放入表達載體，c)用表達載體轉(zhuǎn)化適當?shù)恼婧松锘蛟松锏乃拗骷毎琩)在允許GLP-1分子表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，和e)回收和純化重組方式生產(chǎn)的GLP-1分子。
如前所述，編碼序列可以是完全合成的，也可以是對較大天然胰高血糖素-編碼DNA進行修飾的結果。編碼前胰高血糖素原的DNA序列是由Lund等(1982)提出的，可以用作本發(fā)明化合物的半合成生產(chǎn)原料，為達到所需結果而改變天然序列。
合成基因的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯導致GLP-1分子的產(chǎn)生，該基因可以用本領域熟知的工藝加以構建。由于遺傳密碼的天然簡并性，技術人員將認識到，可以構建相當大的而又數(shù)量一定的DNA序列，所有它們都編碼本發(fā)明的GLP-1分子。
合成基因構建體的方法學是本領域所熟知的(Brown等，1979)。利用遺傳密碼，從所需氨基酸序列設計DNA序列，這是普通生物學家易于確定的。一旦設計完成，序列本身可以利用常規(guī)的DNA合成儀器生成，例如380A或380B型DNA合成儀(PE-Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404)。
為了表達本發(fā)明所用化合物的氨基酸部分，利用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶，將工程合成的DNA序列插入很多適當?shù)闹亟MDNA表達載體中的任意一個(Maniatis等，1989)。將限制性內(nèi)切核酸酶裂解部位加工成編碼DNA的GLP-1分子的兩個末端之一，以促進從本領域熟知的擴增和表達載體分離和向該載體整合。所采用的特定的內(nèi)切核酸酶將受所采用的母體表達載體的限制性內(nèi)切核酸酶裂解模式的支配。選擇限制位點，以適當定向具有控制序列的編碼序列，從而實現(xiàn)適當?shù)哪康牡鞍踪|(zhì)的框架內(nèi)讀碼和表達。編碼序列必須定位在具有啟動子和表達載體的核糖體結合部位的適當閱讀框架內(nèi)，二者都在表達蛋白質(zhì)的宿主細胞中有功能。
為了實現(xiàn)合成基因的高效轉(zhuǎn)錄，必須將其與啟動子-操縱基因區(qū)有效連接。因此，將合成基因的啟動子-操縱基因區(qū)設置為與合成基因的ATG起始密碼子相同的序列方向。
各種可用于轉(zhuǎn)化原核生物和真核生物細胞的表達載體都是本領域所熟知的(Promega Catalogue，1992，Stratagene Catalogue，1992)。而且，美國專利No.4710473描述了可用于高水平在大腸埃希氏桿菌內(nèi)表達外源基因的環(huán)狀DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體。這些質(zhì)?？捎米髦亟MDNA程序中的轉(zhuǎn)化載體，并且(a)賦予質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)自主復制的能力；(b)賦予自主質(zhì)粒復制與溫度的關系，在該溫度下宿主細胞培養(yǎng)物得以維持；(c)穩(wěn)定宿主細胞種群內(nèi)質(zhì)粒的維持；(d)指導合成表示宿主細胞種群內(nèi)質(zhì)粒維持的蛋白質(zhì)產(chǎn)物；(e)提供系列單一限制性內(nèi)切核酸酶識別位點給質(zhì)粒；和(f)終止mRNA轉(zhuǎn)錄。
這些環(huán)狀DNA質(zhì)粒作為重組DNA程序中的載體，可用于保證高水平的外源基因表達。
在構建用于本發(fā)明所用化合物的氨基酸部分的表達載體之后，下一步是將該載體放入適合的細胞內(nèi)，從而構建可用于表達多肽的重組宿主細胞。用重組DNA載體轉(zhuǎn)化細胞的工藝是本領域所熟知的，可以在通行的參考文獻中找到，例如Maniatis等，出處同上。宿主細胞既可以從真核生物細胞、也可以從原核生物細胞加以構建。
原核生物宿主細胞一般產(chǎn)生更高比率的蛋白質(zhì)，也更容易培養(yǎng)。在高水平細菌表達系統(tǒng)內(nèi)被表達的蛋白質(zhì)特征性地聚集成顆粒或內(nèi)含體，其中含有高水平的超表達的蛋白質(zhì)。通常必須采用本領域熟知的工藝，對這種蛋白質(zhì)聚集物加以回收、溶解、變性和重折疊。(Kreuger等，1990；美國專利No.4923967)。
GLP-1類似物和衍生物的制備為生產(chǎn)所需的GLP-1類似物或GLP-1衍生物或其活性片段而對前體GLP-1或GLP-1氨基酸序列所作的改變是通過熟知方法進行的化學修飾、酶修飾或化學與酶修飾的組合。經(jīng)典的溶液相法和半合成法的工藝也可以用于制備本發(fā)明所用GLP-1分子。制備本發(fā)明GLP-1分子的方法是肽化學領域普通技術人員所熟知的。
向Lys34的ε-氨基加入?；?，這可以采用各種本領域已知方法的任意一種來實現(xiàn)(《生物軛合物化學》1990，Hashimoto等，1989)。
例如，使用50％乙腈的硼酸鹽緩沖溶液，可以向賴氨酰-s-胺加入辛酸的N-羥基-琥珀酰亞胺酯。肽可以在加入咪唑基之前或之后被酰化。此外，如果肽是用重組法制備的，那么在酶裂解之前的?；彩强赡艿?。而且，按照WO 96/29342的教導，GLP-1衍生物中的賴氨酸可以被酰化。
大量GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)分子的被保護、未保護與部分被保護的、天然與非天然的功能類似物和衍生物的存在和制備已被描述過(美國專利Nos.5120712；5545618和5118666；Orskov等，1989；WO 91/11457)。
可選地，GLP-1衍生物的氨基酸殘基的氨基和羧基末端可以被保護，或者可選地，僅有一個端基被保護。這類保護基團的生成和除去反應描述在本領域技術人員已知的著作中，例如包括《有機化學中的保護基團》1973，Green，1981和Schroder and Lubke，1965。代表性氨基-保護基團例如包括甲?；⒁阴；?、異丙基、丁氧基羰基、芴基甲氧基羰基、芐酯基等。代表性羧基-保護基團例如包括芐基酯、甲基酯、乙基酯、叔丁基酯、對硝基苯基酯等。
本發(fā)明所用羧基末端為低級烷基酯的GLP-1衍生物是這樣制備的，在催化性酸的存在下，例如鹽酸，使所需(C1-C4)烷醇與所需多肽反應。該烷基酯生成的適當條件包括反應溫度為約50℃，反應時間為約1小時至3小時。類似地，可以生成Asp和/或Glu殘基的烷基酯衍生物。
本發(fā)明所用化合物的羧酰胺衍生物例如按照Stewart等(1984)所述加以制備。
GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物的藥學上可接受的鹽形式可以用在本發(fā)明中。常用于生成酸加成鹽的酸是無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，和有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。這類鹽的例子包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏鱗酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1，6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥乙酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、扁桃酸鹽等。優(yōu)選的酸加成鹽是與無機酸生成的那些，例如鹽酸和氫溴酸。
堿加成鹽包括從無機堿衍生的那些，例如銨或堿金屬或堿土金屬的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。這類可用于制備本發(fā)明鹽的堿因此包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。鹽形式是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明所用GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物可以與一種或多種賦形劑制成制劑，再用在本發(fā)明中。例如，本發(fā)明所用活性化合物通過熟知方法可以與二價金屬陽離子配位化合。這類金屬陽離子例如包括Zn++、Mn++、Fe++、Co++、Cd++、Ni++等。
本發(fā)明組合物可選地，本發(fā)明所用活性化合物可以與藥學上可接受的緩沖劑結合，其pH調(diào)節(jié)在提供可接受的穩(wěn)定性的值，其pH是腸胃外給藥可接受的。
可選地，可以加入一種或多種藥學上可接受的抗微生物劑。間甲酚和苯酚是優(yōu)選的藥學上可接受的抗微生物劑?？梢约尤胍环N或多種藥學上可接受的鹽，以調(diào)節(jié)離子強度或緊張性?？梢约尤胍环N或多種賦形劑，以進一步調(diào)節(jié)制劑的等滲性。甘油是調(diào)節(jié)等滲性的賦形劑例子。
GLP-1受體和由與GLP-1受體結合的配體引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)描述在WO 96/25487；Thorens等，1993和Widmann等，1994中。GLP-1受體是具有七個跨膜域的膜蛋白，與雜三聚G-蛋白偶聯(lián)，后者連結與細胞內(nèi)第二信使的產(chǎn)生結合的配體對該受體的活化作用，細胞內(nèi)第二信使尤其是環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)。cAMP依次活化特異性蛋白激酶，即cAMP-依賴性蛋白激酶(蛋白激酶A，PKA)。該酶磷酸化某些基因啟動子區(qū)內(nèi)的大量關鍵響應元件。在胰腺β-細胞和其它神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中，受控制的分泌途徑的有些特異性蛋白的磷酸化作用通過刺激分泌性顆粒的胞吐作用而刺激肽的分泌。
有多種化合物已知刺激內(nèi)源性GLP-1的分泌。例如，使STC-1細胞與某些促分泌劑接觸，例如腺苷酸環(huán)化酶活化劑毛喉素或蛋白激酶-C-刺激劑12-O-十四烷酰phobol-13-乙酸酯(TPA)，導致GLP-1的釋放顯著增加(Abella等，1994)。STC-1細胞系來源于攜帶胰島素促進性致癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠腸腫瘤，STC-1細胞已知含有胰高血糖素原的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此產(chǎn)生GLP-1。其它化合物，例如促生長素抑制素、抑胃多肽、葡萄糖依賴性促胰島素肽、鈴蟾肽、降鈣素基因相關性肽、胃泌素釋放肽、膽堿等激動劑、β-腎上腺素能激動劑、異丙腎上腺素和蕈毒堿膽堿能激動劑氨基甲酰甲基膽堿，已知類似地導致內(nèi)源性GLP-1的釋放(Plarsancie等，1994，Orskov等，1986，Brubaker，1991，Buchon等，1987)。
組合物的給藥給藥可以由普通醫(yī)師通過任意已知有效的途徑進行，除非直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腸胃外給藥是特別由本發(fā)明所教導的或要求保護的途徑。外周腸胃外給藥是優(yōu)選的。腸胃外給藥在醫(yī)學文獻中一般被理解為將劑型通過無菌注射器或一些其他機械裝置(例如輸液泵)注射進入身體。出于本發(fā)明的目的，外周腸胃外途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥途徑。本發(fā)明所用化合物的靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下給藥途徑是更優(yōu)選的。本發(fā)明所用化合物的靜脈內(nèi)和皮下給藥途徑是更加非常優(yōu)選的。關于腸胃外給藥，本發(fā)明所用活性化合物優(yōu)選與適當pH的蒸餾水混合。
在本發(fā)明中用于降低死亡率和發(fā)病率的某些化合物也可以進行口服、直腸、經(jīng)鼻或下呼吸道途徑給藥，它們都是非腸胃外途徑。所述非腸胃外途徑中，下呼吸道途徑優(yōu)選用于本發(fā)明所用肽的給藥。各種用于通過下呼吸道給藥的肽化合物制劑公開在美國專利Nos.5284656和5364838中。WO 96/19197公報公開了適合于促進本發(fā)明所用化合物的下呼吸道吸收的各種肽的氣霧劑。口服給藥途徑是本發(fā)明所用化合物所優(yōu)選的。
可以采用另外的制藥方法來控制作用的持續(xù)時間。利用配位化合或吸附本發(fā)明所用活性化合物的聚合物可以實現(xiàn)控釋制劑。延長持續(xù)時間可以通過選擇適當?shù)拇蠓肿?，例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、亞乙基乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白，還可以通過選擇大分子的濃度，以及結合方法，目的是延長釋放。另一種延長控釋制劑作用持續(xù)時間的可能方法是將本發(fā)明所用活性化合物結合在聚合材料粒子內(nèi)，例如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或亞乙基乙酸乙烯酯共聚物?；蛘?，不將化合物結合在這些聚合粒子內(nèi)，而使本發(fā)明所用化合物包埋在微膠囊內(nèi)，其制備方法例如凝聚工藝或界面聚合，例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊，或者包埋在膠體藥物釋放系統(tǒng)內(nèi)，例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳狀液、納粒子和納膠囊，或者包埋在巨乳狀液內(nèi)。這樣的教導是本領域技術人員已知的，例如公開在《Remington’s藥物科學》1980中。
劑量對特定患者有效降低由中風引起的死亡率和發(fā)病率的GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物、或活性片段的劑量將取決于多種因素，其中包括患者的性別、體重和年齡、中風的嚴重性、中風的子類型、給藥途徑和生物利用度、所給藥的化合物在體內(nèi)的存留狀態(tài)、制劑和功效。若給藥是間歇性的，每次給藥劑量應當還要考慮兩劑之間的間隔和所給藥的化合物的生物利用度。若給藥是連續(xù)性的，適合的給藥速率在0.25與6pmol/kg/min之間，優(yōu)選從約0.5至約1.2pmol/kg/min。普通醫(yī)師在其技能范圍內(nèi)可用滴定法測量含有GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物、或其活性片段的組合物的給藥劑量和速率，以達到所需的臨床效果，即通過控制葡萄糖降低中風后的死亡率和發(fā)病率。在實施方式中，使血漿葡萄糖濃度降至約7mmol/l以下是急性中風后的治療目標。
“藥學上可接受的”指適合對人給藥的，也就是說，不含毒性成分、所不需要的污染物等，也不干擾活性化合物的活性。
大量等電點在4.8至7.5范圍內(nèi)的GLP-1類似物和衍生物已被公開，例如包括GLP-(7-36)NH2Gly8-GLP-1(7-36)NH2Gln9-GLP-1(7-37)中風的診斷“中風”的診斷涉及醫(yī)學判斷。治療也是本發(fā)明的主題，一般在中風的急性階段給予治療。
需要本發(fā)明所用化合物的患者處于中風的急性階段，也不能自主調(diào)節(jié)血糖?；颊卟荒茏灾髡{(diào)節(jié)血糖的條件是該患者(1)按照國家糖尿病數(shù)據(jù)組的定義(《糖尿病》1979)，以前被診斷為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)；(2)即使以前沒有被診斷為糖尿病，血糖水平也超過11mmol/升；或(3)葡萄糖耐受性異常。
GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物有效使患者血糖水平正?；膭┝繉⑷Q于多種因素，其中非限制性地包括患者的性別、體重和年齡、無力調(diào)節(jié)血糖的嚴重性、無力調(diào)節(jié)血糖的原因、是否同時將葡萄糖或另一種碳水化合物來源給藥、給藥途徑和生物利用度、體內(nèi)的存留狀態(tài)、制劑和功效。若給藥是連續(xù)性的，適合的給藥速率在0.25與6pmol/kg體重/min之間，優(yōu)選從約0.5至約1.2pmol/kg/min。若給藥是間歇性的，每次給藥劑量應當考慮兩劑之間的間隔、GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物的生物利用度、和實現(xiàn)正常血糖所需的濃度。普通醫(yī)師在其技能范圍內(nèi)可用滴定法測量GLP-1、GLP-1類似物或GLP-1衍生物的給藥劑量和速率，以達到所需的臨床效果。
實施例參照具體實施例，本發(fā)明將更加易于理解，提供實施例是為了闡述本發(fā)明的實施方式。
實施例1皮下輸注GLP-1(7-30)對NIDDM患者血糖的作用在夜間通過皮下輸注十小時將GLP-1(7-36)酰胺對五名非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)患者給藥，給藥速率為1.2pmol/kg/hr。作為對照，在不輸注GLP-1(7-36)酰胺的一天，將胰島素輸注給相同五名患者。胰島素輸注速率每隔兩小時進行調(diào)節(jié)，以達到最佳對照效果，和避免低血糖。表1和圖1數(shù)據(jù)證明，皮下輸注GLP-1(7-36)酰胺幾乎使所有患者的血糖正?；?，而不誘發(fā)低血糖。GLP-1(7-36)酰胺代謝控制好于用胰島素所達到的效果，在2300、000和100，GLP-1(7-36)酰胺治療的平均血糖水平低于對照，具有統(tǒng)計學顯著的差異。
表1在夜間用GLP-1(7-36)酰胺連續(xù)輸注十小時的五名NIDDM患者的平均血糖水平。在另一天用相同患者進行的對照研究中，將胰島素通過連續(xù)輸注方式給藥。
實施例2在進餐過程中皮下輸注GLP-1(7-36)對NIDDM患者血糖水平的作用在試驗當日的早餐、午餐和晚餐過程中向五名NIDDM患者輸注GLP-1(7-36)酰胺三小時。輸注時間為730-1030(早餐)、1030-130(午餐)和430-730(晚餐)，如圖2所示。在另一天對相同五名NIDDM患者進行的對照實驗中，在每餐開始前不久皮下注射胰島素，如圖2所示。在輸注GLP-1時，用胰島素注射所觀察到的膳食后葡萄糖游移消失了，正常血糖水平得以維持。每次GLP-1(7-36)酰胺輸注終止后血糖水平立即顯著升高。沒有觀察到GLP-1(7-36)酰胺的事與愿違的副作用。這些數(shù)據(jù)說明，GLP-1(7-36)酰胺輸注比胰島素注射更有效地控制膳食后葡萄糖水平，并且只要繼續(xù)GLP-1(7-36)酰胺的輸注，該控制作用是有效的。
表2用GLP-1(7-36)酰胺輸注三小時的五名NIDDM患者的平均血糖水平，輸注開始于每餐開始的時候。在另一天對相同患者所進行的對照研究中，在每餐前不久通過皮下注射將胰島素給藥。每餐開始于730、1030和1630。
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Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 6<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 6His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 7<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Gln<400> 7His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 8<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 8His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Thr Ser Lys Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 9<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 9His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 10<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，ArgD-Arg和Met<220><221> 變體<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<400> 10His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210> 11<211> 29<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<220><221> 變體<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<400> 11His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly20 25<210> 12<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<220><221> 變體<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，ArgD-Arg和Met<220><221> 變體<222> (30)..(30)<223> 30位的Xaa是Lys，D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Met和D-Arg<400> 12His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly Xaa Gly20 25 30<210> 13<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (10)..(10)<223> 10位的Xaa是Tyr或Val<220><221> 變體<222> (12)..(12)<223> 12位的Xaa是Lys或Ser<220><221> 變體<222> (15)..(15)<223> 15位的Xaa是Asp或Glu<220><221> 變體<222> (16)..(16)<223> 16位的Xaa是Ser或Gly<220><221> 變體<222> (17)..(17)<223> 17位的Xaa是Arg或Gln<220><221> 變體<222> (18)..(18)<223> 18位的Xaa是Arg或Ala<220><221> 變體<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是Gln或Lys<400> 13His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 14<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 14Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 15<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是N-乙基-His<400> 15Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 16<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是N-異丙基-His<400> 16Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 17<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (2)..(2)<223> 2位的Xaa是D-Ala<400> 17His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 18<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Glu<400> 18His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 19<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 19His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu PheIle Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 20<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Asp<400> 20His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 21<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (4)..(4)<223> 4位的Xaa是D-Phe<400> 21His Ala Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 22<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 22His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Ser1 5 10 15Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 23<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 23His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 24<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是His、D-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基組氨酸，β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基-組氨酸和α-甲基-組氨酸<220><221> 變體<222> (2)..(2)<223> 2位的Xaa是Ala，Gly，Val，Thr，Ile，和2-甲基-Ala<220><221> 變體<222> (15)..(15)<223> 15位的Xaa是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，和Gly<220><221> 變體<222> (21)..(21)<223> 21位的Xaa是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，和Gly<220><221> 變體<222> (31)..(31)<223> 31位的Xaa是Gly-OH或不存在<400> 24Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210> 25<211> 30<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 25His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210> 26<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是乙基-Lys<400> 26His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 27<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 27His Ala Thr Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 28<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Thr<400> 28His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 29<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 29His Ala Asn Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 30<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Asn<400> 30His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 31<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 31His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 32<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<400> 32His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 33<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是Lys和Lys-Gly<400> 33His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210> 34<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><22l> 變體<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是Lys，Lys-Gly，Lys-Gly-Arg<400> 34His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210> 35<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成構建體<220><221> 變體<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是4-咪唑丙酰、4-咪唑乙酰、4-咪唑-α或α-二甲基-乙酰<220><221> 變體<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是Lys或Arg<220><221> 變體<222> (31)..(31)<223> 31位的Xaa是Gly或不存在<400> 35Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30
權利要求
1.降低中風后死亡率和發(fā)病率的方法，包括在必要時將選自GLP-1、GLP-1類似物、GLP-1衍生物及其藥學上可接受的鹽的化合物對患者給藥，給藥劑量有效使血糖正常化。
2.權利要求1的方法，其中該化合物是靜脈內(nèi)給藥的。
3.權利要求1的方法，其中該化合物是皮下給藥的。
4.權利要求2或3的方法，其中該給藥是連續(xù)性的。
5.權利要求4的方法，其中該化合物的給藥速率在0.25與6pmol/kg/min之間。
6.權利要求5的方法，其中該化合物的給藥速率在0.5與2.4pmol/kg/min之間。
7.權利要求5的方法，其中所述的速率在約0.5與約1.2pmol/kg/min之間。
8.權利要求2的方法，其中該靜脈內(nèi)給藥是間歇性的。
9.權利要求2的方法，其中該化合物是靜脈內(nèi)給藥的，也通過另一種腸胃外途徑給藥。
10.權利要求9的方法，其中該其他腸胃外途徑是皮下途徑。
11.權利要求1的方法，其中所給藥的該化合物是GLP-1(7-36)酰胺或其藥學上可接受的鹽。
12.降低中風后死亡率和發(fā)病率的方法，包括將這樣的化合物給藥，該化合物通過與GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1衍生物在發(fā)揮它們的促胰島素活性時與之發(fā)生相互作用的相同受體發(fā)生相互作用，而發(fā)揮促胰島素活性。
13.降低中風后死亡率和發(fā)病率的方法，包括將這樣的化合物給藥，該化合物通過與GLP-1、GLP-1類似物和GLP-1衍生物與之發(fā)生相互作用以增強胰島素敏感性的相同受體發(fā)生相互作用，而增強胰島素敏感性。
全文摘要
本發(fā)明提供降低與中風有關的死亡率和發(fā)病率的方法。將GLP－1、GLP－1類似物或GLP－1衍生物以有效使血糖正?；膭┝拷o藥。
文檔編號A61P3/00GK1322137SQ99811307
公開日2001年11月14日 申請日期1999年9月22日 優(yōu)先權日1998年9月24日
發(fā)明者S·埃芬迪克 申請人:伊萊利利公司