專利名稱：羊、兔用免疫球蛋白注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用生物技術(shù)制備動物生物制品。
動物病毒性傳染病發(fā)病率與死亡率高達(dá)50-100％，疫苗對健康動物傳染病的預(yù)防是根本，但對臨床上一定比例發(fā)病群體的治療至今是一個難題。免疫球蛋白的精制與濃縮在國內(nèi)外僅限于微量或小型實(shí)驗(yàn)階段，多為單一抗病毒免疫球蛋白。規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化濃縮與精制抗多病免疫球蛋白的制作工藝，在國內(nèi)外幾乎無一家涉足。目前，國內(nèi)外濃縮、精制提取免疫球蛋白(Ig)主要采用①．離心法；②．鹽析沉淀法；③．分子篩法；④．有機(jī)物沉淀法，這四種方法均處于小中型試制階段。
本發(fā)明采用羊、兔病毒(菌)抗原，接種單蹄獸動物后，誘導(dǎo)其體液免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價免疫球蛋白(俗稱抗體或γ蛋白)。采取酶切技術(shù)切除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)中的Fc片段(無意義可結(jié)晶片段)，以防止對接種動物引起動物過敏性休克，保留其具有抗病毒與中和病毒的Fab片段(有意義病原結(jié)合片段)，通過鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術(shù)精制免疫球蛋白。因此，其制備免疫球蛋白的方法較以往的要簡單、快速、易于掌握，提取回收率理想，經(jīng)濟(jì)效益可觀，適于工業(yè)化制作。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1．制備免疫球膽蛋白所用的動物資源—關(guān)中大毛驢，較馬匹等其它動物有疫病少，抗病力強(qiáng)，易于圈養(yǎng)，產(chǎn)漿量大，每月采兩次血后，體質(zhì)容易恢復(fù)，易于舍飼，對動物的變態(tài)反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)，易于規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)生物制品。
2．本發(fā)明生物制品呈透明狀液體，免疫球蛋白含量可檢測、可量化。通過除菌器處理后，可在常溫(2-10℃)存放兩年，不析出、不沉淀、不變質(zhì)。
3．制備方法中采用酶切-鹽析法，使制劑中平均免疫球蛋白含量提高1-2倍左右，單位體積內(nèi)的效價穩(wěn)定。臨床療效顯著，患病動物通過三天救治，基本上可康復(fù)，無后遺癥，亦無毒副作用。對羊痘、羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊黑疫、羊蘭舌病等疫病的應(yīng)急預(yù)防與緊急治療，在發(fā)病初期，其治愈率達(dá)90％以上。對兔瘟(病毒性出血熱)、兔巴氏桿菌病、兔魏氏梭菌病疫病的應(yīng)急預(yù)防與緊急治療與肉兔、種兔的長途運(yùn)輸抗病劑，在發(fā)病初期，其治愈率達(dá)95％以上。
本發(fā)明的技術(shù)方案采用羊痘、羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊黑疫、羊蘭舌病等病毒抗原；兔瘟(病毒性出血熱)、兔巴氏桿菌、兔魏氏梭菌抗原，接種單蹄獸動物后，誘導(dǎo)其體液免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價免疫球蛋白(俗稱抗體或γ蛋白)。采取酶切技術(shù)切除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)中的Fc片段，以防止對接種動物引起動物過敏性休克，保留其具有抗病毒與中和病毒的Fab片段，通過鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術(shù)精制免疫球蛋白。
本發(fā)明在制備方法中提供了以酶切與鹽析相結(jié)合的新工藝，使單位體積內(nèi)的效價提高2倍，既避免了異源血漿的變態(tài)性反應(yīng)，又減少了提純過程中免疫球蛋白的丟失(回收量由原來的1500g／10000mL提高到1800g／10000ml)。
本發(fā)明在制備方法中提供了對免疫動物的基礎(chǔ)免疫與高度免疫的抗原組合比例配方(卡介苗／抗原10mg／30ml)，以及接種時機(jī)(基礎(chǔ)／強(qiáng)化／常規(guī)3／4／7)與采血時機(jī)(13天)，這對充分利用供漿動物，加大采血次數(shù)、減少原料投入有一定的意義。
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明制作免疫球蛋白針劑時，(1)．采用羊痘、羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊黑疫、羊蘭舌病等病毒(菌)抗原；(2)．兔瘟(病毒性出血熱)、兔巴氏桿菌病、兔魏氏梭菌病抗原，人工免疫接種關(guān)中大毛驢。
第一階段基礎(chǔ)免疫(6針)對檢疫合格的關(guān)中驢，方可免疫。免疫途徑為頸背皮下或肌肉注射，一般注射抗原6次，間隔時間為3-4天。第一次注射抗原全量的1／4；第二次注射全量的1／3；第三次注射全量的1／3；第四次注射全量的1／2；第五次注射全量的1／2；第六次注射全量。于第六次注射后14天試血，測定免疫球蛋白效價，供以后強(qiáng)化免疫時參考。
第二階段強(qiáng)化免疫(2針)一般注射抗原2次(抗原30毫升／頭·次)，間隔時間為3-4天。強(qiáng)化免疫后6-7天，即可大量采血(采血兩次)。采血的毛驢休息半月后，即可進(jìn)行下程常規(guī)高免。
常規(guī)高免(2針)一般注射2次(抗原30毫升／頭·次)，每次間隔9天(9±1天)。免疫結(jié)束的第六天進(jìn)行第一次采血，隔日進(jìn)行第二次采血。采血量為14-16ml／Kg體重，第二次采血較第一次減少約1／5，均由頸靜脈采血。待采取的血液沉淀形成澄清黃層后，收集吸取血漿。
免疫球蛋白(Ig)的提純將準(zhǔn)備精制提純的血漿混合于同一容器內(nèi)，按血清(血漿)量的2倍加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?moI／L鹽酸調(diào)整PH值為3．3-3．4，然后按總量每毫升加入6-9個活力的胃蛋白酶和0．2％的甲苯，攪拌均勻，以水浴加溫30℃±1℃消化2小時。消化期間提純的血漿要不斷攪拌。消化完畢后血漿按總量加入15％的硫酸銨，溶解后用2N NaOH溶液調(diào)整PH值為5．3-5．4，用水法加溫，以每分鐘升1℃為宜，并不斷攪拌直至升到57-58℃時，再攪拌30min，靜置30min，待血漿冷卻至45℃以下時進(jìn)行下一步工藝處理。
第一次沉淀濾過，將上述液體用濾布在濾槽內(nèi)過濾，直至清亮，收集濾液，棄去沉淀物。二次沉淀，收集首次沉淀的濾液，用2N NaOH溶液調(diào)整PH值至7．2-7．3，按總量加入21％的硫酸銨，充分?jǐn)嚢?，溶解后靜置30min，然后用25支純棉濾布在不銹鋼濾槽內(nèi)過濾，收集沉淀，棄去濾液。
將收集的沉淀壓干，稱重，裝入透析袋內(nèi)，每袋約裝200-250g，放置流水槽內(nèi)透析24-72小時。收集袋內(nèi)免疫球蛋白，按180mg／mL稀釋，并按總量加入0．5％氯仿，0．85％氯化鈉和0．5％硫酸慶大霉素粉，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，?N NaOH溶液矯正PH為6．6-6．8。置5-15℃靜置沉淀48小時，最后以正壓形式用直徑為0．3um硝酸纖維微孔濾膜除菌過濾，所得濾液經(jīng)半成品檢驗(yàn)合格后即可組批分裝。經(jīng)成品檢驗(yàn)合格后即可。
權(quán)利要求
1．羊、兔用免疫球蛋白注射液，其特征是采用羊、兔病毒(菌)抗原，接種單蹄獸動物后，誘導(dǎo)其體液免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價免疫球蛋白(俗稱抗體或γ蛋白)，酶切切除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)中的Fc片段，保留其具有抗病毒與中和病毒的Fab片段，通過鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術(shù)精制免疫球蛋白。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊、兔用免疫球蛋白注射液，其特征是在制備方法中，提供了以酶切與鹽析相結(jié)合的新工藝(酶切→熱處理→鹽析→純化)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的羊、兔用免疫球蛋白注射液，其特征是在制備方法中，還提供了對免疫動物的基礎(chǔ)免疫與高度免疫的抗原比例配方(卡介苗／抗原10mg／30ml)，以及接種時機(jī)基礎(chǔ)／強(qiáng)化／常規(guī)3／4／7)與采血時機(jī)(13天)。
全文摘要
羊、兔用免疫球蛋白注射液,涉及應(yīng)用生物技術(shù)制備動物生物制品,其技術(shù)特征是:采用羊、兔病毒(菌)抗原接種單蹄獸動物后,誘導(dǎo)其體液免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高效價免疫球蛋白,通過酶切、鹽析、濾過、壓干、透析等生物技術(shù)精制免疫球蛋白,使免疫球蛋白的濃縮與精制工藝規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化,對羊、兔等疫病的應(yīng)急預(yù)防與緊急治療,在發(fā)病初期,其治愈率達(dá)90%以上。
文檔編號A61K39/395GK1281732SQ9911086
公開日2001年1月31日 申請日期1999年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月22日
發(fā)明者李六金 申請人:李六金