專利名稱：：使皮膚增白的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總的來說涉及用于在對象皮膚上局部使用的脫色素或皮膚增白組合物，以及其使用方法。人的皮膚顏色是由在所謂黑素細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞種群中進(jìn)行的一系列復(fù)雜的細(xì)胞過程引起的。黑素細(xì)胞位于表皮下層，其作用是合成保護(hù)身體不受紫外線輻射損害的棕色素、黑色素。黑色素沉積于黑素體中，黑素體據(jù)發(fā)現(xiàn)是黑素細(xì)胞中的泡囊。黑素體被從黑素細(xì)胞中擠出并且被角化細(xì)胞攜帶到皮膚表面，該角化細(xì)胞將含黑色素的黑素體內(nèi)在化。皮膚觀察到的顏色暗度與黑素細(xì)胞合成并轉(zhuǎn)移給角化細(xì)胞的黑色素的量成比例。在很多情況中，人們期望減少或抑制黑素生成，例如，使皮膚增白，以消除“老年斑”、著色斑，或者減少活性過度的黑素細(xì)胞。本發(fā)明的目的是提供用于皮膚局部使用以抑制黑素生成從而使皮膚增白的方法和組合物。在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明包括含一定量活性劑的物質(zhì)的組合物，其中所說的活性劑中含有對降低人黑素細(xì)胞中黑色素含量有效的育亨賓或其有效的衍生物、立體異構(gòu)體或鹽。該組合物還包含有效量的、能夠在體內(nèi)條件下將育亨賓或其立體異構(gòu)體、衍生物或鹽給藥于含黑素細(xì)胞皮膚層的藥用局部載體。活性劑可以是作為天然提取物的形式提供，例如育亨賓(Yohimbe)樹皮的提取物。本發(fā)明還包括用于降低色素沉淀或促進(jìn)對象皮膚增白的方法。用脫色素組合物處理對象的皮膚，所說的組合物含有對降低人黑素細(xì)胞中黑色素含量有效的育亨賓、和上述的藥用局部載體。本申請的方法還可以包括防曬組合物，以便至少部分地防護(hù)對象的皮膚不受紫外線輻射。附圖簡介圖1顯示了育亨賓對黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的劑量應(yīng)答效果。圖2顯示了游離基質(zhì)的育亨賓對黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的劑量應(yīng)答效果。圖3顯示了育亨賓和育亨賓立體異構(gòu)體蘿芙素(rauwolscine)對黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的對比效果。圖4A和4B是計算機(jī)產(chǎn)生的圖象，圖4C顯示了育亨賓對人皮膚培養(yǎng)物的增白效果。以下將圖4A、4B和4C稱為“圖4”。圖5顯示了從培養(yǎng)物介質(zhì)中除去育亨賓后，人黑素細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中酪氨酸酶活性的回收率。圖6顯示了α2-拮抗劑BU224和efaroxan對另一種人黑素細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中酪氨酸酶活性的影響。圖7顯示了酚妥拉明和育亨賓立體異構(gòu)體柯楠次堿對另一種人黑素細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中酪氨酸酶活性的影響。圖8A和8B是計算機(jī)產(chǎn)生的圖象，圖8C顯示了天然育亨賓樹皮提取物對人皮膚培養(yǎng)物的脫色素效果。以下，圖8A、8B和8C稱作“圖8”。圖9是計算機(jī)產(chǎn)生的圖象，顯示了給豬的皮膚使用育亨賓組合物的脫色素效果。圖10顯示了圖9中被處理皮膚區(qū)域的反射率值。圖11顯示了育亨賓滲透過人皮膚切除部分的滲透率。本發(fā)明涉及用于降低對象皮膚中黑素生成的組合物和方法。這里所說的“對象”是指哺乳動物，更優(yōu)選是人。本發(fā)明包括含有有效量的一種或多種育亨賓或能夠降低黑素細(xì)胞(優(yōu)選人黑素細(xì)胞，更優(yōu)選人直露皮膚的黑素細(xì)胞)中黑色素量的活性劑(以下稱作“黑色素減少劑”，如α2-對抗劑)的組合物。黑色素減少劑可以據(jù)信是降低皮膚內(nèi)黑色素產(chǎn)生量的任何各種方式起作用，例如通過降低黑素細(xì)胞中的CAMP(環(huán)狀A(yù)MP)或起CAMP作用的CAMP衍生物；通過促進(jìn)磷酸二酯酶；或者通過降低酪氨酸酶活性。如上所述，本發(fā)明還包括對本發(fā)明有效的α2-拮抗劑，其中黑素細(xì)胞的黑素生成性被抑制從而導(dǎo)致皮膚增白。因此，正是本申請人獨(dú)到地發(fā)現(xiàn)了育亨賓、和某些其它活性劑(如某些α2受體-對抗劑)對降低黑素細(xì)胞中黑色素生成有效，從而降低皮膚色素沉淀使皮膚增白，以下將作進(jìn)一步描述。更具體地說，本發(fā)明涉及一種組合物，以及使用該組合物的方法，該組合物對抑制人皮膚的黑素生成是有效的。所說的組合物包含有效量的、能夠減少人黑素細(xì)胞中黑色素含量的育亨賓。這里所說的“育亨賓”包括同樣對抑制黑素生成有效的育亨賓的立體異構(gòu)體、鹽和衍生物。其實例是蘿芙素(α-育亨賓)、異-育亨賓、和柯楠次堿(柯楠質(zhì))。所說的育亨賓或其它活性劑可以占組合物的約0.01μM-約1mM，或組合物的約10-4-約10wt％。更優(yōu)選，活性劑占組合物的約10-4-約2wt％。更優(yōu)選，活性劑育亨賓占組合物的約10-3-約1.0wt％。在本發(fā)明的一個方案中，育亨賓或育亨賓衍生物或立體異構(gòu)體可以作為育亨賓(Coryuanthejohimbe，或相關(guān)樹種)樹皮的提取物、或已知含適當(dāng)量育亨賓或所說衍生物或立體異構(gòu)體的任何其它天然來源(如蘿芙藤根)的提取物來提供。制備這種提取物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以通過將樹皮在乙醇中勻化，然后勻漿除去懸浮的顆粒來制備。然后，可以將上清液與局部使用載體混合。下面將更詳細(xì)地描述提取方法。組合物還包含用于抑制紫外線誘導(dǎo)黑素生成的防曬劑。這種防曬劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。如上所述，組合物包含能夠在體內(nèi)條件下將活性劑給藥于含黑素細(xì)胞的皮膚層的藥用局部載體。黑色素減少劑(即活性劑)以任何有效量存在于本發(fā)明的組合物中。黑色素減少劑的“有效量”是引起對象被處理區(qū)域的黑色素降低的量。其中，該量可以隨黑色素減少劑和載體的特性、對象皮膚的顏色和狀況、以及需要的脫色素程度(即增白程度)而變化。本發(fā)明物質(zhì)的組合物優(yōu)選直接涂敷于需要皮膚增白的個體的皮膚上。處理的區(qū)域可以是對象的整個皮膚或僅是需要增白或脫色素的區(qū)域。組合物的涂敷必須周期性重復(fù)進(jìn)行，以便保持皮膚的增白狀況。如上所述，本發(fā)明物質(zhì)的組合物優(yōu)選還包含有效量的、能夠在體內(nèi)條件下將黑色素減少劑給藥于黑素細(xì)胞皮膚層的藥用局部載體。載體可以包括任何的溶液、懸浮液、乳液、或任何其它能夠在體內(nèi)條件下將活性劑給藥于黑素細(xì)胞皮膚層的形式。這里所說的“能夠給藥于”是指載體應(yīng)當(dāng)有助于活性劑穿過角質(zhì)層和所謂黑素細(xì)胞表皮的連續(xù)細(xì)胞層，并且/或者有助于活性劑達(dá)到含黑素細(xì)胞的細(xì)胞層。優(yōu)選，載體應(yīng)當(dāng)基本上不與活性劑互相作用，以便活性劑可以如所說地發(fā)揮其作用。載體的特性和數(shù)量取決于本發(fā)明組合物中所用的黑色素減少劑的特性。然而，在大部分情況中，載體占組合物的約50-約99wt％。優(yōu)選載體中含有醇。或者，載體可以是脂質(zhì)體或水合的脂質(zhì)片狀相，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。載體的優(yōu)選配方含有醇(如甲醇、乙醇或異丙醇)、和增稠劑如丙二醇、聚乙二醇(PEG)或卡波醇(Carbopol)以及滲透促進(jìn)劑，如transcutol。不含活性劑的優(yōu)選載體配方的具體實例為(1)30％丙二醇(PG)70％乙醇(2)30％PG1.0-2.5％油酸或油醇乙醇(QS)(3)10-25％乙氧基二甘醇0-2.5％油酸或油醇0-5％羥丙基纖維素乙醇(QS)；(4)10-50％甲基吡咯烷酮0-20％乙氧基二甘醇0-2.5％油酸或油醇0-5％羥丙基纖維素乙醇(QS)；其它配方見表1和2。其中每個配方中都顯示含有育亨賓，但應(yīng)當(dāng)理解這些配方可以代之以包含所述的對增白皮膚有效的任何化合物，或其組合。表1-含育亨賓的皮膚增白膏配方制劑表2-含育亨賓的皮膚增白膏和凝膠配方制劑</tables>所述的制劑可以很多方式局部使用，以達(dá)到活性劑滲透過皮膚使皮膚增白。物質(zhì)的組合物優(yōu)選為可以用水擦敷在皮膚上的凝膠、露液或溶液形式。也可接受其它施用方式，如氣溶噴霧或使用涂藥瓶。一般來說，制劑可以按0.3-1ml/5-50cm2的劑量施用。制劑的施用頻率為每1-2、2-6、6-8、8-12小時施用于所需增白的區(qū)域。這里所說的劑量是指皮膚施用制劑的量和次數(shù)。制劑中可以包含成膜劑，例如聚乙烯基吡咯烷酮或聚甲基吡咯烷酮。此外，可以使用允許組合物在角質(zhì)層中積累的滲透促進(jìn)劑(如transcutol(乙氧基二甘醇))。組合物還可以包含表皮剝離劑，如用于增強(qiáng)表皮細(xì)胞更新的水楊酸。其它表皮剝離劑包括α羥基和β羥基酸，以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的物質(zhì)，如水果酸。其它成分也可以包含在本發(fā)明的組合物中。當(dāng)存在滲透促進(jìn)劑時，其優(yōu)選占溶劑混合物的約0.5-25wt％，更優(yōu)選占1.0-20wt％。Transcutol是優(yōu)選的滲透促進(jìn)劑，但其它已知的促進(jìn)劑如阿綜(月桂氮酮)、硫代羥乙酸鈣、鏈烷烴羧酸、脂質(zhì)體、極性脂質(zhì)、二甲基甲酰胺、N甲基-2-吡咯烷酮、油酸、油醇、癸基甲基亞砜和丙二醇也能夠使用，并且可以占制劑的一部分。其它可能的滲透促進(jìn)劑包括月桂醇、癸二酸二丁酯、二乙二醇油酸酯、癸二酸二乙酯、琥珀酸二乙酯、癸二酸二異丙酯、己二酸二辛酯、壬二酸二辛酯、癸二酸二辛酯、乙酸乙酯、甘油一月桂酸酯、甘油一油酸酯、異硬脂酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、蔗糖一月桂酸酯、蔗糖一油酸酯、乳酸、月桂酸、亞油酸、亞麻酸、11-十八碳烯酸、Eo-2-油基醚、Eo-5-油基醚、Eo-10-油基醚、N-甲基-2-吡咯烷酮、吡咯烷酮/羧酸結(jié)合物、乙醇、聚乙二醇、吐溫20和吐溫80。組合物還可以包含一種或多種在角質(zhì)層之層狀液晶結(jié)構(gòu)中起增加無序作用的助水溶物質(zhì)，由此增加經(jīng)皮轉(zhuǎn)移性。這種助水溶物質(zhì)的實例是異丙醇、丙二醇和二甲苯磺酸鈉。申請人還注意到制劑中可以包含有效的皮膚增白劑的組合。本發(fā)明的組合物還可以包含其它化妝品和治療可接受的含其它溶劑的載體或賦形劑、增濕劑、濕潤劑、油、乳化劑、增稠劑、稀釋劑、表面活性劑、香料、防腐劑、抗氧化劑、維生素和礦物質(zhì)。下面將要通過聯(lián)系以下實施例中的某些優(yōu)選的實施方案來描述本發(fā)明，以便可以更完整地理解和領(lǐng)會本發(fā)明的目的，但并非要將本發(fā)明局限于這些特定的實施方案。相反，其意圖是要覆蓋包括在由以下權(quán)利要求書定義的本發(fā)明范圍之內(nèi)的所有替換、改進(jìn)和等效變化。因此，以下包括優(yōu)選實施方案的實施例起舉例說明本發(fā)明實踐的作用，可以理解所示的具體內(nèi)容是通過示例的方式，并且僅是出于舉例討論本發(fā)明優(yōu)選實施方案的目的，并且這些具體內(nèi)容是在假設(shè)配制工藝以及本發(fā)明原理和概念方面的描述據(jù)信是最有用和容易理解的情況下作出的。方法器官培養(yǎng)系統(tǒng)使用人的器官培養(yǎng)物來效仿人的體內(nèi)皮膚，并且對本發(fā)明的組合物和方法作充分的評價和研究。本發(fā)明的人器官培養(yǎng)物使用有活力的包皮?！坝谢盍Α笔侵附?jīng)過外科割除后的包皮基本上沒有形態(tài)變化。活力可以由通過組織化學(xué)染色和/或二羥苯基丙氨酸反應(yīng)測定的染色組織超微結(jié)構(gòu)的變化來確定，該技術(shù)允許監(jiān)測組織超微結(jié)構(gòu)中的任何變化。包皮可以由通過標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)割除男性新生兒的包皮來獲得。外科割除后，優(yōu)選將包皮通過真皮內(nèi)注射以下所述的介質(zhì)制備成器官培養(yǎng)物。該過程使粘膜膨脹，并且允許除去膜從而允許足夠的營養(yǎng)物經(jīng)真皮流入包皮中。包皮包括正常情況下被暴置于環(huán)境的表皮，和與表皮相對的真皮。經(jīng)過手術(shù)割除和器官培養(yǎng)物制備后，正常情況下通過身體供應(yīng)營養(yǎng)物的真皮暴露在環(huán)境中。為保持表皮的活力，營養(yǎng)物介質(zhì)通過真皮向包皮提供營養(yǎng)物質(zhì)，如以下所述。營養(yǎng)物介質(zhì)是保持包皮活力的任何組合物。優(yōu)選，營養(yǎng)物介質(zhì)具有諸如溶液、懸浮液或乳液的水相。介質(zhì)的一部分可以商購獲得，例如Iscove的改進(jìn)Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)；Ham的營養(yǎng)混合物F-10培養(yǎng)基，最低基本培養(yǎng)基(MEM)、RPMI培養(yǎng)基1630或1640，Dulbecco的改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)或培養(yǎng)基199，所有這些均為GrandIsland的GibcoLaboratories(NewYork)和其它公司制造，其說明書引入這里作為參考。此外，介質(zhì)還包含約10-約30％的馬血清和約2-約10％的胎牛血清；這些血清例如可以從Logan的HycloneLab公司(Utah)購買到。如果需要，可以添加堿化劑，如碳酸氫鈉，直至介質(zhì)達(dá)到優(yōu)選的pH，優(yōu)選約生理學(xué)pH。還可以加入抗菌劑，如青霉素和/或鏈霉素來控制微生物。如果在手術(shù)割除之后必需要經(jīng)過轉(zhuǎn)移，則要將包皮立即放在用營養(yǎng)物介質(zhì)飽和的吸收載體上。為保持包皮的活力，在手術(shù)割除后將包皮在介質(zhì)中處理約3-4小時。包皮在介質(zhì)中的位置應(yīng)當(dāng)是真皮接觸介質(zhì)并且表皮基本上不接觸到介質(zhì)。在所述的器官培養(yǎng)系統(tǒng)中處理包皮時，在觀察包皮的整個期間保溫培養(yǎng)器官培養(yǎng)系統(tǒng)，例如24-72小時。優(yōu)選，每天更換介質(zhì)，因為營養(yǎng)物可能隨時間而被耗盡，并且保溫造成介質(zhì)組分降解。在制備所述的人器官培養(yǎng)系統(tǒng)中，包皮是外科手術(shù)割除、制備和在如上所述的器官培養(yǎng)系統(tǒng)中處理的。在將包皮放入系統(tǒng)之前，應(yīng)當(dāng)先觀測包皮，以確定所研究的生物學(xué)要素的量和/或狀況，獲得基準(zhǔn)測量值。在用活性劑處理包皮之后，再次觀測生物學(xué)要素，得到處理后測量值，與基準(zhǔn)測量值比較。例如，如果研究包皮中酪氨酸酶的量，則在給包皮使用活性劑之前測定酪氨酸酶的量作為基準(zhǔn)測量值。如果包皮要用研究中的活性劑處理，可以將活性劑添加到營養(yǎng)物介質(zhì)中，以便通過介質(zhì)與包皮接觸。或者，可以將活性劑直接放在包皮的表皮上。處理時間取決于所需的結(jié)果、研究中的活性劑的特性、包皮來源保持活力的時間以及其它因素。在包皮用所研究的活性劑處理之后，可以按任何可測出包皮與未處理包皮觀測和/或測試差異的方式來觀測和/或測試包皮。例如，可以如這里所述的測定酪氨酸酶活性，并且與黑素生成的降低相聯(lián)系；可以通過3H-胸腺嘧啶核苷攝取測定DNA合成的速率，并且與對照進(jìn)行比較；或者通過測量[3H]亮氨酸(蛋白質(zhì))或[3H]尿嘧啶核苷(RNA)摻入到酸性起沉淀作用的物料中的速率，來測定蛋白質(zhì)和/或RNA合成的增加或減少?；蛘?，可以按非這里所述的通過顯微鏡評價處理后包皮的組織切片。人包皮和器官培養(yǎng)物的制備在手術(shù)割除的時候，將人的包皮放在用無菌IMDM培養(yǎng)基(購自IrvineScientificofSantaAna(California)的Iscove改進(jìn)Dulbecco培養(yǎng)基)飽和的無菌紗布上，以便從醫(yī)院手術(shù)室轉(zhuǎn)移至實驗室。將組織用含500U/ml青霉素和500μg/ml鏈霉素的無菌IMDM培養(yǎng)基漂洗5分鐘。于無菌條件下，在用剪子解剖粘膜和下層真皮使皮膚厚度相等之前，從真皮側(cè)經(jīng)真皮注射介質(zhì)。然后將包皮切割成大約3mm×3mm的正方形，并且在-75℃下冷凍或者放入如下述的器官培養(yǎng)物中。用補(bǔ)充20％馬血清、5％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和3mg/ml碳酸氫鈉的含谷氨酰胺的IMDM制備器官培養(yǎng)介質(zhì)。血清得自Logand的HycloneLab.公司(Utah)。通過于6皿組織培養(yǎng)板(Falcon3046)皿中將滅菌的濾器(AP2002500，微孔)放在滅菌的支持篩(25cmSwinnex濾器支持篩，微孔)上面，裝備培養(yǎng)裝置，其中將介質(zhì)添加到皿中以便皮膚支持篩飄浮，并且濾器由下方吸收介質(zhì)。將組織樣品放在飽和濾器的頂部，真皮朝上，并且在37℃下于5％CO2增濕環(huán)境中保溫。每天更換介質(zhì)。獲得的培養(yǎng)物在-75℃下冷凍。對組織學(xué)研究(光學(xué)顯微鏡檢查)，將新鮮組織的解凍樣品和外植體封固在OCT化合物中(ICNImmunoBiologicals，Lisle，Illinois)并且通過液氮冷凍。將低溫控制器的切片(6μm厚)于2％甲醛中40℃下固定2小時，然后用蘇木紫或曙紅染色或者進(jìn)行多巴染色。多巴反應(yīng)通過在0.1M磷酸鈉緩沖劑中兩次更換0.1％L-多巴溶液緩沖劑至pH7.4于37℃下培養(yǎng)4小時完成。酪氨酸酶活性測定通過測定酶的酪氨酸羥化酶活性來確定人皮膚器官培養(yǎng)物中酪氨酸酶活性。試驗測定[3H]酪氨酸轉(zhuǎn)化成L-多巴期間3H2O的產(chǎn)生。將稱重的皮膚制備物于0.3ml含0.01mML-酪氨酸、5-6uCi/ml[3H]酪氨酸和0.1mML-多巴與0.1MpH6.8磷酸鹽緩沖劑的反應(yīng)混合物在37℃下保溫4小時。添加1ml的磷酸鹽緩沖劑中止反應(yīng)，渦旋攪拌試管，并且取出三份0.4ml的等分試樣，并且與同體積的NoritSG活性炭(10％w/v，于0.1NHCl中)混合。在2000xg下離心10分鐘，接著將上清液(0.5ml)放入閃爍小瓶中，加入閃爍流體，并且將小瓶裝在裝備有DPM處理器的TMAnalytin6895閃爍計數(shù)器中。黑素細(xì)胞生物鑒定該研究中使用的正常的人黑素細(xì)胞株得自新生兒或2-6歲黑種人或白種人男性。人黑素細(xì)胞培養(yǎng)物在補(bǔ)充有10％馬血清、5％胎牛血清(FBS)、32nMTPA(12-鄰十四酰佛波醇-13-乙酸酯)、青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的Ham’sF-10營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。為原位測定人黑素細(xì)胞培養(yǎng)物中的酪氨酸酶活性，測量酶的酪氨酸羥化酶活性。將細(xì)胞以2×105細(xì)胞/皿接種于60mm培養(yǎng)皿，并且讓其過夜。然后更換含Ham’sF-10營養(yǎng)培養(yǎng)基+10％FBS+2μg/ml牛垂體浸膏(BPE)+2ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、補(bǔ)充有1μCi/ml[3H]酪氨酸(L-環(huán)-3，5-[3H]-酪氨酸，DuPontNewEnglandNuclear)和前列腺素的生長介質(zhì)，其中被指示。細(xì)胞在標(biāo)示的介質(zhì)中生成72小時，(除非另有說明)并且在此時，除去介質(zhì)并且使用Pomerantz的木炭吸收法分析3H2O的存在。通過在0.1M磷酸鈉緩沖劑(Ph6.8)中聲處理細(xì)胞顆粒，然后在0.5ml含0.1mM酪氨酸、2μCi/ml[3H]酪氨酸、0.1mML-多巴(二羥基苯丙氨酸)和0.1mMPMSF(苯甲基磺酰氟化物)反應(yīng)混合物中37℃下保溫50μl等分試樣2小時，來測定細(xì)胞勻漿酪中的氨酸酶活性。通過添加1ml木炭(10％w/v，0.1NHCl中)中止反應(yīng)。將樣品離心，并且取出上清液測定所產(chǎn)生的3H2O的量。通過將細(xì)胞顆粒在2ml的1NNaOH中37℃下保溫48小時，然后在400nm下測定溶解的黑色素，來測定黑素細(xì)胞中黑色素的量。結(jié)果圖1-8顯示了育亨賓、其立體異構(gòu)體和很多其它化合物對黑素細(xì)胞和培養(yǎng)的包皮中的脫色素效果。黑素細(xì)胞和包皮如上培養(yǎng)。圖1顯示了在McX-TPA介質(zhì)中培養(yǎng)72小時之后，育亨賓HCl對黑種人黑素細(xì)胞(細(xì)胞株B415)中酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果說明了劑量應(yīng)答，其中100μM育亨賓HCl強(qiáng)烈抑制了黑種人黑素細(xì)胞中的黑素生成，而該效果逐漸降低，直至到1μM濃度下，抑制效果實質(zhì)上消失。圖2顯示了制備成游離基質(zhì)的育亨賓(溶解于乙醇)各批次在100μM濃度下的相同抑制效果。抑制程度與圖1所示的類似。圖3顯示了使用育亨賓立體異構(gòu)體蘿芙素(α-育亨賓)在白種人黑素細(xì)胞(細(xì)胞株W422)中保溫72小時后的類似抑制效果，抑制程度類似。圖4顯示了像素圖和如上所述用育亨賓(100μM)和不用育亨賓(對照)在生長介質(zhì)中保溫24小時培養(yǎng)的黑種人包皮的組織玻片照片。用育亨賓處理的皮膚明顯比未處理的包皮著色密度低。關(guān)于相對像素值，對照包皮比用育亨賓處理的包皮大約暗5倍。圖5顯示了黑種人黑素細(xì)胞(細(xì)胞株B417)中的回收結(jié)果。給育亨賓(100μM)處理的黑素細(xì)胞供應(yīng)不含育亨賓的營養(yǎng)介質(zhì)、48小時內(nèi)，處理過的黑素細(xì)胞的黑色素產(chǎn)生回到與暴置于不含育亨賓介質(zhì)的黑素細(xì)胞相同的水平。結(jié)果說明育亨賓的效果是可逆的，并且育亨賓必須重復(fù)使用才保持抑制效果。圖6顯示了兩種有效α2-拮抗劑BU224和efaroxan對處理72小時的白種人黑素細(xì)胞(細(xì)胞株W442)的抑制效果。BU224和efaroxan在100μM下抑制黑素生成。圖7顯示了α2-對抗劑酚妥拉明和育亨賓立體異構(gòu)體柯楠次堿對處理72小時的白種人黑素細(xì)胞(細(xì)胞株W442)的抑制效果。酚妥拉明和柯楠次堿在100μM下抑制黑素生成。圖8顯示了像素圖和如上所述培養(yǎng)的黑種人包皮的組織玻片照片，其中培養(yǎng)物用和不用含育亨賓的育亨賓樹皮提取物(提取過程如下所述)保溫24小時。用含育亨賓的育亨賓樹皮提取物處理的皮膚明顯比乙醇對照樣著色密度低。關(guān)于相對密度，對照包皮比用提取物處理的包皮大約暗4倍。對豬皮膚的體內(nèi)效果測試局部用育亨賓制品對活Yucatan豬無傷皮膚的增白效果。在對象的皮膚上使用100μl量的育亨賓制品和對照樣(賦形劑中不含育亨賓)，每天兩次，共兩周。在第一次使用對照或育亨賓組合物之前，用UV光照射每個區(qū)域，以刺激黑素生成。兩周后，用育亨賓加賦形劑處理的輻射區(qū)域(圖9，區(qū)域B)，其色素明顯少于僅用賦形劑處理的輻射區(qū)域(圖9，區(qū)域A)，反映了育亨賓阻斷黑色素的生成。圖10是顯示單獨(dú)用賦形劑和用賦形劑加育亨賓之間的反射值差異的圖。反射值越高表明著色越少、反射皮膚越多。也就是說，著色皮膚的反射值低于未著色的皮膚。反射值越低表明越暗、反射皮膚越少。圖9的處理區(qū)域A在用UV輻射后反射值降低，說明本質(zhì)上著色。另一方面，圖9的區(qū)域B，用育亨賓處理，在UV輻射之后反射值僅略微下降，說明因輻射引起的著色被抑制。這些結(jié)果表明育亨賓對豬皮膚具有增白作用。對人皮膚的體內(nèi)效果對兩位三十歲男性測試局部育亨賓制劑的無傷皮膚增白效果，該男性背部具有很多相適當(dāng)間隔的著色部位(“咖啡色和奶油色”著色斑)。每位對象選兩種類型的皮膚。給對象施用大約50μl劑量的育亨賓制劑以及其對照(不含育亨賓的賦形劑)，每天兩次施用三周(周末除外)。10天后，目視可見用育亨賓加賦形劑處理的著色斑皮膚增白效果比僅用賦形劑處理的區(qū)域強(qiáng)。沒有制劑(含或不含活性組分，育亨賓)造成處理區(qū)域刺激。使用載體賦形劑151B(表1)和YoP(表2)的育亨賓制劑看來產(chǎn)生了最佳的增白效果。該小型試驗證實了育亨賓使人無傷皮膚增白的效果，以及證明了育亨賓可以透過上層皮膚，并且是有效的而沒有不安全的副作用。育亨賓的皮膚滲透性使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)Franz型立式滲濾池育亨賓(參見T.Franz，經(jīng)皮吸收(PercutaneousAbsorption)“有關(guān)體外數(shù)據(jù)”，J.Invest.Dermatol.，64190-195，1975)分析育亨賓對人的切除皮膚的滲透性。所用的標(biāo)準(zhǔn)Franz滲濾池具有15mm孔口，7.0ml體積，并且裝備HansenHelix攪拌器。使用在含0.05％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水中的10％二甘醇一乙基醚作為受體相，將切除的人皮膚裝入滲濾池中。通過胸部復(fù)位術(shù)從個體中在24小時的手術(shù)內(nèi)獲得人皮膚，并且用解剖刀除去皮下組織，將組織仔細(xì)切成5×15cm切片，避免角質(zhì)層被皮下脂肪污染。將各5×15cm切片放在無菌Whirl-PAKTM包中，并且在溫冰上存儲，直至放入流動機(jī)中(最多轉(zhuǎn)移時間2小時)。在進(jìn)行皮膚體外滲透研究的當(dāng)天，用冷凍機(jī)中取出一片5×15cm切片。如果皮膚不使用則冷凍儲藏不超過6個月。解凍后，將皮膚漂洗，用織物輕拍干，并且裝入Franz滲濾池。通過反相HPLC(UV檢測)分析受體溶液的育亨賓。在研究開始，給皮膚表面涂敷70μl劑量，并且將滲濾池封蓋。24和48小時之后分析滲透劑樣品。Franz滲濾池實驗的結(jié)果見圖11。其中橫坐標(biāo)表示育亨賓的公知制劑和百分比。縱坐標(biāo)表示各制劑滲透過皮膚的育亨賓總納摩爾數(shù)。24小時后的滲透范圍為大約60-350納摩爾，48小時后的滲透范圍為95-515納摩爾。該結(jié)果證明當(dāng)育亨賓與適宜的賦形劑配置時，育亨賓可以顯著量地滲透過人的皮膚。育亨賓樹皮提取方法將10g育亨賓樹皮(可商購獲得，例如，得自GaiaHerb公司或其它商業(yè)來源)在咖啡磨中20秒研磨，以便將樹皮碎成細(xì)沉淀。然后加入100ml水。將混合物在250mlErlwnmeyer燒杯中室溫下攪拌，然后5000xg離心20分鐘。丟棄上清液，將含育亨賓的沉淀物再懸浮于100ml乙醇中。將該混合物簡單地聲處理，然后室溫下攪拌5小時，以便從樹皮中進(jìn)一步提取育亨賓。攪拌后，將混合物再次離心并且保留上清液。拋棄顆粒。在氮?dú)鈼l件下蒸發(fā)乙醇上清液，直至體積被濃縮至16ml。由此在乙醇溶液中獲得大約100微摩爾濃度的育亨賓。提取物中育亨賓的濃度取決于樹皮源和所用的技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上述的提取方法僅是適用于獲得育亨賓提取物的眾多方法中的一種，所有這些方法均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。數(shù)據(jù)顯示育亨賓及其各種衍生物和立體異構(gòu)體以及某些α2-拮抗劑對降低人黑素細(xì)胞中的酪氨酸酶活性、由此抑制黑素生成使皮膚增白是有效的。在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，根據(jù)所述的各種組合物的構(gòu)成和操作或根據(jù)所述方法的步驟或步驟順序，可以作出很多改變。本發(fā)明的范圍由以下權(quán)利要求定義。權(quán)利要求1.用于使皮膚增白的組合物，該組合物包含含一定量對抑制皮膚黑素細(xì)胞中黑素生成有效的育亨賓或其有效衍生物、立體異構(gòu)體或鹽的活性劑；和能有效將活性劑給藥于含黑素細(xì)胞的表皮層的化妝品或藥品可接受的賦形劑或載體。2.權(quán)利要求1的組合物，其中活性劑包含育亨賓、蘿芙素、異-育亨賓、柯楠次堿或異-育亨賓中的至少一種。3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中活性劑以天然提取物的形式提供。4.權(quán)利要求3的組合物，其中天然提取物是育亨賓樹皮的提取物。5.權(quán)利要求1-4任一項的組合物，其中載體或賦形劑包含醇。6.權(quán)利要求1-5任一項的組合物，其中載體或賦形劑包含滲透促進(jìn)劑。7.權(quán)利要求1-6任一項的組合物，其中提取物占組合物的0.01-80wt％。8.權(quán)利要求1-7任一項的組合物，其中活性劑占組合物的0.01-約5wt％。9.權(quán)利要求1-8任一項的組合物，其中載體或賦形劑包含剝離劑。10.用于使皮膚增白的組合物，該組合物包含含一定量對抑制皮膚黑素細(xì)胞中黑素生成有效的α2-受體拮抗劑的活性劑；和能有效將活性劑給藥于含黑素細(xì)胞的表皮層的化妝品或藥品可接受的賦形劑或載體。11.權(quán)利要求10的組合物，其中載體或賦形劑包含醇。12.權(quán)利要求11或12的組合物，其中載體或賦形劑包含滲透促進(jìn)劑。13.權(quán)利要求10-12任一項的組合物，其中活性劑占組合物的0.01-約5wt％。14.增白皮膚的方法，該方法包括提供含活性劑的組合物，其中該組合物含有對抑制皮膚黑素細(xì)胞中黑素生成有效的育亨賓或其有效衍生物、立體異構(gòu)體或鹽的活性劑；并且給表皮局部施用足夠量的組合物，使至少部分抑制表皮中黑素生成。15.權(quán)利要求14的方法，其中在提供組合物的步驟，組合物包含育亨賓、蘿芙素、異-育亨賓、柯楠次堿或異-育亨賓中的至少一種。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中組合物包含能有效將活性劑給藥于含黑素細(xì)胞的表皮層的化妝品或藥品可接受的賦形劑或載體。17.權(quán)利要求14-17任一項的方法，其中組合物包括天然提取物。18.權(quán)利要求17的方法，其中天然提取物是育亨賓樹皮的提取物。19.權(quán)利要求14-18任一項的方法，其中載體或賦形劑包含醇。20.權(quán)利要求14-19任一項的方法，其中載體或賦形劑包含滲透促進(jìn)劑。21.權(quán)利要求14-20任一項的方法，其中以重量百分?jǐn)?shù)表達(dá)，所說的提取物以組合物總重量計0.01-80wt％的濃度施用。22.權(quán)利要求14-21任一項的方法，其中以重量百分?jǐn)?shù)表達(dá)，活性劑的濃度為組合物總重量計的0.01-約5wt％。23.權(quán)利要求14-22任一項的方法，其中載體或賦形劑包含剝離劑。24.增白皮膚的方法，該方法包括提供含活性劑的組合物，其中該組合物含有對抑制皮膚黑素細(xì)胞中黑素生成有效的育亨賓樹皮的提取物；并且給表皮局部施用足夠量的組合物，使至少部分抑制表皮中黑素生成。25.權(quán)利要求24的方法，其中組合物還包含能有效將活性劑給藥于含黑素細(xì)胞的表皮層的化妝品或藥品可接受的賦形劑或載體。26.權(quán)利要求24-25任一項的方法，其中載體或賦形劑包含醇。27.權(quán)利要求24-26任一項的方法，其中組合物包含滲透促進(jìn)劑。28.權(quán)利要求24-27任一項的方法，其中以重量百分?jǐn)?shù)表達(dá)，所說的提取物以組合物總重量計0.01-80wt％的濃度施用。29.權(quán)利要求24-28任一項的方法，其中載體或賦形劑包含剝離劑。30.增白皮膚的方法，該方法包括提供含活性劑的組合物，其中該組合物含有對抑制皮膚黑素細(xì)胞中黑素生成有效的α2-受體拮抗劑；并且給表皮局部施用足夠量的組合物，使至少部分抑制表皮中黑素生成31.權(quán)利要求30的方法，其中活性劑占組合物的0.01-約5wt％。32.權(quán)利要求30-31中任一項的方法，其中載體或賦形劑包含醇。33.權(quán)利要求30-32中任一項的方法，其中載體或賦形劑還包含滲透促進(jìn)劑。34.權(quán)利要求30-33任一項的方法，其中組合物包含剝離劑35.一種用于使皮膚增白的組合物，該組合物包含對抑制黑素生成有效的活性劑。36.權(quán)利要求35的組合物，還包含賦形劑或載體。37.一種增白皮膚的方法，包括給皮膚施用組合物，其中組合物包含對抑制黑素生成有效的活性劑。全文摘要本發(fā)明提供用于給皮膚局部使用育亨賓或其衍生物或立體異構(gòu)體、或有效α文檔編號A61K8/96GK1276715SQ98810401公開日2000年12月13日申請日期1998年7月17日優(yōu)先權(quán)日1997年9月25日發(fā)明者B·B·富勒申請人:俄克拉何馬大學(xué)董事會