專利名稱：：低糖分、穩(wěn)定的、不含白蛋的一種重組體凝血因子制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明一般涉及rFVIII藥用制劑，尤其涉及其穩(wěn)定的、不含白蛋白的凍干制劑。凝血因子VIII是血液凝固過程必需的公知血漿蛋白。盡管凝血因子VIII通常可以從人血漿中獲得，近年來已作出許多努力從重組體來源制備凝血因子VIII(rFVIII)，以便避免與血液制品有關的可能污染。此外，凝血因子VIII的重組體來源可提供實際上無限量的凝血因子，因而避免與使用自愿捐獻血漿作為原料有關的供應能力的限制。因為rFVIII產(chǎn)品的優(yōu)點之一是它不來自于人血漿，因而避免了由人血漿原因引起的可能污染，所以，rFVIII制備當中的目標是開發(fā)穩(wěn)定的rFVIII制劑，它完全不含任何人血原料。不幸的是，像許多其它的治療性蛋白一樣，rFVIII是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在貯存期間它可變得不穩(wěn)定。為克服其不穩(wěn)定性，常用方法是將人血清白蛋白加入該產(chǎn)品中作為穩(wěn)定劑。已發(fā)現(xiàn)白蛋白是FVIII的良好的穩(wěn)定劑并用在市場上的許多銷售產(chǎn)品中。但是，使用人體白蛋白作為rFVIII穩(wěn)定劑，首先，重組體產(chǎn)品的優(yōu)勢之一(即避免任何含人血原料)便喪失了。最近一直有報導，關于使用氯化鈉、氯化鈣和組氨酸作為緩沖離子的低離子強度介質(zhì)和高離分強度介質(zhì)的不含白蛋白的凝血因子VIII制劑。此外，已經(jīng)使用堿性氨基酸例如賴氨酸和糖例如甘露糖醇、蔗糖或麥芽糖。為達到不含白蛋白的凝血因子VIII制劑的穩(wěn)定性，同時保留其用于治療目的所必需的等滲性，在該無白蛋白制劑中大約使用了10％的糖。例如參見美國專利第4877608號(低離子強度制劑)。歐洲專利第0314095號公開另一具有高離子強度和以組氨酸作為緩沖劑的不含白蛋白制劑。美國專利第4877608號涉及其溶液而不涉及凍干產(chǎn)品，后者必須能經(jīng)受對制備該產(chǎn)品是必需的凍干循環(huán)過程。歐洲專利第314095號介紹包括較高含量的氯化鈉并主要以液體制劑形式使用的凝血因子VIII制劑。其它關于凝血因子VIII制劑的專利包括美國專利第5399670號，它介紹精氨酸在含白蛋白凍干制劑中的用途。也參見WO95/01804，它介紹不包含蔗糖或甘氨酸的制劑，美國專利第4440679號和美國專利第4623717號(申請人均為Fernandes等人)顯示一起使用至少30％(重量)糖與氨基酸，以便使液體狀態(tài)的FVIII在巴氏殺菌條件下(60℃，至少10小時)穩(wěn)定。除了上述凝血因子VIII制劑外，還有其它幾篇涉及凝血因子VIII純化和/或穩(wěn)定化的專利。它們包括美國專利第5288853號，它涉及包括在加入甘氨酸后使用結合肝素柱(heparin-coupledcolumn)以便生成純化凝血因子VIII產(chǎn)品的多步驟制備過程。美國專利第5399670號涉及制備增加溶解度的凍干凝血因子VIII制劑的方法，它要求在凍干前，加入精氨酸到凝血因子VIII溶液中。美國專利第5259951號涉及使用離子交換柱從血漿中純化凝血因子VIII的多步驟方法。美國專利第4758657號涉及從血漿中分離凝血因子VIIIC的多步驟方法，其中至少有一個步驟要求將凝血因子VIIIC吸附在疏水的相互作用基質(zhì)上。除上述專利外，最近公開了與本發(fā)明rFVIII制劑似乎類似的凝血因子IX(FIX)制劑。參見Abstract244，作者L.Bush等，Hemophilia，第2卷，副刊1，64頁(1996年6月)。FIX為可轉(zhuǎn)變成活性分解蛋白酶的酶原。另一方面，F(xiàn)VIII作為輔助因子與其它凝血成分一起影響血液凝固過程。FVIII的分子量約340000道爾頓，而FIX的分子量約為56000-57000道爾頓。FVIII對分解蛋白過程非常敏感，同時損失其促凝血活性。眾所周知，凝血因子VIII本身比FIX更不穩(wěn)定，且各個凝血因子的凍干濃縮物都顯示出在不同溫度貯存過程中穩(wěn)定性方面的顯著差異。與FVIII不同，F(xiàn)IX包括獨特的12N末端谷氨酸殘基r-羧化作用，所以提供了作為不同穩(wěn)定性可能的基礎。所以，不必要將FIX制劑假定為FVIII制劑。在PharmaceuticalResearch，12卷，第6期，831-837頁(1995年)中，也公開了與下文所公開制劑類似的穩(wěn)定的重組體人白細胞間素-1受體拮抗劑制劑。不管過去和現(xiàn)在為開發(fā)能夠順利地凍干，然后用水以可迅速復制的、穩(wěn)定的rFVIII制劑所作的一切努力，到目前為止，提供一種不僅可避免使用人體產(chǎn)物例如白蛋白，而且滿足適合的凍干過程和能迅速復制及等滲性的要求，同時具長期穩(wěn)定性包括藥學上可接受的貯存期限的rFVIII制劑是困難的。使人感到驚奇的是，我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該類制劑是能夠得到的。在開發(fā)該制劑的過程中，我們發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有技術中作為緩沖劑來介紹和使用的組氨酸實際上對不含白蛋白的凍干制劑具有失穩(wěn)效應。但是，已發(fā)現(xiàn)所述組氨酸的失穩(wěn)效應通過新的含鹽、甘氨酸和蔗糖的制劑可以有效地得以克服，發(fā)現(xiàn)該組合在穩(wěn)定rFVIII方面具有有益的作用。該混合物也保護rFVIII經(jīng)歷凍干過程中的多次冰凍熔化循環(huán)，并為加水迅速復制該凍干產(chǎn)物提供保證。與基本上是非晶體的大多數(shù)現(xiàn)有技術制劑不同，所述制劑包含晶體和非晶體成分。本發(fā)明制劑在室溫下，以液體狀態(tài)保持穩(wěn)定至少達24小時。以下詳細介紹本發(fā)明制劑及其用途。本改進的rFVIII制劑是藥學上可接受的不含白蛋白凍干產(chǎn)品，它在水中可以迅速復制(在30秒鐘內(nèi))，并用于治療血友病。所述凍干制劑為包含鹽、氨基酸和蔗糖的新的混合物。本產(chǎn)品在室溫下穩(wěn)定，并與現(xiàn)有技術制劑不同，含有較低含量的糖。當用水復制后，本發(fā)明制劑包含下列成分甘氨酸約65-400mM，優(yōu)選290mM，組氨酸最高可達約50mM，優(yōu)選1mM-50mM特別優(yōu)選20mM，蔗糖約15-60mM，優(yōu)選30mM，NaCl最高可達約50mM，優(yōu)選1mM-50mM特別優(yōu)選30mM，CaCl2最高可達約5mM，優(yōu)選0.1-5mM，特別優(yōu)選2.5mM，和rFVIII約50-1500IU/ml在優(yōu)選的凍干制劑中，殘留水分應該約為1-3％(重量)，優(yōu)選約1％(重量)附圖為比較具較低糖含量的本發(fā)明制劑(上方曲線)與具較高糖含量的現(xiàn)有技術所述制劑(下方曲線)在40℃下藥效對時間的圖解。本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)不含白蛋白的制劑，它使經(jīng)歷不同加工步驟例如超濾/diafiltration、大量冷凍貯存、冰凍-熔化操作和凍干過程的rFVIII具有穩(wěn)定性(藥效損失極小或約低于20％)。此外，要求它在復制后液體狀態(tài)下穩(wěn)定的速溶產(chǎn)品。最后，要求它是用短時冷凍干燥過程可以凍干、具合適的貯存期限、藥物學上可接受的凍干產(chǎn)品。在凍干過程中蛋白質(zhì)不結晶。干燥過程的目的應該是將蛋白質(zhì)水溶液轉(zhuǎn)變成為非晶相，以便保護該蛋白質(zhì)免受由于結晶(或全部失去水分)環(huán)境引起化學和/或構象的不穩(wěn)定性。所以，常包含大量的白含蛋白(最高可達1％)以便提供可使所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定的非晶相(成分)。根據(jù)上述全部的目的，開發(fā)了包括便于迅速凍干的晶狀成分和可使rFVIII穩(wěn)定的非晶形成分的制劑。在此所表達的包括非晶形成分的結晶體表示所述制劑包含兩個或兩個以上不同相，其中至少一相是晶狀的和至少一相是非晶形的。固體可以以晶狀或非晶形形式存在。晶狀物質(zhì)的特征為具有明確的結構、化學計量組成和熔點。相反，非晶形物質(zhì)無明確分子結構并可以稱作具有極高粘度的過冷液體，例如粘彈“橡膠”或非常剛性易碎的玻璃。據(jù)認為其它一些糖例如麥芽糖、海藻糖和麥芽三糖可以包括在制劑中起所述非晶形成分的作用。也可以包括甘露糖醇，起制劑晶狀成分的作用。用于確定藥學上可接受的不含白蛋白的rFVIII制劑的程序如下(a)原料是用正交層析方法純化的高度純化的rFVIII。上述方法定義為按不同方法和原理操作并一般連續(xù)使用的層析方法。因此，通過使用更有效的不同純化方法，可以迅速純化蛋白質(zhì)。所產(chǎn)生的凝血因子VIII為至少90％純度(用凝膠電泳)并具高于2000IU/mg比活性的蛋白質(zhì)。rFVIII的理論純度一直是爭論的課題，但據(jù)認為是約3500-5000IU/mg蛋白質(zhì)。(b)通過超濾/diafiltration(UF/DF)將所述蛋白制成制劑，并研究經(jīng)UF/DF的回收率、對冰凍-熔化的敏感性和在不同保溫溫度下液體的穩(wěn)定性。(c)通過DSC(示差掃描量熱法)進一步顯示可能的制劑在熱性能方面的特征。測定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg1)、反玻璃化溫度(Td1)和低共熔溫度(Te1)。該資料用于確定能迅速凍干和用于進一步研究的制劑。(d)使用迅速的冷凍干燥循環(huán)過程將上述重要制劑凍干，并在標準及加速貯存溫度下完成穩(wěn)定性分析。(e)在不同時刻，從在40℃下貯存的樣品中，可以容易地確定出穩(wěn)定的制劑。在分析導致本發(fā)明制劑的許多研究結果的過程中，使用多變量實驗設計策略和程序比例篩選中氨基酸、鹽和糖的混合物所組成的一組成分。使用需要專門操作技術的程序分析所述結果，以便分析成分之間的任何相互作用，產(chǎn)生對所述數(shù)據(jù)的多變量響應表面分析(multi-variableresponse-surfaceanalysis)。使我們感到吃驚的是，發(fā)現(xiàn)組氨酸(常用在現(xiàn)有技術中)實際上對rFVIII制劑具有失穩(wěn)效應。這導致需要產(chǎn)格審查我們認為最后可接受的制劑中各種成分的標準。實施例1通過滴定包含150mMNaCl、2.5mMCaCl2和165mM甘露糖醇的rFVIII混合物中不同含量的組氨酸來研究組氨酸對凍干rFVIII穩(wěn)定性的影響。其結果列于下表1中。表1在組氨酸存在下，40℃貯存兩周后，相當初始藥效的百分率</tables>從以上數(shù)據(jù)可以看出，增加組氨酸的用量導致按照劑量決定關系的復制凍干rFVIII藥效下降。該結果提示組氨酸在使凍干狀態(tài)的FVIII穩(wěn)定的過程中不起作用。實施例2rFVIII在高糖份和低糖份制劑中的穩(wěn)定性。將重組體凝血因子VIII制成兩種制劑。在40℃加速貯存條件下研究其不穩(wěn)定性。與現(xiàn)有技術制劑類似，所述高糖份制劑是非晶形制劑，在用水復制后，它含50mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、5mM組氨酸和10％(重量)的麥芽糖。本發(fā)明的含低糖份制劑是包括用于穩(wěn)定所述蛋白質(zhì)的1％蔗糖(30mM蔗糖)非晶形成分的晶狀體。在用WFI復制后，該制劑含30mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、20mM組氨酸、290mM甘氨酸和大約200IU/ml的rFVIII。在附圖中將該制劑與現(xiàn)有技術制劑進行比較，其中可以看出，在超出規(guī)定時間情況下，本發(fā)明低糖份rFVIII制劑比現(xiàn)有技術的高糖份穩(wěn)定產(chǎn)品在時間上更穩(wěn)定得多。本領域技術人員可以已知的本發(fā)明進行大量的各種修改。所以，上述實施例僅用來說明本發(fā)明，本發(fā)明范圍只受到下列權利要示書的限制。權利要求1.穩(wěn)定的、不含白蛋白的、凍干rFVIII制劑，當用水復制后，含約65-400mM甘氨酸，最高可達50mM組氨酸，15-60mM蔗糖，最高可達50mMNaCl，最高可達5mMCaCl2，和50-1500IUrFVIII/ml。2.穩(wěn)定的、不含白蛋白的、凍干rFVIII制劑，當用水復制后，含約290mM甘氨酸，20mM組氨酸，30mM蔗糖，30mMNaCl，2.5mMCaCl2，和50-1500IUrFVIII/ml。3.權利要求1的凍干制劑，其中殘留的水分約為1-3％(重量)。4.權利要求2的凍干制劑，其中殘留水分約為1％(重量)。全文摘要當用水復制后,包括晶狀和非晶形成分凍干形式、穩(wěn)定的、不含白蛋白的重組體凝血因子Ⅷ(rFⅧ)制劑含約65—400mM甘氨酸、最高可達50mM組氨酸、15—60mM蔗糖、最高可達50mMNaCl、最高可達5mMCaCl文檔編號A61K47/16GK1181974SQ97114668公開日1998年5月20日申請日期1997年7月11日優(yōu)先權日1996年7月12日發(fā)明者R·納亞爾申請人:美國拜爾公司