專利名稱：涉及物質(zhì)在細(xì)胞表面的附著和顯露的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物質(zhì)(特別是蛋白質(zhì)和多肽)在諸如乳酸乳球菌的革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞表面的輸出，細(xì)胞壁附著和顯露的材料和方法。公開的方法提供了包括抗原，特異性結(jié)合蛋白質(zhì)和酶的蛋白質(zhì)細(xì)胞壁附著的表面表達(dá)。
背景技術(shù)：
多肽在細(xì)菌表面的顯露是幾年來的一個研究主題。由于重組DNA技術(shù)使利用細(xì)菌細(xì)胞作為廉價生產(chǎn)廣泛的不同蛋白質(zhì)成為可能，因此引起了這方面的興趣。研究集中在多肽在革蘭氏陰性細(xì)菌表面的顯露，例如，參見在美國專利5348867中提供的綜述。然而，在革蘭氏陰性細(xì)菌中，已證實難以找到在細(xì)胞表面顯露多肽使其以高密度安全附著于表面的適應(yīng)性方法。
然而，重組產(chǎn)物在細(xì)菌表面的高密度表面表達(dá)是這些細(xì)胞用于某些工業(yè)應(yīng)用，用于疫苗形成，肽文庫構(gòu)建和全細(xì)菌細(xì)胞吸附劑生產(chǎn)領(lǐng)域的前提。據(jù)本發(fā)明人所知，沒有背景技術(shù)導(dǎo)致在細(xì)菌表面，更具體地說，在諸如乳酸乳球菌和相似或相關(guān)種類的芏半氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞表面恒定，穩(wěn)定，高密度表達(dá)。
以前對細(xì)菌表面提供多肽的研究主要集中在使用諸如大腸桿菌和沙門氏菌屬的革蘭氏陰性細(xì)菌(Georgiou等，1993)。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，肽聚糖細(xì)胞壁被2個分離的脂膜束縛。外膜對具有相對分子量大于500(Mr)的分子在很大程度上是不可透過的，結(jié)果極少有蛋白質(zhì)釋放進(jìn)生長培養(yǎng)基中。由于外膜的存在，革蘭氏陰性細(xì)菌表面暴露的蛋白質(zhì)要么是整合的外膜蛋白，要么是諸如菌毛或鞭毛的蛋白質(zhì)附器。
由革蘭氏陰性生物分泌的少數(shù)蛋白質(zhì)經(jīng)過可包含達(dá)14種不同基因產(chǎn)物的特化運輸系統(tǒng)運輸通過外膜(例如，支鏈淀粉酶分泌；Kornacker和Pugsley 1990a)。
使C端融合到整合膜蛋白上來顯露外源蛋白質(zhì)的可能性由于許多整合膜蛋白質(zhì)的C端區(qū)域似平對于蛋白質(zhì)在外膜上的靶向和正確裝配是必需的這一事實而復(fù)雜化。圍繞這一問題的一種方法是使用大腸桿菌主要脂蛋白(Lpp)的N-端靶向序列來指導(dǎo)蛋白質(zhì)融合到外膜上。由于Lpp不會橫斷外膜，所以也需要外膜蛋白(OMP；例如，大腸桿菌OmpA)的跨膜區(qū)以將融合蛋白定位到細(xì)胞表面。然而，已證實了這些Lpp-OmpA融合體對顯露諸如β-內(nèi)酰胺酶，單鏈Fv抗體和纖維素結(jié)合蛋白的功能性蛋白的應(yīng)用(Georgiou等，1990)。
對于表面顯露多肽的其它方法涉及使氨基酸插入諸如LamB的整合膜蛋白外膜環(huán)內(nèi)或不含跨膜區(qū)的菌毛和鞭毛蛋白質(zhì)中(Charbit等，1991；Thiry等，1989，Steidler等，1993a，b)。該方法的主要問題是大型氨基酸插入/取代破壞了融合蛋白質(zhì)的正確折疊和/或定位，以致于當(dāng)用于固定細(xì)菌細(xì)胞時，從外膜中提取融合蛋白質(zhì)(Steidler，phDThesis，University of Gent，比利時)。
盡管最近在形成從革蘭氏陰性細(xì)菌的蛋白質(zhì)的表面顯露的方法中取得了明顯的進(jìn)展，但為達(dá)到該目的使用整合膜蛋白的主要缺陷在于融合蛋白質(zhì)不能牢固地附著到細(xì)胞表面。而且，已知膜蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)對細(xì)胞是有害的，如果需要高密度的表面表達(dá)，這一因素可能會限制該系統(tǒng)的可能應(yīng)用。
相反，革蘭氏陰性細(xì)菌不具有外膜且據(jù)認(rèn)為在細(xì)胞表面顯露的蛋白質(zhì)以其C端連接到細(xì)胞表面(Schneewind等，1992)。革蘭氏陽性細(xì)菌的許多表面蛋白質(zhì)具有對這些生物來說特有的某些常見特征。各分子在其N端具有一個充當(dāng)細(xì)胞分泌輸出信號的分泌先導(dǎo)肽，一個LPXTG基序，剛好在C端具有一個C端疏水區(qū)和帶電的氨基酸。針對這些鑒定和功能的大多數(shù)研究使用金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的細(xì)胞壁分類和錨著區(qū)在金黃色葡萄球菌中進(jìn)行(Navarre和Schneewind，1994)。已表明蛋白質(zhì)A以尚待闡明的機制共價偶聯(lián)到金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁上。
發(fā)明概述本發(fā)明證實了經(jīng)過構(gòu)建編碼融合蛋白質(zhì)的嵌合基因使外源蛋白質(zhì)牢固附著于乳酸乳球菌和其它革蘭氏陽性細(xì)菌的表面成為可能，其中該嵌合基因含編碼(1)N端分泌信號，(2)將要進(jìn)行表面表達(dá)的蛋白質(zhì)和(3)金黃色葡萄球菌蛋白A的細(xì)胞壁分類和錨著區(qū)的核酸。
與大腸桿菌比較，由于在乳酸乳球菌中以高水平表達(dá)的異源性蛋白質(zhì)相當(dāng)少，因此在本研究前不能肯定地預(yù)期是否能進(jìn)行任何特定蛋白質(zhì)的表達(dá)或該表達(dá)是否對細(xì)胞具有毒性。當(dāng)以高水平表達(dá)分泌的或與膜相關(guān)的蛋白質(zhì)時很可能會出現(xiàn)這種毒性，因為蛋白質(zhì)的輸出可能對細(xì)胞膜的整合或一般分泌途徑的功能具有有害影響。
因此，本發(fā)明首次顯示蛋白質(zhì)或多肽當(dāng)作為與細(xì)胞壁錨著區(qū)域的融合物進(jìn)行表達(dá)時能牢固附著于革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁上。如下所示，在正常情況下能釋放非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)的離子去污劑存在的條件下經(jīng)過煮沸細(xì)胞不能去掉該蛋白質(zhì)。盡管不希望受任何具體理論的限制，但我們相信乳酸乳球菌似乎具有連接(共價)融合到細(xì)胞壁肽聚糖上的表達(dá)的蛋白質(zhì)A所需的必要酶。從這種具有的酶不容易預(yù)期與革蘭氏陽性細(xì)菌的許多表面蛋白質(zhì)共有的蛋白質(zhì)A的LPXTG基序和C-端疏水區(qū)的這種結(jié)合，因為這些基序僅僅是必要的，但不是出現(xiàn)共價細(xì)胞壁錨著的充分條件。
因此，本發(fā)明從這樣的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生使用包含編碼諸如來自金黃色葡萄球菌蛋白A的分泌信號序列，所需的蛋白質(zhì)或多肽及細(xì)胞壁附著區(qū)的核酸的嵌合基因可將感興趣的蛋白質(zhì)和多肽(包括但不限于粘附素，抗原，酶和配體)牢固地附著于諸如乳酸乳球菌的革蘭氏陽性細(xì)菌肽聚糖細(xì)胞壁的外表面上。
因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了一種包括編碼一種融合蛋白的核酸的重組載體，該融合蛋白質(zhì)包含分泌信號序列，所需的蛋白質(zhì)或多肽及細(xì)胞壁附著區(qū)；以便當(dāng)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)革蘭氏陽性細(xì)菌宿主并表達(dá)融合蛋白質(zhì)時，所需的蛋白質(zhì)或多肽附著于并顯露于宿主細(xì)胞壁的外表面上。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性宿主生物。
在另一個方面，本發(fā)明提供了上述革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽被表達(dá)并共價附著于細(xì)胞壁，且顯露于宿主生物表面外表上。
在另一個方面，本發(fā)明提供了改造革蘭氏陽性宿主生物以在其表面顯露所需蛋白質(zhì)或多肽的方法、包括用編碼包含人泌信號序列，所需蛋白質(zhì)或多肽及細(xì)胞壁附著區(qū)的融合蛋白的重組核酸轉(zhuǎn)化宿主生物，使宿主能表達(dá)融合蛋白質(zhì)，從而細(xì)胞壁錨著區(qū)使宿主能在細(xì)胞壁表面附著并顯露所需的蛋白質(zhì)或多肽。這一方面還包括以該方法可獲得的革蘭氏陽性宿主生物的菌株。
優(yōu)選的是，革蘭氏陽性宿主生物是乳球菌宿主，如乳酸乳球菌，或具有表達(dá)融合蛋白質(zhì)并將所需蛋白質(zhì)或多肽附著并穩(wěn)定顯露于細(xì)胞表面之特征的相似或相關(guān)種類。蛋白質(zhì)A融合物相似地附著于L.lactis和金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)表明，在相似或相關(guān)的革蘭氏陽性細(xì)菌中的其它細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)也是如此。其它這類革蘭氏陽性細(xì)菌的例子包括枯草芽孢桿菌，格氏鏈球菌，木糖葡萄球菌，乳芽孢桿菌屬種類，同一屬中的嗜冷的和向冷的種，芽孢桿菌屬種類，梭狀芽孢桿菌屬種類和棒狀桿菌屬種類。
優(yōu)選的是，分泌信號序列能經(jīng)分泌的Sec依賴性途徑靶向用于分泌的蛋白質(zhì)且來自諸如usp45的天然分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。然而，盡管在實施例中使用這種分泌信號序列，但也可采肜其它分泌信號序列，如來自其它分泌蛋白質(zhì)的那些分泌信號序列。
優(yōu)選的是，細(xì)胞壁錨著區(qū)在C端包括來自金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的錨著區(qū)。然而，其它蛋白質(zhì)可用作細(xì)胞壁錨著區(qū)，只要它們具有穩(wěn)定結(jié)合于細(xì)胞表面的特征且能在細(xì)胞表面上體現(xiàn)所需蛋白質(zhì)或多肽。
優(yōu)選的是，編碼融合蛋白質(zhì)的核酸可操作地連接到控制序列上以指導(dǎo)其表達(dá)。一個這樣的例子是用包含在乳球菌宿主中有效的可誘導(dǎo)的啟動子控制下的T7或T7-樣聚合酶基因的核酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的乳球菌宿主生物，其中該控制序列包括對所說的聚合酶特異性的在編碼融合蛋白的核酸上游的啟動子，作為聚合酶表達(dá)的結(jié)果該啟動子選擇性地指導(dǎo)編碼融合蛋白質(zhì)的核酸的轉(zhuǎn)錄(見GB-A-2278358)。
已發(fā)現(xiàn)使用T7聚合酶系統(tǒng)可實現(xiàn)的高水平的異源性蛋白質(zhì)表達(dá)提供了在細(xì)菌表面的高水平的蛋白質(zhì)A-融合多肽的表達(dá)。對于本發(fā)明設(shè)想的許多應(yīng)用，經(jīng)過實現(xiàn)在細(xì)菌上融合分子的最高可能的表面密度，相聯(lián)方法的經(jīng)濟(jì)學(xué)可以在材料上是優(yōu)惠的。然而，對于某些應(yīng)用，使用組成型或活性較小的啟動子可產(chǎn)生有用的結(jié)果，特別是當(dāng)需要低水平表達(dá)的情況。
使用已知技術(shù)和本文提供的說明書，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按常規(guī)制備對所公開的載體的各種變異體。而且，以上面的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)或多肽可經(jīng)過改變其氨基酸序列而基本上不改變其特性來進(jìn)行修飾，例如，通過插入、添加，缺失或取代一個或多個堿基對或氨基酸來改造核酸或氨基酸序列。本文公開的這類多肽的衍生物包括在本發(fā)明中。
如上所述，用編碼融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性宿主生物具有廣泛的應(yīng)用，用作疫苗以在細(xì)胞表面顯露生物學(xué)活性分子，作為吸附劑及在細(xì)胞表面顯露酶，例如用作催化劑。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽包括至少一個需要引起免疫學(xué)反應(yīng)的表位。優(yōu)選的是，該蛋白質(zhì)或多肽是來自病原體的免疫原，抗原或粘附素。
在該方面，本發(fā)明還提供了包括上述宿主生物與合適的載體混合的疫苗。本發(fā)明還包括在疫苗制品中使用上述革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是一種需要引起免疫學(xué)反應(yīng)的表位。優(yōu)選的是，該疫苗經(jīng)鼻內(nèi)或腸胃外，或經(jīng)諸如口腔或陰道的其它粘膜途徑用藥。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是生物學(xué)活性分子。以舉例的方式，生物學(xué)活性分子可以是藥物，激素，酶，DNA/RNA結(jié)合蛋白質(zhì)或能在其它共同表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)上進(jìn)行二級修飾(糖基化，二硫鍵異構(gòu)化)的物質(zhì)。作為選擇，所需的蛋白質(zhì)或多肽可以是靶基團(tuán)；例如抗體，或其片段，或受體特異性的粘附素。
在這一方面，本發(fā)明還包括包含革蘭氏陽性宿主生物的藥用組合物和其在醫(yī)學(xué)治療方法中的應(yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明提供了革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是配體的特異性結(jié)合配偶體。在這一方面，本發(fā)明還包括在配體的純化或分離方法中使用革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是該配體的特異性結(jié)合配偶體，從而特異性結(jié)合配偶體顯露于生物的表面允許結(jié)合配偶體結(jié)合到配體上。
本發(fā)明還提供了將革蘭氏陽性宿主生物固定于固相上的方法，例如，經(jīng)過表達(dá)融合到細(xì)胞壁錨著區(qū)上的抗生蛋白鏈菌素使在細(xì)胞表面體現(xiàn)的抗生物蛋白鏈菌素能結(jié)合到固定于固相的生物素上。因此，本發(fā)明提供了固定本發(fā)明的革蘭氏陽性宿主生物的方法，它包括將本發(fā)明這一方面的宿主生物與配體固著于其上的固體表面接觸。本發(fā)明還提供了經(jīng)過在也在其表面上表達(dá)結(jié)合到待檢測的配體(例如，抗生蛋白鏈菌素或蛋白質(zhì)A)上的蛋白質(zhì)的細(xì)胞中共同表達(dá)諸如熒光素酶或熒光蛋白質(zhì)的報道活性檢測與特異性配體(例如，生物素或免疫球蛋白)復(fù)合物的方法。
在另一方面，本發(fā)明提供了革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的質(zhì)白質(zhì)或多肽是一種酶。本發(fā)明的該方面還包括包含革蘭氏陽性宿主生物的組合物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是表達(dá)并顯露于宿主細(xì)胞表面的一種酶，以及該組合物在由酶，例如可從周圍環(huán)境分解諸如脂肪和膽固醇的不需要的食物成份的表面酶催化的反應(yīng)中的應(yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明提供了篩選諸如抗體或抗原或其片段的物質(zhì)庫的方法，包括用編碼物質(zhì)與細(xì)胞壁錨狀區(qū)融合體的核酸轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性宿主生物，表達(dá)該融合體使物質(zhì)顯露于細(xì)胞表面。然后可使用識別劑，例如標(biāo)記的抗體檢測待篩選的特定物質(zhì)。
附圖的簡要描述

圖1顯示了下述基因融合體的構(gòu)建；圖2顯示了從(i)生長培養(yǎng)基，(ii)溶葡球菌素處理的細(xì)胞上清，(iii)在Laemmli SDS緩沖液“斷裂釋放”中煮沸的完整細(xì)胞，和(iv)溶葡球菌素處理的細(xì)胞的細(xì)胞沉淀殘渣中回收的蛋白質(zhì)的Western印跡。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序用兔抗-抗生蛋白鏈菌素抗血清和第二抗體綴合物經(jīng)免疫印跡檢測所示的蛋白質(zhì)(見箭頭)。這些結(jié)果證實在乳酸乳球菌中產(chǎn)生的抗生蛋白鏈菌素融合的A蛋白牢固地附著地細(xì)胞表面；圖3顯示了生物素綴合物能特異性地結(jié)合到表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合體的完整細(xì)胞的表面上，因此證實了該蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞的表面。該附圖顯示了已在其上收集了表達(dá)抗生蛋白鏈菌素蛋白質(zhì)A融合體(pL2SAX)或抗生蛋白鏈菌素(pL2SA)的細(xì)胞并與生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(B-POD)或預(yù)先用抗生蛋白鏈菌素(SA)處理以封閉其結(jié)合位點的B-POD反應(yīng)的濾膜。經(jīng)過與辣根過氧化物酶的生色底物溫育檢測結(jié)合B-POD的細(xì)胞。只有在其表面表達(dá)抗生蛋白鏈菌素蛋白質(zhì)A融合蛋白的完整細(xì)胞結(jié)合生物素標(biāo)記的酶綴合物B-POD；圖4，標(biāo)記了pL2SAX的相片顯示了結(jié)合到用生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶綴合物覆蓋的聚苯乙烯表面的在細(xì)胞表面表達(dá)抗生蛋白鏈菌素蛋白質(zhì)A融合體的乳酸乳球菌細(xì)胞的照片。在陰性對照中沒有看見細(xì)胞，該陰性對照代表了本文所述的所有對照樣品。
圖5(A)顯示了廣泛的革蘭氏陽性縮主范圍的載體pTREXI，pTIL2TT和pTITT的物理和遺傳圖譜。以粗線表示表達(dá)盒，大環(huán)內(nèi)酯，Lincosamides和鏈陽性菌素B(MLS)抗性決定簇，TTFC基因，usp45的分泌信號序列(L2)，金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A錨(SPA-X)和復(fù)制子(來自pAMβ1的Ori)；圖5(B)是pTREXI中表達(dá)盒的示意圖，顯示了參與基因表達(dá)的各種序列元件，特有的限制性核酸內(nèi)切酶位點的位置，ShineDalgarno(SD)基序和翻譯起動起始密碼子(ATG)；圖5(C)顯示了pTREXI表達(dá)盒的DNA序列和限制性核酸內(nèi)切酶位點的圖譜。在圖譜中還顯示了關(guān)鍵的表達(dá)元件；圖6顯示了用于PCR的引物表；圖7顯示了將細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TTFC(pTITT)，分泌TTFC(pTIL2TT)或表達(dá)TTFC-蛋白質(zhì)A融合體蛋白質(zhì)(pTTA)的完整細(xì)胞與兔TTFC多克隆抗血清在其上溫育，收集到膜上，然后與抗體過氧化物酶綴合物和底物反應(yīng)以檢測細(xì)胞表面的抗TTFC抗體的結(jié)合的濾膜。只有表達(dá)TTFC-蛋白質(zhì)A融合體的完整細(xì)胞在其細(xì)胞表面顯露TTFC。
詳細(xì)描述用于生產(chǎn)抗多肽抗體的活的或滅活的細(xì)菌疫苗和工具本發(fā)明可用于在諸如乳酸乳球菌的革蘭氏陽性細(xì)菌中表面表達(dá)抗原，粘附素和生物學(xué)活性分子。這些細(xì)菌屬于已建議作為用于粘膜免疫的疫苗傳遞載體的那些細(xì)菌(Well等，1993)。暴露于細(xì)菌細(xì)胞表面的抗原更易于被免疫系統(tǒng)識別(比僅在細(xì)菌死亡和降解后釋放的抗原)，因為表達(dá)抗原更易被諸如巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的抗原識別和處理細(xì)胞上的其受體接近。因此抗原和抗原決定簇的表面表達(dá)可增強革蘭氏陽性細(xì)菌疫苗表達(dá)的抗原的免疫原性。在其表面表達(dá)抗原的全細(xì)胞也是有用的免疫原，用于在動物中產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體(Charbit等，1987)。
生物學(xué)活性分子的細(xì)菌傳遞除了表達(dá)抗原和/或生物學(xué)活性分子外，對存在于消化道和其它粘膜組織(例如，呼吸道尿-生殖道和鼻道)中的細(xì)胞和/或組織上的受體具有特異性的粘附素的表面表達(dá)使重組細(xì)菌能靶向特異性的細(xì)胞和組織，例如，瘤形成。這種靶向于增強使用這些細(xì)菌將抗原和/或生物學(xué)活性分子傳遞到粘膜表面的效率。如果所用的細(xì)菌在正常情況下不附著于特定的粘膜表面或不在其上繁殖，這種靶向可增加細(xì)菌與粘膜表面間的接觸時間，從而幫助該細(xì)菌合成的一個或多個分子的傳遞和/或吸收。
許多生物學(xué)活性分子的表面表達(dá)經(jīng)過傳遞任意一種大量的激素，細(xì)胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)分子，細(xì)胞受體和/或其配體，酶，細(xì)胞特異性毒素而在疾病治療中具有廣泛的應(yīng)用。這些分子可與侵染素或能使細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞和/或從核內(nèi)體釋放進(jìn)胞質(zhì)的其它蛋白質(zhì)共同表達(dá)，從而以本發(fā)明的方法為將細(xì)菌靶向細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室提供了可行性。
另外，具有足夠結(jié)合親和力的表面配體可用于使細(xì)菌被各種各樣的所需分子覆蓋；例如，DNA或RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的表面表達(dá)可用于使生物在DNA或RNA中被覆蓋。可發(fā)現(xiàn)這種方法在基因治療或核酸免疫中的應(yīng)用。
特異性抗原、抗體和配體的表面顯露最近形成的噬菌體顯示技術(shù)使得經(jīng)過淘選表達(dá)反配體的重組噬菌體，然后附著于含感興趣的抗原，抗體或受體的固化支持物上能從復(fù)雜的文庫中分離特異性的抗原，抗體和其它配體(Chiswell和McCafferty，1992)。一個可選擇的方案是使用革蘭氏陽性細(xì)菌用于在表面提供蛋白質(zhì)和肽。細(xì)菌顯示技術(shù)的優(yōu)勢在于(i)表達(dá)所需配體的細(xì)菌可直接使用熒光反配體作探針來檢測，然后可使用能分揀單個細(xì)菌的FACS機器獲得不含非表達(dá)子細(xì)胞的這些細(xì)菌。這一程序可避免需要繁殖噬菌體以回收感興趣的克隆的DNA序列，(ii)，與噬菌體系統(tǒng)相比在細(xì)菌中可以更高的密度表達(dá)表面蛋白質(zhì)，(iii)不會碰到某些重組噬菌體不能感染大腸桿菌(以使它們能繁殖)的問題。
細(xì)菌作為金細(xì)胞吸附劑的應(yīng)用使用純化生物學(xué)產(chǎn)物的親和色譜常常可將多步程序轉(zhuǎn)變成單步或幾乎單步的程序。接著，這又導(dǎo)致與生物學(xué)產(chǎn)物回收相關(guān)的下游改造方法的復(fù)雜性降低，也意味著可實現(xiàn)大量節(jié)約資本投資；可減少操作花費及可更迅速地回收產(chǎn)物本身。事實上，該方案的一個最佳實施例是使用野生型金黃色葡萄球菌來結(jié)合和純化抗體。
在細(xì)菌表面發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)A對于某些免疫球蛋白的Fc區(qū)具有高親和力，且加熱殺死的及化學(xué)穩(wěn)定化的金黃色葡萄球菌細(xì)胞已按常規(guī)用于純化抗體。
然而，需要供應(yīng)足夠的固化形式的配體導(dǎo)致親和色譜不經(jīng)濟(jì)。
諸如單鏈抗體，蛋白質(zhì)受體，粘附分子等的配體或反配體的功能性片段在細(xì)菌表面的表達(dá)使得這些分子能經(jīng)細(xì)菌生長廉價地復(fù)制；然后截留的細(xì)菌細(xì)胞可用于提供廉價形式的吸附劑。
諸如乳酸乳球菌的無毒的革蘭氏陽性細(xì)菌不含存在于大腸桿菌中的內(nèi)毒素，該內(nèi)毒素起初污染在該細(xì)菌中制備的所有重組產(chǎn)物，且必須在純化程序過程中去除。因此，使用革蘭氏陽性細(xì)菌用于表面顯露配體不會導(dǎo)致產(chǎn)物被內(nèi)毒素污染。
酶覆蓋的細(xì)菌作為生物催化劑由革蘭氏陽性細(xì)菌和其它生物產(chǎn)生的許多酶被這些生物分泌進(jìn)其環(huán)境中，并在該處可介導(dǎo)各種生物轉(zhuǎn)化。這些化學(xué)轉(zhuǎn)化對于存活和生長是必需的，或者它們可使該生物更有效地與其環(huán)境中的其它生物競爭。
為營養(yǎng)目的需要的酶包括，例如，可將諸如糖，脂，核酸和蛋白質(zhì)的生物學(xué)聚合物降解成其取代基并為生長的生物提供營養(yǎng)成份的那些酶。
分泌的酶也執(zhí)行一系列不同的功能，如能將細(xì)菌和其它生物本身固定在其環(huán)境中有利的表面上的粘質(zhì)和粘蛋白(糖蛋白或蛋白聚糖)的生物合成。它們也可滅活從其它生物產(chǎn)出的諸如抗生素或毒素的抗微生物物質(zhì)；它們可降解由地質(zhì)學(xué)或工業(yè)過程遺留在環(huán)境中的毒性或難對付的物質(zhì)。
許多這類分泌的酶具有工業(yè)用途，但較理想的是需要存在于固相中，以便通過該相的液體反應(yīng)物能被固著的酶進(jìn)行催化轉(zhuǎn)變。
本發(fā)明的另一個關(guān)鍵的方面是經(jīng)過以能產(chǎn)生固相形式酶的細(xì)菌形式提供該生物轉(zhuǎn)化過程所需的活性成分改進(jìn)在工業(yè)過程中使用酶的可能性。
生產(chǎn)分泌蛋白的固著細(xì)胞的使用本發(fā)明提供了以附著于固相支持物上的革蘭氏陽性細(xì)菌生產(chǎn)分泌的蛋白質(zhì)的方法。例如，在其表面顯露抗生蛋白鏈菌素并也分泌感興趣的酶或其它蛋白質(zhì)的細(xì)胞可附著于生物素覆蓋的固相上。該方案的一個優(yōu)勢是回收含分泌的感興趣的蛋白質(zhì)的生長培養(yǎng)基不需離心去掉細(xì)菌細(xì)胞。
具有雙功能氨基末端區(qū)的雜二聚蛋白質(zhì)在細(xì)菌表面的裝配在本發(fā)明的該方面，雜二聚體的一個配偶體，例如，包含一個信號肽，一個單鏈抗體，重鏈的鉸合和/或恒定區(qū)及金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的細(xì)胞壁錨著區(qū)的融合多肽在細(xì)菌表面表達(dá)，另一個配偶體被分泌且由相似融合多肽組成，例如不同的單鏈抗體(識別不同的抗原)或酶促活性，但缺乏細(xì)胞壁錨。組成型配偶體多肽可在生長于共同培養(yǎng)基中的相同的改造的細(xì)胞中或在不同的改造的細(xì)胞中合成。
在這一例子中，細(xì)菌表面充當(dāng)具有雙功能氨基末端區(qū)的專一性雜二聚體分子的裝配位點。然后可以收集的細(xì)菌特異性地釋放和純化裝配的蛋白質(zhì)，例如，經(jīng)過溶葡球菌素的作用?？晒┻x擇的且優(yōu)選的是，經(jīng)過特異性蛋白酶，例如，因子Xa，腸激酶，膠原酶，Igase(來自淋病奈瑟氏球菌)，凝血酶，TEV(煙草蝕刻病毒蛋白酶對全細(xì)菌的作用可獲得釋放，其識別位點在緊接細(xì)胞壁錨上游摻入融合多肽。以常規(guī)分離技術(shù)可以純化所需的蛋白質(zhì)。
盡管已知生產(chǎn)雙功能雜二聚體的方法，但一般來說目前還沒有可從不可避免地共同生產(chǎn)的均二聚體(因而是單功能的)分子中分離它們的可應(yīng)用的方法。
另外，該方法可用于在細(xì)菌表面裝配均多聚體蛋白質(zhì)。
實施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建步驟1金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A錨著區(qū)的克隆使用以公開序列為基礎(chǔ)的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得編碼金黃色葡萄球菌菌株Cowan I NCTC 8530的葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SPA)錨的DNA片段(Saiki等，1985)。以Marmur等(1961)的方法在含dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM，1μM有意義(及反義)引物和1μM以金黃色葡萄球菌菌株Cowan I NCTC 8530分離的基因組DNA的廠家提供的100μl緩沖液中用熱穩(wěn)定性Vent DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室)進(jìn)行PCR。有意義和反意引物設(shè)計成分別包括在其5’端的BamHI和XbaI的限制性核酸內(nèi)切酶位點以利于隨后的克隆步驟。經(jīng)20個循環(huán)的變性(94℃45秒)，引物退火(68℃，30秒)和DNA聚合(72℃45秒)后，以瓊脂糖凝膠電泳檢測預(yù)期大小(621bp)的PCR擴增的DNA產(chǎn)物。然后使用標(biāo)準(zhǔn)程序(Maniatis)克隆和測序純化的DNA片段。編碼金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的C端區(qū)(nt.1043至2252)的克隆的DNA片段的DNA序列與以前報道的相同(Shuttleworth等)。
步驟2抗生蛋白鏈菌素基因的克隆和操作抗生蛋白鏈菌素選作報道蛋白以證實本發(fā)明的可行性。抗生蛋白鏈菌素易于檢測且已知結(jié)合生物素，其抗血清可從商業(yè)途徑獲得?？蓮囊幌盗匈|(zhì)粒獲得抗生蛋白鏈菌素基因片段，其中抗生蛋白鏈菌素基因突變成在成熟蛋白編碼序列的起始和末端插入不同的限制性核酸內(nèi)切酶位點。
編碼抗生蛋白鏈菌素的成熟形式的基因片段連接進(jìn)NaeI消化的乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pLET2N(Steidler等，1995)以產(chǎn)生usp45信號分泌信號光導(dǎo)序列(存在于pLET2N)和抗生蛋白鏈菌素編碼序列的框內(nèi)融合(圖1)。所得的質(zhì)粒命名為pL2SA，可用于在乳酸乳球菌中表達(dá)和分泌抗生蛋白鏈菌素(見下面)。然后經(jīng)過克隆編碼蛋白質(zhì)A錨區(qū)的PCR擴增的DNA片段構(gòu)建含有融合到pL2SA中的抗生蛋白鏈菌素基因3’端的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)AC端錨著區(qū)(稱為X區(qū))的質(zhì)粒pL2SAX(見步驟1和圖1)。含pL2SAX的乳球菌表達(dá)菌株表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)AC端區(qū)融合蛋白，它牢固地附著于細(xì)胞壁上(見下面)。
抗生蛋白鏈菌素和抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白質(zhì)在乳酸乳球菌中的表達(dá)從大腸桿菌菌株MC1022分離質(zhì)粒pL2SA和pL2SAX并用于經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化含pILPol的乳酸乳球菌T7表達(dá)宿主菌株MG1820(菌株UCP1000，Wells等，1993)。經(jīng)過用乳糖代替生長培養(yǎng)基中的葡萄糖在乳酸乳球菌中誘導(dǎo)抗生蛋白鏈菌素和抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白的表達(dá)(Steidler等，1995)。為了檢測抗生蛋白鏈菌素蛋白產(chǎn)物在乳酸乳球菌中的表達(dá)，用已誘導(dǎo)3小時的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分級分離和免疫印跡分析。首先經(jīng)離心沉淀10ml細(xì)胞，以100,000g第二次離心上清1小時以去掉任何不溶物質(zhì)。然后如前所述經(jīng)酚提取從高速上清回收蛋白成份(Steidler等，1995)。在第一步中獲得的細(xì)胞沉淀在Tris緩沖鹽溶液(TBS0.15M NaCl，0.02M Tris-HCl，pH7.5)中洗滌3次并重懸于含0.6mg溶葡球菌素(Sigma，St.Louis，USA)的250μl 10％蔗糖，20mM Tris-HCl(pH7.5)中并在37℃培養(yǎng)1小時以酶促消化細(xì)胞壁。
用溶葡球菌素處理后，經(jīng)離心從酶促釋放的細(xì)胞壁物質(zhì)分離細(xì)胞(稱為殘渣)并經(jīng)過在Laemmli破碎緩沖液中煮沸溶解。稱為“溶葡球菌素釋放的蛋白質(zhì)級分”的上清同樣用破碎緩沖液處理。以生長培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)，使用標(biāo)準(zhǔn)程序經(jīng)過用抗抗生蛋白鏈菌素的抗血清免疫印跡分析溶葡球菌素釋放的級分和細(xì)胞殘渣。溶葡球菌素已顯示出特異性地釋放連接到存在于細(xì)胞壁肽聚糖上的五甘氨酸肽上的蛋白質(zhì)(Schneewind等，1993)。
細(xì)胞分級分離及從含pL2SA的乳酸乳球菌表達(dá)菌株UCP1000回收的蛋白質(zhì)的免疫印跡分析的結(jié)果顯示乳酸乳球菌產(chǎn)生了抗生蛋白鏈菌素預(yù)期大小的蛋白質(zhì)并分泌進(jìn)生長培養(yǎng)基。在用溶葡球菌素處理的細(xì)胞的總細(xì)胞蛋白殘渣中未檢測到抗生蛋白鏈菌素且在溶葡球菌素釋放的細(xì)胞壁物質(zhì)中僅檢測到痕量的蛋白質(zhì)(見圖2)。在該菌株中，經(jīng)過用溶葡球菌素處理細(xì)胞釋放的分泌型抗生蛋白鏈菌素總量比例相當(dāng)小可能是抗生蛋白鏈菌素在通過細(xì)胞膜運輸后未通過細(xì)胞壁擴散的結(jié)果。
與這些發(fā)現(xiàn)相反，攜帶pL2SAX的菌株產(chǎn)生的抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白質(zhì)不分泌進(jìn)生長培養(yǎng)基。然而，這一融合蛋白質(zhì)在通過用溶葡球菌素處理從細(xì)胞壁釋放的物質(zhì)中大量存在表明它與細(xì)胞壁相聯(lián)系(圖2)。在溶葡球菌素處理的細(xì)胞沉淀(殘渣)中也檢測到融合蛋白表明部分釋放的蛋白質(zhì)在用溶葡球菌素培養(yǎng)期間不擴散出細(xì)胞壁。當(dāng)在Laemmli破碎緩沖液中煮沸表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白的洗滌細(xì)胞時，以免疫印跡分析檢測到的蛋白質(zhì)表觀分子量大于在用溶葡球菌素處理的細(xì)胞級分上清中檢測到的蛋白質(zhì)(圖2)。這種較高分子量的多肽可能代表在將融合蛋白質(zhì)分類并錨著于細(xì)胞壁上的途徑中的一種中間產(chǎn)物。在煮沸的溶葡球菌素處理的細(xì)胞的細(xì)胞沉淀(殘渣)部分中發(fā)現(xiàn)兩種形式的蛋白質(zhì)，表明用溶葡球菌素更溫和地酶促處理細(xì)胞不釋放較高分子量形式的融合蛋白質(zhì)進(jìn)入上清。
在乳酸乳球菌表面顯露抗生蛋白鏈菌素為顯示抗生蛋白鏈菌素融合到金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的C端區(qū)域會導(dǎo)致表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面顯露，將表達(dá)抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素蛋白質(zhì)A融合產(chǎn)物的乳酸乳球菌菌株在含1％牛血清白蛋白(BSA)的TBS中洗滌3次，然后用生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(1μg)在室溫培養(yǎng)1小時。在可溶性抗生蛋白鏈菌素存在下也用生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶培養(yǎng)細(xì)胞的對照樣品以顯示與細(xì)胞的結(jié)合可通過與游離底物的競爭來抑制。然后用含1％BSA的TBS洗滌細(xì)胞3次并借助于真空裝置收獲得到硝酸纖維素濾膜上。根據(jù)廠家建議在TMB(辣根過氧化物酶底物)溶液中培養(yǎng)濾膜檢測到生物素與細(xì)胞表面的結(jié)合。圖3的結(jié)果顯示了生物素辣根過氧化物酶綴合物結(jié)合到表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白的完整細(xì)胞的表面但不結(jié)合表達(dá)抗生蛋白鏈菌素的細(xì)胞?？膳懦锼?辣根過氧化物酶綴合物非特異性地結(jié)合表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白質(zhì)的乳酸乳球菌細(xì)胞表面的可能性，因為在可溶性抗生蛋白鏈菌素存在下抑制結(jié)合。
特異性固著在其細(xì)胞表面表達(dá)抗生蛋白鏈菌素的乳酸乳球菌細(xì)胞為提供特異性結(jié)合在其細(xì)胞表面表達(dá)抗生蛋白鏈菌素的細(xì)菌細(xì)胞的固相表面，用1μg/ml生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶(BoehringerMannheim，德國)在1ml TBS中室溫下覆蓋培養(yǎng)皿(20mm，Maxisotp，Nunc.丹麥)1小時。然后，經(jīng)過在室溫下用含1％BSA的2mlTBS培養(yǎng)平板2小時封閉非特異性結(jié)合位點。10ml表達(dá)抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞在TBS中洗滌3次并重懸于1ml含1％BSA的TBS中室溫下1。在該培養(yǎng)步驟期間經(jīng)過每分鐘搖動6秒使細(xì)胞保持懸浮。最后，用TBS將細(xì)胞懸液稀釋成10ml，將1ml該懸液加入預(yù)處理的培養(yǎng)皿(見上文)中室溫下1小時。然后在軌道搖床上10分鐘內(nèi)用1ml TBS洗滌培養(yǎng)皿3次，然后以光學(xué)顯微鏡檢查法檢查它們。結(jié)果(圖4和表1)表明，表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合蛋白的乳酸乳球菌結(jié)合引用生物素-堿性磷酸酶覆蓋的培養(yǎng)皿表面，但不結(jié)合到未用該綴合物處理的培養(yǎng)皿表面。表達(dá)并分泌抗生蛋白鏈菌素的細(xì)胞不結(jié)合到覆蓋的或未覆蓋的培養(yǎng)皿表面。表達(dá)抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合產(chǎn)物的細(xì)胞的結(jié)合被加入可溶性抗生蛋白鏈菌素抑制表明該結(jié)合是特異性的且通過生物素與存在于細(xì)胞表面的抗生蛋白鏈菌素來介導(dǎo)(表1)。
表1表面結(jié)合測定的結(jié)果表面處理乳酸乳球菌菌株 (i)1％BSA (i)1μg/ml B-AP (i)μg/ml B-AP(ii)1％BSA(ii)30μg/ml SA(iii)1％BSAMG1820(pILPol，pL2S ND ND NDA)MG1820(pILPol，pL2S ND 2×105mm-1NDAX)表1的說明，乳酸乳球菌的表達(dá)菌株要為攜帶質(zhì)粒pL2SAX并產(chǎn)生抗生蛋白鏈菌素-蛋白質(zhì)A融合產(chǎn)物，要為攜帶質(zhì)粒pL2SA并產(chǎn)生抗生蛋白鏈菌素，ND；未檢測到，B-AP，生物素-堿性磷酸酶綴合物，BSA牛血清白蛋白，SA抗生蛋白鏈菌素。
實施例2減毒毒素片段C(TTFC)抗原在乳酸乳球菌表面的顯露這一另外的實施例提供了經(jīng)過構(gòu)建編碼融合蛋白的嵌合基因可將蛋白質(zhì)抗原牢固地附著于乳酸乳球菌表面的證據(jù)，其中該嵌合基因含編碼(1)N-端分泌信號，(2)將要進(jìn)行表面表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原和(3)金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A細(xì)胞壁分類和錨著區(qū)的核酸。
第一步克隆并遺傳操作TTFC和金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A錨著區(qū)(1a)pTREX和pTREX1的構(gòu)建經(jīng)過在200μl1×TBE，150mM NaCl中煮沸20μg各寡核苷酸并使其冷卻到室溫退火編碼推斷的RNA穩(wěn)定序列，翻譯起始區(qū)和靶基因的多克隆位點的合成寡核苷酸。使用Tf1 DNA聚合酶在含250μM脫氧核苷酸三磷酸酯和1.5mM MgCl2的1×Tf1緩沖液中35℃、45℃，55℃和65℃各1分鐘，接著72℃10分鐘延伸退火的寡核苷酸。有義和反義寡核苷酸分別在其5’端含有NheI和BamHI的識別位點以利于進(jìn)一步克隆。
用NheI和BamHI切割所得的雙鏈DNA片段，并克隆進(jìn)pUC19NT7的XbaI和BamHI位點之間，pUC19NT7是pUC19的衍生物，它含有來自pLET1(Wells等，1993C)且克隆進(jìn)EcoRI和Hind III位點之間的T7表達(dá)盒。所得的構(gòu)建體命名為pUCLEX。然后經(jīng)過用Hind III切割并鈍端化，接著在克隆進(jìn)pIL253的EcoRI和SacI(鈍端化)位點之前用EcoRI切割去掉pUCLEX中的完整表達(dá)盒以產(chǎn)生載體pTREX。為了構(gòu)建表達(dá)載體pTREX1，含乳球菌啟動子P1的PCR擴增的DNA片段克隆進(jìn)存在于載體pTREX的表達(dá)盒中的EcoRI和Bgl II位點之間(圖5)。該啟動子以前已經(jīng)使用啟動子探針載體pSB292分離并經(jīng)引物延伸和DNA序列分析鑒定(Waterfield等，1995)。
(1b)質(zhì)粒pTIL2TT的構(gòu)建使用質(zhì)粒pLET2-TTFC作模板及公開的序列(Wells等，1993b)經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得編碼融合到usp45基因的乳球菌信號分泌先導(dǎo)序列上的減毒毒素片段C基因的DNA片段。用熱穩(wěn)定性vent DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室)在含dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM，1μM有義和反義引物(圖6)及大約50ng質(zhì)粒pLET2-TTFC作模板DNA的廠家提供的100μl反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行PCR。反義引物設(shè)計成包括在其5’端的BamHI位點以利于隨后的克隆步驟。經(jīng)30個循環(huán)的變性(94℃45秒)，引物退火(50℃30秒)和DNA聚合(72℃120秒)后，以瓊脂糖凝膠電泳檢測預(yù)期大小的PCR擴增的DNA產(chǎn)物(1478bp的雙鏈DNA)。然后用限制性核酸內(nèi)切酶Barn HI消化純化的DNA片段并克隆進(jìn)首先用SphI酶切鈍化，然后用BamHI酶切的乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pTREX1中。命名為pTIL2TT的所得的質(zhì)粒在圖5中顯示。
(1c)pTITT的構(gòu)建以PCR(使用標(biāo)準(zhǔn)條件；見上面)產(chǎn)生減毒毒素片段C(TTFC)的片段，在其5’和3’端分別編碼XbaI和BamHI位點。在TTFC序列的3’端BamHI位點前導(dǎo)入終止密碼子。TTFC PCR片段首先克隆進(jìn)pUCLEX的XbaI和BamHI位點之間，然后經(jīng)過用SphI-BamHI剪切取出并再克隆進(jìn)SphI和BamHI消化的pTRIX1。命名為pTITT的所得的質(zhì)粒在圖5中顯示。
(1d)pTTA的構(gòu)建使用以公開序列為基礎(chǔ)的引物(圖6)經(jīng)PCR獲得編碼金黃色葡萄球菌菌株Cowan INCTC8530的葡萄球菌屬蛋白質(zhì)A(SPA)錨的DNA片段。有義和反義引物設(shè)計成在其5’端分別包括BamHI和BglII的限制性核酸內(nèi)切酶位點以利于隨后的克隆步驟。用熱穩(wěn)定性Vent DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室)在含dATP，dTTP，dCTP和dGTP各2.5mM，1μM有義和反義引物(圖6)及大約50ng質(zhì)粒pL2SAX(在本專利中進(jìn)一步描述)作模板DNA的廠家提供的100μl反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行PCR。經(jīng)30個循環(huán)的變性(94℃45秒)，引物退火(55℃30秒)和DNA聚合(72℃35秒)后，以瓊脂糖凝膠電泳檢測預(yù)期大小的PCR擴增的DNA產(chǎn)物。然后用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和BglII消化純化的DNA片段并克隆進(jìn)質(zhì)粒pTIL2TT，該質(zhì)粒已經(jīng)首先用BamHI酶切并根據(jù)廠家建議的方法使用小牛腸道磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。所得的命名為pTTA的質(zhì)粒含有融合到TTFC基因3’端的金黃色葡萄球菌蛋白A C端區(qū)(稱為X區(qū))(圖5)。
第二步TTFC蛋白質(zhì)A融合蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)和表面顯露為了顯示TTFC融合到金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的C端區(qū)域會導(dǎo)致表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面顯露，經(jīng)離心收獲細(xì)胞內(nèi)表面TTFC(即攜帶質(zhì)粒pTITT)分泌TTFC(即，攜帶質(zhì)粒pTIL2TT)或TTFC蛋白質(zhì)A融合產(chǎn)物(即，攜帶質(zhì)粒pTTA)的乳酸乳球菌菌株，在含1％BSA的TBS(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)中洗滌3次，然后用1μg兔抗-TTFC在室溫下培養(yǎng)30分鐘。然后用1ml TBS洗滌細(xì)胞3次并重懸于1ml TBS中。借助于真空裝置將100μl該細(xì)胞懸液中的細(xì)胞收獲得到硝酸纖維素膜(0.22μm)上。然后，在室溫下在5ml含5μg連接到辣根過氧化物酶(Boehringer Mannheim)上的抗兔IgG的PBS-2.5％脫脂奶粉中培養(yǎng)膜。根據(jù)廠家建議經(jīng)過在TMB(辣根過氧化物酶底物)溶液中培養(yǎng)濾膜檢測到抗兔過氧化物酶與結(jié)合于攜帶pTTA而不是攜帶pTIL2TT和pTITT的乳酸乳球菌完整細(xì)胞表面上的兔抗TTFC抗體結(jié)合。顯示于圖7中的結(jié)果表明僅在表達(dá)TTFC蛋白質(zhì)A融合蛋白質(zhì)的完整細(xì)胞表面檢測到TTFC。
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權(quán)利要求
1.一種重組載體，它包括編碼融合蛋白的核酸，該融合蛋白包含一個分泌信號序列，一個所需的蛋白質(zhì)或多肽及一個細(xì)胞壁附著區(qū)，以便當(dāng)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)革蘭氏陽性細(xì)菌宿主時表達(dá)融合蛋白質(zhì)，所需的蛋白質(zhì)或多肽附著并顯露于宿主細(xì)胞壁的外表面。
2.如權(quán)利要求1所要求的重組載體，其中革蘭氏陽性宿主生物是乳球菌屬種類，枯草芽孢桿菌，格氏鏈球菌，木糖葡萄球菌，乳芽孢桿菌屬種類，芽孢桿菌屬的嗜冷的和向冷的種類，梭狀芽孢桿菌屬種類或棒狀桿菌屬種類。
3.如權(quán)利要求2所要求的重組載體，其中革蘭氏陽性宿主生物是乳球菌屬宿主，優(yōu)選是乳酸乳球菌。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所要求的重組載體，其中分泌信號序列能經(jīng)過分泌的sec依賴性途徑靶向用于分泌的蛋白質(zhì)或多肽且來自天然分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。
5.如權(quán)利要求4所要求的重組載體。其中分泌信號肽來自蛋白質(zhì)usp45的信號序列。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所要求的重組載體，其中細(xì)胞壁附著區(qū)包括至少來自金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A的C端錨著區(qū)。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所要求的重組載體，其中編碼融合蛋白的核酸可操作地連接到指導(dǎo)其表達(dá)的控制序列上。
8.如權(quán)利要求7所要求的重組載體，其中的核酸進(jìn)一步包括在編碼融合蛋白的核酸上游的誘導(dǎo)型啟動子控制下的T7或T7樣聚合酶基因。
9.用權(quán)利要求1至8中任一項所限定的重組載體轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性宿主生物。
10.如權(quán)利要求9所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需蛋白質(zhì)或多肽被表達(dá)，且共價附著于細(xì)胞壁上并顯露于宿主生物表面的外表面上。
11.一種改造革蘭氏陽性宿主生物使在其表面顯露所需蛋白質(zhì)或多肽的方法，包括用編碼包括分泌信號序列。所需蛋白質(zhì)或多肽及細(xì)胞壁附著區(qū)的融合蛋白的重組核酸轉(zhuǎn)化宿主生物，使宿主能表達(dá)融合蛋白，從而細(xì)胞壁附著區(qū)使宿主在細(xì)胞壁表面附著并顯露所需蛋白質(zhì)或多肽。
12.如權(quán)利要求11所要求的方法，以權(quán)利要求2至8的任一個或多個特征改進(jìn)。
13.以權(quán)利要求11或權(quán)利要求12中所要求的方法可獲得的革蘭氏陽性宿主生物。
14.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需蛋白質(zhì)或多肽包括至少一個需要對其產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)的表位。
15.權(quán)利要墳14中所要求的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是來自病原體的免疫原，抗原或粘附素。
16.一種疫苗，包含權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所限定的革蘭氏陽性宿主生物與合適的載體混合。
17.權(quán)利要求14或權(quán)利要求15中所限定的革蘭氏陽性宿主生物在疫苗制備中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是需要誘導(dǎo)耐受性的蛋白質(zhì)或多肽。
19.權(quán)利要求18中所限定的革蘭氏陽性宿主生物在誘導(dǎo)對該蛋白質(zhì)或多肽的耐受性中的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是生物學(xué)活性分子。
21.如權(quán)利要求20所要求的革蘭氏陽性宿主生物，其中生物學(xué)活性分子是藥品，激素，酶，DNA/RNA結(jié)合蛋白或能在其它共同表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)上進(jìn)行次級修飾的物質(zhì)。
22.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是能指導(dǎo)宿主生物與靶位點結(jié)合的靶向基團(tuán)。
23.如權(quán)利要求20所要求的革蘭氏陽性宿主生物，其中靶向基團(tuán)是抗體，或其片段，它能結(jié)合靶抗原或半抗原或是粘附素。
24.一種藥用組合物，包含如權(quán)利要求9，10或18至23中任一項所限定的革蘭氏陽性宿主生物。
25.如權(quán)利要求9，10，13-15或18至23中任一項所限定的革蘭氏陽性宿主生物用于醫(yī)藥。
26.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是配體特異性結(jié)合配偶體。
27.權(quán)利要求26中所要求的革蘭氏陽性宿主生物，其中配體結(jié)合到固相表面使宿主生物可固著于其上。
28.權(quán)利要求27中所要求的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是抗生蛋白鏈菌素，配體是生物素或生物素連接物，例如生物素標(biāo)記的酶，如生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶。
29.固著權(quán)利要求26至28中任一項所限定的革蘭氏陽性宿主生物的方法，包括將宿主生物與配體固著于其上的表面接觸。
30.權(quán)利要求26至28中任一項所限定的革蘭氏陽性宿主生物在純化或分離配體中的應(yīng)用。
31.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物在檢測具有特異性配體的復(fù)合物中的應(yīng)用，其中核酸進(jìn)一步包括表達(dá)時產(chǎn)生報道活性的基因。
32.如權(quán)利要求31中所要求的應(yīng)用，其中的報道活性是熒光蛋白或熒光素酶且所需的蛋白質(zhì)是抗生蛋白鏈菌素。
33.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中所需的蛋白質(zhì)或多肽是酶。
34.一種組合物，包含如權(quán)利要求33所限定的革蘭氏陽性宿主生物，其中該酶被表達(dá)且暴露于宿主生物的細(xì)胞表面。
35.如權(quán)利要求34所限定的組合物用于由反應(yīng)所催化的反應(yīng)。
36.一種篩選物質(zhì)文庫的方法，包含用編碼該物質(zhì)與細(xì)胞壁錨著區(qū)的融合物的核酸轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性宿主生物并在細(xì)胞表面表達(dá)該融合物的步驟。
37.如權(quán)利要求36所要求的方法，其中該物質(zhì)是抗體或抗原或其片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了在革蘭氏陽性宿主生物中獲得所需蛋白質(zhì)或多肽的表面表達(dá)的方法。另外,還公開了在該方法中有用的載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性宿主生物。
文檔編號A61K39/00GK1201493SQ9619808
公開日1998年12月9日 申請日期1996年9月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月7日
發(fā)明者L·斯泰德勒, E·里茂特, J·M·威爾斯 申請人:L·斯泰德勒, E·里茂特, J·M·威爾斯