專利名稱：編碼用于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞攝入的dna分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼用于結(jié)核分枝桿菌攝入的DNA分子和其在藥物、疫苗及診斷測(cè)試中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是世界上主要的死亡原因，據(jù)估計(jì)每年有9百萬(wàn)新發(fā)病的結(jié)核病例且由該疾病引起290萬(wàn)人死亡。在美國(guó)，穩(wěn)定下降的結(jié)核病發(fā)生率自從1985年起開始回升。該問題還由于日益增加的結(jié)核分枝桿菌的耐藥性菌株的出現(xiàn)而復(fù)雜化。
最近結(jié)核病的爆發(fā)包括大量HIV感染的病人集中居住的環(huán)境(如，醫(yī)院的AIDS病房，改造所(correctional facilities)，和收容所)。在這些爆發(fā)中也發(fā)生結(jié)核病向健康護(hù)理人員的傳播；18～50％的這樣人員在其皮試中表現(xiàn)轉(zhuǎn)化(conversion)。參見F.Laraque等.，“HIV感染病人中的結(jié)核病”，AIDS讀者(9月/10月1992)、在此引入以供參考。
結(jié)核分枝桿菌感染后有2種基本的臨床表現(xiàn)。
在大多數(shù)病例中，吸入的結(jié)核桿菌(通過吞噬性肺泡(alveolar)巨噬細(xì)胞而攝入)在稱為結(jié)核節(jié)(tubercles)的局部病灶中或者被直接殺死或者在細(xì)胞內(nèi)有一定限度地生長(zhǎng)。偶爾在小孩和免疫妥協(xié)個(gè)體中，有早期的血源性傳播，伴隨有小粟疹(米粒樣)病灶的形成或威脅生命的腦膜炎。更為普遍地是，在感染2～6周后，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫產(chǎn)生，并且免疫淋巴細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞向病灶的浸透導(dǎo)致殺死大多數(shù)桿菌和隔離該初步感染，經(jīng)常在感染個(gè)體中觀察不到癥狀。對(duì)結(jié)核菌素(tuberculin)純化的蛋白衍生物(“PPD”)的皮試反應(yīng)性和，在有些病例中，治愈的鈣化病灶X-射線證據(jù)提供感染的唯一證據(jù)，然而，休眠但存活的結(jié)核桿菌病菌以一種未知程度存在著。
第二個(gè)表現(xiàn)是感染惡化或爆發(fā)引起疾病發(fā)作。感染結(jié)核分枝桿菌的個(gè)體在一生中有10％的發(fā)病危險(xiǎn)。在每一種情況下，該桿菌在肺中最初的感染位點(diǎn)經(jīng)淋巴或血液傳播到身體的其它部位。肺尖(apex of thelung)和局部淋巴結(jié)為優(yōu)選的位點(diǎn)。胸膜(pleura)、淋巴管、骨骼、生殖-泌尿系統(tǒng)、腦膜、腹膜或皮膚的肺外結(jié)核約占結(jié)核病人的15％。雖然許多桿菌被殺死，但是一大部分浸潤(rùn)的吞噬細(xì)胞和肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞也死亡，產(chǎn)生特征性固態(tài)干酪樣(乳酪樣)壞死，在這里桿菌可以存活但不能大量繁殖。如果保護(hù)性免疫反應(yīng)占上風(fēng)，病灶可被遏制，盡管對(duì)肺或其它組織有一些殘余的損傷。如果壞死反應(yīng)延伸，發(fā)展進(jìn)支氣管，肺中產(chǎn)生孔洞，允許大量桿菌隨咳嗽傳播至體外。在最糟糕的情況下，固態(tài)的壞死也許是從炎癥細(xì)胞釋放水解酶的結(jié)果，可能會(huì)液態(tài)化，從而產(chǎn)生用于桿菌增殖的豐富培養(yǎng)基，或許達(dá)到每毫升109個(gè)。該病理性炎癥過程產(chǎn)生特征性虛弱、發(fā)熱、胸痛，咳嗽，并且，當(dāng)血管遭腐蝕時(shí)出現(xiàn)血痰。
對(duì)其致病力和發(fā)病機(jī)理的分子基礎(chǔ)知道甚少。已表明關(guān)于無(wú)毒菌株分子證據(jù)的建立、推斷的病原致病基因的鑒定和克隆、和證實(shí)致病性可通過這些基因傳遞給無(wú)毒菌株是必要的。盡管有無(wú)毒的結(jié)核分枝桿菌菌株存在，但突變的性質(zhì)是未知的。在背景技術(shù)中還沒有鑒定出涉及結(jié)核病發(fā)病機(jī)理的單一基因。侵入宿主細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)存活、生長(zhǎng)、傳播、或組織趨向性也不知道。沒有在分子水平鑒定現(xiàn)存藥物的靶向，并且沒有限定任何耐藥機(jī)制；在近20年來(lái)沒有鑒定過用于藥物開發(fā)的新的分枝桿菌靶向。
有很多用于結(jié)核病的醫(yī)療方案。由美國(guó)公眾健康協(xié)會(huì)和美國(guó)胸科協(xié)會(huì)推薦的處方是異煙肼利福平和對(duì)二氮雜苯酰胺聯(lián)合使用2個(gè)月接著再施用異煙肼和利福平4個(gè)月。在HIV感染的病人中，異煙肼和利福平的治療要額外持續(xù)7個(gè)月。該治療，稱為短期化療，對(duì)完成服藥的病人產(chǎn)生90％以上的治愈率。用于多重耐藥結(jié)核病的治療需要在起始處方中添加ethambutol和/或鏈霉素，或二線藥物，如卡那霉素、氨基羥丁基卡那霉素A(amikacin)曲霉素(capreomycin)、ethionamide，環(huán)絲氨酸、PAS、和氯苯吩嗪(clofazimin)。新的藥物，如ciprofloxacin和ofloxacin也可使用。對(duì)于感染傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌并表現(xiàn)PPD陽(yáng)性結(jié)果的個(gè)體，用異煙肼的化學(xué)預(yù)防在防止該病中約有90％的有效性。結(jié)核病和這些治療在B.Bloom等“結(jié)核病關(guān)于復(fù)發(fā)殺死劑的評(píng)述，”科學(xué)，2571055-64(1992)；“美國(guó)結(jié)核病的控制，”美國(guó)胸科協(xié)會(huì)，1461623-33(1992)；城市健康信息，11卷(1992)中有更為詳盡的討論，在此引用以供參考。
雖然當(dāng)前使用的對(duì)結(jié)核病的治療具有相對(duì)較高的成功水平，提高治療該病的成功率仍有必要。此外，就逐漸增加的抗傳統(tǒng)治療的結(jié)核分枝桿菌菌株水平而言，必須開發(fā)新型的治療。在結(jié)核病高發(fā)區(qū)，無(wú)論在美國(guó)還是在國(guó)外，這種抗性菌株變得越來(lái)越多。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且/或者在巨噬細(xì)胞中存活的能力的分離的DNA分子以及由這些分離的DNA分子編碼的分離的蛋白或多肽。該分子可作為異源DNA而插入表達(dá)載體以形成用于生產(chǎn)該蛋白或肽的重組DNA表達(dá)系統(tǒng)。同樣地，通常插入到表達(dá)載體以形成重組DNA表達(dá)系統(tǒng)的異源DNA可參入到細(xì)胞中以達(dá)到這個(gè)目的。
本發(fā)明分離的蛋白或多肽可與可藥用載體聯(lián)合以形成疫苗或單獨(dú)使用于給哺乳動(dòng)物，尤其是人類用藥，從而防止結(jié)核分枝桿菌的感染。作為選擇，本發(fā)明的每個(gè)蛋白或多肽可用于產(chǎn)生抗體或其結(jié)合部分。該抗體或其結(jié)合部分可單獨(dú)使用或與可藥用載體聯(lián)合使用以治療已接觸結(jié)核分枝桿菌的哺乳動(dòng)物，尤其是人類，從而誘導(dǎo)被動(dòng)免疫以防止疾病的發(fā)生。
本發(fā)明的蛋白或多肽或者產(chǎn)生的抗它們的抗體或其結(jié)合部分也可用于對(duì)組織或體液樣品中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)方法中。當(dāng)該蛋白或多肽被使用時(shí)，它們作為抗原而被提供。任何與該抗原或抗體的反應(yīng)用顯示樣品中結(jié)核分枝桿菌的存在的分析系統(tǒng)加以檢測(cè)。作為選擇，通過提供賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或在巨噬細(xì)胞中存活能力的基因的核苷酸序列或其片段作為核酸雜交分析或基因擴(kuò)增檢測(cè)方法(如用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法)中的探針、可在這樣的樣品中，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。檢測(cè)與該探針的任何反應(yīng)從而顯示出樣品中結(jié)核分枝桿菌的存在。
本發(fā)明的蛋白或多肽也可用于與結(jié)核分枝桿菌治療或檢測(cè)無(wú)關(guān)的目的。更具體地說，這些蛋白或多肽賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力的特性可用于允許這樣的細(xì)胞攝入其它物質(zhì)。這可用包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞要攝入的物質(zhì)和與該物質(zhì)相聯(lián)的本發(fā)明蛋白或多肽的產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明DNA分子的分離構(gòu)成了治療和檢測(cè)該細(xì)菌的顯著進(jìn)步。它也提供了用于預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染的疫苗和用于那些接觸結(jié)核分枝桿菌的患者的被動(dòng)免疫的藥劑的基礎(chǔ)。用于疫苗或產(chǎn)生藥劑的蛋白可用重組DNA技術(shù)高水平地制備。
在診斷應(yīng)用中，本發(fā)明蛋白或多肽以及抗它們的抗體和其結(jié)合部分允許快速檢測(cè)特定個(gè)體是否感染結(jié)核分枝桿菌。此外，這樣的檢測(cè)無(wú)須檢查待測(cè)個(gè)體的抗體反應(yīng)就可完成。
除了開發(fā)治療和診斷結(jié)核分枝桿菌的工具以外，本發(fā)明的賦予這樣的有機(jī)體進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力在需要將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞的治療中具有重要的用途。通過將本發(fā)明的蛋白或多肽與藥劑聯(lián)合，這樣的藥劑可迅速導(dǎo)入其所治療的細(xì)胞中。增強(qiáng)的細(xì)胞對(duì)該產(chǎn)物的攝取可降低藥物劑量，從而降低毒性和費(fèi)用。例如，在傳統(tǒng)的癌癥治療中，由于需要大劑量的用藥、藥物的毒性是一個(gè)主要的問題；本發(fā)明具有降低該高劑量水平而向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)攘炕蚋咚降乃幬锏臐摿Α?br> 此外，結(jié)合本發(fā)明的蛋白或多肽至DNA片段可與基因治療方案結(jié)合使用。特別地，本發(fā)明DNA分子編碼產(chǎn)物增加巨噬細(xì)胞攝取的能力提供了特異性地運(yùn)送基因至巨噬細(xì)胞的機(jī)會(huì)。這樣的系統(tǒng)不僅可用于誘導(dǎo)體液免疫而且可誘導(dǎo)細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A、 1B、和1C為感染結(jié)核分枝桿菌菌株HeLa細(xì)胞的超薄切片電鏡圖譜，包括H37Ra(ATCC25177)(圖1A)，和侵襲重組菌株大腸桿菌XL1-Blue(pZX7)(圖1B和1C)。電子透明區(qū)環(huán)繞結(jié)核分枝桿菌有機(jī)體(圖1A中箭頭)。該細(xì)胞在圖1A中與結(jié)核分枝桿菌菌株培養(yǎng)72小時(shí)且在圖1B和1C中與XL1-Blue(pZX7)培養(yǎng)7.5小時(shí)。在圖1C中可見復(fù)合有機(jī)體，表明細(xì)菌在吞噬體(phagosomes)中增殖。線段代表0.5μm。
圖2顯示從原始載體pZX7構(gòu)建單向缺失亞克隆(pZX7.3，pZX7.4，pZX7.5，和pZX7.6)和Bam HI-Pst I(pZX7.1)，Pst I-Hind DIII(pZX7.2)，和Bam HI-EcoRI(pZX7.7)亞克隆。黑杠代表結(jié)核分枝桿菌DNA序列，并且白杠代表pBluescript序列。亞克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-Blue且然后將這些轉(zhuǎn)化菌株與HeLa細(xì)胞單層培養(yǎng)物一起培養(yǎng)6小時(shí)。
圖3A、3B、和3C為與接觸非病原性大腸桿菌XL1-Blue(pBluescript)24小時(shí)(圖3C)相比接觸侵襲性重組大腸桿菌克隆XL1-Blue(pZX7)3小時(shí)(圖3A)和24小時(shí)(圖B)的人類巨噬細(xì)胞的超薄切片電鏡顯微照片。細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中被數(shù)層膜分隔并包圍(圖3B)。接觸XL1-Blue(pBluescript)24小時(shí)后巨噬細(xì)胞的電鏡顯微照片未見細(xì)菌。線段代表1μm。
圖4顯示丙酮沉淀的可溶性細(xì)菌細(xì)胞超聲裂解液成分的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在9％的凝膠中分析多肽(左側(cè))分子量標(biāo)準(zhǔn)(1道)，帶有在Bam HI-EcoRI pBluescript克隆位點(diǎn)之間含有無(wú)關(guān)的結(jié)核分枝桿菌DNA片段的載體(pZN7)的大腸桿菌XL1-Blue(2道)，和XL1-Blue(pZX7)(3道)。在8％的凝膠中分析(右側(cè))含有在pZX7(1道)和XL1-Blue(pZX7)(2道)Bam HI克隆位點(diǎn)上游12個(gè)堿基處導(dǎo)入2個(gè)堿基移碼的載體(pZX7.8)的XL1-Blue。分子大小在遠(yuǎn)端右側(cè)表示。我們?cè)赬L1-Blue(pZX7)的可溶性蛋白部分中檢測(cè)到一個(gè)52-KD的多肽(箭頭)。一個(gè)約50KD的蛋白由含pZX7.8的XL1-Blue表達(dá)。52-KD蛋白的表達(dá)總是與Hela細(xì)胞與重組大腸桿菌克隆的相互作用相關(guān)聯(lián)。
圖5顯示重組大腸桿菌裂解液的SDS-PAGE分析，低分子量標(biāo)記在1道，大腸桿菌BL21(DES)在2道，大腸桿菌BL21(DE3)(pET23c)在3道，未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)(pET23c-ORF1)在4道，且誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)(pET23c-ORF1)在5道。
圖6A與B顯示被結(jié)核分枝桿菌侵入相關(guān)性重組蛋白包裹的乳膠小珠與HeLa細(xì)胞相聯(lián)的透視電鏡研究。圖6A顯示重組蛋白包被小珠(箭頭)。圖6B顯示對(duì)照大腸桿菌裂解液蛋白-包被小珠(箭頭)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞中存活之能力的分離的DNA分子。該DNA分子包括相應(yīng)于如下所示的SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，GGATCGAATT GCTGGCCTTT GGCGGGCGATTCGTGGAGATCGCCCGTAGA AAGGTTCGCG 60GACGCCAAGG CCGCCGCAGA CCGCCATAAACGTAGTTGACCAGGTGGTCT TGACTGGGGC 120CGGACACCGA CGTGAACGAG GCGACCCGATCCGCGTTACATCCACCTGAT TCCGGCAAAT 180GTGAACGCCG ACATCAAGGC GACCACGGTGTTCGGCGGTAAGTATGTGTC GTTGACCACG 240CCGAAAAACC CGACAAAGAG GCGGATAACG CCAAAAGACG TCATCGACGT ACGGTCGGTG300ACCACCGAGA TCAACACGTT GTTCCAGACG CTCACCTCGA TCGCCGAGAA GGTGGATCCG360GTCAAGCTGA ACCTGACCCT GAGCGCGGCC GCGGAGGCGT TGACCGGGCT GGGCGATAAG420TTCGGCGAGT CGATCGTCAA CGCCAACACC GTTCTGGATG ACCTCAATTC GCGGATGCCG480CAGTCGCGCC ACGACATTCA GCAATTGGCG GCTCTGGGCG ACGTCTACGC CGACGCGGCG540CCGGACCTGT TCGACTTTCT CGACAGTTCG GTGACCACCG CCCGCACCAT CAATGCCCAG600CAAGCGGAAC TGGATTCGGC GCTGTTGGCG GCGGCCGGGT TCGGCAACAC CACAGCCGAT660GTCTTCGACC GCGGCGGGCC GTATCTGCAG CGGGGGGTCG CCGACCTGGT CCCCACCGCC720ACCCTGCTCG ACACTTATAG CCCGGAACTG TTCTGCACGA TCCGCAACTT CTACGATGCC780GATCGACCTG ACCGCGGGGC TGCCGCATAG GCCCGGAGTG GTTCGCGATC GGCGAGGCGC840ACGTCAAAGT GATTCGCGCC CTTTTTCGCC CACCTGCCCG CCGCGGTGGA TGTGTCCACC900CGCCAGGCCG CCGAAGCCGA CCTGGCCGGC AAAGCCGCTC AATATCGTCC CGACGAGCTG960GCCCGCTACG CCCAGCGGGT CATGGACTGG CTACACCCCG ACGGCGACCT CACCGACACC 1020GAACGCGCCC GCAAACGCGG CATCACCCTG AGCAACCAGC AATACGACGG CATGTCACGG 1080CTAAGTGGCT ACCTGACCCC CCAAGCGCGG GCCACCTTTG AAGCCGTGCT AGCCAAACTG 1140GCCGCCCCCG GCGCGACCAA CCCCGACGAC CACACCCCGG TCATCGACAC CACCCCCGAT 1200GCGGCCGCCA TCGACCGCGA CACCCGCAGC CAAGCCCAAC GCAACCACGA CGGGCTGCTG 1260GCCGGGCTGC GCGCGCTGAT CCGTCATCCT GCCATCTCGG CCCTCGGCGC CGCCAACTCC 1320AGGTGCTGTG CGGTCCACGC CGAACGCATG CACGCGATCT CGAATTGGTT GGCACCGTAT 1380TCGGGATGGA ACTGCTCGAT AGCGATGCCT GCTGCCGTTG CCGCGGCGTT GACATCGCGG 1440ACGAACGCCT CGTGCTCGAG CACCCCGGCG ACACCGTACT GCGCCCACAG CGTCGAAGGC 1500AGCCGCTGGC CGTCCGCGTC GACCAAGAGG AATTC 1535上面的DNA分子編碼具有約50至55千道爾頓分子量，優(yōu)選52千道爾頓的多肽。從相應(yīng)于SEQ.ID.No.1核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列代表一個(gè)高度親水性蛋白，在其羧基末端具有一個(gè)疏水區(qū)。它可為一個(gè)分泌蛋白，細(xì)胞質(zhì)蛋白，或以其羧基末端附著于有機(jī)體外膜的表面蛋白。據(jù)認(rèn)為該蛋白或多肽具有相應(yīng)于如下所示的SEQ.ID.No.2的推導(dǎo)的氨基酸序列Gly Ser Asn Cys Trp Pro Leu Ala Gly Asp Ser Trp Arg Ser Pro Val1 5 10 15Glu Arg Phe Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Asp Arg His Lys Arg Ser20 25 30Xaa Pro Gly Gly Leu Asp Trp Gly Arg Thr Pro Thr Xaa Thr Arg Arg35 40 45Pro Asp Pro Arg Tyr Ile His Leu Ile Pro Ala Asn Val Asn Ala Asp50 55 60Ile Lys Ala Thr Thr Val Phe Gly Gly Lys Tyr Val Ser Leu Thr Thr65 70 75 80Pro Lys Asn Pro Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys Asp Val Ile Asp85 90 95Val Arg Ser Val Thr Thr Glu Ile Asn Thr Leu Phe Gln Thr Leu Thr100 105 110Ser Ile Ala Glu Lys Val Asp Pro Val Lys Leu Asn Leu Thr Leu Ser115 120 125Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Leu Gly Asp Lys Phe Gly Glu Ser130 135 140Ile Val Asn Ala Asn Thr Val Leu Asp Asp Leu Asn Ser Arg Met Pro145 150 155 160Gln Ser Arg His Asp Ile Gln Gln Leu Ala Ala Leu Gly Asp Val Tyr165 170 175Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Phe Asp Phe Leu Asp Ser Ser Val Thr180 185 190Thr Ala Arg Thr Ile Asn Ala Gln Gln Ala Glu Leu Asp Ser Ala Leu195 200 205Leu Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Thr Thr Ala Asp Val Phe Asp Arg210 215 220Gly Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Gly Val Ala Asp Leu Val Pro Thr Ala225 230 235 240Thr Leu Leu Asp Thr Tyr Ser Pro Glu Leu Phe Cys Thr Ile Arg Asn245 250 255Phe Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Asp Arg Gly Ala Ala Ala Xaa Ala Arg260 265 270Ser Gly Ser Arg Ser Ala Arg Arg Thr Ser Lys Xaa Phe Ala Pro Phe275 280 285Phe Ala His Leu Pro Ala Ala Val Asp Val Ser Thr Arg Gln Ala Ala290 295 300Glu Ala Asp Leu Ala Gly Lys Ala Ala Gln Tyr Arg Pro Asp Glu Leu305 310 315 320Ala Arg Tyr Ala Gln Arg Val Met Asp Trp Leu His Pro Asp Gly Asp325 330 335Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala Arg Lys Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asn340345 350Gln Gln Tyr Asp Gly Met Ser Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Thr Pro Gln355 360 365Ala Arg Ala Thr Phe Glu Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Ala Pro Gly370 375 380Ala Thr Asn Pro Asp Asp His Thr Pro Val Ile Asp Thr Thr Pro Asp385 390 395 400Ala Ala Ala Ile Asp Arg Asp Thr Arg Ser Gln Ala Gln Arg Asn His405 410 415Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu Arg Ala Leu Ile Arg His Pro Ala Ile420 425430Ser Ala Leu Gly Ala Ala Asn Ser Arg Cys Cys Ala Val His Ala Glu435 440 445Arg Met His Ala Ile Ser Asn Trp Leu Ala Pro Tyr Ser Gly Trp Asn450 455 460Cys Ser Ile Ala Met Pro Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Thr Ser Arg465 470 475480Thr Asn Ala Ser Cys Ser Ser Thr Pro Ala Thr Pro Tyr Cys Ala His485 490 495Ser Val Glu Gly Ser Arg Trp Pro Ser Ala Ser Thr Lys Arg Asn500 505 510在緊接下去的序列中，Xaa表示終止密碼子。該分離蛋白或多肽的生嚴(yán)優(yōu)選用重組DNA技術(shù)完成。認(rèn)為該蛋白或多肽具有一個(gè)或更多個(gè)賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞中存活能力的抗原決定簇。
正如上面SEQ.ID.Nos.1和2中存在終止密碼子所示，這些序列構(gòu)成或由幾個(gè)開放閱讀框編碼。第1個(gè)開放閱讀框由SEQ.ID.No.1中核苷酸序列的181位置延伸至807位置。該賦予進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的序列具有下面的核苷酸序列(SEQ.ID.No.3)GTGAACGCCG ACATCAAGGC GACCACGGTG TTCGGCGGTA AGTATGTGTC GTTGACCACG 60CCGAAAAACC CGACAAAGAG GCGGATAACG CCAAAAGACG TCATCGACGT ACGGTCGGTG120ACCACCGAGA TCAACACGTT GTTCCAGACG CTCACCTCGA TCGCCGAGAA GGTGGATCCG180GTCAAGCTGA ACCTGACCCT GAGCGCGGCC GCGGAGGCGT TGACCGGGCT GGGCGATAAG240TTCGGCGAGT CGATCGTCAA CGCCAACACC GTTCTGGATG ACCTCAATTC GCGGATGCCG300CAGTCGCGCC ACGACATTCA GCAATTGGCG GCTCTGGGCG ACGTCTACGC CGACGCGGCG360CCGGACCTGT TCGACTTTCT CGACAGTTCG GTGACCACCG CCCGCACCAT CAATGCCCAG420CAAGCGGAAC TGGATTCGGC GCTGTTGGCG GCGGCCGGGT TCGGCAACAC CACAGCCGAT480GTCTTCGACC GCGGCGGGCC GTATCTGCAG CGGGGGGTCG CCGACCTGGT CCCCACCGCC540ACCCTGCTCG ACACTTATAG CCCGGAACTG TTCTGCACGA TCCGCAACTT CTACGATGCC600GATCGACCTG ACCGCGGGGC TGCCGCA 627相應(yīng)于SEQ.ID.No.3的核苷酸序列編碼下面的氨基酸序列(SEQ.ID.No.4)Val Asn Ala Asp Ile Lys Ala Thr Thr Val Phe Gly Gly Lys Tyr Val1 5 10 15Ser Leu Thr Thr Pro Lys Asn Pro Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys20 25 30Asp Val Ile Asp Val Arg Ser Val Thr Thr Glu Ile Asn Thr Leu Phe35 40 45Gln Thr Leu Thr Ser Ile Ala Glu Lys Val Asp Pro Val Lys Leu Asn50 55 60Leu Thr Leu Ser Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Leu Gly Asp Lys65 70 75 80Phe Gly Glu Ser Ile Val Asn Ala Asn Thr Val Leu Asp Asp Leu Asn85 90 95Ser Arg Met Pro Gln Ser Arg His Asp Ile Gln Gln Leu Ala Ala Leu100 105 110Gly Asp Val Tyr Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Phe Asp Phe Leu Asp115 120 125Ser Ser Val Thr Thr Ala Arg Thr Ile Asn Ala Gln Gln Ala Glu Leu130 135 140Asp Ser Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Thr Thr Ala Asp145 150 155 160Val Phe Asp Arg Gly Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Gly Val Ala AsP Leu165 170 175Val Pro Thr Ala Thr Leu Leu Asp Thr Tyr Ser Pro Glu Leu Phe Cys180 185 190Thr Ile Arg Asn Phe Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Asp Arg Gly Ala Ala195 200205Ala由該氨基酸序列編碼的蛋白或多肽具有一個(gè)或更多個(gè)賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的抗原決定簇。該蛋白或多肽具有22-28千道爾頓的分子量，優(yōu)選為25千道爾頓。
相應(yīng)于SEQ.ID.Nos.1和2的序列含有一個(gè)額外的開放閱讀框或由其所編碼，它被認(rèn)為賦予結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力。相應(yīng)于該開放閱讀框的核苷酸序列如下(SEQ.ID.No.5)GTGGATGTGT CCACCCGCCA GGCCGCCGAA GCCGACCTGG CCGGCAAAGC CGCTCAATAT 60CGTCCCGACG AGCTGGCCCG CTACGCCCAG CGGGTCATGG ACTGGCTACA CCCCGACGGC 120GACCTCACCG ACACCGAACG CGCCCGCAAA CGCGGCATCA CCCTGAGCAA CCAGCAATAC 180GACGGCATGT CACGGCTAAG TGGCTACCTG ACCCCCCAAG CGCGGGCCAC CTTTGAAGCC 240GTGCTAGCCA AACTGGCCGC CCCCGGCGCG ACCAACCCCG ACGACCACAC CCCGGTCATC 300GACACCACCC CCGATGCGGC CGCCATCGAC CGCGACACCC GCAGCCAAGC CCAACGCAAC 360CACGACGGGC TGCTGGCCGG GCTGCGCGCG CTGATCCGTC ATCCTGCCAT CTCGGCCCTC 420GGCGCCGCCA ACTCCAGGTG CTGTGCGGTC CACGCCGAAC GCATGCACGC GATCTCGAAT 480TGGTTGGCAC CGTATTCGGG ATGGAACTGC TCGATAGCGA TGCCTGCTGC CGTTGCCGCG 540GCGTTGACAT CGCGGACGAA CGCCTCGTGC TCGAGCACCC CGGCGACACC GTACTGCGCC 600CACAGCGTCG AAGGCAGCCG CTGGCCGTCC GCGTCGACCA AGAGGAATTC 650相應(yīng)于SEQ.ID.No.5的核苷酸序列編碼具有下面氨基酸序列的蛋白或多肽(SEQ.ID.No.6)Val Asp Val Ser Thr Arg Gln Ala Ala Glu Ala Asp Leu Ala Gly Lys15 10 15Ala Ala Gln Tyr Arg Pro Asp Glu Leu Ala Arg Tyr Ala Gln Arg Val20 25 30Met Asp Trp Leu His Pro Asp Gly Asp Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala35 40 45Arg Lys Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asn Gln Gln Tyr Asp Gly Met Ser50 55 60Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Thr Pro Gln Ala Arg Ala Thr Phe Glu Ala65 70 75 80Val Leu Ala Lys Leu Ala Ala Pro Gly Ala Thr Asn Pro Asp Asp His85 90 95Thr Pro Val Ile Asp Thr Thr Pro Asp Ala Ala Ala Ile Asp Arg Asp100 105 110Thr Arg Ser Gln Ala Gln Arg Asn His Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu115 120 125Arg Ala Leu Ile Arg His Pro Ala Ile Ser Ala Leu Gly Ala Ala Asn130 135 140Ser Arg Cys Cys Ala Val His Ala Glu Arg Met His Ala Ile Ser Asn145150 155 160Trp Leu Ala Pro Tyr Ser Gly Trp Asn Cys Ser Ile Ala Met Pro Ala165 170 175Ala Val Ala Ala Ala Leu TAr Ser Arg Thr Asn Ala Ser Cys ser Ser180 185 190Thr Pro Ala Thr Pro Tyr Cys Ala His Ser Val Glu Gly Ser Arg Trp195200 205推斷的賦予結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的蛋白或多肽具有預(yù)期的至少21千道爾頓的分子量。因?yàn)镾EQ.ID.No.6為在末端沒有終止密碼子的DNA分子所編碼，預(yù)期在自然狀態(tài)下該蛋白或多肽具有大于SEQ.ID.No.6 216千道爾頓的分子量。參見SEQ.ID.No.5。因此，在自然狀態(tài)，賦予在巨噬細(xì)胞中存活的蛋白或多肽被認(rèn)為是更長(zhǎng)。
本發(fā)明的蛋白或多肽優(yōu)選通過傳統(tǒng)技術(shù)以純化形式生產(chǎn)。例如，見下面的實(shí)施例5-6。為了分離該蛋白，繁殖帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌宿主細(xì)胞，勻漿、離心勻漿產(chǎn)物以去除細(xì)菌碎片。然后將上清進(jìn)行隨后的硫酸銨沉淀。含有本發(fā)明蛋白的部分在適當(dāng)大小的萄聚糖或聚丙烯酰胺柱中進(jìn)行凝膠過濾以分離該蛋白。如果必要，可進(jìn)一步以HPLC純化該蛋白餾分。
任何一個(gè)賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或在巨噬細(xì)胞中存活能力的DNA分子可用傳統(tǒng)的重組DNA技術(shù)插入到細(xì)胞中。一般來(lái)說，該過程包括將選定的DNA分子插入到一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，該DNA分子量是異源的(即，正常情況下不存在)。該異源DNA分子以適當(dāng)?shù)姆较蚝驼_的閱讀框插入到表達(dá)系統(tǒng)或載體中。載體含有用于插入蛋白-編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件。
美國(guó)專利No.4,237,224(Cohen和Boyer，在此引用僅供參考)描述了用限制酶切和DNA連接酶連接以重組質(zhì)粒形式生產(chǎn)表達(dá)系統(tǒng)。這些重組質(zhì)粒然后通過轉(zhuǎn)化手段導(dǎo)入并在包括原核生物和生長(zhǎng)培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制。
重組基因也可導(dǎo)入病毒，如牛痘病毒。重組病毒可通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入病毒感染的細(xì)胞而產(chǎn)生。
合適的載體包括，但不限于，下面的病毒載體如λ載體系統(tǒng)gtll，gtWES.tB，Charon 4，和質(zhì)粒載體如pBR322，pBR325，pACYC 177，pACYC184，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pR290，pKC37，pKC101，SV40，pBluecript II SK+/-或KS+/-(見Stratagene，La Jolla，Calif的“Stratagene克隆系統(tǒng)”Catalog(1993)，在此引用僅供參考)，pQE.pIH821，pGEX，pET系列(見F·W，Studier等.，“使用T7 RNA聚合酶指導(dǎo)克隆基因的表達(dá)，”基因表達(dá)技術(shù)185卷(1990)，在此引用僅供參考)及其任何衍生物。重組分子可通過轉(zhuǎn)化，尤其是轉(zhuǎn)導(dǎo)，接合，遷移或電穿孔而導(dǎo)入細(xì)胞。DNA序列用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的克隆程序克隆進(jìn)入載體，如Maniatis等所述.，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)，在此引用以供參考。
可使用各種宿主-載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)蛋白-編碼序列。首先，載體系統(tǒng)必須與所用的宿主細(xì)相容。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于如下以噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA，或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；微生物如含有酵母載體的酵母；用病毒(如，牛痘病毒，腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)(如，桿狀病毒)。這些載體的表達(dá)元件強(qiáng)度和特異性各異。依據(jù)所用的宿主載體系統(tǒng)，可用許多合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一個(gè)。
不同的遺傳和信號(hào)和加工事件控制基因表達(dá)的許多水平(如，DNA轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)的翻譯)。
DNA轉(zhuǎn)錄依賴于啟動(dòng)子的存在，它是引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列并且因此啟動(dòng)mRNA合成。真核啟動(dòng)子DNA序列不同于原核啟動(dòng)子DNA序列。此外，真核啟動(dòng)子和伴隨的遺傳信號(hào)在原核系統(tǒng)中可能不被識(shí)別或不起作用，并且，此外，原核啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中不被識(shí)別和不起作用。
同樣地，在原核細(xì)胞中mRNA的翻譯依賴于不同于真核細(xì)胞信號(hào)的適當(dāng)原核細(xì)胞信號(hào)的存在。在原核細(xì)胞中mRNA的有效翻譯需要mRNA上稱為Shine-Dalgarno(SD)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該序列是mRNA的短的核苷酸序列，位于起始密碼子，通常為AUG的前面，其編碼蛋白氨基末端的甲硫氨酸。SD序列與16S rRNA(核糖體RNA)的3′-末端互補(bǔ)并且可能通過與rRNA形成雙螺旋啟動(dòng)mRNA與核糖體的結(jié)合從而允許核糖體的正確定位。有關(guān)使基因表達(dá)最大化的綜述，見Roberts和Lauer，酶學(xué)方法，68473(1979)，在此引用以供參考。
啟動(dòng)子的“強(qiáng)度”(即，它們啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力)各異。為達(dá)到表達(dá)克隆基因的目的，為了獲得高水平基因轉(zhuǎn)錄和，因此達(dá)到的表達(dá)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子是必要的。依據(jù)所用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可用許多合適啟動(dòng)子中的任何一個(gè)。例如，當(dāng)在大腸桿菌中克隆時(shí)，可使用其噬菌體，或質(zhì)粒，啟動(dòng)子如T7噬菌體啟動(dòng)子，Lac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，recA啟動(dòng)子，核糖體RNA啟動(dòng)子，大腸桿菌噬菌體λ的PR和PL啟動(dòng)子及其它，包括但不限于，lacUV5，ompF，bla，lpp等指導(dǎo)相鄰DNA片段的高水平轉(zhuǎn)錄。此外，可用通過重組DNA或其它合成DNA技術(shù)生產(chǎn)的雜合trp-lacUV5(tac)啟動(dòng)子或其它大腸桿菌啟動(dòng)子以提供用于插入基因的轉(zhuǎn)錄。
可選擇在如果沒有特異誘導(dǎo)時(shí)抑制啟動(dòng)子作用的細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株和表達(dá)載體。在某些操縱子中，添加特異的誘導(dǎo)物對(duì)插入DNA的有效轉(zhuǎn)錄是必須的。例如，lac操縱子通過添加乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而誘導(dǎo)。多種其它操縱子，如trp，pro，等，處于不同的控制下。
在原核細(xì)胞中用于有效基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的特異起始信號(hào)也是需要的。通過分別定量基因特異性信使RNA和合成蛋白測(cè)得這些轉(zhuǎn)錄和翻譯起始信號(hào)“強(qiáng)度”可以各不相同。含有啟動(dòng)子的DNA表達(dá)載體也可包含各種“強(qiáng)”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號(hào)的任何組合。例如，在大腸桿菌中的有效翻譯需要距起始密碼子(ATG)約7-9個(gè)堿基的5′的Shine-Dalgarno(SD)序列以提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)。這樣，可以使用任何可被宿主細(xì)胞核糖體利用的SD-ATG組合。此外，可使用通過重組DNA或其它包括插入合成核苷酸的技術(shù)制備的任何SD-ATG組合。
一旦賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或在巨噬細(xì)胞中存活能力的所需的分離DNA分子克隆進(jìn)入表達(dá)系統(tǒng)，就容易將它插入宿主細(xì)胞。這樣的插入可依據(jù)載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，通過上述的各種形式的轉(zhuǎn)化來(lái)完成。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌，病毒，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。
一般來(lái)說，人類免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生結(jié)合到細(xì)菌表面特異蛋白或碳水化合物上的抗體對(duì)病原細(xì)菌感染作出反應(yīng)?？贵w刺激結(jié)合到巨噬細(xì)胞，該細(xì)胞具有結(jié)合到抗體Fc區(qū)的受體。其它血清蛋白，稱為補(bǔ)體，包被外源顆粒并通過結(jié)合到巨噬細(xì)胞特異的表面受體刺激它們的攝入。一旦該顆粒結(jié)合到巨噬細(xì)胞表面，通過部分質(zhì)膜向顆粒表面連續(xù)的聚集便開始隨后的攝入過程。膜上的表面受體然后與顆粒表面均勻分布的配體相互作用以將表面連接。巨噬細(xì)胞包被的顆粒然后運(yùn)送至溶酶體，該顆粒在此被攝入。
有些有機(jī)體被巨噬細(xì)胞攝入(即經(jīng)歷攝入)但不被殺死。結(jié)核分枝桿菌就是其中之一，結(jié)果，這樣的有機(jī)體能夠不確定地在巨噬細(xì)胞中存活并且，一旦逃離巨噬細(xì)胞時(shí)，導(dǎo)致激活的結(jié)核病。
就本發(fā)明對(duì)賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的核苷酸序列的測(cè)定而言，表明結(jié)核分枝桿菌攝入的分子基礎(chǔ)。有了該信息和上述的重組DNA技術(shù)，可開發(fā)廣泛的分別用于治療和檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的治療和/或預(yù)防試劑和診斷程序。
例如，有效量的本發(fā)明的蛋白或多肽可作為疫苗單獨(dú)或與藥用上可接受的載體聯(lián)合施用于人類用于預(yù)防結(jié)核分枝桿菌的感染。作為選擇，給接觸結(jié)核分枝桿菌的個(gè)體施用有效量的抗這些蛋白或多肽的抗體或其結(jié)合部分作為被動(dòng)免疫是可能的。這樣的抗體或其結(jié)合部分單獨(dú)施用或與藥用上可接受的載體聯(lián)合施用以實(shí)現(xiàn)對(duì)最近接觸結(jié)核分枝桿菌的個(gè)體進(jìn)行的短期治療。
適用于誘導(dǎo)被動(dòng)免疫的抗體可為單克隆或多克隆抗體。
單克隆抗體的制備可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)完成。基本上，該過程包括首先從預(yù)先以感興趣的抗原(即本發(fā)明蛋白或多肽)體內(nèi)或體外免疫的哺乳動(dòng)物(如，小鼠)脾臟中獲得免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)。分泌抗體的淋巴細(xì)胞然后與能在細(xì)胞培養(yǎng)物無(wú)限繁殖的(小鼠)，骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞融合，因而制備出永久的分泌免疫球蛋白的細(xì)胞系。培養(yǎng)得到的融合細(xì)胞或雜交瘤并且篩選得到的集落用于生產(chǎn)所需單克隆抗體。克隆產(chǎn)生這類抗體的集落，并在體內(nèi)或體外培養(yǎng)以生產(chǎn)大量抗體。融合這類細(xì)胞的理論基礎(chǔ)和實(shí)際方法學(xué)的描述在Kohler和Milstein，自然256495(1975)中提出，在此引用僅供參考。
哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞通過以本發(fā)明蛋白或多肽之一活體免疫動(dòng)物(如小鼠)而被免疫。必需以幾周的間隔重復(fù)這樣的免疫以獲得足夠滴度的抗體。在適當(dāng)?shù)娜芤夯蜃魟┲袔в胁《?。在最后一次抗原加?qiáng)后，殺死動(dòng)物并取出脾臟細(xì)胞。
與哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞融合或其它能在細(xì)胞培養(yǎng)物中無(wú)限繁殖的融合方式通過標(biāo)準(zhǔn)的和眾所周知的技術(shù)來(lái)完成，例如，通過用聚乙二醇(PEG)或其它融合試劑(見Milstein和Kohler，歐洲免疫學(xué)雜志。6511(1976)，在此引用以供參考)。選擇該永久的細(xì)胞系，優(yōu)選的為鼠源性的，但也可源自其它哺乳動(dòng)物種類的細(xì)胞，包括但不限于大鼠和人類，這些細(xì)胞系利用某些營(yíng)養(yǎng)物的必需酶有缺陷，能夠快速生長(zhǎng)并具有良好的融合能力。許多這樣的細(xì)胞系是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且其它被常規(guī)描述。
產(chǎn)生多克隆抗體的方法也眾所周知。通常，可通過給首先抽血以獲得免疫前血清的新西蘭白兔以產(chǎn)生這樣的抗體?？乖稍?個(gè)不同的位點(diǎn)以每位點(diǎn)100μl的總量注射。每次注射的物質(zhì)將包含人工表面活性劑佐劑普郎尼克多元醇(pluronic polyols)，或在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以后含有該蛋白或多肽的粉狀丙烯酰胺凝膠。在第一次注射后2周在兔體中抽血并以相同的抗原以6周的間隔3次加強(qiáng)免疫。然后在每次加強(qiáng)后10天收集血清樣品。然后用相應(yīng)于捕獲抗體的抗原通過親和色譜從血清中回收多克隆抗體。最后，該兔以戊巴比妥150mg/kg IV麻醉。這與其它用于產(chǎn)生多克隆抗體的方法在E.Harlow等，編，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(1988)中公開在此引用以供參考。例如，見下文實(shí)施例9。
除了利用完整的抗體外，本發(fā)明方法包括該抗體結(jié)合部分的使用。這樣的抗體片段可通過傳統(tǒng)的方法制備，如蛋白水解片段化方法；，如在J.Goding，單克隆抗體原理和實(shí)踐，p8.98-118(紐約，學(xué)術(shù)出版社1983)中所述，在此引用僅供參考。
本發(fā)明疫苗和被動(dòng)免疫試劑可經(jīng)口腔，腸外施用，例如，皮下，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜腔內(nèi)，通過鼻內(nèi)灌注，或通過應(yīng)用于粘膜，如，鼻，喉，和支氣管的粘膜施用。它們可單獨(dú)或與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體聯(lián)合施用，并且可以用固體或液體形式如，片劑，膠囊，粉末，溶液，懸液，或乳劑。
固體單位劑量形式可為傳統(tǒng)類型。該固體形式可為膠囊，如含有本發(fā)明蛋白或多肽或本發(fā)明抗體或其結(jié)合部分和載體，例如，潤(rùn)滑劑及惰性填充劑如，乳糖，蔗糖，或玉米淀粉的普通明膠類型。在另一實(shí)施方案中，這些化合物用傳統(tǒng)的片劑基質(zhì)如乳糖、蔗糖、或玉米淀粉與粘合劑如阿拉伯膠，玉米淀粉，或明膠，崩解劑如，玉米淀粉，土豆淀粉，或藻酸，和潤(rùn)滑劑硬脂酸或硬脂酸鎂聯(lián)合使用做成片劑。
本發(fā)明的蛋白或多肽或本發(fā)明的抗體或其結(jié)合部分也可通過這些物質(zhì)的溶液或懸液以生理上可接受的帶有藥物載體的稀釋劑以可注射的劑量施用。這樣的載體包括無(wú)菌液體如水和油類，其中添加或不添加表面活性劑和其它藥用上可接受的佐劑。油類的例子有石油，動(dòng)物，植物或人工來(lái)源的油，例如，花生油，大豆油，或礦物油。一般來(lái)說，水，鹽水，水溶性葡萄糖和相關(guān)的糖溶液，以及乙二醇如丙烯乙二醇或聚乙二醇為優(yōu)選的液體載體，尤其用于可注射的溶液。
對(duì)于用作氣霧劑，溶液中或懸液中本發(fā)明的蛋白或多肽或本發(fā)明的抗體或其結(jié)合部分可與適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，例如，碳?xì)浠衔锿七M(jìn)劑如丙烷，丁烷，或異丁烷及傳統(tǒng)的佐劑一起包裝于一個(gè)加壓的氣霧劑容器中。本發(fā)明的物質(zhì)也可用非加壓的形式施用，如噴霧劑(nebulizer或atomizer)。
在本發(fā)明另一個(gè)方面，本發(fā)明的蛋白或多肽可用作檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌體液診斷分析中的抗原。作為選擇，該桿菌的檢測(cè)可以采用抗該抗原的抗體或其結(jié)合部分的診斷分析加以完成。這種技術(shù)允許在以下組織或體液樣品中對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)血液，脊髓液，痰，胸積液(pleuralfluid)，尿，支氣管肺泡灌洗液，淋巴結(jié)，骨髓，或其它活檢材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該分析系統(tǒng)具有夾心或競(jìng)爭(zhēng)性形式。合適分析的實(shí)施例包括酶聯(lián)免疫吸附分析、放免分析，凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)分析，免疫擴(kuò)散分析，凝集分析，熒光免疫分析，蛋白A免疫分析，或免疫電泳分析。
在本發(fā)明其它診斷實(shí)施例中，本發(fā)明分離的DNA分子的核苷酸序列可用作檢測(cè)各種病人體液中結(jié)核分枝桿菌的核酸雜交分析中的探針。本發(fā)明的核苷酸序列可用于本領(lǐng)域已知的任何核酸雜交分析系統(tǒng)，包括，但不限于，Southern雜交(Southern，分子生物學(xué)雜志，98508(1975))；Northern雜交(Thomas等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，77520-05(1980))；菌落雜交(Gtunstein等.，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，723961-65(1975)，在此引用僅供參考)。作為選擇，本發(fā)明分離的DNA分子可用于基因擴(kuò)增檢測(cè)方法中(如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。見H.A.Erlich等.，“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)最新進(jìn)展”，科學(xué)2521643-51(1991)，在此引用僅供參考。
更一般地說，用于結(jié)核分枝桿菌完成攝入現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)可用于導(dǎo)致其它物質(zhì)攝入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這通過利用導(dǎo)致細(xì)胞攝入的本發(fā)明蛋白或多肽(即相應(yīng)于具有SEQ.ID.Nos.2和4氨基酸的那些蛋白或多肽)與用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入的這類物質(zhì)相聯(lián)系來(lái)實(shí)現(xiàn)。該現(xiàn)象可用于導(dǎo)入多種物質(zhì)進(jìn)入這類細(xì)胞，包括抗生素，DNA片段，抗癌(anti-neoplastic)劑，及其混合物。
用于抗生素直接進(jìn)入細(xì)胞的可能性構(gòu)成了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步，因?yàn)樗鼈儗⒛軌驓⑺兰?xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌。用于完成這種攝入的一個(gè)方法是通過以抗生素充滿微球體(microspheres)并且然后為了完成這種攝入，以本發(fā)明的細(xì)胞攝入蛋白或多肽包被微球體。作為選擇，代替利用微球體運(yùn)送抗體，該治療劑可化學(xué)交聯(lián)于本發(fā)明的細(xì)胞攝入蛋白或多肽上。
該技術(shù)可用于治療由細(xì)胞內(nèi)病原體導(dǎo)致的各種疾病。對(duì)于結(jié)核病的治療，自身很難穿透細(xì)胞但在體外測(cè)試中具有高活性抗細(xì)胞外結(jié)核分枝桿菌的各種抗生素可與本發(fā)明的細(xì)胞攝入蛋白或多肽結(jié)合使用。在癌癥治療中，抗癌劑的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸通過將這種藥物與本發(fā)明的細(xì)胞攝入蛋白或多肽連接可極大地增強(qiáng)。這將能夠減少該藥的劑量及其產(chǎn)生的毒性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是利用本發(fā)明的細(xì)胞攝入蛋白或多肽于基因治療或遺傳疫苗中，在后者，幾段治療上或預(yù)防上有用的DNA以它們的胸腺嘧啶殘基通過交聯(lián)臂偶聯(lián)于本發(fā)明的這些蛋白或多肽上。結(jié)果，遺傳物質(zhì)可導(dǎo)入細(xì)胞以校正遺傳缺陷或產(chǎn)生所需特征或用作免疫原的產(chǎn)物。
實(shí)施例實(shí)施例1-HeLa細(xì)胞侵襲克隆的制備和篩選為了鑒定編碼哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)入的結(jié)核分枝桿菌DNA序列，按如下構(gòu)建重組侵襲克隆以限制酶Sau3 Al和EcoRI消化結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株(ATCC 25177)基因組，并將DNA片段連接到噬菌體質(zhì)粒(phagemid)載體pBluescript II(Stratagene，La Jolla，(A)的Bam HI-EcoRI限制性位點(diǎn)。重組載體通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌EL1-Blue(Stratagene)。我們通過與R.R.Isberg和S.Falkow在自然317，262(1987)(在此引用僅供參考)中描述方法類似的方法篩選出用于HeLa細(xì)胞侵襲克隆的重組菌株。
通過篩選方法發(fā)現(xiàn)一帶有在pBluescript載體的Bam HI-EcoRI限制酶位點(diǎn)含有1535-堿基插入子的質(zhì)粒(pZX7)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子XL1-Blue(pZX7)總是與HeLa細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。透視電鏡證實(shí)該克隆進(jìn)入HeLa細(xì)胞(圖1)。圖1A顯示用結(jié)核分枝桿菌菌株H37Ra(ATCC 25177)感染的HeLa細(xì)胞，而侵襲性重組菌株大腸桿菌XL1-Blue(pZX7)顯示于圖1B和1C。在圖1A中細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌菌株培養(yǎng)72小時(shí)，在圖1B和圖1C中與XL1-Blue(pZX7)培養(yǎng)7.5小時(shí)。該克隆被HeLa細(xì)胞的內(nèi)吞化(Internalizationf)是時(shí)間依賴性的(圖1B)，早在感染后3.5小時(shí)便見到細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)體。一些吞噬體含有多個(gè)有機(jī)體(圖1C)，這表明該細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)增殖。一些內(nèi)吞化的桿菌被明顯的ETZ包圍，外表與HeLa細(xì)胞內(nèi)環(huán)繞結(jié)核分枝桿菌的明亮帶類似(圖1A，箭頭)。該帶是代表常見環(huán)繞其它病原性細(xì)胞內(nèi)分桿菌有機(jī)體的ETZ(見P.Draper和R.J.W.Rees，自然.228，860(1970)；N.Rastogi，微生物學(xué)研究141，217(1990)；T.Yamamoto，M.Nishimura，N.Harada，T.Imaeda，國(guó)際麻風(fēng)病雜志(Int.J.Lepr).26，111(1958)，在此引用僅供參考)還是制備中的人為因素尚不清楚。
含有載體pBluescript或另一pBluescript-衍生的重組載體(pZN7)的非病原性大腸桿菌XL1-Blue菌株在7.5小時(shí)后未表現(xiàn)出與HeLa細(xì)胞的關(guān)聯(lián)。
為了證實(shí)侵襲表型的確由克隆的結(jié)核分枝桿菌DNA片段編碼，我們以pZX7轉(zhuǎn)化了其它非病原性大腸桿菌菌株，特別是轉(zhuǎn)化了HB101，DH5α和NM522。構(gòu)建體HB101(pZX7)，DH5α(pZX7)，和NM522(pZX7)是HeLa細(xì)胞侵襲性的。在延長(zhǎng)貯存的XL1-Blue(pZX7)中pZX7的自發(fā)丟失與侵襲表型丟失有關(guān)。
pZX7的四個(gè)核酸外切酶III單向缺失亞克隆和亞克隆Ban HI-PstI(pZX7.1)，Pst-I-Hind III(pZX7.2)，和Bam HI-EcoRI(pZX7.7)用于HeLa細(xì)胞的相聯(lián)。pZX7的單向缺失亞克隆用核酸外切酶III根據(jù)制造商的說明(Erase-a-Base System，Promega，Madison，WI)而產(chǎn)生。質(zhì)粒pZX7在Bam HI-EcoRI DNA插入子EcoR I位點(diǎn)下游以Hind III和Kpn I限制酶雙酶切以產(chǎn)生相鄰于插入子的5′突出末端和相鄰于插入子的4-堿基3′突出末端以及在互補(bǔ)鏈上的4-堿基3′突出從而保護(hù)其免受ExoIII的酶切。酶切的質(zhì)粒在37℃與300U的ExoIII混合并且每30秒將2.5μl的ExoIII消化產(chǎn)物的等份試樣轉(zhuǎn)移至含有S1核酸酶的管中以去除殘留的單鏈尾部。S1核酸酶通過中和和70℃加熱10分鐘而失活。加入Klenow DNA聚合酶以產(chǎn)生連接的平末端從而環(huán)化含有缺失的載體。然后用連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌XL1-Blue菌株。這些轉(zhuǎn)化菌株與HeLa細(xì)胞單層一起孵育6小時(shí)。
該程序的結(jié)果顯示于圖2。黑杠代表結(jié)核分枝桿菌DNA序列，并且白杠代表pBluescript序列。如圖所示，帶有pZX7.3，pZX7.4，或pZX7.5的大腸桿菌)XL1-Blue菌株以與大腸桿菌ZL1-Blue(pZX7)類似的方式與HeLa細(xì)胞相聯(lián)，而其它的亞克隆則否。實(shí)施例2-人類巨噬細(xì)胞的感染用實(shí)施例1的大腸桿菌重組克隆感染的巨噬細(xì)胞單層在聚苯乙烯孔底部的蓋玻片上形成。首先它們以每個(gè)巨噬細(xì)胞感染大約10個(gè)過夜生長(zhǎng)的細(xì)菌感染1個(gè)或2個(gè)小時(shí)接著以磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌并再孵育1個(gè)，6個(gè)或22個(gè)小時(shí)。培養(yǎng)在含有2％AB的熱-滅活的含有慶大霉素(10μg/ml)的人類血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中37℃進(jìn)行。包括進(jìn)慶大霉素是為了殺死細(xì)胞外細(xì)菌。再次洗滌巨噬細(xì)胞單層并且然后以無(wú)菌的蒸餾水裂解細(xì)胞。裂解液鋪板于胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基以獲得菌落讀數(shù)。用于顯微鏡，巨噬細(xì)胞單層以100％甲酰固定，以10％Giemsa染液染色，并且通過光學(xué)顯微鏡檢查或處理以便進(jìn)行電子顯微鏡檢。
僅感染1小時(shí)的單層在洗滌、固定和染色之后立即通過光學(xué)顯微鏡檢查。巨噬細(xì)胞裂解物培養(yǎng)和光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示于表1，見下文。感染巨噬細(xì)胞的百分比計(jì)數(shù)來(lái)自蓋片單層上每100至200個(gè)巨噬細(xì)胞中感染巨噬細(xì)胞的數(shù)目。每個(gè)大腸桿菌菌株在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)試4至6次，并以大腸桿菌重組克隆和對(duì)照菌株XL1-Blue(pBluescript)及XL1-Blue(pZX7.3)感染細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的平均值通過學(xué)生T檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
圖3顯示接觸侵襲性重組大腸桿菌克隆XL1-Blue(pZX7)3小時(shí)(圖3A)和24小時(shí)(圖3B)的人類巨噬細(xì)胞的超薄切片的電鏡照片。在圖32中，超薄切片的電鏡照片是接觸非病原性大腸桿菌XL1-Blue(pBluescript)24小時(shí)的人類巨噬細(xì)胞。24小時(shí)以后，細(xì)胞內(nèi)桿菌更多，由認(rèn)為是宿主來(lái)源的多層分隔，環(huán)繞(圖3B)。以大腸桿菌(pBluescript)感染24小時(shí)后巨噬細(xì)胞內(nèi)未見細(xì)菌(圖3C)。
表1顯示獲自感染以HeLa侵襲性大腸桿菌XL1-Blue(pZX7)，亞克隆XL1-Blue(pZX7.3)，和非侵襲性XL1-Blue(P.Bluescript)的人類巨噬細(xì)胞單層細(xì)胞光學(xué)顯微鏡檢和培養(yǎng)研究的結(jié)果。測(cè)定每毫升細(xì)胞培養(yǎng)裂解液的菌落形成單位(CFU)。如表所示，感染1小時(shí)以后，重組克隆感染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(82±8％)是XL1-Blue(pBluescript)感染細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(15±6％，P＜0.001)的5倍多。
表1裂解液接觸感染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù) 每毫升培養(yǎng)物CFU時(shí)間(平均值±SEM) (平均值±SEM)(小時(shí)) pBluescript pZXF3 pZX7 pBluescript pZX71 15±6 59±10**82±8****ND*****ND3 9±4 ND55±17 1800±5003500±17008 4±2 ND35±5 10±5 1600±40024 12±1023±8*60±13***3±1 1300±200*P＞0.05，與pBluescript克隆相比。0.001，與pBluescript或pZX7.3克隆相比。0.05與pZX7.3克隆相比。
**P＜0.001，與pBluescript克隆相比。
***P＜0.001，與pBluescript或pZX7.3克隆相比。
****P＜0.001，與pBluescript克隆相比，P＜0.05，與pZX7.3克隆相比。
*****ND平均值未測(cè)定。此觀察結(jié)果表明克隆的結(jié)核分枝桿菌DNA序列以高于巨噬細(xì)胞背景吞噬細(xì)胞活性的數(shù)量增強(qiáng)細(xì)菌攝入。感染24小時(shí)以后，12％(±10％)的接觸XL1-Blue(pBluescript)的巨噬細(xì)胞和60％(13±％)的接觸XL1-Blue(pZX7)的細(xì)胞被感染(p＜0.001)。如表1中所示，感染24小時(shí)的巨噬細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)顯示細(xì)胞內(nèi)的大腸桿菌XL1-Blue(pZX7)菌株是能夠存活的。
在表1中比較感染1小時(shí)時(shí)XL1-Blue(pZX7)，XL1-Blue(pBluescript)，和一個(gè)HeLa細(xì)胞-侵襲性缺失衍生物，大腸桿菌XL1-Blue(pZX7.3)感染巨噬細(xì)胞的能力，大腸桿菌XL1-Blue(PZX7.3)侵襲能力是XL1-Blue(pBluescript)侵襲力的4倍(P＜0.001)，但過24小時(shí)后差異不再明顯。因此，與HeLa細(xì)胞侵襲有關(guān)的DNA序列負(fù)責(zé)巨噬細(xì)胞增加的攝入，并且賦予在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的序列位于對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行必需序列的下游。實(shí)施例3-同源性分析Bam HI-EcoRi DNA片段通過鏈終止方法測(cè)序，在F.Sanget，等，“以鏈終止抑制劑的DNA測(cè)序，”美國(guó)科學(xué)院院報(bào).，745463-67中描述，在此引用僅供參考，并且發(fā)現(xiàn)具有1535個(gè)堿基對(duì)[歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)許可證號(hào)X70901]。該序列與GenBank(R72.0)或EMBL(R31.0)數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何DNA序列未表現(xiàn)出同源性。未能發(fā)現(xiàn)明顯的原核啟動(dòng)子連續(xù)序列。如果我們假定結(jié)核分枝桿菌使用通常的原核終止密碼子序列，可鑒定出氨基酸序列的同源性。發(fā)現(xiàn)一個(gè)靠近可能的開放閱讀框推斷序列的NH2-末端的區(qū)域具有(i)與一種由Listeriamonocytogenes編碼的與哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)入有關(guān)的蛋白，內(nèi)吞素(internalin)(A.B.Hartmam，M.Venkatesan E.V.Oaks，J.M.Buysse.細(xì)菌雜志，172，1905(1990)，在此引用僅供參考)的80殘基NH2-末端區(qū)域有27％的相同性；(ii)Shigella侵襲質(zhì)粒IpaH基因產(chǎn)物(B.E.Anderson，G.A.McDonald，D.C.Jones，R.L.Regnery，感染、免疫，58，2760(1990)，在此引用僅供參考)的145-殘基區(qū)域具有20％的相同性；和(iii)與一種將網(wǎng)格蛋白連接到負(fù)責(zé)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的有被小囊的受體上的質(zhì)膜蛋白，人類β-銜接蛋白(S.Ponnambalam，M.S.Robinson，A.P.Jackson，L.Peiper，P.Parham，生物化學(xué)雜志，265，4814(1990)和J.L.Golkstein.M.S.Browm，R.G.W.Anderson，D.W.J.Schneider，細(xì)胞生物學(xué)每年綜述(ammu.Rev.Cell.Biol)1，1(1985)，在此引用僅供參考)的176個(gè)殘基區(qū)域具有18％的相同性。當(dāng)與假結(jié)核菌(Yersinra psendotuberculosis)侵襲蛋白進(jìn)行序列比較時(shí)，與細(xì)胞進(jìn)入有關(guān)的區(qū)域和靠近侵襲COOH-末端(R.R.Isberg，D.L.Voorhis，S.FalkoW，細(xì)胞50，769(1987)，在此引用僅供參考)的100-殘基區(qū)域有19％的相同性。這些序列比較的功能意義尚不清楚。實(shí)施例4-52kD多肽的功能分析通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析的蛋白片段按如下制備離心收獲含氨芐青霉素(100μ/ml)的胰酶大豆液體培養(yǎng)基中5-ml細(xì)菌過夜培養(yǎng)物的等份試樣(調(diào)至在550nm時(shí)的吸光率為光密度600)。我們?nèi)缓笤?.5ml含5mM MgCl2的10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中聲處理細(xì)胞沉淀。在小離心機(jī)(Eppendorf model 5415C)中以12,000rpm在4℃離心聲處理產(chǎn)物25分鐘。向干凈離心管中600μl的上清中加入丙酮(60％v/v)，并以14,000rpm在4℃離心混合物25分鐘。以20μl蒸餾水和20μl Laemmli’s沸騰緩沖液重懸沉淀，加熱至沸騰5分鐘并用SDS-PAGE分析。第一次離心后含有外膜部分的細(xì)菌碎片重懸于100μl水和100μl含7.5mM MgCl2和3％(v/v)Triton X-100的15mM的tris-HCl緩沖液(pH8.0)中并以14,000rpm離心25分鐘。沉淀重懸于25μl水和25μl沸騰緩沖液中并煮沸且用SDS-PAGE分析20-μl樣品的等分試樣。
丙酮沉淀的細(xì)菌細(xì)胞聲處理物的可溶性部分進(jìn)行SDS-PAGE(即，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)。多肽在9％的凝膠中分析(左)分子量標(biāo)準(zhǔn)(1道)，具有一個(gè)在Bam HI-EcoRI pBluescript克隆位點(diǎn)之間含有一個(gè)無(wú)關(guān)結(jié)核分枝桿菌DNA片段的載體(pZN)的大腸桿菌XL1-BBlue(2道)，和XL1-Blue(pZX7)(3道)。在8％的凝膠中分析(右)含有在pZX7(1道)和XL1-Blue(pZX7)(2道)Bam HI克隆位點(diǎn)上游12個(gè)堿基處導(dǎo)入2堿基移碼載體(pZX7.8)的XL1-Blue。分子大小在遠(yuǎn)端右測(cè)表示。我們?cè)赬L1-Blue(pZX7)可溶性蛋白部分檢測(cè)到52-KD的多肽(箭頭)。一個(gè)約50KD的蛋白由含pZX7.8的XL1-Blue表達(dá)。52-KD蛋白的表達(dá)總是和HeLa細(xì)胞與重組大腸桿菌克隆的相互作用相關(guān)。
從圖4的SDS-PAGE結(jié)果，可以得出XL1-Blue(pZX7)的細(xì)菌細(xì)胞聲處理物的可溶性部分含有一個(gè)52-KD的多肽，該多肽在具有含無(wú)關(guān)結(jié)核分枝桿菌DNA片段的pBluescript-衍生載體(pZN7)的XL1-Blue可溶性部分中沒有檢測(cè)到。在XbaI位點(diǎn)5′突出端以Klenow DNA聚合酶補(bǔ)平后通過平端連接而導(dǎo)入的位于pZX7中Bam HI克隆位點(diǎn)上游12堿基處的2堿基移碼(通過測(cè)序證實(shí))，導(dǎo)致HeLa細(xì)胞與含該質(zhì)粒(pZX7.8)的大腸桿菌XL1-Blue相關(guān)的喪失。此克隆不表達(dá)52-KD蛋白，但在可溶性部分檢測(cè)到一個(gè)新的低分子量的多肽。在長(zhǎng)時(shí)間XL1-Blue(pZX7)保存后與HeLa細(xì)胞相關(guān)能力的自發(fā)丟失伴隨著52-KD蛋白的丟失。因此，此52-KD蛋白很可能是克隆的結(jié)核分枝桿菌DNA片段的表達(dá)產(chǎn)物。在細(xì)菌外膜多肽部分沒有可檢測(cè)到的差異存在。實(shí)施例5-亞克隆編碼介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的A蛋白的開放閱讀框(ORF-1)相應(yīng)于SEQ.ID.No.3(即，ORF-1)的核苷酸序列亞克隆進(jìn)入pET載體(來(lái)自Novagen和pET23a，b，c)的EcoRI和HindlII核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。這通過亞克隆PCR-擴(kuò)增的ORF-1片段的產(chǎn)物而完成。用于擴(kuò)增ORF-1的引物如下EcoRI-引物5′-GGGGAATTCATGTGAACGCCGACATCAA(SEQ.ID.No.7)；Hind III-引物5′GGGAAGCTTATTGCGGCAGCCCCGGCGTC(SEQ.ID.No.8)。從結(jié)核分枝桿菌菌株H37Ra(ATCC 25177)中提取的DNA用下面的PCR條件擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，引物于56℃退火2分鐘，并且引物在72℃延伸1分鐘。擴(kuò)增的DNA通過1.8％的瓊脂糖凝膠電泳分離，并且經(jīng)紫外照射觀察后，根據(jù)制造商的說明，用QIAEX從凝膠中分離擴(kuò)增的DNA。然后在相同的消化緩沖液中以EcoRI和HinDIII消化DNA。
pET載體也以EcoRI和HinDIII核酸內(nèi)切酶消化，在1％瓊脂糖中分離，并從凝膠中分離線性化的載體，并且與PCR-擴(kuò)增的ORF-1 DNA片段的EcoRI/HinDIII消化產(chǎn)物混合用于連接反應(yīng)。
連接反應(yīng)按如下完成向含5μl消化的PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物與3μl載體DNA消化產(chǎn)物的混合物中加入1μl 10×T4連接酶緩沖液(NewEngland BioLabs)和1μl T4連接酶(15U)。混合物在室溫孵育4小時(shí)。將1.5μl的連接混合物電穿孔進(jìn)入大腸桿菌菌株BL 21(DE3)，并且將大腸桿菌接種至含有氨芐青霉素(200μg/ml)的瓊脂板用于37℃培養(yǎng)過夜。每種pET 23構(gòu)建體(pET 23a-ORF1，pET 23 b-ORF1，pET23c-ORF1)的代表菌落按別處所述測(cè)試它們與HeLa細(xì)胞的相關(guān)性。用IPTG誘導(dǎo)及不誘導(dǎo)對(duì)菌株進(jìn)行測(cè)試。實(shí)施例6-ORF-1表達(dá)蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析為了表達(dá)由ORF-1編碼的蛋白，pET23重組子BL21(DE3)大腸桿菌菌株首先在5ml含氨芐青霉素的胰酶大豆液體培養(yǎng)基(TSB)中培養(yǎng)過夜。第二天，沉淀500-μl樣品并重懸于5ml合氨芐青霉素(200μg/ml)的TSB，培養(yǎng)3小時(shí)。然后，向培養(yǎng)物中加入50μlIPTG(40mM)并且再在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。沉淀1ml細(xì)菌懸液(OD＝500，在Abs 600時(shí))，并將沉淀重懸于50μl水和50μl Laemmli沸騰緩沖液并煮沸5分鐘。15μl的沸騰樣品的等份試樣上樣于12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，并且電泳分離。在這些實(shí)驗(yàn)中以同樣方式處理含pET載體的BL21(DE3)作為對(duì)照。
SDS-PAGE在約25-28 kDa的位置顯示出一個(gè)由BL21(DE3)(pET23c-ORF1)表達(dá)的蛋白，其它任何pET23構(gòu)建體或?qū)φ誃L21(DE3)(pET23c)菌株均不表達(dá)該蛋白。甚至不同IPTG誘導(dǎo)，有些蛋白的表達(dá)是明顯的(圖5)。同樣的重組菌株BL21(DE3)(pET23c-ORF1)也表現(xiàn)出與HeLa細(xì)胞的較強(qiáng)相關(guān)性。因此，顯示出ORF1的表達(dá)產(chǎn)物是以賦予HeLa細(xì)胞的相關(guān)性。實(shí)施例7-重組ORF-1蛋白的N-末端分析IPTG-處理的BL21(DE3)(pET23c-ORF1)菌株按上述用于SDS-PAGE方法制備。8個(gè)泳道以相同的細(xì)菌裂解液上樣，并且有一條泳道以對(duì)照大腸桿菌裂解液上樣。電泳以后，分離的蛋白用電印跡儀(IDEA科學(xué)公司)轉(zhuǎn)移至一張PVDF膜(Immobilon，Millipore)上。該膜以考馬斯蘭染色2分鐘并且脫色至轉(zhuǎn)移的蛋白帶變得清晰可見為止。切下對(duì)照大腸桿菌電泳道中不存在的重組大腸桿菌電泳道中25-28kDa的蛋白部分并送至斯坦福大學(xué)蛋白和核苷酸實(shí)驗(yàn)室(Stanford University Protein andNucleotide Facility)進(jìn)行N-末端的微量測(cè)序(microsequencing)。N-末端含有pET載體T7 tag氨基酸序列(位置1至15)，接著為Val，Asn，Ala，Asp，Ile，這證實(shí)了由ORF-1核苷酸序列推斷的N-末端氨基酸序列。實(shí)施例8-以重組蛋白包被乳膠小珠從研究HeLa細(xì)胞與小珠的相聯(lián)由ORF-1編碼的25-28 kDa蛋白的粗制品按如下獲自BL21(DE3)(pET23c-ORF1)按上述通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。誘導(dǎo)后，細(xì)菌懸液在含100mM NaCl和1mM EDTA的Tris緩沖液(pH8.0)中混合至終濃度為10％(Vol/vol)。向溶液中加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，并將細(xì)胞在室溫下培養(yǎng)20分鐘。然后將細(xì)胞以5000g離心10分鐘，并棄去上清液。沉淀轉(zhuǎn)移至冰上，并且重懸于5ml含100mM NaCl，1mM EDTA和0.1％脫氧膽酸鈉的冰冷50mM Tris緩沖液(pH8.0)中。加入MgCl2和DNAseI分別至終濃度為8mM和10μg/ml。冰浴直至粘性消失。以10,000g離心10分鐘來(lái)取出懸液中包涵體形成的物質(zhì)。通過重懸于5ml含1％NP-40，100mM NaCl，和1mM EDTA的50mM Tris緩沖液洗滌得到的沉淀，接著以不含NP-40的相同緩沖液洗滌。沉淀物質(zhì)的等分試樣通過SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的存在。
剩余的沉淀溶解于位于25mMHEPES緩沖液(pH7.6)中的2ml 6M鹽酸胍中(GuHCl)，該緩沖液含有100mM KCl，0.1mM EDTA，125mMMgCl2，10％甘油，和0.1％NP-40(HEMN緩沖液)以及蛋白酶抑制劑(1mM DTT，2μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，0.1mM PMSF，和0.1mM偏亞硫酸氫鈉)。溶解的蛋白在缺少6M GuHCl的HEMGN緩沖液中于4℃透析2天。為了對(duì)照，以相同的方法處理大腸桿菌BL21(DE3)(pET23C)細(xì)胞。通過BCA方法測(cè)定蛋白的濃度。
2μl 10％的0.3μM聚苯乙烯乳膠小珠(Sigma)水懸液樣品加入到1ml PBS(pH7.5)中的100μg/ml蛋白溶液中。小珠與蛋白溶液在37℃恒速振蕩孵育過夜，并作周期性簡(jiǎn)短的聲處理以分散團(tuán)塊。然后將100μl小珠懸液加入到培養(yǎng)于24孔組織培養(yǎng)板中圓形玻璃蓋片上MEM(含有10％胎牛血清)中的HeLa細(xì)胞單層上。對(duì)照包括僅與PBS孵育的小珠，在PBS中含有1％BSA，小珠用上述對(duì)照大腸桿菌菌株蛋白制品包被。在每孔2mlMEM中的HeLa細(xì)胞單層于37℃培養(yǎng)5小時(shí)，然后以PBS洗5次，并以100％的甲醇固定30分鐘。細(xì)胞然后以10％Giemsa染色20分鐘并通過光學(xué)顯微鏡檢查。
也制備用于透射電鏡檢查的HeLa細(xì)胞。經(jīng)5小時(shí)培養(yǎng)后的Hela細(xì)胞單層以PBS中(pH7.5)2％的戊二醛固定3小時(shí)，然后刮下并重懸于相同的戊二醛緩沖液中。然后溫和地沉淀細(xì)胞，并按標(biāo)準(zhǔn)方法切片制備用于透射電鏡鏡檢的沉淀一個(gè)結(jié)果顯示于圖6。實(shí)施例9-產(chǎn)生抗重組蛋白的多克隆抗血清表達(dá)25-28 kDa蛋白的大腸桿菌BL21(CE3)(pET23c-ORF1)裂解液在多孔中通過12％SDS-PAGE分離，并從凝膠中切下蛋白質(zhì)。含有該蛋白的丙烯酰胺凝膠碎片用杵臼研碎，并且重懸于2ml無(wú)菌PBS(pH7.5)中。通過BCA方法對(duì)蛋白濃度作粗略估計(jì)。以每位點(diǎn)約20μg的抗原懸液在7-8個(gè)位點(diǎn)皮下注射6月齡的NZW雌免。在第一次注射后的4周和6周以相同量的抗原加強(qiáng)免疫該兔。在最后一次加強(qiáng)注射2周后獲得的血液中收集血清。其對(duì)重組蛋白的反應(yīng)性通過Western印跡加以檢測(cè)。以1∶10,000稀釋的免疫抗血清能夠檢測(cè)到結(jié)合至硝酸纖維素膜上不到1μg的蛋白。實(shí)施例4中52千道爾頓的多肽和實(shí)施例7中23-28千道爾頓的多肽均被這些抗體所識(shí)別。實(shí)施例10-對(duì)IS 6110存在的分析以Sau3AI和EcoRI限制酶制備結(jié)核分枝桿菌菌株H37Ra(ATCC25177)基因組DNA的部分消化產(chǎn)物。因?yàn)镠37Ra菌株含有多拷貝的由Grawford等的美國(guó)專利No.5,183,737所述的IS 6110，并且IS6110不具有EcoRI位點(diǎn)，所以消化產(chǎn)物將含有幾個(gè)含IS 6110的DNA片段。將DNA片段連接到載體pBluescript II的BamHI-EcoRI限制性位點(diǎn)以制備重組文庫(kù)。然后將重組載體電穿孔進(jìn)入大腸桿菌XL1-Blue。然后通過本申請(qǐng)以外所述的方法篩選重組大腸桿菌菌株的侵襲克隆。
經(jīng)初始用HeLa細(xì)胞的篩選以后，得到15個(gè)大腸桿菌菌落。這些中僅一個(gè)穩(wěn)定表現(xiàn)出與Hela細(xì)胞的相關(guān)性。這就是以前描述的菌株XL1-Blue(pZX7)。當(dāng)測(cè)試幾次時(shí)其它或表現(xiàn)出微弱的與HeLa細(xì)胞的相關(guān)性或沒有表現(xiàn)出與HeLa細(xì)胞的相關(guān)性。這些其它菌株最近通過PCR-擴(kuò)增的IS 6110中245-bp區(qū)域而產(chǎn)生的探針測(cè)試IS 6110的存在，該P(yáng)CR用下面的引物INS15′-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC(SEQ.ID.No.9)和INS25′-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA(SEQ.ID.No.10)。
沒有一個(gè)含有IS6110序列。此外，其它克隆缺乏與HeLa細(xì)胞恒定且強(qiáng)烈的相關(guān)性表明包含在pZX7中的序列是其基因組文庫(kù)DNA片段中唯一編碼哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)入的序列。
雖然為了說明的目的詳細(xì)描述了本發(fā)明，但應(yīng)明白這些細(xì)節(jié)僅是用于說明的目的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在不偏離由下面權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下對(duì)其作出變化。
序列表(1)一般信息(i) 申請(qǐng)人康奈爾研究基金公司(ii)發(fā)明題目編碼用于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞攝入的DNA分子及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)目10(iv)通迅地址(A)地址Nixon，Hargrave，Devans & Doyle LL？(B)街道Clinton Square，P.O.Box 1051(C)城市Rochester(D)州New York(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵編14603(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利發(fā)布#1.0，#1.25版(vi)目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期(C)分類(viii)律師/代理信息(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)登記號(hào)30,727(C)參考/摘要號(hào)19603/183(D-1485A)(ix)電信信息(A)電話(716)263-1304(B)傳真(716)263-1600(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1535個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GGATCGAATT GCTGGCCTTT GGCGGGCGAT TCGTGGAGAT CGCCCGTAGA AAGGTTCGCG60GACGCCAAGG CCGCCGCAGA CCGCCATAAA CGTAGTTGAC CAGGTGGTCT TGACTGGGGC120CGGACACCGA CGTGAACGAG GCGACCCGAT CCGCGTTACA TCCACCTGAT TCCGGCAAAT180GTGAACGCCG ACATCAAGGC GACCACGGTG TTCGGCGGTA AGTATGTGTC GTTGACCACG240CCGAAAAACC CGACAAAGAG GCGGATAACG CCAAAAGACG TCATCGACGT ACGGTCGGTG300ACCACCGAGA TCAACACGTT GTTCCAGACG CTCACCTCGA TCGCCGAGAA GGTGGATCCG360GTCAAGCTGA ACCTGACCCT GAGCGCGGCC GCGGAGGCGT TGACCGGGCT GGGCGATAAG420TTCGGCGAGT CGATCGTCAA CGCCAACACC GTTCTGGATG ACCTCAATTC GCGGATGCCG480CAGTCGCGCC ACGACATTCA GCAATTGGCG GCTCTGGGCG ACGTCTACGC CGACGCGGCG540CCGGACCTGT TCGACTTTCT CGACAGTTCG GTGACCACCG CCCGCACCAT CAATGCCCAG600CAAGCGGAAC TGGATTCGGC GCTGTTGGCG GCGGCCGGGT TCGGCAACAC CACAGCCGAT660GTCTTCGACC GCGGCGGGCC GTATCTGCAG CGGGGGGTCG CCGACCTGGT CCCCACCGCC720ACCCTGCTCG ACACTTATAG CCCGGAACTG TTCTGCACGA TCCGCAACTT CTACGATGCC780GATCGACCTG ACCGCGGGGC TGCCGCATAG GCCCGGAGTG GTTCGCGATC GGCGAGGCGC840ACGTCAAAGT GATTCGCGCC CTTTTTCGCC CACCTGCCCG CCGCGGTGGA TGTGTCCACC900CGCCAGGCCG CCGAAGCCGA CCTGGCCGGC AAAGCCGCTC AATATCGTCC CGACGAGCTG960GCCCGCTACG CCCAGCGGGT CATGGACTGG CTACACCCCG ACGGCGACCT CACCGACACC 1020GAACGCGCCC GCAAACGCGG CATCACCCTG AGCAACCAGC AATACGACGG CATGTCACGG 1080CTAAGTGGCT ACCTGACCCC CCAAGCGCGG GCCACCTTTG AAGCCGTGCT AGCCAAACTG 1140GCCGCCCCCG GCGCGACCAA CCCCGACGAC CACACCCCGG TCATCGACAC CACCCCCGAT 1200GCGGCCGCCA TCGACCGCGA CACCCGCAGC CAAGCCCAAC GCAACCACGA CGGGCTGCTG 1260GCCGGGCTGC GCGCGCTGAT CCGTCATCCT GCCATCTCGG CCCTCGGCGC CGCCAACTCC 1320AGGTGCTGTG CGGTCCACGC CGAACGCATG CACGCGATCT CGAATTGGTT GGCACCGTAT 1380TCGGGATGGA ACTGCTCGAT AGCGATGCCT GCTGCCGTTG CCGCGGCGTT GACATCGCGG 1440ACGAACGCCT CGTGCTCGAG CACCCCGGCG ACACCGTACT GCGCCCACAG CGTCGAAGGC 1500AGCCGCTGGC CGTCCGCGTC GACCAAGAGG AATTC 1535(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度511個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO2Gly Ser Asn Cys Trp Pro Leu Ala Gly Asp Ser Trp Arg Ser Pro Val15 10 15Glu Arg Phe Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Asp Arg His Lys Arg Ser20 25 30Xaa Pro Gly Gly Leu Asp Trp Gly Arg Thr Pro Thr Xaa Thr Arg Arg35 40 45Pro Asp Pro Arg Tyr Ile His Leu Ile Pro Ala Asn Val Asn Ala Asp50 55 60Ile Lys Ala Thr Thr Val Phe Gly Gly Lys Tyr Val Ser Leu Thr Thr65 70 75 80Pro Lys Asn Pro Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys Asp Val Ile Asp85 90 95Val Arg Ser Val Thr Thr Glu Ile Asn Thr Leu Phe Gln Thr Leu Thr100 105 110Ser Ile Ala Glu Lys Val Asp Pro Val Lys Leu Asn Leu Thr Leu Ser115 120 125Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Leu Gly Asp Lys Phe Gly Glu Ser130 135 140Ile Val Asn Ala Asn Thr Val Leu Asp Asp Leu Asn Ser Arg Met Pro145150 155 160Gln Ser Arg His Asp Ile Gln Gln Leu Ala Ala Leu Gly Asp Val Tyr165 170 175Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Phe Asp Phe Leu Asp Ser Ser Val Thr180 185 190Thr Ala Arg Thr Ile Asn Ala Gln Gln Ala Glu Leu Asp Ser Ala Leu195200 205Leu Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Thr Thr Ala Asp Val Phe Asp Arg210 215 220Gly Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Gly Val Ala Asp Leu Val Pro Thr Ala225230 235240Thr Leu Leu Asp Thr Tyr Ser Pro Glu Leu Phe Cys Thr Ile Arg Asn245 250 255Phe Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Asp Arg Gly Ala Ala Ala Xaa Ala Arg260 265 270Ser Gly Ser Arg Ser Ala Arg Arg Thr Ser Lys Xaa Phe Ala Pro Phe275 280 285Phe Ala His Leu Pro Ala Ala Val Asp Val Ser Thr Arg Gln Ala Ala290 295 300Glu Ala Asp Leu Ala Gly Lys Ala Ala Gln Tyr Arg Pro Asp Glu Leu305 310 315 320Ala Arg Tyr Ala Gln Arg Val Met Asp Trp Leu His Pro Asp Gly Asp325 330 335Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala Arg Lys Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asn340 345 350Gln Gln Tyr Asp Gly Met Ser Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Thr Pro Gln355 360 365Ala Arg Ala Thr Phe Glu Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Ala Pro Gly370 375 380Ala Thr Asn Pro Asp Asp His Thr Pro Val Ile Asp Thr Thr Pro Asp385 390 395 400Ala Ala Ala Ile Asp Arg Asp Thr Arg Ser Gln Ala Gln Arg Asn His405 410415Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu Arg Ala Leu Ile Arg His Pro Ala Ile420 425 430Ser Ala Leu Gly Ala Ala Asn Ser Arg Cys Cys Ala Val His Ala Glu435 440 445Arg Met His Ala Ile Ser Asn Trp Leu Ala Pro Tyr Ser Gly Trp Asn450 455 460Cys Ser Ile Ala Met Pro Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Thr Ser Arg465 470 475480Thr Asn Ala Ser Cys Ser Ser Thr Pro Ala Thr Pro Tyr Cys Ala His485 490 495Ser Val Glu Gly Ser Arg Trp Pro Ser Ala Ser Thr Lys Arg Asn500 505 510(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度627個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GTGAACGCCG ACATCAAGGC GACCACGGTG TTCGGCGGTA AGTATGTGTC GTTGACCACG 60CCGAAAAACC CGACAAAGAG GCGGATAACG CCAAAAGACG TCATCGACGT ACGGTCGGTG 120ACCACCGAGA TCAACACGTT GTTCCAGACG CTCACCTCGA TCGCCGAGAA GGTGGATCCG 180GTCAAGCTGA ACCTGACCCT GAGCGCGGCC GCGGAGGCGT TGACCGGGCT GGGCGATAAG 240TTCGGCGAGT CGATCGTCAA CGCCAACACC GTTCTGGATG ACCTCAATTC GCGGATGCCG 300CAGTCGCGCC ACGACATTCA GCAATTGGCG GCTCTGGGCG ACGTCTACGC CGACGCGGCG 360CCGGACCTGT TCGACTTTCT CGACAGTTCG GTGACCACCG CCCGCACCAT CAATGCCCAG 420CAAGCGGAAC TGGATTCGGC GCTGTTGGCG GCGGCCGGGT TCGGCAACAC CACAGCCGAT 480GTCTTCGACC GCGGCGGGCC GTATCTGCAG CGGGGGGTCG CCGACCTGGT CCCCACCGCC 540ACCCTGCTCG ACACTTATAG CCCGGAACTG TTCTGCACGA TCCGCAACTT CTACGATGCC 600GATCGACCTG ACCGCGGGGC TGCCGCA 627(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度209個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型未知(xi)序列描述SEQ ID NO4Val Asn Ala Asp Ile Lys Ala Thr Thr Val Phe Gly Gly Lys Tyr Val1 5 10 15Ser Leu Thr Thr Pro Lys Asn Pro Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys20 25 30Asp Val Ile Asp Val Arg Ser Val Thr Thr Glu Ile Asn Thr Leu Phe35 40 45Gln Thr Leu Thr Ser Ile Ala Glu Lys Val Asp Pro Val Lys Leu Asn50 55 60Leu Thr Leu Ser Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Leu Gly Asp Lys65 70 75 80Phe Gly Glu Ser Ile Val Asn Ala Asn Thr Val Leu Asp Asp Leu Asn85 90 95Ser Arg Met Pro Gln Ser Arg His Asp Ile Gln Gln Leu Ala Ala Leu100 105 110Gly Asp Val Tyr Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Phe Asp Phe Leu Asp115 120 125Ser Ser Val Thr Thr Ala Arg Thr Ile Asn Ala Gln Gln Ala Glu Leu130 125 140Asp Ser Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Thr Thr Ala Asp145 150 155 160Val Phe Asp Arg Gly Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Gly Val Ala Asp Leu165 170 175Val Pro Thr Ala Thr Leu Leu Asp Thr Tyr Ser Pro Glu Leu Phe Cys180 185 190Thr Ile Arg Asn Phe Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Asp Arg Gly Ala Ala195 200 205Ala(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度650個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述 SEQ ID NO5GTGGATGTGT CCACCCGCCA GGCCGCCGAA GCCGACCTGG CCGGCAAAGc CGCTCAATAT60CGTCCCGACG AGCTGGCCCG CTACGCCCAG CGGGTCATGG ACTGGCTACA CCCCGACGGC120GACCTCACCG ACACCGAACG CGCCCGCAAA CGCGGCATCA CCCTGAGCAA CCAGCAATAC180GACGGCATGT CACGGCTAAG TGGCTACCTG ACCCCCCAAG CGCGGGCCAC CTTTGAAGCC240GTGCTAGCCA AACTGGCCGC CCCCGGCGCG ACCAACCCCG ACGACCACAC CCCGGTCATC300GACACCACCC CCGATGCGGC CGCCATCGAC CGCGACACCC GCAGCCAAGC CCAACGCAAc360CACGACGGGC TGCTGGCCGG GCTGCGCGCG CTGATCCGTC ATCCTGCCAT CTCGGCCCTC420GGCGCCGCCA ACTCCAGGTG CTGTGCGGTC CACGCCGAAC GCATGCACGC GATCTCGAAT480TGGTTGGCAC CGTATTCGGG ATGGAACTGC TCGATAGCGA TGCCTGCTGC CGTTGCCGCG540GCGTTGACAT CGCGGACGAA CGCCTCGTGC TCGAGCACCC CGGCGACACC GTACTGCGCC600CACAGCGTCG AAGGCAGCCG CTGGCCGTCC GCGTCGACCA AGAGGAATTC 650(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度216個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Val Asp Val Ser Thr Arg Gln Ala Gln Ala Glu Ala Asp Leu Ala Gly Lys1 5 10 15Ala Ala Gln Tyr Arg Pro Asp Glu Leu Ala Arg Tyr Ala Gln Arg Val20 25 30Met Asp Trp Leu His Pro Asp Gly Asp Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala35 40 45Arg Lys Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asn Gln Gln Tyr Asp Gly Met Ser50 55 60Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Thr Pro Gln Ala Arg Ala Thr Phe Glu Ala65 70 75 80Val Leu Ala Lys Leu Ala Ala Pro Gly Ala Thr Asn Pro Asp Asp His85 90 95Thr Pro Val Ile Asp Thr Thr Pro Asp Ala Ala Ala Ile Asp Arg Asp100 105 110Thr Arg Ser Gln Ala Gln Arg Asn His Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu115 120 125Arg Ala Leu Ile Arg His Pro Ala Ile Ser Ala Leu Gly Ala Ala Asn130135 140Ser Arg Cys Cys Ala Val His Ala Glu Arg Met His Ala Ile Ser Asn145 150 155 160Trp Leu Ala Pro Tyr Ser Gly Trp Asn Cys Ser Ile Ala Met Pro Ala165 170 175Ala Val Ala Ala Ala Leu Thr Ser Arg Thr Asn Ala Ser Cys Ser Ser180 185 190Thr Pro Ala Thr Pro Tyr Cys Ala His Ser Val Glu Gly Ser Arg Trp195 200 205Pro Ser Ala Ser Thr Lys Arg Asn210 215(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GGGGAATTCA TGTGAACGCC GACATCAA 28(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8GGGAAGCTTA TTGCGGCAGC CCCGGCGTC 29(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CGTGAGGGCA TCGAGGTGGC 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型 cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GCGTAGGCGT CGGTGACAAA20
權(quán)利要求
1.賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和(/或〕巨噬細(xì)胞中存活能力的分離的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中所述的DNA分子包括相應(yīng)于SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中所述的DNA編碼具有約50-55千道爾頓分子量的多肽。
4.〔根據(jù)權(quán)利要求1的〕分離的DNA分子，〔其中所說的DNA分子賦予〕賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的分離的DNA分子，其中所述的DNA分子包括相應(yīng)于SEQ.ID.NO.3的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的分離的DNA分子，其中所述的DNA分子編碼具有約22至28千道爾頓分子量的多肽。
7.〔根據(jù)權(quán)利要求1的〕分離的DNA分子，〔其中所述的DNA分子賦予〕賦予結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力并包括相應(yīng)于SEQ.ID.NO.5的核苷酸序列。
8.由根據(jù)權(quán)利要求1的賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和〔或〕在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的DNA分子編碼的分離的蛋白或多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的蛋白或多肽，其中所述的DNA分子包括相應(yīng)于SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的蛋白或多肽，其中的蛋白或多肽具有相應(yīng)于SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的蛋白或多肽，其中所述的蛋白或多肽具有約50-55千道爾頓的分子量。
12.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA分子編碼〔8〕的分離的蛋白質(zhì)或多肽，〔其中所述的DNA分子賦予〕賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的蛋白或多肽，其中所述的DNA分子包括相應(yīng)于SEQ.ID.NO.3的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的蛋白或多肽，其中的蛋白或多肽具有相應(yīng)于SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的蛋白或多肽，其中所述的蛋白或多肽具有約22至28千道爾頓的分子量。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的蛋白或多肽，其中所述的蛋白或多肽為重組型的。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的蛋白或多肽，其中所述的蛋白或多肽純化的。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的蛋白或多肽，其中所述的蛋白或多肽具有一個(gè)或更多個(gè)賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的抗原決定簇。
19.根據(jù)權(quán)利要求8的DNA分子編碼的分離的蛋白質(zhì)或多肽，〔其中所述的DNA分子賦予〕賦予結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力并具有相應(yīng)于SEQ.ID.No.6的氨基酸序列。
20.接種哺乳動(dòng)物防止結(jié)核分枝桿菌感染的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求8的分離的蛋白或多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的施用為口腔、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)施用。
22.一種重組DNA表達(dá)系統(tǒng)，包括其中插入有根據(jù)權(quán)利要求1的賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和〔/或〕在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力的異源DNA的表達(dá)載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的重組DNA表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的異源DNA〔賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力并〕在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活且包括相應(yīng)于SEQ.ID.No.1的核苷酸序列。
24.〔根據(jù)權(quán)利要求22的〕重組DNA表達(dá)系統(tǒng)，它包括一種其中插入根據(jù)權(quán)利要求4的〔，其中所述的〕異源DNA的表達(dá)載體〔賦予〕，該異源DNA賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力并〔包括〕包括相應(yīng)于SEQ.ID.No.3的核苷酸序列。
25.〔根據(jù)權(quán)利要求22的〕重組DNA表達(dá)系統(tǒng)，根據(jù)權(quán)利要求7的〔其中所述的〕異源DNA〔賦予結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力并且包括相應(yīng)于SEQ.ID.No.5的核苷酸序列〕。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的重組DNA表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的異源DNA以適當(dāng)?shù)姆较蚝驼_的閱讀框插入到所述的載體。
27.參入有根據(jù)權(quán)利要求1的異源DNA的宿主細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述的異源DNA〔賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力且〕包括相應(yīng)于SEQ.ID.No.1的核苷酸序列。
29.參入了根據(jù)權(quán)利要求5的異源DNA分子的〔27〕的宿主細(xì)胞〔，其中所述的異源DNA賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力并包括相應(yīng)于SEQ.ID.No.3的核苷酸序列〕。
30.參入了根據(jù)權(quán)利要求7的異源DNA分子的〔27〕的宿主細(xì)胞〔，其中所述的異源DNA賦予結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力并包括相應(yīng)于SEQ.ID.No.5的核苷酸序列〕。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述的異源DNA插入到包括表達(dá)載體的重組DNA表達(dá)系統(tǒng)中。
32.一種防止由結(jié)核分枝桿菌所引起的哺乳動(dòng)物感染和疾病的疫苗，包括根據(jù)權(quán)利要求8的分離的蛋白或多肽；和可藥用載體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗，其中所述的蛋白或多肽為純化的。
34.接種哺乳動(dòng)物防止結(jié)核分枝桿菌感染的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求32的疫苗。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的施用為口腔、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)施用。
36.抗根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白或多肽的分離的抗體或其結(jié)合部分。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的分離的抗體或其結(jié)合部分，其中所述的抗體為單克隆或多克隆抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的分離的抗體或其結(jié)合部分，其中所述的抗體對(duì)由賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并〔/或〕在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力的基因片段編碼的所述蛋白或多肽抗原決定簇具有特異性。
39.被動(dòng)免疫感染有結(jié)核分枝桿菌的哺乳動(dòng)物的方法，包括給感染有結(jié)核分枝桿菌的哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求36的所述抗體或其結(jié)合部分。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述的施用為口腔、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)施用。
41.用于被動(dòng)免疫感染有結(jié)核分枝桿菌哺乳動(dòng)物的組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求36的分離的抗體或其結(jié)合部分；和可藥用載體。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述的抗體為單克隆或多克隆抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述的抗體對(duì)由賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和〔/或〕在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力的基因片段編碼的所述蛋白或多肽抗原決定簇具有特異性。
44.一種被動(dòng)免疫感染有結(jié)核分枝桿菌的哺乳動(dòng)物的方法，包括給感染有結(jié)核分枝桿菌的哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求41的所述組合物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述的施用為口腔、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)施用。
46.檢測(cè)組織或體液樣品中結(jié)核分枝桿菌的方法，包括提供根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白或多肽作為抗原；樣品與抗原接觸；和用分析系統(tǒng)檢測(cè)表明結(jié)核分枝桿菌在樣品中存在的任何反應(yīng)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中的分析系統(tǒng)選自酶聯(lián)免疫吸附分析、放免分析、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)分析、免疫擴(kuò)散分析，凝集分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析、和免疫電泳分析。
48.檢測(cè)組織或體液樣品中結(jié)核分枝桿菌的方法，包括提供根據(jù)權(quán)利要求36的抗體或其結(jié)合部分；樣品與抗體或其結(jié)合部分接觸；和用分析系統(tǒng)檢測(cè)表明結(jié)核分枝桿菌在樣品中存在的任何反應(yīng)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中的分析系統(tǒng)選自酶聯(lián)免疫吸附分析、放免分析、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)分析、免疫擴(kuò)散分析、凝集分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析、和免疫電泳分析。
50.檢測(cè)組織或體液樣品中結(jié)核分枝桿菌的方法，包括提供根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子的核苷酸序列作為核酸雜交分析中的探針；樣品與探針接觸；和檢測(cè)表明結(jié)核分枝桿菌在樣品中存在的任何反應(yīng)。
51.檢測(cè)組織或體液樣品中結(jié)核分枝桿菌的方法，包括提供根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子的核苷酸序列作為基因擴(kuò)增檢測(cè)方法中的探針；樣品與探針接觸；和檢測(cè)表明結(jié)核分枝桿菌在樣品中存在的任何反應(yīng)。
52.用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入物質(zhì)的產(chǎn)品，包括用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入的物質(zhì)；和根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白或多肽，其中所述的蛋白與所述的物質(zhì)相連。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的產(chǎn)品，其中所述的蛋白或多肽具有約50-55千道爾頓的分子量。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的產(chǎn)品，其中所述的蛋白或多肽具有相應(yīng)于SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求〔52〕68的產(chǎn)品，其中所述的蛋白或多肽具有24-28千道爾頓的分子量。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的產(chǎn)品，其中所述的蛋白或多肽具有相應(yīng)于SEQ.ID.No.4的氨基酸序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的產(chǎn)品，其中所述的蛋白或多肽為純化的。
58.根據(jù)權(quán)利要求55的產(chǎn)品，其中所述的物質(zhì)選自抗生素、DNA片段、抗癌劑、和其混合物。
59.一種細(xì)胞攝入方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白或多肽引導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述的蛋白或多肽為具有約50-55千道爾頓的分子量。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述的蛋白或多肽具有相應(yīng)于SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求〔59〕69的方法，其中所述的蛋白或多肽具有22-28千道爾頓的分子量。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述的蛋白或多肽具有相應(yīng)于SEQ.ID.No.4的氨基酸序列。
64.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述的蛋白或多肽為純化的。
65.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述的物質(zhì)選自抗生素、DNA片段、抗癌劑、和其混合物。
66.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述的方法誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
68.用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入物質(zhì)的產(chǎn)品，包括用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入的物質(zhì)；和根據(jù)權(quán)利要求12的蛋白或多肽，其中所述的蛋白與所述的物質(zhì)有關(guān)。
69.細(xì)胞攝入方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求12的蛋白或多肽引導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及賦予結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞中存活之能力的DNA分子。由該基因片段編碼的蛋白在防止結(jié)核分枝桿菌感染的疫苗中是有用的,而產(chǎn)生的抗該蛋白的抗體用于被動(dòng)免疫那些已由該有機(jī)體感染的患者。這些蛋白和抗體均可用于檢測(cè)組織或體液中結(jié)核分枝桿菌的診斷分析。本發(fā)明的蛋白可與各種其它治療物質(zhì)一起,用于施用于哺乳動(dòng)物,尤其是人類,從而實(shí)現(xiàn)這類細(xì)胞對(duì)這些物質(zhì)的攝入。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1182454SQ96193436
公開日1998年5月20日 申請(qǐng)日期1996年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月22日
發(fā)明者L·W·里萊 申請(qǐng)人:康乃爾研究基金會(huì)有限公司