專利名稱：人趨化因子多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的用途以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明的多肽是人趨化因子β-4(也稱為“Ckβ-4”)和人趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白(稱為“MCP-4”，也稱為人趨化因子β-10和“Ckβ-10”)，這些統(tǒng)稱為“趨化因子多肽”。本發(fā)明還涉及抑制這些多肽的作用。
趨化因子是一類正在被發(fā)現(xiàn)的在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的小的分泌細(xì)胞因子超家族。所有的趨化因子在氨基酸水平呈25～75％的同源性且包含空間保守的半胱氨酸殘基，本發(fā)明的多肽也是如此。“C-X-C分支”的成員(根據(jù)在保守基序中開始兩個(gè)半胱氨酸的位置)，也稱為嗜中性白細(xì)胞激活肽(NAP)/IL-8家族，主要通過其作用于嗜中性白細(xì)胞激發(fā)促炎性活性(例如，IL-8和NAP-2)，而“C-C分支”家族的成員似乎是引誘某些單核細(xì)胞?！癈-C分支”成員包括PF4，MIPs，MCPs，及本發(fā)明的趨化因子多肽。
這一趨化因子家族已確定有許多生物學(xué)功能。巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α和1β是特定的淋巴細(xì)胞群和單核細(xì)胞的趨化物(Schall，T.J.，Cytokine，3165(1991))，而MCP-1已被闡明是特異的單核細(xì)胞化學(xué)引誘劑(Matsushima，K.，et al.，J.Exβ.Med.，691485(1989))。這一趨化因子家族的共同功能是能激發(fā)特定細(xì)胞如免疫細(xì)胞(白細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞的趨化性遷移。這些趨化因子也能激活這一家族中的某些細(xì)胞。
對(duì)趨化因子應(yīng)答的免疫細(xì)胞有許多體內(nèi)功能，因此通過此類趨化因子對(duì)其的調(diào)節(jié)功能在疾病的治療中是一個(gè)重要領(lǐng)域。
例如，嗜酸性細(xì)胞可殺滅寄生蟲以減輕寄生蟲感染，嗜酸性細(xì)胞也能引起呼吸系統(tǒng)的氣道慢性炎癥。巨噬細(xì)胞可抑制脊椎動(dòng)物腫瘤的形成。另外，嗜堿性粒細(xì)胞可釋放在變態(tài)反應(yīng)中起重要作用的組胺。由此，促進(jìn)和抑制這些細(xì)胞有廣泛的治療效用。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了新的多肽Ckβ-4和MCP-4(也稱為Ckβ-10)，以及其片段，類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人源的。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了編碼這些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了為治療目的而使用此多肽或編碼此多肽的多核苷酸的方法，如治療實(shí)體瘤、慢性感染、自身免疫疾病、銀屑病、氣喘癥、過敏癥，調(diào)節(jié)造血功能及促進(jìn)傷口愈合。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了抗這些多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了這些多肽的拮抗劑/抑制劑，其可用于例如在治療自身免疫疾病，慢性炎癥及感染性疾病，組胺介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，不依賴于前列腺素的發(fā)熱，骨髓功能低下，矽肺，結(jié)節(jié)病、嗜酸性細(xì)胞增多綜合征及肺炎時(shí)抑制這些多肽的作用。
本發(fā)明的這些及其它方面根據(jù)本文的教導(dǎo)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
下述附圖旨在說明本發(fā)明的實(shí)施方案，并非限制本發(fā)明的范圍。


圖1示出Ckβ-4的cDNA序列及相應(yīng)推出的氨基酸序列，前24個(gè)氨基酸代表推導(dǎo)的Ckβ-4的前導(dǎo)序列，因此推測(cè)的成熟多肽有70個(gè)氨基酸。使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸縮寫。
圖2示出MCP-4(也稱為Ckβ-10)的cDNA序列及相應(yīng)推出的氨基酸序列，前23個(gè)氨基酸代表推測(cè)的MCP-4(Ckβ-10)的前導(dǎo)序列，因此推測(cè)的成熟多肽有75個(gè)氨基酸。然而如圖5所注明的，在細(xì)胞中產(chǎn)生的MCP-4有若干個(gè)氨基末端，在圖1中由箭頭示出，在圖5中有顯示，本文將作討論。另外已觀察到在某些形式的MCP-4中有若干個(gè)羧基末端并在細(xì)胞中產(chǎn)生；如圖5所示并在本文討論。使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸縮寫。
圖3示出Ckβ-4和eotaxin成熟肽(底行)間的氨基酸序列同源性。
圖4示出人MCP-4(Ckβ-10)(頂行)與人MCP-3(底行)間氨基酸序列同源性。使用了標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸縮寫。
圖5示出經(jīng)體外表達(dá)分離的幾種不同形式的MCP-4(Ckβ-10)的氨基酸序列。Bac1，2和3示出用桿狀病毒表達(dá)的MCP-4三種NH2末端變體的序列。Dro1，2和3+示出在果蠅細(xì)胞中體外表達(dá)MCP-4cDNA而分離的MCP-4序列。此圖還示出全長(zhǎng)MCP-4序列與MCP-3和eotaxin序列間的同源性比較。相同的殘基用垂直線表示。
圖6是一對(duì)曲線圖，顯示出(A)應(yīng)答MCP-4(Ckβ-10)、eotaxin、MCP-1、MCP-2、MCP-3和RANTES而從細(xì)胞松馳素B處理的人血單核細(xì)胞中釋放的N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶.，以及(B)應(yīng)答MCP-4(Ckβ-10)、MCP-1、MCP-3和陰性對(duì)照的細(xì)胞松馳素B處理的單核細(xì)胞的遷移指數(shù)。
酶活性以(A)中垂直軸上任意熒光單位的線性方式表示，相對(duì)遷移指數(shù)是在(B)中垂直軸上以線性方式表示，在兩個(gè)曲線的水平軸上以log方式示出nM濃度的趨化因子濃度。
如下述實(shí)施例中討論的，在48孔趨化室中測(cè)量細(xì)胞遷移，在5個(gè)高強(qiáng)度區(qū)域計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。遷移是以遷移指數(shù)(遷移細(xì)胞平均值/未加趨化因子時(shí)遷移細(xì)胞平均值)表示。每個(gè)點(diǎn)是三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值，桿表示三個(gè)培養(yǎng)物平均值的標(biāo)準(zhǔn)方差。
圖7是-套顯示應(yīng)答各種濃度的MCP-4(Ckβ-10)、eotaxin、MCP-1、MIP-1α和陰性對(duì)照的CD4+和CD8+T-淋巴細(xì)胞的遷移的圖。上部分圖顯示CD4+T-淋巴細(xì)胞的遷移，下部分圖顯示CD8+T-淋巴細(xì)胞的遷移。在上下兩套圖中左圖顯示應(yīng)答MCP-1、MIP-1α和陰性對(duì)照的遷移，右圖顯示應(yīng)答MCP-4(Ckβ-10)、eotaxin的遷移。遷移細(xì)胞數(shù)以線性方式表示在垂直軸上，引誘劑培養(yǎng)基中的趨化因子濃度(nM)以log方式表示在水平軸上。
如下述實(shí)施例中討論的，在48孔趨化室中測(cè)量細(xì)胞遷移，在5個(gè)高強(qiáng)度區(qū)域計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。遷移是遷移指數(shù)(遷移細(xì)胞平均值/未加趨化因子時(shí)遷移細(xì)胞平均值)表示。每個(gè)點(diǎn)是三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值，桿表示三個(gè)培養(yǎng)物平均值的標(biāo)準(zhǔn)方差。
圖8提供了顯示人嗜酸性細(xì)胞應(yīng)答陰性對(duì)照、100nM MCP-1、100nM MCP-3和幾種濃度的MCP-4(Ckβ-10)和eotaxin的遷移的圖。遷移指數(shù)沿垂直軸以線性方式表示，引誘劑培養(yǎng)基中的趨化因子濃度(nM)以log方式表示在水平軸上。
如下述實(shí)施例中討論的，在48孔趨化室中測(cè)量細(xì)胞遷移，在5個(gè)高強(qiáng)度區(qū)域計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。遷移是以遷移指數(shù)(遷移細(xì)胞平均值/未加趨化因子時(shí)遷移細(xì)胞平均值)表示。每個(gè)點(diǎn)是三份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值，桿表示三個(gè)培養(yǎng)物平均值的標(biāo)準(zhǔn)方差。
圖9是顯示在各種濃度的Ckβ-4、堿性FGF和HG0100存在下培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的存活性的圖。按照鈣黃綠素釋放進(jìn)行的存活細(xì)胞計(jì)數(shù)以線性方式顯示在垂直軸上，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中因子的濃度(ng/ml)以log方式顯示在水平軸上。每個(gè)點(diǎn)是6份培養(yǎng)物的平均值，桿表示6個(gè)培養(yǎng)物平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖10是顯示在各種濃度的Ckβ-4、堿性FGF和HG0100存在下培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)生長(zhǎng)的圖。神經(jīng)生長(zhǎng)以線性方式在垂直軸上示出，是以在490nm測(cè)得的神經(jīng)絲蛋白光密度(OD490)表示。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中因子的濃度(ng/ml)以log方式在水平軸上表示。每個(gè)點(diǎn)是6份培養(yǎng)物的平均值，桿代表6個(gè)培養(yǎng)物的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖11是顯示在各種濃度的Ckβ-4和MCP-1存在下培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞的趨化性的圖。在每個(gè)圖中趨化性以485nm處激發(fā)刺激的530nm處熒光釋放比率呈線性方式在垂直軸上表示。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的因子濃度(ng/ml)以log方式在水平軸上示出。每個(gè)點(diǎn)代表幾份重復(fù)培養(yǎng)物的平均值，桿代表培養(yǎng)物平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了分離的核酸(多核苷酸)，其編碼具有圖1推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟Ckβ-4多肽，或編碼由ATCC保藏號(hào)75848的克隆(1994年7月29日保藏)的cDNA編碼的成熟多肽，以及編碼具有圖2和圖5推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟MCP-4(也稱為Ckβ-10)多肽，或編碼由ATCC保藏號(hào)75849的克隆(1994年7月29日保藏)的cDNA編碼的成熟多肽。根據(jù)本發(fā)明的這一方面還提供了編碼包括圖2和圖5所示的28-93位殘基序列的MCP-4多肽的多核苷酸，特別是編碼具有圖2和圖5所示的1-98、17-98、20-98、22-98、24-98、28-98、28-95或28-93位殘基序列的多肽的多核甘酸及其片段、類似物和衍生物。
編碼Ckβ-4的多核苷酸在衍生自人膽囊的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。Ckβ-4與趨化因子家族在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，含有一編碼96個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，該蛋白質(zhì)大約頭26個(gè)氨基酸殘基是推測(cè)的前導(dǎo)序列，如此成熟蛋白含70個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)在全部編碼序列上與eotaxin具有最高程度的同源性，呈20％相同性及37％相似性。另外趨化因子中的4個(gè)空間保守的半胱氨酸殘基在本發(fā)明的多肽中也被發(fā)現(xiàn)，這一點(diǎn)是很重要的。
編碼MCP-4(也稱作Ckβ-10)的多核苷酸在衍生自9周早期人組織的cDNA文庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)。MCP-4與趨化因子家族在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，含有一編碼98個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框，該蛋白質(zhì)大約頭20個(gè)氨基酸殘基是推測(cè)的前導(dǎo)序列，如圖5所示及本文其它處所討論的，如此成熟蛋白質(zhì)含有75個(gè)氨基酸，這取決于裂解位點(diǎn)，見圖5所示。該蛋白質(zhì)與MCP-1、MCP-2、MCP-3和eotaxin有顯著的序列相似性，并在全部編碼序列上與MCP-3具有最高的同源性，呈65％相同性和77％相似性。
以下詳細(xì)描述的本發(fā)明的特別優(yōu)選的MCP-4多肽(也稱為Ckβ-10)包括具有圖2或圖5所示氨基酸序列的多肽。應(yīng)理解的是這種優(yōu)選的多肽包括那些具有游離氨基及阻斷氨基末端的多肽，特別是圖5中所注明的多肽，其中的末端谷氨酰胺被焦谷氨酰胺殘基阻斷。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，優(yōu)選的是包括圖2或圖5所示的28-93位殘基序列的MCP-4多肽，特別優(yōu)選的是具有圖2或圖5所示的1-98、17-98、20-98、22-98、24-98、28-98、28-95和28-93位殘基序列的多肽及其片段、類似物和衍生物。
這里多肽例如可用桿狀病毒載體在昆蟲宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的cDNA、特別是具有圖1、2或5所示序列的cDNA或具有保藏克隆的人cDNA序列的cDNA而產(chǎn)生。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1和圖2所示的編碼序列相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由于遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性，與圖1和圖2或圖5的DNA或保藏的cDNAs編碼相同的成熟多肽或例如上文所述的其它多肽。
編碼圖1和圖2或圖5的成熟多肽以及本文其它處所述多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即僅包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1和圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列和圖5所示序列的多肽或編碼由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或是該多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼圖1和圖2所示的相同成熟多肽、圖5所示的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1和圖2的多肽或圖5所示多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物，這些核苷酸變異體包括缺失變異體、取代變異體和添加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1和圖2所示的編碼序列或圖5所示多肽編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。如本領(lǐng)域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，但基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括這樣的多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框內(nèi)與有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸融合，例如前導(dǎo)序列，其是用于控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白(preprotein)，前導(dǎo)序列可以由宿主細(xì)胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸還可編碼一種蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸殘基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原并是蛋白質(zhì)的非活性形式，一旦序列原被切掉，則保留活性成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或編碼具有序列原的蛋白或具有序列原和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有在讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，其可用于純化本發(fā)明的多肽。標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物用于在細(xì)菌宿主中純化與該標(biāo)記物融合的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列可以是血凝素標(biāo)記物(HA)。HA標(biāo)記物相應(yīng)于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少50％、優(yōu)選70％的相同性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件，，是指雜交僅發(fā)生在序列間具有至少95％、優(yōu)選97％相同性的情況下。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1和圖2的cDNA編碼的成熟多肽、或圖5所示的多肽或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物將根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定期限保藏。這些保藏僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是對(duì)根據(jù)35 U.S.C 112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時(shí)，其是參照。制造、使用或銷售保藏物需經(jīng)許可，而本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1和圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的趨化因子多肽，以及該多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1和圖2的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持這些多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，其可通過裂解蛋白原部分而激活以生產(chǎn)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的趨化因子多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1和圖2的多肽或圖5的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選由保守的氨基酸殘基取代)，并且這種取代的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類似物被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并優(yōu)選純化至均一性。
術(shù)語“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，若其是天然存在的則是天然環(huán)境)中脫離的物質(zhì)。例如，存在于活體動(dòng)物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，并且如果這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其還是分離的。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在改良的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，改良培養(yǎng)基是為了激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增Ckβ-4或MCP-4基因(也稱作Ckβ-10基因)。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前用于選擇用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，其對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可通過重組技術(shù)用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達(dá)載體中特別是載體或質(zhì)粒中以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒；衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可復(fù)制和生存。
如上所述，可通過多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，通常，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些和其它程序?qū)儆诒绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接以指導(dǎo)mRNA合成，作為這些啟動(dòng)子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動(dòng)子，E.coli lac或trp啟動(dòng)子，λ噬菌體PL啟動(dòng)子和其它公知用于控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或者病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還含有一用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的基因，如對(duì)于真核細(xì)胞培養(yǎng)為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可采用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動(dòng)子或調(diào)控序列的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅和Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。選擇合適的宿主細(xì)胞被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在該載體中以正向或反向插入本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動(dòng)子，它們是可商購(gòu)的。以下舉出載體的例子，細(xì)菌的載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質(zhì)?；蜉d體，只要其可在宿主中復(fù)制和生存即可。
啟動(dòng)子區(qū)可以選自使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體的任何所需基因，兩個(gè)合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambdaPR，PL和trp；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動(dòng)子屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范疇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建物的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞?？赏ㄟ^磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))將構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
可以用傳統(tǒng)的方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建物以生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。或者，也可通過常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動(dòng)子的控制下，可以在哺乳細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白質(zhì)，也可采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建物衍生的RNA生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達(dá)載體見Sambrook，et al，Molecular ClonningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書引入本文作參考。
高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入一增強(qiáng)子序列而得以增加，增強(qiáng)子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用于啟動(dòng)子以增加其轉(zhuǎn)錄。其例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(100-270bp處)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表達(dá)基因的啟動(dòng)子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)子可以衍生于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白的操縱子。在合適的階段，雜合結(jié)構(gòu)序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地，裝配一能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列。任選地，雜合序列可以編碼一包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，以賦予所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡(jiǎn)便性。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號(hào)一起插入帶有功能啟動(dòng)子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標(biāo)記及一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以確證載體保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中擴(kuò)增。合適的用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當(dāng)然，也可采用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細(xì)菌表達(dá)載體可以包括衍生于包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購(gòu)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，這些商購(gòu)質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動(dòng)子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度改變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。
典型地，細(xì)胞由離心收集，用物理或化學(xué)方法破碎，保留得到的粗提物以進(jìn)一步純化。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可用任何常規(guī)方法破碎，如凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解試劑，這些方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的。
也可使用各種哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，以及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳類表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列?？墒褂迷醋許V40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接體和多腺苷酸化位點(diǎn)以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
可通過硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陽離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析羥基磷灰石層析和凝集素層析等方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化趨化因子多肽。如果需要，可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)型，最后，可采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的趨化因子多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成過程的產(chǎn)物，或者通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，通過培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳類細(xì)胞)而生產(chǎn)。根據(jù)在重組生產(chǎn)過程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化或是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可以包括一起始的甲硫氨酸殘基。
趨化因子多肽在癌癥化療及治療白血病期間可被用于抑制骨髓干細(xì)胞群形成以作為輔助的保護(hù)性治療。
趨化因子多肽也可通過調(diào)節(jié)各種造血祖細(xì)胞的活化和分化而調(diào)節(jié)造血機(jī)能。
趨化因子多肽也可用于抑制表皮角化細(xì)胞增殖以治療以角化細(xì)胞增殖為特征的銀屑病。
趨化因子多肽也可通過激發(fā)宿主防御細(xì)胞如CD8+，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的侵入及活化用于治療實(shí)體腫瘤。具體地，Ckβ-4作用于外周血淋巴細(xì)胞，MCP-4(也稱為Ckβ-10)作用于CD8+T細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和單核細(xì)胞。它們也可被用于提高患者防御機(jī)能抵御有抵抗力的慢性感染，如通過對(duì)微生物殺傷性白細(xì)胞的引誘和激活來抵御分支桿菌感染、利斯特氏菌感染或利什曼蟲感染或機(jī)會(huì)致病菌感染如隱球菌感染、例如由Ckβ-4引誘外周血白細(xì)胞(PBL)，由MCP-4引誘CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞。
趨化因子多肽也可提高嗜酸性細(xì)胞數(shù)量，這些細(xì)胞具有獨(dú)特的殺死侵入組織中寄生蟲的幼蟲的功能，如在血吸蟲病，毛線蟲病和蛆蟲病中。
趨化因子多肽還可通過對(duì)IL2生物合成的抑制來抑制T細(xì)胞增殖以治療自身免疫疾病和白血病。
Ckβ-4和MCP-4(也稱為Ckβ-10)也可用于傷口愈合，都是通過清除碎屑及結(jié)締組織促炎細(xì)胞的募集，也通過其對(duì)過量的TGFβ介導(dǎo)的纖維化的控制來完成。以這種相同方式，Ckβ-4和MCP-4也可被用于治療其它纖維性疾病，包括肝硬化，骨關(guān)節(jié)炎和肺纖維化。
本發(fā)明的趨化因子也可用于促進(jìn)神經(jīng)元存活和分化，它們可用于治療神經(jīng)退化癥。因此，例如Ckβ-4可以用于促進(jìn)神經(jīng)元存活和神經(jīng)生長(zhǎng)。
趨化因子還可被用作血管發(fā)生抑制劑，因而它們具有抗腫瘤功能。
本發(fā)明的趨化因子也可用于鑒別具有相似生物活性的其它分子。如此篩選的一個(gè)例子是用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針來分離基因的編碼區(qū)。具有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸用來篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫(kù)以確定與探針雜交的文庫(kù)成員。
本發(fā)明還涉及一種診斷分析方法，以定量和定性檢測(cè)多肽或?yàn)樵摱嚯奶峁┬畔⒌膍RNA的改變的水平。本領(lǐng)域人員熟知這類分析方法，包括ELISA分析、放射免疫分析及RT-PCR。分析中檢測(cè)出的多肽或其mRNA的水平可用于闡明多肽在各種疾病中的顯著性及用于診斷其中多肽水平改變明顯的疾病。
本發(fā)明提供了一種鑒別多肽的受體的方法，編碼受體的基因經(jīng)表達(dá)克隆被鑒別。從對(duì)多肽有應(yīng)答的細(xì)胞中制備多腺苷酸化RNA，將產(chǎn)自該RNA的cDNA文庫(kù)分成各集合體用于轉(zhuǎn)染對(duì)多肽無應(yīng)答的COS細(xì)胞或其它細(xì)胞。將在玻片上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于標(biāo)記的多肽?？捎枚喾N方法包括碘化或引入位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識(shí)別位點(diǎn)將多肽標(biāo)記。在固定和溫育后，對(duì)玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒別出陽性集合體并使用重復(fù)的亞集合體和重篩選方法制備亞集合體，最后產(chǎn)生編碼推測(cè)的受體的單一克隆。作為受體鑒別的另一種方法，可將標(biāo)記的多肽與細(xì)胞膜或表達(dá)受體分子的提取制備物光親和性連接。經(jīng)PAGE分析將交聯(lián)材料分解并在X線下曝光。切下含多肽受體的標(biāo)記復(fù)合物，分解成肽片段并進(jìn)行蛋白質(zhì)微量測(cè)序。由微量測(cè)序得到的氨基酸序列用于設(shè)計(jì)生成一套寡核苷酸探針以篩選cDNA文庫(kù)從而鑒別編碼推測(cè)的受體的基因。
本發(fā)明提供了一種用以鑒別那些能增強(qiáng)(刺激劑)或阻斷(拮抗劑)多肽與其鑒定的受體的相互作用的藥物的篩選藥物的方法。刺激劑是一種能提高多肽固有生物功能的化合物，而拮抗劑則消除這種功能。例如將表達(dá)多肽受體的哺乳細(xì)胞或其膜制備物在藥物的存在下與如放射性標(biāo)記的趨化因子多肽進(jìn)行溫育，則可檢測(cè)藥物促進(jìn)或阻斷此相互作用的能力。
潛在的拮抗劑包括抗體，或在某些情況下，與多肽結(jié)合的寡核苷酸。潛在的拮抗劑的另一例子是多肽的顯性失活突變體。顯性失活突變體是與野生型多肽的受體結(jié)合但不能保持其生物活性的多肽。
檢測(cè)多肽顯性失活突變體的分析包括一種體外趨化性分析，其中配有不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜的多孔趨化室用來檢測(cè)在潛在的拮抗劑/抑制劑或刺激劑分子的存在或不存在下，多肽對(duì)白細(xì)胞的化學(xué)引誘能力。
用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建物也是可能的拮抗劑。反義技術(shù)通過三螺旋形成或反義DNA或RNA可用于控制基因表達(dá)，這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼區(qū)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)一DNA寡核苷酸以互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄涉及的基因的某區(qū)域(三螺旋-見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooneyet al，Science，241456(1988)；and Dervan et al，Seience，2511360(1991)，從而防止多肽的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成多肽。(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。上述的寡核苷酸也可輸送至細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可以在體內(nèi)表達(dá)以抑制多肽的生產(chǎn)。
另一種潛在的拮抗劑是多肽的肽衍生物，所述的多肽是失去生物學(xué)功能但仍能識(shí)別并與多肽受體結(jié)合從而有效地阻斷受體的多肽的天然或合成的修飾的類似物，肽衍生物的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
拮抗劑可用于在自身免疫疾病、慢性炎癥及感染性疾病當(dāng)中抑制巨噬細(xì)胞及其前體、嗜中性白細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及一些T細(xì)胞亞型如活化的CD8+胞毒性T細(xì)胞及天然殺傷細(xì)胞的趨化性和活化作用。自身免疫疾病的例子包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥及胰島素依賴型糖尿病。一些感染性疾病包括阻止單核噬細(xì)胞的增生及激活的矽肺、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性肺纖維化，阻止嗜酸細(xì)胞的生產(chǎn)和遷移的原發(fā)性嗜酸細(xì)胞增多綜合癥，阻止巨噬細(xì)胞的遷移及本發(fā)明的多肽的產(chǎn)物的生產(chǎn)的內(nèi)毒性休克。拮抗劑也可通過阻止在動(dòng)脈壁的單核細(xì)胞的侵潤(rùn)用于治療動(dòng)脈硬化。
拮抗劑也可通過抑制趨化因子誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒并釋放組胺用以治療組胺型變態(tài)反應(yīng)。
拮抗劑也可通過阻止單核細(xì)胞對(duì)傷口區(qū)域侵潤(rùn)治療炎癥。由于急性和慢性肺部炎癥與肺內(nèi)單核吞噬細(xì)胞的隔絕有關(guān)，因而拮抗劑也可用于調(diào)節(jié)正常肺吞噬細(xì)胞數(shù)量。
拮抗劑也可通過阻止單核細(xì)胞對(duì)患者關(guān)節(jié)內(nèi)滑液的侵潤(rùn)用以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。單核細(xì)胞的侵入及激活是退化性和炎癥性關(guān)節(jié)病的一個(gè)重要致病因素。
拮抗劑也可用于干擾主要是IL-1和TNF引起的損害性級(jí)聯(lián)作用，其能阻止其它炎性細(xì)胞因子的生物合成。由此拮抗劑可用于預(yù)防炎癥。拮抗劑也可用于抑制趨化因子誘導(dǎo)的前列腺素不依賴型發(fā)熱。
拮抗劑也可用于治療骨髓機(jī)能低下疾病，如再生障礙性貧血和骨髓發(fā)育不良綜合癥。
拮抗劑也可通過阻止嗜酸性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的積聚用于治療氣喘及變態(tài)反應(yīng)。拮抗劑還可與如下文所述的藥物學(xué)可接受的載體形成組合物而應(yīng)用。
本發(fā)明的趨化因子多肽及刺激劑或拮抗劑可以與合適的藥物學(xué)載體聯(lián)合應(yīng)用。如此的組合物包括治療有效量的多肽和藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其結(jié)合物。配制品應(yīng)適合給藥的方式。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝盒或試劑盒，其包括一或多個(gè)填充有一或多種本發(fā)明的藥物組合物成分的容器。與這種容器在一起的還有由控制藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)出具的通知，該通知反應(yīng)了該機(jī)構(gòu)許可其為人體用而生產(chǎn)、使用或銷售。另外，本發(fā)明的多肽可以與其它藥物化合物結(jié)合應(yīng)用。
此藥物組合物可以諸如局部，靜脈，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，腫瘤內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，或皮內(nèi)途徑的傳統(tǒng)方式給藥。多肽的給藥量是足以治療和/或預(yù)防特定的病癥。一般來說，多肽的給藥量最低為大約每天每千克體重10微克，大多數(shù)情況下給藥量不超過每天每千克體重約8毫克。大多數(shù)情況下，考慮到給藥途徑、癥狀等，藥劑量為每天每千克體重約10微克至1毫克。
根據(jù)本發(fā)明，趨化因子多肽和刺激劑或拮抗劑也可以用于體內(nèi)表達(dá)多肽，即經(jīng)常被稱為“基因治療”的方法。
因此，例如，可用編碼來自體內(nèi)的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對(duì)患者的細(xì)胞進(jìn)行工程化，隨后將工程化的細(xì)胞再提供給需用多肽治療的患者，這些方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒利用本領(lǐng)域熟知的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行工程化。
類似地，例如也可通過本領(lǐng)域公知的程序在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程化以在體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域所公知的，可將生產(chǎn)含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細(xì)胞給予患者以在體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的工程化并在體內(nèi)表達(dá)多肽。通過這種方法給予本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)是顯而易見的。例如，用于工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，而是例如腺病毒，其在與合適的輸送載體結(jié)合后可用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個(gè)別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購(gòu)用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來的非常重要的第一步。
簡(jiǎn)而言之，可通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用cDNA的計(jì)算機(jī)分析快速選擇長(zhǎng)度不超過基因組DNA的一個(gè)外顯子并因而不會(huì)使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對(duì)含有個(gè)別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個(gè)快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類似的方式將來自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體特異的cDNA文庫(kù)。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至500或600個(gè)堿基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于與獨(dú)特的染色體位置結(jié)合以具有足夠的信號(hào)強(qiáng)度便于檢測(cè)。FISH需要使用衍生EST的克隆，越長(zhǎng)越好。例如，2000bp是好的，更好為4000bp，而超過4000則可能不是獲得好結(jié)果所必須的，因其時(shí)間百分比不合理。此技術(shù)的綜述見Verma et al.，Human Chromosomesa Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中發(fā)現(xiàn)(可在線從JohnsHopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個(gè)體和未感染個(gè)體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個(gè)體中觀察到某一突變而未在任何正常個(gè)體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的致病基因中的一個(gè)(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個(gè)基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或其類似物、或表達(dá)其的細(xì)胞可用作免疫原生產(chǎn)抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的各種程序生產(chǎn)這些抗體和片段。
抗對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽的抗體可以通過將多肽直接注射給動(dòng)物或?qū)⒍嚯慕o予動(dòng)物、優(yōu)選非人而獲得，如此獲得的抗體隨后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，僅編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可用于生產(chǎn)與完整天然多肽結(jié)合的抗體，這種抗體隨后可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離該多肽。
為制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體的技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(USP4.946,778)可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
以下將參照實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解的是，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。除非另有說明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進(jìn)對(duì)下述實(shí)施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿懽帜竝置于前面和/或后跟大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤?gòu)得到的，或者是公眾可以不受限制地得到的，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對(duì)DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購(gòu)的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)粒或DNA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μg DNA。對(duì)特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃1小時(shí)的溫育時(shí)間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic AcidsRes.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個(gè)互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有經(jīng)過脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有說明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。實(shí)施例1 Ckβ-4的細(xì)菌表達(dá)和純化用對(duì)應(yīng)于加工的Ckβ-4蛋白(減去推測(cè)的信號(hào)肽序列)的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼Ckβ-4的DNA序列，ATCC#75848。將對(duì)應(yīng)于Ckβ-4的附加的核苷酸分別加入到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物序列為5’-CCC
AAGCAGCAAGCAACTTT-3’(SEQ ID NO5)，其含有-SphI限制性酶位點(diǎn)(黑體字處)，后接起自編碼成熟蛋白序列的第二個(gè)核苷酸的17個(gè)Ckβ-4編碼序列的核苷酸(下劃線處)。ATG密碼子包含在SphI位點(diǎn)內(nèi)，ATG后的下一個(gè)密碼子，其第一個(gè)堿基來自SphI位點(diǎn)，剩下兩個(gè)堿基對(duì)應(yīng)于推定的成熟蛋白的第一個(gè)密碼子的第二個(gè)和第三個(gè)堿基。結(jié)果，在其構(gòu)建物中在成熟蛋白序列的氨基末端加上了氨基酸MQA。3’序列為5’-AAA
ATGTTCTTGACTTTTTTACT-3’(SEQ ID NO6)，其含有互補(bǔ)于BamHI位點(diǎn)的序列(黑體字處的)，后接21個(gè)在終止密碼子前的基因特異性序列的核苷酸。限制性酶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-70(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，OA，91311)上的限制性酶位點(diǎn)。pQE-70編碼抗生素抗性(Ampr’)，一個(gè)細(xì)菌復(fù)制點(diǎn)(ori)，一個(gè)IPTG可調(diào)控啟動(dòng)子操縱子(P/O)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記(6-His)及限制性酶位點(diǎn)。用SphI和BamHI消化pQE-70。將擴(kuò)增序列連到pQE-70中并插入有編碼6-組氨酸標(biāo)記的序列及RBS的框架中。然后通過Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)所述步驟，用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株(來自Qiagen，商標(biāo)M15/rep4)。M15/rep4含有多拷貝的表達(dá)lacI阻遏物并賦予卡那霉素抗性(Kanr)的質(zhì)粒pREP4。在LB平板上鑒別轉(zhuǎn)化子并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制性分析確定。在補(bǔ)加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基中將含有所需構(gòu)建物的克隆培養(yǎng)過夜(O/N)，O/N培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比例接種到大體積培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞至光密度600(0.D.600)為0.4-0.6。隨后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)激活P/O，使基因表達(dá)水平提高。再培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解到離液劑6M鹽酸胍中，澄清后，在使得與含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，通過鎳-鰲合柱層析(Hochuli，E.et.，J.Chromatography 411177-184(1984)，從溶液中純化溶解的Ckβ-4。在6M鹽酸胍pH5.0中從柱中洗脫Ckβ-4(純度＞98％)。蛋白質(zhì)由GnHCl中復(fù)性出來可以
其中R4是無環(huán)脂肪C15-C22烴基、R5是C1-C4飽和烷基，或羥烷基，R8選自上述R4和R5，而A-是上面定義的陰離子；(ii)下式二酰氨基季銨鹽
其中R1是無環(huán)脂肪C15-C21烴基，各R2是有1至3個(gè)碳原子相同或不同的二價(jià)亞烷基，R5和R9是C1-C4飽和烷基、或羥烷基，而A是陰離子；(iii)下式二酰氨基烷氧基化季銨鹽
其中n等于1至約5，而R1、R2、R5和A-定義同上；(iv)
其中R1是無環(huán)脂肪C15-C21烴基，R2是有1-3個(gè)碳原子的相同或不同的二價(jià)亞烷基，R5是C1-C4飽和烷基或羥烷基，A-是陰離子，而R2與其它R2相同或不同。
(v)它們的混合物成分(c)的例子眾所周知的是二烷基二甲基銨鹽，例如二動(dòng)物脂-70。將擴(kuò)增序列連到pQE-70中并插入有編碼6-組氨酸標(biāo)記的序列及RBS的框架中。然后通過Sambrook，J.et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)所述步驟，用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株(來自Qiagen，商標(biāo)M15/rep4)。M15/rep4含有多拷貝的表達(dá)lacI阻遏物并賦予卡那霉素抗性(Kanr’)的質(zhì)粒pREP4。在LB平板上鑒別轉(zhuǎn)化子并篩選氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制性分析確定。在補(bǔ)加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基中將含有所需構(gòu)建物的克隆培養(yǎng)過夜(O/N)，O/N培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的比例接種到大體積培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞至光密度600(0.D.600)為0.4-0.6。隨后加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)激活P/O，使基因表達(dá)水平提高。再培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解到離液劑6M鹽酸胍中，澄清后，在使得與含6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，通過鎳-鰲合柱層析(Hochuli，E.et.，J.Chromatography 411177-184(1984)，從溶液中純化溶解的MCP-4(也稱為Ckβ-10)。在6M鹽酸胍pH5.0中從柱中洗脫MCP-4(純度＞98％)。蛋白質(zhì)由GnHCl中復(fù)性出來可以各種方案進(jìn)行(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Strueture-A Practical Approach，IRL Press，New York(1990)。首先使用透析步驟以除去GnHCl?；蛘邚逆?鰲合柱中分離出的純化的蛋白質(zhì)結(jié)合到第二個(gè)柱中，在第二個(gè)柱中具有下降的線性GnHCl梯度。在結(jié)合到柱中時(shí)使蛋白質(zhì)復(fù)性，隨后用含250mM咪唑，150mM氯化鈉，25mM Tris-HCl pH7.5及10％甘油的緩沖液洗脫。最后，將溶解的蛋白質(zhì)對(duì)含5mM碳酸氫銨的貯存緩沖液透析。然后在SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質(zhì)。實(shí)施例3 重組Ckβ-4在COS細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒Ckβ-4 HA的表達(dá)衍生自載體pcDNAI/Amp(Initrogen)，所述載體含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)E.coli復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，后接多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和多腺苷酸化位點(diǎn)。編碼完整Ckβ-4前體和在框內(nèi)融合到其3’末端的HA標(biāo)記的DNA片段被克隆至載體的多接頭區(qū)，從而重組蛋白質(zhì)直接在CMV啟動(dòng)子下表達(dá)。HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，andR.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標(biāo)記與靶蛋白質(zhì)融合使得用識(shí)別HA表位的抗體很容易檢測(cè)重組蛋白質(zhì)。
下面闡述質(zhì)粒構(gòu)建策略使用兩種引物在原始的EST上由PCR構(gòu)建編碼Ckβ-4的DNA序列，ATTC.#75848，5’引物序列為5’-GGAAAGCTTATGTGCTGTACCAAGAGTTT-3’(SEQ ID NO9)，其含有一Hind III位點(diǎn)，后接20個(gè)起自起始密碼子的Ckβ-4編碼序列的核苷酸；3’序列為5’CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACATGGTTCCTTGACTTTTT-3’(SEQ ID NO10)，其含有互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)、轉(zhuǎn)譯終止密碼子、HA標(biāo)記及Ckβ-4編碼序列的后20個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。因此PCR產(chǎn)物含有一HindIII位點(diǎn)，Ckβ-4編碼序列，后接框內(nèi)融合的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后的轉(zhuǎn)譯終止密碼子及XbaI位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體，pcDNAI/Amp，用Hind III和XabI限制性酶消化并連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株SURE(得自Strategene Cloning Systems，11099North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)，在氨芐青霉素培養(yǎng)平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒DNA并用限制性分析檢測(cè)正確的片段的存在。為表達(dá)重組Ckβ-4，將COS細(xì)胞通過DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Laboratory Press，(1987)。用放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)Ckβ-4 HA蛋白的表達(dá)(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)。轉(zhuǎn)染二天后，將細(xì)胞用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物培養(yǎng)基，用去污劑(RIPA緩沖液(150mM氯化鈉，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1 984))將細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基用HA特異性單克隆抗體沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分析。實(shí)施例4 重組MCP-4在COS細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒MCP-4-HA(也稱為Ckβ-10HA)的表達(dá)衍生自載體pcDNAI/Amp(Initrogen)，所述載體含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)E.coli復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，后接多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和多腺苷酸化位點(diǎn)。編碼完整MCP-4前體和在框內(nèi)融合到其3’末端的HA標(biāo)記的DNA片段被克隆至載體的多接頭區(qū)，從而重組蛋白質(zhì)直接在CMV啟動(dòng)子下表達(dá)。HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA標(biāo)記與靶蛋白質(zhì)融合使得用識(shí)別HA表位的抗體很容易檢測(cè)重組蛋白質(zhì)。
下面闡述質(zhì)粒構(gòu)建策略
使用兩種引物在原始的EST上由PCR構(gòu)建編碼MCP-4(也稱為Ckβ-10)的cDNA序列，其存在于ATTC.#75849的DNA的cDNA插入物中，5’引物序列為5’-GGAAAGCTTATGAAAGTTTCTGCAGTGC-3’(SEQ ID NO11)，其含有一Hind III位點(diǎn)，后接19個(gè)起自起始密碼子的MCP-4編碼序列的核苷酸；3’序列為5’CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAAGTCTTCAGGGTGTGAGCT-3’(SEQ ID NO12)，其含有互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)譯終止密碼子、HA標(biāo)記及MCP-4編碼序列的后19個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。因此PCR產(chǎn)物含有一HindIII位點(diǎn)，MCP-4編碼序列，后接框內(nèi)融合的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后的轉(zhuǎn)譯終止密碼子及XbaI位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體，pcDNAI/Amp，用Hind III和BamHI限制性酶消化并連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株SURE(得自Strategene Cloning Systems，11099North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)，在氨芐青霉素培養(yǎng)平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒DNA并用限制性分析檢測(cè)正確的片段的存在。為表達(dá)重組MCP-4(也稱為Ckβ-10)，將COS細(xì)胞通過DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1987)。用放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)Ckβ-10 HA蛋白的表達(dá)(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)。轉(zhuǎn)染二天后，將細(xì)胞用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物培養(yǎng)基，用去污劑(RIPA緩沖液(150mM氯化鈉，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，Let al.，Id.37767(1984))將細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基用HA特異性單克隆抗體沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分析。實(shí)施例5 用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆并表達(dá)MCP-4編碼全長(zhǎng)MCP-4蛋白(也稱為Ckβ-10蛋白質(zhì))的cDNA序列，存在于ATCC#75849的DNA中，是使用對(duì)應(yīng)于基因的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增的5’引物序列為5’-CGCG
TTAACCTTCAACATGAAA(SEQ ID NO13)，其含有一BamHI限制性酶位點(diǎn)(黑體字處)，后接12個(gè)代表在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)譯起始的有效信號(hào)的核苷酸(J.Mol.Biol.1987，196，947-950，Kozak，M.)，緊接其后是MCP-4編碼序列的前6個(gè)核苷酸(劃線處是轉(zhuǎn)譯起始密碼子ATG)。
3’引物序列為5’-CGCGGGTACCTTAACACATAGTACATTTT(SEQ ID NO14)，其含有限制性內(nèi)切酶Asp781的裂解位點(diǎn)及19個(gè)互補(bǔ)于MCP-4基因的3’非轉(zhuǎn)譯序列的核苷酸。使用商購(gòu)的試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)將擴(kuò)增的序列從1％瓊脂糖凝膠中分離出。然后用內(nèi)切酶BamHI和Asp781消化該片段，隨后再次用1％瓊脂糖凝膠純化。該片段命名為F2。
載體pA2(pVL941載體的修飾物，見下述)通過使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(綜述參見Summers，M.D.and Smith G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)程序方法手冊(cè)，德克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站通報(bào)No.1555)用于MCP-4蛋白質(zhì)的表達(dá)。該表達(dá)載體含有苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子，后接限制性內(nèi)切酶BamHI和Asp781的識(shí)別位點(diǎn)。猴病毒(SV)40的多腺苷酸位點(diǎn)用于有效地多腺苷酸化。為易于篩選重組病毒，以與多角體蛋白啟動(dòng)子相同的方向插入E.coli的β-半乳糖苷酶基因，后接多角體蛋白基因的多腺苷酸信號(hào)。多角體蛋白序列的兩側(cè)由病毒序列旁側(cè)，以用于共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組。許多其它的桿狀病毒載體如pAc373，pVL941和pAcIM1，可用于代替pRG1(Luckow，V A.and Summers，M.D.，Virology，17031-39)。
用限制性酶BamHI和Asp781消化質(zhì)粒，然后通過本領(lǐng)域人員已知程序使用牛腸磷酸酶脫磷酸。將DNA從1％瓊脂糖凝膠中分離出，這一載體DNA稱為V2。
用T4DNA連接酶將F2片段和去磷酸化的V2質(zhì)粒連接。然后轉(zhuǎn)化E.coli HB101細(xì)胞，用BamHI和Asp781鑒別含帶有MCP-4基因的質(zhì)粒pBacMCP-4(也稱為pBacCkβ-10)的細(xì)菌?？寺∑蔚男蛄杏肈NA測(cè)序證實(shí)。
使用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417(1987))將5μg pBacMCP-4質(zhì)粒與1.0μg商購(gòu)的線性桿狀病毒(“Baculo GoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染。
在含50μl無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定板的無菌孔中將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg pBacMCP-4質(zhì)?；旌?。隨后加入10μl Lipofectin和90μlGrace’s培養(yǎng)基，混和并在室溫下溫育15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物滴加到種植在含1ml無血清的Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板上的Sf9昆蟲細(xì)胞中(ATCC CRL 1711)。將平板前后搖動(dòng)以混合新加入的溶液。然后在27℃溫育此平板5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板中除去轉(zhuǎn)染物溶液，加入補(bǔ)充有10％胎牛血清的1ml Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。將平板放回溫育器在27℃下繼續(xù)培養(yǎng)四天。
四天后收集上清，進(jìn)行類似如Summers和Smith(前述)所述的空斑分析。使用帶“Blue Gal”的修飾的瓊脂糖凝膠(Life TechnologiesInc.Gaithersburg)，其能較易分離出藍(lán)染的空斑(“空斑分析”的詳細(xì)描述見于Life Technologies Inc.，Gaithersbury為昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)分發(fā)的使用手冊(cè)的第9-10頁。)將病毒的連續(xù)稀釋液加入細(xì)胞中四天后，用一Eppendorf吸量管的尖頭挑出藍(lán)染的空斑。將含重組病毒的瓊脂重懸在一個(gè)含200μlGrace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。經(jīng)短暫的離心除去瓊脂，含重組桿狀病毒的上清用于感染種在35mm平皿中的Sf9細(xì)胞。四天后收集這些培養(yǎng)皿中的上清，在4℃下貯藏。
Sf9細(xì)胞在補(bǔ)加10％熱失活的FBS的Grace’s培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。然后用重組桿狀病毒V-MCP-4(也稱為V-Ckβ-10)以感染復(fù)數(shù)(MOI)＝2感染該細(xì)胞，六小時(shí)后除去培養(yǎng)基，置換入不含蛋氨酸和半胱氨酸的SF900 II培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)。42小時(shí)后加入5μCi的35S-蛋氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(Amersham)。溫育該細(xì)胞16小時(shí)后，離心收集并通過SDS-PAGE和放射自顯影觀察標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6-12 用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和果蠅細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)MCP-4(也稱為Ckβ-10)及表達(dá)的MCP-4的鑒定如上所述進(jìn)行下述實(shí)施例6-12，只是稍作修改并采用下面總述及各具體實(shí)施例中所述的另外的技術(shù)。(如在它處所述的，MCP-4也稱為Ckβ-10)克隆和表達(dá)編碼MCP-4的全長(zhǎng)cDNA被克隆到桿狀病毒表達(dá)載體(PharMingen)中，根據(jù)廠商指導(dǎo)用重組桿狀病毒感染SF9細(xì)胞，低速離心收集細(xì)胞上清。用混合的蛋白酶抑制劑(20μg/ml pefablocSC，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml E64和1mM EDTA)處理上清，并用肝素親和、陽離子交換和大小排阻層析純化重組蛋白。用電子噴射質(zhì)譜分析純度大于95％的蛋白并測(cè)序。
趨化因子根據(jù)熟知方案(Clark-Lewis等，生物化學(xué)303128-3135(1991))化學(xué)合成用于對(duì)比的趨化因子MCP-1、MCP-2、MCP-3、RANTES、MIP-1α和eotaxin。
細(xì)胞單核細(xì)胞(Uguccioni等，歐洲免疫學(xué)雜志2564-68(1995))和嗜中性粒細(xì)胞(Peveri等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1671547-1559(1988))以大于90％的純度分離自由瑞士紅十字會(huì)中心實(shí)驗(yàn)室提供的供體血液淡黃層。用同一來源分離血淋巴細(xì)胞(Loetscher等，F(xiàn)ASEB J.81055-1060(1994))。根據(jù)Loetscher等，F(xiàn)ASEB J.81055-1060(1994)所述培養(yǎng)保持并使用人CD4+和CD8+T細(xì)胞克隆。通過葡聚糖沉積、Percoll密度梯度離心及用抗CD16單抗包被的磁珠的陰性篩選從健康個(gè)體的新鮮血液中純化嗜酸性細(xì)胞(Rot等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)1798960-8964(1995))。
實(shí)施例6在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)MCP-4(也稱為Ckβ-10)含有MCP4編碼序列的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建如上所述制備用于這一實(shí)施例的表達(dá)載體，用質(zhì)粒載體pA2表達(dá)MCP-4，這一質(zhì)粒是Gentz等，歐洲生物化學(xué)雜志210545-554(1992)所述的pNR704的衍生物，此載體中已導(dǎo)入E.coliβ一半乳糖苷酶基因用于篩選重組子。
用下列PCR寡核苷酸分離擴(kuò)增MCP-4的編碼序列。
正向引物(SEQ ID NO15)5’GCGGGATCCTTAACCTTCAACATGAAA反向引物(SEQ ID NO16)5’CGCGGGTACCTTAACACATAGTACATTTT擴(kuò)增后用限制性內(nèi)的酶BamHI和AspT18消化片段，然后插入表達(dá)載體，該表達(dá)載體在多角體啟動(dòng)子下游含有這些限制性位點(diǎn)。
經(jīng)限制性分析和DNA測(cè)序證實(shí)合適的插入及載體和插入片段的方向。
重組桿狀病毒的分離用脂轉(zhuǎn)染方法將5μg含MCP-4 cDNA的表達(dá)載體和1μg線性化桿狀病毒DNA(BaculoGOLD TM，Pharmingen，San Diego，CA)共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，3-4天后收集上清。然后進(jìn)行系列有限稀釋，分離單個(gè)的染藍(lán)的噬斑。
本實(shí)施例所用的昆蟲細(xì)胞系Sf9是公知的并很容易得到，例如，其可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC CRL1711獲得。
MCP-4的純化在含2％FBS的EX-CELL 400培養(yǎng)基中于27℃培養(yǎng)Sf9細(xì)胞。感染前低速離心收集細(xì)胞，用無血清的EX-CELL 400培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。6小時(shí)后以MOI＝2感染細(xì)胞，72小時(shí)后經(jīng)低速離心除去細(xì)胞。用混合的蛋白酶抑制劑(20μg/ml pefabloc SC，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml E-64和1mM EDTA)處理上清。將上清過強(qiáng)陽離子交換柱I poros 50HS(Perseptive Biosystem)進(jìn)行初始捕獲。用在25mM乙酸鈉pH6中的1M NaCl洗脫重組MCP-4蛋白，然后進(jìn)一步用肝素親和層析(poros 20HEI1，Perseptive Biosystem)純化。得到的MCP-4蛋白經(jīng)大小排阻層析(Sephacryl S200HR，Pharmacia)精制。大小排阻后得到的純化MCP-4蛋白的純度約95％或更高，用質(zhì)譜和微測(cè)序進(jìn)一步分析這一物質(zhì)。
用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜分析來分析純化的物質(zhì)。
還使用公知的常規(guī)技術(shù)經(jīng)微測(cè)序分析了純化的MCP-4，為此，將純化的物質(zhì)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Novex 4-20％凝膠)并轉(zhuǎn)印至ProBlott膜(Applied Biosystems，Inc.(ABI))上。用PonceauS(在4％乙酸中的濃度為0.2％)染色后，切下蛋白條帶，置于“BlotCartridge”，然后用帶有氣相印跡循環(huán)儀的ABI-494型測(cè)序儀(Perkin-Elmer-Applied Biosystems，Inc.)進(jìn)行N-端氨基酸序列分析。
分析結(jié)果用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)從克隆基因表達(dá)MCP-4產(chǎn)生幾種形式的MCP-4。
如上所述在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)圖1的cDNA、分離并在含18％脲的SDS PAGE上電泳鑒定(Padrines等，F(xiàn)EBS Lett.352231-235(1994))而制備的MCP-4產(chǎn)生一條單一的有些寬的條帶，表觀Mr約為8000道爾頓。沒有污染蛋白的跡象。
純化制劑的質(zhì)譜分析得到質(zhì)量為8576和8754道爾頓的兩個(gè)主要組分。
微測(cè)序揭示出三種長(zhǎng)度不同的MCP-4成熟形式，在NH2末端有幾個(gè)殘基的不同。
這些MCP-4多肽的序列示于圖5，還示出了由全長(zhǎng)cDNA編碼的氨基酸序列，并與MCP-3和eotaxin的序列對(duì)比。MCP-4的主要形式與這些蛋白質(zhì)有60％氨基酸相同性，并與RANTES、MIP-1α和MIP-1β有29％、39％和41％的相同性。
使用兩個(gè)緊密相關(guān)的變體的混合物進(jìn)行下述的活性分析。
實(shí)施例7MCP-4刺激幾種血細(xì)胞的趨化性用帶有5μm孔的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(Nucleopore)在48孔室(Neuro Probe，Cabin John，MD，USA)中評(píng)價(jià)單核細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的趨化性，用帶3μm孔的膜評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞的趨化性，用補(bǔ)加20mM hepes，pH7.4和1％無菌血漿蛋白溶液(5％PPL SRK；瑞士紅十字會(huì)中心實(shí)驗(yàn)室，Bern，瑞士)的RPMI 1640溶解置于下面孔中的趨化因子，并懸浮細(xì)胞(每個(gè)上面孔中50000個(gè)單核細(xì)胞或嗜酸性細(xì)胞和100000個(gè)淋巴細(xì)胞)。置于37℃ 60分鐘后，移去膜，用PBS洗上面一側(cè)，固定并染色。所有分析均以三份重復(fù)進(jìn)行，在1000倍放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中的遷移細(xì)胞。確定無趨化劑時(shí)的自發(fā)遷移。
MCP-4以典型的雙眾數(shù)濃度依賴性誘導(dǎo)單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的遷移(如圖6、7和8所示)。
如圖6曲線(B)所示，根據(jù)在觀察到最大作用時(shí)的遷移細(xì)胞數(shù)和濃度(100nM)的指示，在效率和強(qiáng)度方面MCP-4對(duì)單核細(xì)胞的活性相當(dāng)于MCP-3的活性。與先前研究(Uguccioni等，歐洲免疫學(xué)雜志2564-68(1995))一致的是，MCP-1對(duì)這些細(xì)胞更有效并且強(qiáng)度顯著更大，在1nM處即達(dá)到最大作用。
如圖7所示，MCP-4也誘導(dǎo)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)遷移，其效率與MCP-1類似，但是最大作用需10-100nM MCP-4，而只需1nM MCP-1。使用10nM-1μM濃度的eotaxin也觀察到兩種T細(xì)胞的某些遷移。新鮮制備的血淋巴細(xì)胞均不應(yīng)答對(duì)克隆細(xì)胞有效的任何趨化因子，不發(fā)生遷移。
如圖8所示，對(duì)于嗜酸性細(xì)胞MCP-4激發(fā)類似于eotaxin所激發(fā)的遷移，最大作用濃度為10-30nM。MCP-3具有類似的效率，但其最大有效濃度為100nM。eotaxin和MCP-3均是這些細(xì)胞的強(qiáng)引誘劑。MCP-1不是嗜酸性細(xì)胞的趨化劑并作為陰性對(duì)照。
實(shí)施例8MCP-4(也稱為Ckβ-10)刺激細(xì)胞釋放N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶Uguccioni等，歐洲免疫學(xué)雜志2564-68(1995)示出測(cè)定應(yīng)答化學(xué)刺激的N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶的釋放是定量單核細(xì)胞的應(yīng)答的特別可靠和方便的方法。在該文獻(xiàn)中描述了單核細(xì)胞對(duì)趨化因子的反應(yīng)性得以精確測(cè)定。
簡(jiǎn)單地說，用細(xì)胞松馳素B(2.7μg/ml)對(duì)在0.3ml預(yù)保溫培養(yǎng)基(136mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM KH2PO4，1mM CaCl2，20mMHepes，pH7.4，5mM D-葡萄糖和1mg/ml無脂肪酸BSA)中的1.2×106個(gè)單核細(xì)胞樣品進(jìn)行預(yù)處理2分鐘，并用趨化因子刺激。3分鐘在冰上冷卻并離心而終止反應(yīng)，測(cè)定上清中的酶活。
如圖6曲線(A)所示，暴露于MCP-4的細(xì)胞被刺激釋放大量的溶酶體酶如N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶。在這一點(diǎn)上MCP-4與MCP-2一樣強(qiáng)并與其它單核細(xì)胞趨化蛋白的作用類似。相反，RANTES所刺激的酶釋放顯著降低，eotaxin不刺激釋放酶。
類似地，根據(jù)Peveri等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1671547-1559(1988)所述的方法測(cè)定由嗜中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶以確定對(duì)趨化因子的反應(yīng)性。在這些實(shí)驗(yàn)中MCP-4不刺激嗜中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶。
實(shí)施例9MCP-4(也稱為Ckβ-10)調(diào)節(jié)胞漿游離Ca2+用基本上如von Tscharner等，自然324369-372(1986)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的胞漿游離Ca2+濃度([Ca2+])的改變。
在含136mM NaCl，4.8mM KCl，1mM CaCl2，5mM葡萄糖和20mMHEPES，pH7.4的緩沖液中，每106個(gè)細(xì)胞用0.2nmol fura-2乙酰氧基甲酯在37℃保溫30分鐘而用fura-2加載細(xì)胞。離心后，將fura加載的細(xì)胞重懸于相同緩沖液中(106個(gè)細(xì)胞/ml)，并在37℃用趨化因子刺激。然后記錄[CaCl2]相關(guān)的熒光素變化。
單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞經(jīng)MCP-4刺激后觀察到[Ca2+]的快速及瞬時(shí)升高。升高速率及倍數(shù)隨MCP-4濃度而增加。在MCP-4濃度為10-100nM時(shí)獲得[Ca2+]的最大升高。MCP-4和MCP-1對(duì)于CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞均顯示出類似的濃度依賴性[Ca2+]瞬時(shí)誘導(dǎo)。MIP-1α和eotaxin在兩種細(xì)胞中誘導(dǎo)小得多的但明顯的[Ca2+]變化。這些細(xì)胞因子在這一方面的較低強(qiáng)度與Loetscher等，F(xiàn)ASEB J.81055-1060(1994)及其它人先前關(guān)于它們是弱的淋巴細(xì)胞引誘劑的報(bào)道相一致。
實(shí)施例10受體利用/脫敏實(shí)驗(yàn)通過以短的時(shí)間間隔監(jiān)測(cè)由重復(fù)趨化因子刺激所致的[Ca2+]的變化測(cè)試受體利用。后續(xù)的暴露脫敏方案提供了對(duì)受體利用的測(cè)量。根據(jù)Ugnccioni等，歐洲免疫學(xué)雜志2564-68(1995)針對(duì)單核細(xì)胞的所述方案利用90秒精確間隔進(jìn)行確定。在單核細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞中進(jìn)行確定。
用MCP-1或MCP-3刺激單核細(xì)胞導(dǎo)致對(duì)MCP-4的反應(yīng)性喪失，表明這種新的趨化因子與這些單核細(xì)胞趨化蛋白共享相同的受體。相反，在這一分析中用RANTES或MIP-1α刺激不影響MCP-4反應(yīng)性。
在相反極性的測(cè)試中，首先用MCP-4刺激的單核細(xì)胞對(duì)MCP-1、RANTES和MIP-1α的反應(yīng)性明顯降低，對(duì)MCP-3的反應(yīng)性略有降低。
結(jié)果還表明MCP-4與其它單核細(xì)胞趨化蛋白共享受體并且MCP-4識(shí)別結(jié)合RANTES和MIP-1α的受體。
在嗜酸性細(xì)胞中，MCP-4顯示出明顯的與MCP-3、RANTES和eotaxin的交叉脫敏作用。事實(shí)上，其使得對(duì)后續(xù)的eotaxin和MCP-3的刺激的應(yīng)答喪失，明顯降低對(duì)RANTES的反應(yīng)性。因此其顯示出是這些細(xì)胞的主要興奮劑。這些結(jié)果表明MCP-4與MCP-3、RANTES和eotaxin共享受體。
相反，用MCP-4刺激不影響嗜酸性細(xì)胞對(duì)MIP-1α的應(yīng)答，因此MIP-1α受體顯然不識(shí)別或結(jié)合MCP-4。相同的受體似乎結(jié)合RANTES，其保留對(duì)已被MCP-4刺激的細(xì)胞的一定活性。
實(shí)施例11在果蠅表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)MCP-4(也稱為Ckβ-10)在公知的很容易得到的果蠅細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，使用在此系統(tǒng)中表達(dá)克隆基因的常規(guī)技術(shù)表達(dá)編碼MCP-4的全長(zhǎng)cDNA。
從表達(dá)cDNA的細(xì)胞中制備表達(dá)的MCP-4并用公知的鑒定多肽和蛋白的常規(guī)技術(shù)鑒定表達(dá)的MCP-4。
在該表達(dá)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)幾種形式的MCP-4，包括具有縮短的氨基和羧基末端的MCP，以及包含翻譯后修飾的MCP-4。
具體地，果蠅細(xì)胞表達(dá)具有圖1所示氨基酸序列但有如下不同的MCP-4。
N-末端序列變?yōu)镈ro1QGLKAQPDDro2pyroQGLKAQPDDro3++LNVPST，其在三種形式中發(fā)生，這三種形式因C-末端序列的不同缺失而不同。發(fā)現(xiàn)DRO3具有圖5所示的T，T(des3)和A(des5)羧基末端。
全長(zhǎng)序列見圖5所示。
實(shí)施例12分析在果蠅表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的MCP-4(也稱為Ckβ-10)用上述方法分析在果蠅細(xì)胞中表達(dá)的不同形式的MCP-4的活性。
在趨化性分析中Dro1和Dro2使單核細(xì)胞、PBL和EOL-3細(xì)胞遷移，并且它們?cè)贑a2+遷移分析中均有活性。
Dro3顯示出大大降低的生物活性，可以用作拮抗劑。
實(shí)施例13Ckβ-4增強(qiáng)皮質(zhì)神經(jīng)元的存活性皮質(zhì)細(xì)胞來自胎齡17天的大鼠胎兒。制備單細(xì)胞懸液后，在含血清培養(yǎng)基中以15000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞鋪板。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基并加入測(cè)試因子。每隔一天更換培養(yǎng)基并再加入測(cè)試因子。
6-7天后用同時(shí)提供存活和死亡細(xì)胞指示的雙色熒光確定細(xì)胞存活性。在這一分析中活細(xì)胞根據(jù)胞內(nèi)酯酶活性確定，并通過將幾乎無熒光的細(xì)胞透過性鈣黃綠素AM轉(zhuǎn)化成強(qiáng)熒光的鈣黃綠素而定量?；罴?xì)胞幾乎普遍表達(dá)酯酶活性及多陽離子熒光鈣黃綠素。因此，活細(xì)胞在這一分析中產(chǎn)生均一的強(qiáng)綠熒光?？蓪?duì)此分析進(jìn)行校準(zhǔn)以便在520nm的發(fā)射可用來確定培養(yǎng)物中的總活細(xì)胞數(shù)?？捎觅?gòu)自Molecular Probes的活/死細(xì)胞分析試劑盒進(jìn)行這項(xiàng)分析，本實(shí)施例正是使用了這一試劑盒。
如圖9所示，Ckβ-4(實(shí)心方塊)刺激培養(yǎng)物中皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活，與HG0100(空心方塊)類似。
每個(gè)點(diǎn)均代表6個(gè)重復(fù)培養(yǎng)物的平均值。
實(shí)施例14Ckβ-4增加皮質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備并保持皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)物。在測(cè)試因子存在下6-7天后，經(jīng)ELISA確定培養(yǎng)物中存在的神經(jīng)絲蛋白量。
如圖10所示，Ckβ-4在濃度為10-100ng/ml時(shí)促進(jìn)軸突的派生，類似于bFGF-10。結(jié)果來自6個(gè)重復(fù)培養(yǎng)物。
實(shí)施例15Ckβ-4誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞的趨化性用上述方法確定外周血淋巴細(xì)胞應(yīng)答Ckβ-4和MCP-1的趨化性。
如圖11所示，Ckβ-4在1-10ng/ml時(shí)顯示峰值活性，與飽和的MCP-1活性類似。
依據(jù)上述教導(dǎo)對(duì)本發(fā)明可做各種修改及變動(dòng)，因此在權(quán)利要求范圍內(nèi)本發(fā)明可以與具體描述的不同方法實(shí)施。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人李浩東(ii)發(fā)明名稱人趨化因子多肽(iii)序列數(shù)20(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人人體基因組科學(xué)有限公司(B)街道9410 Key West Avenue(C)城市Rockville(D)州馬里蘭州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編20850(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1996.2.23(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Millstein，Larry S(B)注冊(cè)號(hào)34，679(viii)通訊信息(A)電話301-309-8504(B)傳真301-309-8512(2)SEQ ID N01的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度291堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..288(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG TGC TGT ACC AAG AGT TTG CTC CTG GCT GCT TTG ATG TCA GTG CTG 48Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu1 5 10 15CTA CTC CAC CTC TGC GGC GAA TCA GAA GCA GCA AGC AAC TTT GAC TGC 96Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys20 25 30TGT CTT GGA TAC ACA GAC CGT ATT CTT CAT CCT AAA TTT ATT GTG GGC 144Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly35 40 45TTC ACA CGG CAG CTG GCC AAT GAA GGC TGT GAC ATC AAT GCT ATC ATC 192Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile50 55 60TTT CAC ACA AAG AAA AAG TTG TCT GTG TGC GCA AAT CCA AAA CAG ACT 240Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr65 70 75 80TGG GTG AAA TAT ATT GTG CGT CTC CTC AGT AAA AAA GTC AAG AAC ATG 288Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met85 90 95TAA 291(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度96個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu1 5 10 15Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys20 25 30Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly35 40 45Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile50 55 60Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr65 70 75 80Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met85 90 95(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度297個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(C)名稱/關(guān)鍵CDS(D)位置1..294(xi)序列描述SEQ ID NO3ATG AAA GTT TCT GCA GTG CTT CTG TGC CTG CTG CTC ATG ACA GCA GCT 48Met Lys Val Ser Ala Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Thr Ala Ala1 5 10 15TTC AAC CCC CAG GGA CTT GCT CAG CCA GAT GCA CTC AAC GTC CCA TCT 96Phe Asn Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser20 25 30ACT TGC TGC TTC ACA TTT AGC AGT AAG AAG ATC TCC TTG CAG AGG CTG 144Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu35 40 45AAG AGC TAT GTG ATC ACC ACC AGC AGG TGT CCC CAG AAG GCT GTC ATC 192Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile50 55 60TTC AGA ACC AAA CTG GGC AAG GAG ATC TGT GCT GAC CCA AAG GAG AAG 240Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys65 70 75 80TGG GTC CAG AAT TAT ATG AAA CAC CTG GGC CGG AAA GCT CAC ACC CTG 288Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu85 90 95AAG ACT TGALys Thr 297(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Val Ser Ala Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Thr Ala Ala1 5 10 15Phe Asn Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser20 25 30Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu35 40 45Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile50 55 60Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys65 70 75 80Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu85 90 95Lys Thr(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CCCGCATGCA AGCAGCAAGC AACTTT 26(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6AAAGGATCCC ATGTTCTTGA CTTTTTTACT 30(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7CCCGCATGCA GCCAGATGCA CTCAACG 27(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8AAAGGATCCA GTCTTCAGGG TGTGAGCT 28(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9GGAAAGCTTA TGTGCTGTAC CAAGAGTTT29(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度59個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO10CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA CATGGTTCCT TGACTTTTT 59(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11GGAAAGCTTA TGAAAGTTTC TGCAGTGC 28(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度58個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA GTCTTCAGGG TGTGAGCT58(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO13CGCGGGATCC TTAACCTTCA ACATGAAA 28(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14CGCGGGTACC TTAACACATA GTACATTTT29(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GCGGGATCCT TAACCTTCAA CATGAAA 27(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16CGCGGGTACC TTAACACATA GTACATTTT29(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度70個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO17His Pro Gly Ile Pro Ser Ala Cys Cys Phe Arg Val Thr Asn Ile Cys1 5 10 15Lys Ile Ser Phe Gln Ala Leu Lys Ser Tyr Lys Ile Ile Thr Ser Ser20 25 30Lys Cys Pro Gln Thr Ala Ile Val Phe Glu Ile Lys Pro Asp Lys Met35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Arg Xaa Xaa Trp Val Gln Asp Ala Lys Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Ile Ser Gln65 70(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度99個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO18Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala1 5 10 15Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr20 25 30Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu35 40 45Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val50 55 60Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln65 70 75 80Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr85 90 95Pro Lys Leu(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度76個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO19Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度74個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO20Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，選自由下述組成的一組a)一種編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的Ckβ-4多肽或所述多肽的片段，類似物或衍生物的多核苷酸；b)一種編碼具有由ATCC保藏號(hào)75848所含的cDNA編碼的氨基酸序列的Ckβ-4多肽或所述多肽的片段，類似或衍生物的多核苷酸；c)一種編碼具有圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列的圖2的MCP-4多肽的28-93位氨基酸殘基序列的MCP-4多肽或所述多肽的片段，類似物或衍生物的多核苷酸；以及d)一種編碼具有由ATCC保藏號(hào)75849所含的cDNA編碼的氨基酸序列的MCP-4多肽或所述多肽的片段，類似物或衍生物的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸是基因組DNA。
5.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的Ckβ-4。
6.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有選自圖2和5的殘基1-98、17-98、20-98、22-98、24-98、28-98、28-95和28-93的氨基酸序列的MCP-4。
7.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼由ATCC保藏號(hào)75848的cDNA編碼的Ckβ-4多肽。
8.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼由ATCC保藏號(hào)75849的cDNA編碼的MCP-4多肽。
9.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其具有圖1所示的Ckβ-4編碼序列。
10.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其具有圖2所示的MCP-4編碼序列。
11.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其具有由ATCC保藏號(hào)75848保藏的Ckβ-4編碼序列。
12.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其具有由ATCC保藏號(hào)75849保藏的MCP-4編碼序列。
13.一種含有權(quán)利要求2所述DNA的載體。
14.用權(quán)利要求13所述載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
15.一種生產(chǎn)多肽的方法包括用權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
16.生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求13所述的載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化。
17.可與權(quán)利要求2所述的DNA雜交并編碼具有Ckβ-4活性的多肽的分離的DNA。
18.可與權(quán)利要求2所述的DNA雜交并編碼具有MCP-4活性的多肽的分離的DNA。
19.一種多肽，選自由下述組成的一組(i)一種具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的Ckβ-4多肽及其片段、類似物和衍生物；(ii)由ATCC保藏號(hào)75848的cDNA編碼的Ckβ-4多肽及所述多肽的片段、類似物及衍生物；(iii)具有選自圖2和圖5的殘基1-98、17-98、20-98、22-98、24-98、28-98、28-95和28-93的氨基酸序列的MCP-4多肽及其片段、類似物及衍生物；(iv)由ATCC保藏號(hào)75849的cDNA編碼的MCP-4多肽及所述多肽的片段、類似物及衍生物。
20.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中多肽是具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的Ckβ-4。
21.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中多肽是選自(iii)中所列的MCP-4多肽。
22.抗權(quán)利要求19所述的多肽的抗體。
23.抗權(quán)利要求19所述的多肽的拮抗劑。
24.治療需要Ckβ-4的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求19所述的Ckβ-4多肽。
25.治療需要抑制Ckβ-4的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求23所述的Ckβ-4拮抗劑。
26.治療需要MCP-4的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求19所述的MCP-4多肽。
27.治療需要抑制MCP-4的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求23所述的拮抗劑。
28.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求19所述的多肽及一種藥物學(xué)可接受的載體。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，其中通過提供給患者編碼所述多肽的DNA并在其體內(nèi)表達(dá)所述的多肽而給予治療有效量的多肽。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其中通過提供給患者編碼所述多肽的DNA并在其體內(nèi)表達(dá)所述的多肽而給予治療有效量的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了人趨化因子多肽,編碼趨化因子多肽的DNA(RNA)及通過重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的方法。也公開了使用趨化因子多肽治療白血病、腫瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纖維性疾病、傷口愈合和銀屑病的方法。本發(fā)明還公開了抗趨化因子多肽的拮抗劑及其作為治療劑治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,自身免疫炎癥和慢性炎癥及感染性疾病,變態(tài)反應(yīng),前列腺素不依賴型發(fā)熱及骨髓機(jī)能低下癥的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1209167SQ96180105
公開日1999年2月24日 申請(qǐng)日期1996年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月23日
發(fā)明者李浩東, 馬克·亞當(dāng)斯, 索朗熱·亨施克·利馬, 拉爾夫·奧德森, 李玉鈴, 大衛(wèi)·帕米利, 約翰·懷特, 愛德華·阿佩爾包姆 申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司