專利名稱：環(huán)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式I的新的環(huán)肽環(huán)—(Arg-A-Asp-R1-R2)I其中A為Gly或Ala，R1為2—羧基—8—氨基—4—硫代毒芹側(cè)堿—9—酮(Btd)、O—氨基甲基—O’—羧基聯(lián)苯(Biph)、2—氨基甲基—5—羧基甲基—噻吩(Act)、或6—氨基己酸殘基(Aha)或2—(1，7—二氮雜螺[4.4]壬—7—基)—4—甲基戊酸((S，S)螺—Pro—Leu)或2—(3—氨基—1—吡咯烷—2—酮基)—4—甲基戊酸殘基((S)Gly[ANC—2]—Leu或(R)Gly[ANC—2]—Leu)，在每一種情況下殘基通過肽鍵鍵合，R2不存在或者為Val，和它們的生理上可接受的鹽。
相似的化合物可從Pharmazie 40(8)，532—5，(1985)中知道。
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)具有有價(jià)值的性質(zhì)的新的化合物，特別是那些能夠被用于藥劑制備中的化合物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式I化合物和它們的鹽具有非常有用的特性。它們特別適用于整合蛋白抑制劑，在本文中它們特別地抑制了β3—或β5—整合蛋白受體與配體間的相互作用。這些化合物對(duì)整合蛋白αvβ1、avβ3、αvβ5、αvβ6和α11bβ3尤其有效，這種作用可被，例如J.W.Smith等認(rèn)在J.Biol.Chem.256，12267—12271(1990)中所述的方法證實(shí)。除此之外它們還有消炎作用。所有這些作用可用文獻(xiàn)中已知的方法來證實(shí)。
這些化合物能用作人和獸類藥物中藥劑的活性物質(zhì)，尤其適于預(yù)防和治療血液循環(huán)失調(diào)、血栓形成、心肌梗塞、冠狀動(dòng)脈血栓形成心臟病、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、中風(fēng)、心絞痛、腫瘤、溶骨病、特別是骨質(zhì)疏松、血管形成術(shù)后的血管生成和心瓣再狹窄。此外，它們?cè)趥谥委熯^程中可以具有輔助作用。
上文和下文中給定的氨基酸殘基的縮寫表示下列的氨基酸殘基Act2—氨基甲基噻吩—5—乙酸Aha6—氨基己酸Ala丙氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Asp(OR)天冬氨酸(β—酯)Arg 精氨酸Biph O—氨基甲基聯(lián)苯基—O’—羧酸Btd 8—氨基—4—硫代毒芹側(cè)堿—9—酮—2—羧酸Cys 半胱氨酸Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸Gly[ANC—2]—Leu 2—(3—氨基—1—吡咯烷—2—酮基)—4—甲基戊酸His 組氨酸Ile 異亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 賴氨酸Met 蛋氨酸Nle 正亮氨酸Orn 鳥氨酸Phe 苯丙氨酸Pro 脯氨酸螺—Pro—Leu 2—(1，7—二氮雜螺[4，4]—6氧代壬—7—基)—4—甲基戊酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val纈氨酸此外，下文所用的縮寫具有下面的定義BOC叔丁氧基羰基CBZ芐氧基羰基DCCI 二環(huán)己基碳化二亞胺DMF二甲基甲酰胺EDCI N—乙基—N’—(3—二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽Et 乙基Fmoc 9—芴基甲氧基羰基HOBT 1—羥基苯并三唑Me 甲基Mtr4—甲氧基—2，3，6—三甲基苯基磺?；鵒But 叔丁氧基OMe甲氧基OEt乙氧基POA 苯氧基乙?；鵗BTu2—(1H—苯并三唑—1—基—1，1，3，3—四甲基四氟硼酸脲TFA 三氟乙酸上述氨基酸可能存在有兩種或多種對(duì)映體形式，則在上文和下文中，例如作為式I化合物的組成部分包括所有對(duì)映體形式以及它們的混合物(例如DL形式)。作為式I化合物組成部分的氨基酸可進(jìn)一步被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及式I化合物或它的一種鹽的制備方法，其特征是用溶劑解或氫解試劑處理使這種化合物從它的一種功能性衍生物中被釋放出來或者用一種環(huán)化劑處理式II的肽H—Z—OHII其中Z為-Arg-A-Asp-R1-R2--A-Asp-R1-R2-Arg--Asp-R1-R2-Arg-A--R1-R2-Arg-A-Asp-or-R2-Arg-A-Asp-R1-，或該肽的反應(yīng)性衍生物，和/或通過用酸或堿處理使式I的堿性或酸性化合物轉(zhuǎn)化為其一種鹽。
除非特別說明，上、下文中的殘基A、R1、R2和Z的含義與式I和II中的含義相同。
殘基(S，S)螺—Pro—Leu為2—(1，7—二氮雜螺[4，4]—6—氧代壬—7—基)—4—甲基戊酸殘基，并具有如下結(jié)構(gòu) 殘基(S)Gly[ANC—2]—Leu或(R)Gly [ANC—2]—Leu為3(S)—或3(R)—2—(3—氨基—1—吡咯烷—2—酮基)—4—甲基或酸殘基， Biph為O—氨基甲基聯(lián)苯基—O’—羧酸殘基，Biph 1和Biph 2為可能的阿托異構(gòu)體。
殘基R1如同殘基R2一樣，所有前面給出的定義同樣優(yōu)選。因此本發(fā)明同樣涉及環(huán)五肽和環(huán)四肽。
A優(yōu)選為Gly，但也可為Ala，尤其是DAla。
式I的化合物，以及制備它們的反應(yīng)物，是另外用已知的方法制備的，如在文獻(xiàn)中所述(例如在標(biāo)準(zhǔn)著作如Houben—Weyl，Methodender Organischen Chemie[有機(jī)化學(xué)方法](Methods of OrganicChemistry)，(Georg—Theime—Verlag.Stuttgart)，尤其是在已知的并適用于所提到的反應(yīng)的條件下進(jìn)行。也可利用在本文中未詳細(xì)提到的已知的改進(jìn)方法。
(R)—和(S)—式肽組分Gly[ANC—2]—Leu可按R.M.Freidinger等人在J.Org.Chem.47，104(1982)中所述的方法制得。螺—Pro—Leu成分則可按類似于P.Ward等人在J.Med.Chem.33，1848++(1990)中所述的方法制得。Btd的合成則可按U.Nagai等人在Tetrahedron 49，3577—3592(1993)中所述方法進(jìn)行。
如果需要，起始物料也可就地形成，因此不必從反應(yīng)混合物中將它們分離出來而是直接進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生式I的化合物。
式I化合物能用溶劑解，特別是水解，或用氫解的方法從它們的功能性衍生物釋放出式I化合物來制備。
用于溶劑解或氫解的優(yōu)選的起始物料是那些含有(替代一個(gè)或多個(gè)游離的氨基和/或羥基)被保護(hù)的氨基和/或羥基的化合物，優(yōu)選地是那些含有，(替代連接于一個(gè)氮原于上的一個(gè)氫原子)，一個(gè)氨基保護(hù)基，例如那些遵從于式I但含有，(替代NH2基)一個(gè)NHR’基(其中R’是一個(gè)氨基保護(hù)基，例如Fmoc、BOC或CBZ的化合物。
另一些優(yōu)選的起始物料是那些(替代羥基中的氫原子)帶有羥基保護(hù)基的化合物，例如那些遵從于式I但含有替代羥基苯基的一個(gè)R”O(jiān)—苯基(其中R”是羥基保護(hù)基)的化合物。
在起始物料的分子中也可能存在著兩個(gè)或多個(gè)相同或不同的被保護(hù)的氨基和/或羥基，如果存在的保護(hù)基是彼此不同的，則在許多情況下它們可以被選擇性地除去。
術(shù)語“氨基保護(hù)基”通常是已知的涉及那些具有保護(hù)(封閉)一個(gè)氨基不參加化學(xué)反應(yīng)的能力，但是在分子的其它部分所需要的化學(xué)反應(yīng)實(shí)施完后能夠很容易被除去的基閉，特別是，這些基團(tuán)代表性的是未被取代的或已被取代的?；?、芳基、芳烷氧基甲基或芳烷基。由于氨基保護(hù)基在所需的反應(yīng)(或反應(yīng)序列)后被除去，它們的性質(zhì)和大小在其它方面并不重要；但是，那些具有1—20，尤其是1—8個(gè)碳原子的保護(hù)基是優(yōu)選的。在本發(fā)明的方法中術(shù)語“?；睉?yīng)該被認(rèn)為是最廣泛意義上的，它包括從脂肪族、芳基脂肪族、芳香族或雜環(huán)羧酸或磺酸中衍生來的?；?，尤其是烷氧基羰基、芳氧基羰基和，特別是芳烷氧基羰基。這樣的?；膶?shí)例是烷?；缫阴；?、丙酰基和丁?；?；芳烷?；绫揭阴；环减；绫郊柞；蚣妆锦；?；芳氧基烷?；鏟OA；烷氧基羰基如甲氧基羰基、乙氧基羰基，2，2，2—三氯乙氧基羰基，BOC，和2—碘代乙氧基羰基；芳烷氧基羰基如CBZ(芐氧羰基)，4—甲氧基芐氧基羰基和Fmoc；和芳基磺?；鏜tr。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是BOC和Mtr，還有CBZ，F(xiàn)moc，芐基和乙?；?br> 術(shù)語“羥基保護(hù)基”同樣是通常已知的和涉及那些具有保護(hù)羥基不參加化學(xué)反應(yīng)能力的基團(tuán)，但這些基團(tuán)在分子其它部分的所需的化學(xué)反應(yīng)實(shí)施完后很容易除去。這樣的基團(tuán)代表性的是上述未取代的或取代的芳基、芳基烷基或?；?，還有烷基。由于這些基團(tuán)在所需要的化學(xué)反應(yīng)或反應(yīng)序列后又被除去，所以羥基保護(hù)基的性質(zhì)和大小并不太重要；1—20，尤其是1—10個(gè)碳原子的羥基保護(hù)基是優(yōu)選的。羥基保護(hù)基的實(shí)例包括芐基、對(duì)硝基苯甲?；?duì)甲苯磺?；?、叔丁基和乙?；?，其中芐基和叔丁基是特別優(yōu)選的。在天冬氨酸和谷氨酸中的COOH基以它們的叔丁酯形式(例如，Asp(OBut)被保護(hù)較好。
被用作起始物料的式I化合物的功能性衍生物可以用氨基酸和肽合成的常規(guī)的方法來制備，如在上述的權(quán)威著作和專利申請(qǐng)中所敘述的方法，例如Merrifield的固相方法(B.F.Gysin和R.B.Merri-field，J.Am.Chem.Soc，94，3102及下列等(1972))尤其優(yōu)選的是在流動(dòng)反應(yīng)器中按Fmoc方案合成，該方法由A.Jonczyk和J.Meienhofer在Peptides，Proc.8th.Am.Pept.Symp.73—77(1983)(Eds.V.J.Hruby.and D.H.Rich)，Pierce Co.Rockford中進(jìn)行了敘述。
從式I化合物的功能性衍生物中釋放出式I的化合物的實(shí)施取決于所用的保護(hù)基的性質(zhì)，例如用強(qiáng)酸，較有利地用TFA或高氯酸，或用其它的強(qiáng)無機(jī)酸如鹽酸或硫酸，強(qiáng)的有機(jī)羧酸，如三氯乙酸，或磺酸如苯—或?qū)Α妆交撬?。額外存在一種惰性溶劑是可能的但不總是必需的，適當(dāng)?shù)亩栊匀軇┹^好是有機(jī)酸，例如羧酸如乙酸，醚如四氫呋喃或二噁烷，酰胺如DMF，鹵代烴如二氯甲烷，和醇如甲醇、乙醇或異丙醇，還有水。上述溶劑的混合物也是適宜的。較好地是過量使用TFA而不需要加入其它溶劑，而高氯酸較好地是以乙酸和70％高氯酸的比率為9∶1的混合物的形式來使用。裂解的反應(yīng)溫度較有利地是在大約0℃至大約50℃，優(yōu)選15至30℃(室溫)。
例如，基團(tuán)BOC、OBut和Mtr可較有利地用TFA在二氯甲烷中除去或用3～5nHCl在二惡烷中于15—30℃下除去，F(xiàn)moc基團(tuán)的除去可用大約5～50％濃度的二甲胺、二乙胺或哌啶等仲胺在DMF中的溶液于15～30℃來進(jìn)行。
能夠被氫解除去的保護(hù)基(例如，CBZ或芐基)能夠用，例如，氫在催化劑(例如，貴金屬催化劑如鈀，較有利地是載于活性炭上)存在下進(jìn)行處理來除去。在這方面，適當(dāng)?shù)娜軇┦悄切┥厦嫠o定的，特別是醇如甲醇或乙醇，或酰胺如DMF。氫解通常是在大約0～100℃的溫度下和大約1～200巴的壓力下，優(yōu)選在20～30℃和1—10巴下實(shí)施，例如，CBZ基的氫解較有利地是于20～30℃用5～10％Pd—C在甲醇中或用甲酸銨(代替H2)于Pd—C上在甲醇/DMF中完成。
式I化合物也可在合成肽的條件下通過環(huán)化式II化合物獲得，該反應(yīng)優(yōu)選按常規(guī)的肽合成法，如Houben—Weyl，Volume 15/II，page1—806(1974)中所述的方法進(jìn)行。
反應(yīng)優(yōu)選地是在有脫水劑存在下，例如碳化二亞胺如DCCI或EDCI，和丙膦酐(比較Angew.Chem，92，129(1980)，二苯基膦酰疊氮化物或2—乙氧基—N—乙氧基羰基—1，2—二氫喹啉在惰性溶劑中，例如鹵代烴如二氯甲烷、醚如四氨呋喃或二噁烷，酰胺如DMF或二甲基乙酰胺，腈如丙烯腈，或在這些溶劑的混合物中，于大約-10～40℃，優(yōu)選0～30℃的溫度下進(jìn)行。為了促進(jìn)在分子間肽結(jié)合前發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，優(yōu)選在稀溶液中進(jìn)行反應(yīng)。
為了替代式II化合物在反應(yīng)中也可以使用這些化合物的適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性衍生物，例如那些反應(yīng)性基團(tuán)在中間被保護(hù)基封閉的衍生物，可以使用式II的氨基酸衍生物，例如，以它們的活性酯的形式，較有利地是通過加入HOBt或N—羥基琥珀酰亞胺在原有位置上形成酯。
式II的起始物料通常是新的，它們可用已知的方法，例如用上面所給的肽合成的方法和除去保護(hù)基的方法來制備。
通常，進(jìn)行合成的第一步是制備如式R’—Z—OR”的被保護(hù)的五肽酯，例如BOC—Z—OMe或BOC—Z—OEt，這些化合物水解產(chǎn)生式R’—Z—OH的酸，例如BOC—Z—OH；從這些酸中除去保護(hù)基R’，由此得到式H—Z—OH(II)的游離肽。
用酸可將式I的堿轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸加成鹽，特別適用該反應(yīng)的酸是那些能產(chǎn)生生理上可接受的鹽的那些酸。例如，可被使用的無機(jī)酸的實(shí)例是硫酸、硝酸，氫鹵酸如鹽酸或氫溴酸，磷酸如正磷酸，氨基磺酸，和有機(jī)酸，特別是脂族、脂環(huán)，芳脂族，芳香族或雜環(huán)的單一或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如，甲酸、乙酸、丙酸，新戊酸，二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯甲酸、水楊酸、2—或3—苯基丙酸、檸檬酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸或乙磺酸、乙二磺酸、2—羥基乙磺酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、萘—磺酸和萘二磺酸和月桂基硫酸。與生理上不能接受的酸形成的鹽，例如苦味酸鹽，能被用來分離和/或純化式I化合物。
另外，通過與堿反應(yīng)式I的酸能被轉(zhuǎn)化成一種它的生理上可接受的金屬鹽或銨鹽。特別適當(dāng)?shù)柠}是鈉、鉀、鎂、鈣和胺鹽，還有取代的銨鹽，例如二甲基銨鹽，二乙基銨鹽或二異丙基銨鹽，單乙醇銨鹽、二乙醇銨鹽或三乙醇銨鹽、環(huán)己基胺鹽和二環(huán)己基銨鹽、二芐基亞乙基二銨鹽，還有例如，與N—甲基—D—谷氨酰胺或與精氨酸或賴氨酸形成的鹽。
式I的新的化合物，和它們的生理上可接受的鹽通過將其與至少一種賦形劑或助劑一起混和，如果需要，與一種或幾種活性物質(zhì)一起投入適宜的藥劑形式中用于制備藥物制品。這樣制得的制品可被用作藥物用于人體或獸醫(yī)中。作為賦形劑的適宜的物質(zhì)是那些適于腸道(例如，口服或直腸的)，非腸道的(例如，靜脈注射)或局部(例如，皮膚、表面的、眼的或鼻的)服用或適于吸入劑噴霧形式服用的并且不與新的化合物反應(yīng)的有機(jī)物或無機(jī)物，實(shí)例是水或等滲的鹽水溶液，低級(jí)醇、植物油、芐基醇、聚乙二醇、甘油三乙酸酯和其它脂肪酸甘油酯、明膠、大豆卵磷酯、碳水化合物如乳糖或淀粉、硬脂酸鎂、滑石、纖維素和凡士林，口服形式特別是片劑、涂膜片劑、膠囊、糖漿、或滴劑；帶有抗胃液涂層或膠囊套的涂膜片劑和膠囊是特別受到注意的。栓劑能被用于直腸服用，而非腸道服用則使用溶液，優(yōu)選油性或水溶液，還有懸浮液，乳狀液或移植物。適于局部服用的藥物形式的實(shí)例是溶液，它可以眼藥水滴劑的形式來使用，和其它實(shí)例是懸浮液、乳狀液、霜?jiǎng)?、軟膏或繃帶。?duì)于吸入劑噴霧的服用方式來說，可以使用含有溶解于或懸浮于推進(jìn)氣或推進(jìn)氣混合物(例如，CO2或氟氯烴)的活性物質(zhì)的噴霧。在這種情況下活性物質(zhì)優(yōu)選以微粉化的形式被使用，可以存在有一種或多種外加的生理上可接受的溶劑，例如，乙醇，用通常的吸入器可配制吸入劑溶液。新的化合物可被冷凍干燥并且產(chǎn)生的凍干物能被用于，例如，制備注射用制品。此時(shí)注射可以巨九劑或以連續(xù)注放(例如，靜脈、肌肉、皮下或鞘內(nèi))來進(jìn)行。所述制品可以消毒和/或可以含有助劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑和/或潤(rùn)濕劑，乳化劑，影響滲透壓的鹽，緩沖劑物質(zhì)、著色劑和/或香味劑。如果需要，它們也可以含有一種或多種其它活性物質(zhì)，例如一種或多種維生素。
根據(jù)本發(fā)明的物料通常按與其它已知的商業(yè)上可得到的多肽相類似的方法服用，特別是用于與在US—A—4472305中所述的化合物相似的方法服用，優(yōu)選的劑量是大約0.05—500mg，特別是0.5—100mg，每劑量單位。每天劑量?jī)?yōu)選大約0.01—2mg/kg體重。但是，每個(gè)特定病人的特定劑量取決于許多因素，例如，所用的特定化合物的效力，年齡、體重、健康的一般狀態(tài)、飲食，給藥的時(shí)間和途徑、排泄速度、藥物的結(jié)合和各自病情的嚴(yán)重性。非腸道服用是優(yōu)選的。
此外，式I的新的化合物能被用作制備親和層析柱，用于制備純整合蛋白。
本文中，配體即式I的肽衍生物，經(jīng)定位功能基共價(jià)地偶合于聚合物載體上。
適宜的聚合物載體材料是在肽化學(xué)中本身是已知的并優(yōu)選地具有親水性的固態(tài)聚合物相，實(shí)例為交聯(lián)的聚糖如纖維素、Sepharose或Sephadex、丙烯酰胺、以聚乙二醇為基體的聚合物或TentakelR聚合物。
連接于聚合物載體上的適當(dāng)?shù)亩ㄎ换鶅?yōu)選的是2—12個(gè)碳原子的線性亞烷基鏈，其一端直接連接于聚合物上，另一端帶有一個(gè)功能基如，羥基、氨基、巰基、馬來酰亞胺基或—COOH，并適于與相應(yīng)的肽的功能側(cè)鏈相連接。
在這方面有可能將肽直接連接或，如果需要，經(jīng)過第二個(gè)定位基定位于聚合物上。
此外，對(duì)一些是式I的肽的一個(gè)組成部分的氨基酸殘基可以將側(cè)鏈修飾以使其經(jīng)過SH、OH、NH2或COOH基有可能定位于聚合物上。
作為定位基其側(cè)鏈可被直接使用的氨基酸殘基的實(shí)例是例如Arg或Asp。
可通過游離NH2基團(tuán)結(jié)合的定位基的實(shí)例是如下基團(tuán)，如—CO—CnH2n—NH2、—CO—CnH2n—OH、—CO—CnH2n—SH或—CO—CnH2n—COOH其中n＝2－12，亞烷基的鏈長(zhǎng)不很嚴(yán)格如果需要，該鏈可以全部或部分地被例如，適當(dāng)?shù)姆蓟蛲榛蓟娲?br> 可被連接至游離酸性基閉上的C—末端定位基的實(shí)例是—O—CnH2n—SH、—O—CnH2n—OH、O—CnH2n—NH2、—O—CnH2n—COOH、—NH—CnH2n—SH、—NH—CnH2n—OH、—NH—CnH2n—NH2或—NH—CnH2n—COOH，n和亞烷基鏈均如上段所述。
用于純化整合蛋白的親合色譜材料的制備是在常規(guī)的和對(duì)于氨基酸縮合其本身是已知的和已經(jīng)在式I化合物的制備的相關(guān)部分?jǐn)⑹鲞^的條件下來實(shí)施。
對(duì)于含硫醇的定位基，加成反應(yīng)，例如與聚合物結(jié)合的硫醇進(jìn)行Michael加成以形成馬來酰亞胺衍生物或二硫化物的反應(yīng)是可能發(fā)生的。
上下文中所用溫度均為℃，在后面的實(shí)例中“常規(guī)操作”是指如果必需加入水，將混合物中和，用乙醚或二氯甲烷萃取，相分離，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過濾，蒸發(fā)濃縮和在硅膠上色譜純化和/或結(jié)晶化。Rt＝HPLC在系統(tǒng)ALichrosorb RPR選擇B(250×4；5μm或系統(tǒng)BLichrosorbRRP18(250×4；5μm)上的保留時(shí)間(分)，洗脫劑(系統(tǒng)A)0.3％TFA水溶液；在流速為1ml/min時(shí)50分鐘形成0—80vol％異丙醇梯度；于215nm處檢測(cè)。洗脫劑(系統(tǒng)B)洗脫劑A0.1％TFA水溶液；洗脫劑B0.1％TFA的乙腈/水(9∶1)溶液；梯度20—90％B；以1ml/min的流速50分鐘形成。M+＝用“快原子轟擊”(FAB)法獲得的質(zhì)譜的分子峰，所示分子量與所計(jì)算的值相比增加了一個(gè)質(zhì)量單位。實(shí)施例1用85ml二氯甲烷稀釋0.4gH—Arg(Mtr)—Gly—Asp—Btd—ONa[它可通過用哌啶/DMF除去FMOC基團(tuán)并用TFA/CH2Cl2(1∶1)除去樹脂而得自FMOC—Arg(Mtr)—Gly—Asp—Btd—O—Wang，—O—Wang為改進(jìn)的Merrifield技術(shù)中所使用的4—氧甲基苯氧甲基聚苯乙烯樹脂的殘基]的15ml DMF溶液，并用50mgNaH-CO3處理。在干冰/丙酮混合物中冷卻后，加入40μl二苯基磷?；B氮化物。室溫下靜置16小時(shí)后，濃縮溶液。過濾濃縮物(SephadexG10柱，于異丙醇/水8∶2中)，然后通過HPLC按常規(guī)方式純化，得到環(huán)—(Arg(Mtr)—Gly—Asp—Btd)。
類似地，通過環(huán)化相應(yīng)的線性肽可得到下列環(huán)肽環(huán)(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(S)Gly[ANC-2]-Leu)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(R)Gly[ANC-2]-Leu)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(S，S)spiroPro-Leu)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Biph1)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Biph2)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Act)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Btd-Val)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-Btd-Val)；環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Aha)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-AspBtd)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-(S)Gly[ANC-2]-Leu)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-(R)Gly[ANC-2]-Leu)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-(S，S)spiroPro-Leu)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-Biph1)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-Biph2)；環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-Act).實(shí)施例2將0.28g環(huán)—(Arg(Mtr)—(Gly—Asp—Btd)[可按實(shí)施例1所述通過環(huán)化得到]的8.4ml TFA溶液、1.7ml二氯甲烷和0.9ml苯硫酚于室溫下靜置4小時(shí)，然后濃縮，用水稀釋并冷卻干燥。在Sephadex G10(乙酸/水1∶1)上凝膠過濾，然后在所述條件下通過制備性HPLC純化，得到環(huán)—(Arg—Gly—Asp—Btd)；RT＝13.2；M+＝527。
類似地，可得到下列環(huán)肽由 環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(S)Gly[ANC-2]-Leu)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-(S)Gly[ANC-2]-Leu)；RT＝4.8；M+525；由 環(huán)—-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(R)Gly[ANC-2]-Leu)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-(R)Gly[ANC-2]-Leu)；RT＝6.3；M+525；由 環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-(S，S)spiroPro-Leu)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-(S，S)spiroPro-Leu)；RT＝14.6；M+565；由 環(huán)—-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Biph1)制得環(huán)—-(Arg-Gly-Asp-Biph1)；RT＝20.7；M+538；由 環(huán)—(Arg(Mtr)Gly-Asp-Biph2)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Biph2)；RT＝20.8；M+538；由 環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Act)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Act)，RT＝14.3；M+547；由 環(huán)—(Arg(Mt)-Gly-Asp-Btd-Val)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Btd-Val)；由 環(huán)—(Arg(Mtr)-DAla-Asp-Btd-Val)制得環(huán)—(Arg-DAla-AspBtd-Val)；由 環(huán)—(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Aha)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Aha)實(shí)施例3將80mg環(huán)(Arg—Gly—Asp—Btd)溶于0.01M HCl中5—6次，并在每一次溶解后冷卻干燥。然后通過HPLC純化，得到環(huán)—(Arg—Gly—Asp—Btd)×HCl。
同樣地，可得到下列環(huán)肽由 環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Aha)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Aha)×HCl；由 環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Btd-Val)制得環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Btd-Val)×HCl；由 環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Btd-Val)制得環(huán)—(Arg-DAla-Asp-Btd-Val)×HCl；由乙酸處理環(huán)—(Arg—DAla—Asp—Btd—Val)，得到環(huán)—(Arg—DAla—Asp—Btd—Val)×H3C—COOH；由0.01N硝酸處理環(huán)—(Arg—Gly—Asp—Aha)，得到；環(huán)—(Arg—Gly—Asp—Aha)×HNO3。實(shí)施例4為制備親和相，將0.9gCl—(CH2)3—CO—NH—(CH2)3聚合物[可通過Cl—(CH2)3—COOH與H2N—(CH2)3聚合物的縮合得到]懸浮于10ml 0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7)中，并于4°加入1當(dāng)量環(huán)—(Arg(Mtr)—Gly—Asp(ONa)—Btd。攪拌反應(yīng)混合物4小時(shí)，同時(shí)升溫至室溫，濾出固體殘余物，并用10ml緩沖液(pH7)洗滌兩次，然后用10ml水洗滌三次，得到環(huán)—(Arg(Mtr)—Gly—Asp(O(CH2)3—CONH—(CH2)3—聚合物)—Btd)。實(shí)施例5類似地，通過除去環(huán)—(Arg(Mtr)—Gly—Asp(—O—(CH2)3—CONH—(CH2)3—聚合物—Btd)中的Mtr基團(tuán)可得到環(huán)—(Arg—Gly—Asp(O—(CH2)3—CONH—(CH2)3—聚合物)—Btd)。實(shí)施例6與實(shí)施例4類似，通?？s合聚—O(CH2)3—NH2(市售)和環(huán)—(Arg—Gly—Asp—Biph1)可獲得環(huán)(Arg—Gly—Asp—(NH—(CH2)3—O—聚合物)—Bipb1)。
同樣，通過縮合環(huán)—(Arg—Gly—Asp—Btd—Val)與H2N(CH2)3—O—聚合物，得到環(huán)—(Arg—Gly—Asp—(NH—(CH2)3—O—聚合物)—Btd—Val)。
以下實(shí)施例涉及藥物制品。
實(shí)施例A注射小瓶將100克式I的環(huán)肽和5克磷酸氫二鈉在3升二次蒸餾水中的溶液用2N鹽酸調(diào)整至pH＝6.5，過濾消毒，將其裝入注射小瓶中和然后在無菌條件下冷凍干燥，和在無菌條件下將小瓶封口，每個(gè)注射小瓶含有5毫克活性物質(zhì)。
實(shí)施例B栓劑將20克式I的活性物質(zhì)與100克大豆卵磷酯和1400克可可奶油的混合物熔化，倒入模具中和靜置冷卻，每個(gè)栓劑含有20毫克活性物質(zhì)。
實(shí)施例C溶液將1克式I活性物質(zhì)，9.38克NaH2PO4×2H2O、28.48克Na2HPO4×12H2O和0.1克亞芐基毒芹屬氯化物溶于940毫升二次蒸餾水中制得一種溶液，將溶液調(diào)整至pH＝6.8，稀釋至1升和照射消毒，該溶液能以眼藥水的方式來使用。
實(shí)施例D軟膏在無菌條件下將500毫克的式I的活性物質(zhì)與99.5克凡士林混合。
實(shí)施例E片劑將100g式I的環(huán)肽、1kg乳糖、600g微結(jié)晶纖維素、600g玉米淀粉、80g滑石和10g硬脂酸鎂的混合物以常規(guī)的方式壓縮形成片劑，每片含有10毫克活性物質(zhì)。
實(shí)施例F涂膜片劑用與實(shí)施例E相類似的方法組成片劑，和然后以常規(guī)的方式用含有蔗糖、玉米淀粉、滑石、黃蓍膠和著色劑的涂層進(jìn)行涂膜。
實(shí)施例G膠囊以常規(guī)的方式，用式I的活性物質(zhì)裝填成硬的明膠膠囊，使每個(gè)膠囊含有5毫克的活性物質(zhì)。
實(shí)施例H吸入噴霧劑將14g式I活性物質(zhì)溶于101等滲NaCl溶液，并將該溶液注入具有泵裝置的市售噴霧容器中。該溶液可被噴至口腔或鼻腔中，一次噴霧量(約0.1ml)相當(dāng)于約0.14mg劑量。
權(quán)利要求
1. 式I的環(huán)肽或其可作藥用的鹽環(huán)—(Arg-A-Asp-R1-R2)I其中A為Gly或Ala，R1為2—羧基—8—氨基—4—硫代毒芹側(cè)堿—9—酮(Btd)、O—氨基甲基—O’—羧基聯(lián)苯(Biph)、2—氨基甲基—5—羧基甲基—噻吩(Act)、或6—氨基己酸殘基(Aha)或2—(1，7—二氮雜螺[4.4]壬—7—基)—4—甲基戊酸((S，S)螺—Pro—Leu)或2—(3—氨基—1—吡咯烷—2—酮基)—4—甲基戊酸殘基((S)Gly[ANC—2]—Leu或(R)Gly[ANC—2]—Leu)，在每一種情況下殘基通過肽鍵鍵合，R2不存在或者為Val。
2. (a)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-(S)Gly[ANC-2]-Leu)；(b)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-(R)Gly[ANC-2]-Leu)；(c)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-(S，S)spiro-Pro-Leu)；(d)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Act)；(e)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Btd)；(f)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Aha)；(g)環(huán)—(Arg-Gly-Asp-Btd-Val)；(h)環(huán)—(Arg-DAla-Asp-Btd-Val).
3. 權(quán)利要求1所述的式I化合物的對(duì)映體或非對(duì)映體。
4. 權(quán)利要求1所述的式I化合物或其鹽的制備方法，其特征在于它是通過用溶劑解或氫解試劑處理從其一種功能性衍生物中釋放出來，或在于用環(huán)化劑處理式II的肽或其反應(yīng)性衍生物，H—Z—OH(II)其中Z為-Arg-A-Asp-R1-R2--A-Asp-R1-R2-Arg--Asp-R1-R2-Arg-A--R1-R2-Arg-A-Asp-or-R2-Arg-A-Asp-R1-，和/或在于通過用酸或堿處理使式I堿性或酸性化合物轉(zhuǎn)化為其一種鹽。
5. 一種制備藥品的方法，其特征在于將權(quán)利要求1的式I化合物和/或其一種生理上可接受的鹽與至少一種固體或半固體賦形劑或助劑一起制成合適的劑型。
6. 一種藥品，其特征在于它含有至少一種權(quán)利要求1的式I化合物和/或其一種可作藥用的鹽。
7. 權(quán)利要求1的式I化合物或可作藥用的鹽在制備可治療疾病的藥物中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1的式I化合物或其可作藥用的鹽在控制疾病中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1的式I化合物或其可作藥用的鹽在生產(chǎn)用于親和層析柱的固定化配體中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1的式I化合物在通過親和層析純化整合蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及式I的新的環(huán)肽及其鹽cyclo-(Arg-A-Asp-R這些化合物作為整合蛋白抑制劑，尤其可用于循環(huán)、骨骼等疾病的預(yù)防和治療以及腫瘤的治療，并且可用作抗微生物和抗病毒活性物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K38/08GK1116628SQ95105200
公開日1996年2月14日 申請(qǐng)日期1995年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月30日
發(fā)明者A·瓊茲希克, G·霍爾澤曼, S·古德曼, H·凱斯勒, R·豪布納, J·沃瑪司 申請(qǐng)人:默克專利股份有限公司