專(zhuān)利名稱(chēng)：注射器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種酵母乳糖酶的提取方法，該方法屬于化學(xué)溶劑破壁提取的范圍，適用于對(duì)酵母膜酶的提取和初步純化。
乳糖酶廣泛用于乳制品工業(yè)，在奶酪和低乳糖牛奶的加工過(guò)程中加入少量乳糖酶可加快乳糖水解速度，提高產(chǎn)品質(zhì)量。此酶亦用于成人和嬰幼兒先天性或繼發(fā)性乳糖不耐受癥的治療。乳糖酶是某些酵母的胞內(nèi)酶，固定在酵母細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，屬于膜酶。常規(guī)的提取方法是將含乳糖酶的酵母從培養(yǎng)液中收獲、榨干，用物理或化學(xué)的方法破細(xì)胞壁，然后提取。如勻槳法，機(jī)械研磨法，甲苯或乙酸乙酯等有機(jī)溶劑法等(Y.Ito.et.alEur.J.Biochem.105 85-92 1980)但是，用這些方法處理時(shí)間較長(zhǎng)，乳糖酶的釋放包括酶從膜結(jié)構(gòu)上游離的過(guò)程，此時(shí)，胞內(nèi)其他物質(zhì)也釋放出來(lái)，其中包括蛋白酶類(lèi)。蛋白酶很難從酶制品中除去，少量蛋白酶的存在可使乳糖酶在較短期內(nèi)大量失活。因此，應(yīng)縮短乳糖酶提取時(shí)間并降低已釋放的蛋白酶活性，從而提高乳糖酶的保存性能。
本發(fā)明提出一種改進(jìn)的酵母乳糖酶提取方法，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高的回收率，并選擇性地降低酵母蛋白酶的活性，提高乳糖酶的保存性能。
本方案采用多種無(wú)毒或低毒有機(jī)溶劑按一定比例配制成破膜溶劑，使酵母細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)破膜，并使用外源性蛋白酶加速乳糖酶從酵母細(xì)胞膜上釋放，亦部分破壞了已釋放的酵母蛋白酶，再針對(duì)不同的蛋白酶使用不同的蛋白酶抑制物，使之滅活。達(dá)到初步純化之目的。這一過(guò)程，可使酵母本身的蛋白酶活性大部分被消除，縮短了提取時(shí)間，提高了提取百分率，同時(shí)又改善了乳糖酶的保存性能。
此方法還適用于對(duì)酵母蔗糖酶，酵母麥芽糖酶及其它酵母膜酶的提取。
本發(fā)明提出的破膜溶劑為醇類(lèi)、酯類(lèi)與氯仿組成的混合溶劑。其中醇類(lèi)為2-4個(gè)碳原子的醇，占混合溶劑的50-80%(V/V);酯類(lèi)為甲酸、乙酸或丁酸的C2-C5碳醇酯，占15-40%(V/V);氯仿占5-10%(V/V)。采用的外源性蛋白酶是選取對(duì)乳糖酶從膜上游離釋放有效，對(duì)乳糖酶損傷小，并便于從乳糖酶提取液中除去的蛋白酶。如胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、地衣芽胞桿菌蛋白酶、米曲蛋白酶。黑曲蛋白酶等均有不同的效果。針對(duì)不同蛋白酶選用大豆胰蛋白酶抑制因子、碘乙酸(或碘乙酰胺)等作為蛋白酶抑制物，以去除乳糖酶提取液中的外源性蛋白酶。
本發(fā)明具體方案可見(jiàn)于以下實(shí)施例。
實(shí)施例一100克糊狀濕酵母，加100ml破膜溶劑，破膜溶劑配方為乙醇60ml、乙酸乙酯30ml、氯仿10ml。攪拌10-30分鐘，使酵母破膜。得到破膜混懸液約為180ml，加入PH6-10的含適量木瓜蛋白酶的緩沖液至1800ml，室溫?cái)嚢?-24小時(shí)，使乳糖酶從破碎的細(xì)胞壁上游離溶解，然后用滴定法加入碘乙酸(或碘乙酰胺)適量，使木瓜蛋白酶被抑制。4000-7000rpm離心12分鐘去除沉淀，上清液即為初步純化的乳糖酶提取液。提取液中幾乎無(wú)殘余的蛋白酶活性，有良好的保存性能。
實(shí)施例二100克糊狀濕酵母，加100ml破膜溶劑，破膜溶劑配方為異丙醇50-80%，甲酸乙酯15-40%，氯仿5-10%，攪拌10-30分鐘使酵母破膜，加入PH6-10的磷酸鹽緩沖液至1800ml，內(nèi)含適量胰蛋白酶，攪拌6-24小時(shí)，使乳糖酶從破碎的細(xì)胞壁上游離、溶解，然后滴加大豆胰蛋白酶抑制因子適量，使胰蛋白酶正好被抑制，4000-7000rpm離心12分鐘去除沉淀，上清液即為提純的乳糖酶提取液。經(jīng)測(cè)定，提取液中幾乎無(wú)蛋白酶活性，乳糖酶保存性能良好。
實(shí)施例三100克糊狀濕酵母，加100ml破膜溶劑，破膜溶劑配比為乙醇60ml，乙酸乙酯30ml，氯仿10ml，攪拌處理10-30分鐘，加入PH6-10的磷酸鹽緩沖液，其中不含外源性蛋白酶，加至1800ml，攪拌24-48小時(shí)，使乳糖酶自細(xì)胞膜上游離，4000-7000rpm離心12分鐘，去除沉淀，得乳糖酶提取液。
與例一、例二相比，由于例三中未使用外源性蛋白酶處理破膜后的酵母碎片，乳糖酶從細(xì)胞膜碎片上游離較慢，攪拌處理時(shí)間需增加2-4倍，同時(shí)，乳糖酶的提取率較例一、例二為低，保存性能也差。
實(shí)施例四，100克糊狀濕酵母，加100ml破膜溶劑，破膜溶劑配比為乙醇50-80%，丁酸丁酯15-40%，氯仿5-10%，攪拌處理10-30分鐘，加入9倍于處理液量的，PH6-10的緩沖液，內(nèi)含適量外源性蛋白酶(黑曲蛋白酶或米曲蛋白酶或地衣芽胞桿菌蛋白酶或糜蛋白酶任取一種)，攪拌6-24小時(shí)后，用滴定法加入大豆胰蛋白酶抑制因子適量，使外源性蛋白酶被抑制，4000-7000rpm離心12分鐘，濾去沉淀，得初步純化的乳糖酶提取液。該提取液中乳糖酶活性良好，回收率理想，且保存性能好。
權(quán)利要求
1.一種酵母乳糖酶的提取方法，屬于用化學(xué)溶劑破壁處理的范圍，其特征在于用醇類(lèi)(C2-C4的醇)、酯類(lèi)(甲酸、乙酸或丁酸的C2-C5碳醇酯)和氯仿組成的混合溶液處理糊狀濕酵母，攪拌10-30分鐘，使之破壁液化，每份此混合物中加入PH6-10的緩沖液9份(V/V)，攪拌24-48小時(shí)，離心法除去沉淀物，得到含酵母乳糖酶的提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述酵母乳糖酶的提取方法，其特征在于所述PH6-10的緩沖液中加入適量的外源性蛋白酶，攪拌6-24小時(shí)后用滴定法加入蛋白酶抑制物，然后離心除去沉淀物，得到含酵母乳糖酶的提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述酵母乳糖酶的提取方法，其特征在于所述外源性蛋白酶為木瓜蛋白酶，或黑曲蛋白酶，或米曲蛋白酶，或地衣芽胞桿菌蛋白酶，或糜蛋白酶，或胰蛋白酶;所述蛋白酶抑制物是大豆胰蛋白酶抑制因子，或碘乙酸，或碘乙酰胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述酵母乳糖酶的提取方法，其特征在于所述混合溶液的配比(V/V)為醇類(lèi)50-80%，酯類(lèi)15-40%，氯仿5-10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述酵母乳糖酶的提取方法，其特征在于此法還適用于對(duì)酵母蔗糖酶、酵母麥芽糖酶及其它酵母膜酶的提取。
全文摘要
尤其適用于醫(yī)藥目的注射器包含一注射筒體(1)、一位于注射筒體(1)內(nèi)而可在其中移動(dòng)的活塞(10)和一注射針(6)，為確保可抽取精確量的活性成分和稀釋液，活塞(10)包含至少二可沿注射筒體(1)的縱軸相對(duì)移動(dòng)的活塞元件(2、3)。
文檔編號(hào)A61M5/315GK1072865SQ9211417
公開(kāi)日1993年6月9日 申請(qǐng)日期1992年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月29日
發(fā)明者瑟杰·M·馬蘇里克, 安德瑞·N·梭克羅夫, 馬拉特·M·卡須里克夫 申請(qǐng)人:瑟杰·M·馬蘇里克