專利名稱：病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒疫苗，特別是涉及以遺傳工程手段改造的用作疫苗的突變病毒、含有突變病毒的疫苗、重組體細(xì)胞，以及生產(chǎn)疫苗的方法。
病毒疫苗一般分為兩類。第一類是“被殺死的”疫苗，其為已經(jīng)過適當(dāng)化學(xué)物質(zhì)如β-丙醇酸內(nèi)酯處理后殺死的病毒制劑。第二類是活的“減毒”疫苗，其為經(jīng)過對病毒基因組的特異性遺傳操作，或更常見的是在某種類型組織培養(yǎng)系統(tǒng)中傳代而降低了對宿主之致病性的病毒。這兩種類型的疫苗均有其各自的缺點(diǎn)。因?yàn)楸粴⑺赖牟《疽呙绮荒茉谒拗鲀?nèi)復(fù)制，所以必須注射給藥，并因此而可能產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。例如被殺死的脊髓灰質(zhì)炎病毒制劑(即沙克疫苗)可產(chǎn)生免疫球蛋白(Ig)G抗體反應(yīng)，但不能在原發(fā)感染的天然部位即腸內(nèi)刺激IgA的產(chǎn)生。因此，雖然該疫苗能夠保護(hù)機(jī)體免于發(fā)生脊髓灰質(zhì)炎的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，但并不能阻斷原發(fā)感染，且不能賦予“群體免疫力”。另外，殺死的病毒即不能進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，也不能在其中復(fù)制。因此不能產(chǎn)生針對復(fù)制期間所產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的任何有益免疫學(xué)反應(yīng)，它們也不能刺激針對病毒抗原之胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。“死”抗原不能被抗原呈現(xiàn)細(xì)胞檢拾并提供給T細(xì)胞。然而，可由Ⅱ類MHC分子呈現(xiàn)并導(dǎo)致對T輔助細(xì)胞的刺激作用。T輔助細(xì)胞又可幫助B細(xì)胞產(chǎn)生針對抗原的特異性抗體。為了刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生，必須通過被感染細(xì)胞內(nèi)的特殊途徑加工病毒抗原，并作為被中斷的肽片段出現(xiàn)在Ⅰ類MHC分子上。一般認(rèn)為該降解途徑對于那些在被感染細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)是最為有效的，所以只有進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)免疫原性病毒蛋白質(zhì)的病毒才能產(chǎn)生病毒特異性胞毒性T細(xì)胞。因此，死疫苗是誘導(dǎo)抗病毒感染之細(xì)胞免疫力的不良誘導(dǎo)劑。從這一觀點(diǎn)看，活的病毒疫苗更為可取。
迄今，已通過刪除非必要基因或部分地?fù)p傷一個(gè)或多個(gè)必要的基因(在此情況下，損傷是使基因仍保留功能活性，但不能很有效地發(fā)揮作用)制成了活性的減毒病毒。但活減毒病毒常常帶有殘留的致病性，而對宿主造成有害影響。另外，除非經(jīng)特異性刪除造成減毒，否則有可能逆轉(zhuǎn)為更強(qiáng)毒力形式的病毒。但有一個(gè)事實(shí)是，在宿主中可產(chǎn)生某些病毒蛋白質(zhì)，這意味著它們比那些不能產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)的死疫苗更為有效。
活減毒病毒不僅其本身可用作疫苗，而且可作為其它基因的“疫苗載體”，換句話說即可攜帶來自須對抗之第二種病毒(或其他病原體)的基因。一般情況下?？墒褂枚徊《究频某蓡T如牛痘病毒作為疫苗載體。當(dāng)使用病毒作為疫苗載體時(shí)，重要的是它不能引起致病作用。換句話說，須以可使單純病毒疫苗減毒的同樣方法對其進(jìn)行減毒。因此，在這種情況下應(yīng)用時(shí)也會(huì)存在如上面所述的同樣缺點(diǎn)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有可能從病毒基因組中刪除某個(gè)基因，并提供一個(gè)所謂的“互補(bǔ)”細(xì)胞，進(jìn)而由該細(xì)胞提供帶有被刪除基因之產(chǎn)物的病毒。這一方法已在某些病毒如腺病毒、皰疹病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒中得以實(shí)現(xiàn)。對于腺病毒，是用5型腺病毒DNA的片段轉(zhuǎn)化人細(xì)胞系(Graham，Smiley，Russell&Nairn，J.Gen，Virol，36，59-72，1977)。該細(xì)胞系表達(dá)某些病毒基因，并發(fā)現(xiàn)它能支持具有其已被刪除或失活之基因的病毒突變體的生長(Harrison，Graham&Williams，Virology77，319-329，1977)。雖然病毒能在該細(xì)胞系(“互補(bǔ)細(xì)胞系”)上很好地生長并產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)的病毒顆粒，但完全不能在正常人細(xì)胞上生長。已顯示表達(dá)SV40病毒基因組(乳多空病毒)之T抗原編碼區(qū)的細(xì)胞能夠支持被特異性刪除的病毒在該區(qū)域的復(fù)制(Gluzman，Cell，23，182-195，1981)。對于單純性皰疹病毒，已產(chǎn)生了表達(dá)gB糖蛋白(Caietal.J.Virol.62，714-721，1987)，gD糖蛋白(LigasangJohnson，J，Virol.62，1486，1988)和直接早期蛋白質(zhì)ICP4(Delucaetal.J.Virol，56，558，1985)的細(xì)胞系，而且已表明這些細(xì)胞系能夠支持帶有相應(yīng)基因特異性失活拷貝之病毒的復(fù)制。
本發(fā)明提供了用作疫苗的突變病毒，其中編碼產(chǎn)生感染性病毒所必須之蛋白質(zhì)的病毒基因已被刪除或失活;且其中所說的病毒能在具有異源核苷酸序列的細(xì)胞中生長，所說的核苷酸序列可使所說的細(xì)胞表達(dá)由所說的被刪除或失活之病毒基因編碼的必要蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了包含上述病毒，連同一種或多種賦形劑和/或佐劑的疫苗。病毒基因組本身可提供免疫原，或可含有表達(dá)該免疫原蛋白質(zhì)的異源基因插入段。
本發(fā)明還提供了用如上所述的，用于制備疫苗的減毒病毒轉(zhuǎn)染的互補(bǔ)細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了使用上述病毒制備用于治療或預(yù)防疾病之疫苗的方法。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)疫苗的方法，該方法包括培養(yǎng)用帶有被刪除或失活之病毒基因的病毒感染的細(xì)胞，其中所說病毒基因編碼一種對于感染性病毒的產(chǎn)生不可缺少的蛋白質(zhì)，且其中宿主細(xì)胞具有包括所說之病毒基因的異源核苷酸序列并能表達(dá)由所說之基因編碼的必要蛋白質(zhì)，然后收獲如此產(chǎn)生的病毒，并將其用于疫苗中。
病毒可衍生于單純性皰疹病毒(HSV)，其中例如編碼糖蛋白H(gH)的基因已被失活或刪除。突變病毒也可包含編碼衍生于病原體之免疫原的異源序列，宿主細(xì)胞可以是含有編碼HSV糖蛋白H之基因的重組真核細(xì)胞系。作為另一個(gè)例子，病毒可以是衍生于某真痘病毒如牛痘病毒，其也可包括編碼衍生于病原體之免疫原的異源序列。
本發(fā)明顯示了一種將死疫苗和由減毒疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生的病毒蛋白質(zhì)所誘導(dǎo)之額外免疫反應(yīng)的有效性及安全性相結(jié)合的獨(dú)特方式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它包括兩個(gè)特征。首先，通常是經(jīng)過產(chǎn)生特異性缺失而在病毒基因組內(nèi)使選擇的基因失活。此基因?qū)⑴c感染性病毒的產(chǎn)生，但最好不阻礙病毒基因組的復(fù)制。因此被感染細(xì)胞能由復(fù)制的遺傳材料產(chǎn)生多種病毒蛋白質(zhì)，而且在某些情況下可產(chǎn)生新的病毒顆粒，但這些病毒都是沒有感染性的，這就意味著病毒感染不能從接種部位蔓延開來。
本發(fā)明的第二個(gè)特征涉及為病毒提供被刪除基因之表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞，從而使之能夠在組織培養(yǎng)物中生長病毒。因此，雖然病毒缺少編碼某必要蛋白質(zhì)的基因，但如果它生長于適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，即可增殖并產(chǎn)生與原病毒看不出有什么區(qū)別的完整病毒顆粒。該突變病毒制品從其帶有缺陷的基因組并且不能在正常宿主內(nèi)產(chǎn)生感染性病毒的意義上看，它是無活性的，故可按足以在宿主體內(nèi)直接產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的量安全使用之。因此，突變病毒不一定是對被保護(hù)之宿主的細(xì)胞有感染性，而且只須按常規(guī)使用死疫苗或活減毒疫苗完全相同的方式使用即可發(fā)揮作用。但從免疫病毒能與細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)動(dòng)病毒復(fù)制周期，從而能在被保護(hù)之宿主細(xì)胞內(nèi)引起感染并在其中產(chǎn)生某些病毒抗原的意義上說，免疫病毒本身較好是仍然有感染性的。這樣使得有另一個(gè)刺激宿主免疫系統(tǒng)之細(xì)胞免疫的機(jī)會(huì)。
缺失或失活的基因較好是盡可能晚地參與病毒生活周期的基因，這樣便可在體內(nèi)提供盡可能多的病毒蛋白質(zhì)以產(chǎn)生免疫性反應(yīng)。例如，基因可以是參與包裝或某些其它復(fù)制后過程的基因，如HSV的gH糖蛋白。但選擇的基因可以是參與病毒基因組復(fù)制的基因，并且在體內(nèi)表達(dá)之蛋白質(zhì)的范圍將取決于正常情況下基因得以表達(dá)的階段。對于人細(xì)胞肥大病毒(HCMV)，選擇的基因可以是有效地阻止病毒基因組在體內(nèi)復(fù)制的基因(除直接早期基因外)，因?yàn)樵诓《净蚪M復(fù)制前產(chǎn)生的(而且確實(shí)對它是重要的)直接早期基因是高度免疫原性的。
本發(fā)明可應(yīng)用于任何病毒，其中一個(gè)或多個(gè)必要基因能被鑒定并可從病毒基因組中刪除或在病毒基因組中被失活。對于腺病毒、皰疹病毒、乳多空病毒、乳頭狀瘤病毒和細(xì)小病毒等DNA病毒，可通過(1)體外操作被選擇之必要基因的已克隆DNA拷貝以產(chǎn)生特異性DNA改變，以及(2)通過常規(guī)重組和標(biāo)志保留方法將已改變的變體重新引入病毒基因組中而直接實(shí)現(xiàn)上述目的。但本發(fā)明也可應(yīng)用于RNA病毒。可用現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)在體外操作RNA病毒基因組的互補(bǔ)DNA拷貝，然后再于體外將其轉(zhuǎn)錄成RNA?？蓪⑺玫降腞NA重新導(dǎo)入病毒基因組中。該技術(shù)已被用于在正鏈和負(fù)鏈RNA病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒(RacanielloandBaltimore，Science，214，916-919，1981)和流感病毒(Lutyesetal，Cell，59，1107-1113，1989)的基因組中產(chǎn)生特異性改變。
在理論上，任何編碼必要蛋白質(zhì)的基因均應(yīng)是按該方法產(chǎn)生減毒病毒的潛在靶基因。但在實(shí)踐中，對基因的選擇將決定于多方面的考慮。
1.基因較好是感染的后期所需要的。從而不會(huì)在早期中斷減毒病毒的復(fù)制過程，這就意味著大部分甚至可能所有其他病毒抗原都將在被感染細(xì)胞中產(chǎn)生，并以與宿主細(xì)胞I類MHC分子結(jié)合的方式貢獻(xiàn)于宿主免疫系統(tǒng)。如此呈現(xiàn)便導(dǎo)致通過胞毒性T細(xì)胞來發(fā)展抗病毒感染的細(xì)胞免疫。胞毒性T細(xì)胞可識(shí)別這些抗原，從而殺死感染細(xì)胞的病毒。缺失的基因可能代表了完全不是病毒組裝所需的基因，但它對于組裝好的病毒能夠感染細(xì)胞來說是不可缺少的。HSVgH蛋白質(zhì)即是這種蛋白質(zhì)的一個(gè)例子。在沒有這種蛋白質(zhì)的情況下，仍可產(chǎn)生HSV病毒粒子，但它們是非感染性的。
2.選擇之基因的表達(dá)產(chǎn)物本身對真核細(xì)胞確實(shí)是沒有毒性的，這樣便可以相對地容易地產(chǎn)生互補(bǔ)細(xì)胞。然而，由于基因在互補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)可能處于可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的控制下，這樣其表達(dá)就只能在需要時(shí)才啟動(dòng)，所以上述條件不是絕對必要的。
靶基因產(chǎn)生之突變的性質(zhì)也是一個(gè)選擇因素。只要使逆轉(zhuǎn)為野生型結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn)減到最小，任何產(chǎn)生非功能性基因產(chǎn)生的改變都是令人滿意的。這些改變包括打斷帶無關(guān)序列的靶基因并造成特異性缺失。但為將疫苗用作治療和/或預(yù)防劑，最令人滿意的戰(zhàn)略是刪除應(yīng)包括將被導(dǎo)入互補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)的整個(gè)序列。可通過在互補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)病毒和細(xì)胞DNA間的重組使再生野生型病毒的危險(xiǎn)減小到最低程度。
迄今為止，雖然已有幾個(gè)將特異性失活的病毒與互補(bǔ)細(xì)胞相結(jié)合的例子(見上文所述)，但這些都是用于病毒的基礎(chǔ)研究，或者是借以制備用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的較安全的載體(使用反轉(zhuǎn)錄病毒)。迄今還沒有用于制作疫苗之目的，而且就本申請人所知，也沒有人提出這樣的使用方法。
除使用這種失活病毒/互補(bǔ)細(xì)胞組合以生產(chǎn)抗野生型病毒的安全疫苗外，本發(fā)明還涉及使用同一系統(tǒng)生產(chǎn)用作抗外來病原體之疫苗的安全的病毒載體。
這種載體的一個(gè)例子是基于HSV制得的。HSV基因組之大足以容納大量有價(jià)值的附加遺傳信息，且已描述了幾種攜帶并表達(dá)外來遺傳材料的重組HSV病毒(如LigasandJohnson，J.Virol，1988，文獻(xiàn)同上)。因此可使用上述被刪除的必要病毒基因，并攜帶和表達(dá)特定外來基因的病毒作為進(jìn)行疫苗接種的安全載體，用以產(chǎn)生抗外來蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。
HSV的一個(gè)重要特征是它可進(jìn)而潛伏于被感染個(gè)體的神經(jīng)元中，并有時(shí)會(huì)再活化而導(dǎo)致局部損傷。為此可使用缺失某個(gè)必要病毒基因并表達(dá)外來基因的HSV，以在被處理的個(gè)體中有意造成神經(jīng)細(xì)胞的潛在感染。重新激活這樣一種潛在感染不會(huì)導(dǎo)致?lián)p害的產(chǎn)生，因?yàn)榇藭r(shí)的病毒載體不能再充分復(fù)制，而可導(dǎo)致最初部分病毒復(fù)制周期的發(fā)動(dòng)。在此期間可發(fā)生外來基因的表達(dá)，而引發(fā)免疫反應(yīng)。如果編碼某蛋白質(zhì)的已缺失的HSV基因?qū)τ诓《窘M裝不是必需的，而只與組裝好的病毒粒子的感染性有關(guān)，便可將這樣的外來抗原摻入組裝的病毒顆粒中，以提高其免疫原性效應(yīng)。當(dāng)然，這種外來基因的表達(dá)和其蛋白質(zhì)在病毒顆粒中的摻入也可發(fā)生在突變病毒在其互補(bǔ)宿主內(nèi)最初產(chǎn)生的階段，在此情況下，即當(dāng)將突變病毒用作疫苗時(shí)，即可直接將外來蛋白質(zhì)提供給被處理的個(gè)體。
在另一個(gè)例子中，牛痘病毒(一種痘病毒)可攜帶并表達(dá)來自各種不同病原體的基因，并已證明當(dāng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)時(shí)它們可成為有效的疫苗。用于人體的潛力是很大的，但由于與廣泛使用牛痘病毒作為抗天花疫苗有關(guān)的已知副作用，所以一般不太同意在人身上大規(guī)模使用未修飾的牛痘疫苗。已經(jīng)嘗試了通過刪除非必要基因如牛痘生長因子基因來使牛痘病毒減毒(Buller，Chakrabarti，Cooper，Twardzik&Moss，J.Virology62，866-874，1988)。但如此減毒的病毒仍可在體內(nèi)復(fù)制，盡管其復(fù)制水平很低。也產(chǎn)生了缺失必要基因的非牛痘病毒，但這種缺失了上述必要基因的病毒，當(dāng)與其互補(bǔ)細(xì)胞結(jié)合而生長時(shí)，可提供該病毒載體的較安全變體。
這種抗異源蛋白質(zhì)免疫的一般性戰(zhàn)略的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可用同一病毒載體以一種常規(guī)活病毒載體不可能達(dá)到的方式進(jìn)行多次有效的疫苗接種。因?yàn)榫推湫Я碚f，一種標(biāo)準(zhǔn)的活病毒疫苗可能依賴于它通過許多次感染而形成的在宿主動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制的能力，所以它在具有抗該病毒之免疫力的個(gè)體中的使用便將受到嚴(yán)重限制。用同種病毒作第二次攻擊，無論是提供抗同一蛋白質(zhì)的加強(qiáng)免疫，還是產(chǎn)生抗不同蛋白質(zhì)的新的免疫反應(yīng)，可能都是無效的。如使用缺失了某必要基因的病毒載體(并不期望或要求它進(jìn)行多次復(fù)制)，也在免疫接種后很快就出現(xiàn)有效的免疫作用。突變病毒的劑量可以相當(dāng)大(因?yàn)樗鼞?yīng)是完全安全的)，因此不大可能通過宿主免疫反應(yīng)來阻斷這些尚需一定時(shí)間才能充分動(dòng)員的早期過程。
雖然我們在上面已得到突變病毒的必要基因是有缺陷的，并且可含有免疫原性病原體蛋白質(zhì)的基因，但突變體也可缺少一個(gè)以上的必要基因，和/或含有多個(gè)免疫原性病原體蛋白質(zhì)基因。因此，突變病毒可包括以上面提到的方式用作疫苗的HIVgp120基因，以及HIVgag蛋白質(zhì)基因，它們可在接種疫苗的宿主內(nèi)得以表達(dá)并以與MHC-I結(jié)合的方式呈現(xiàn)于宿主細(xì)胞表面上，從而刺激宿主的T細(xì)胞反應(yīng)。
為了更清楚地了解本發(fā)明，下面將借助實(shí)施例并參考下列附圖以非限制方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。


圖1說明質(zhì)粒pGH1的生產(chǎn)程序;
圖2說明質(zhì)粒pGH2的生產(chǎn)程序;
圖3a顯示用于產(chǎn)生質(zhì)粒pSP64Ta之互補(bǔ)寡核苷酸的堿基對;
圖3b說明質(zhì)粒pSP64Ta的產(chǎn)生;
圖4a顯示用于產(chǎn)生質(zhì)粒pCMVIEP的兩個(gè)寡核苷酸序列;
圖4b圖解顯示質(zhì)粒pCMVIEP;
圖5圖解顯示質(zhì)粒pCMVlacZ;
圖6圖解顯示質(zhì)粒pGH3;
圖7圖解顯示構(gòu)建質(zhì)粒pGH-120的戰(zhàn)略。
缺失了糖蛋白H的單純性瘡疹病毒(gH-HSV)單純性皰疹病毒(HSV)是一種大的DNA病毒，它可以在人體內(nèi)引起多種病癥，包括反復(fù)發(fā)作的面部和外陰部損傷，以及雖然罕見但常常是致命的腦炎。使用藥物Acyclovir以化學(xué)治療法可在一定程度上控制該病毒引起的感染，但還沒有可用來預(yù)防原發(fā)感染的疫苗?？笻SV疫苗接種的困難是病毒在體內(nèi)一般是通過直接在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移來傳播的。在這種情況下，由于循環(huán)抗體只能中和細(xì)胞外病毒，所以體液免疫難以奏效。為控制病毒感染，最重要的還是細(xì)胞免疫，為此一種能產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫力，而且又對機(jī)體安全的疫苗將是相當(dāng)可取的。
在SHV基因組內(nèi)進(jìn)行失活的適當(dāng)靶基因是糖蛋白H基因(gH)。gH蛋白質(zhì)是一種存在于病毒外殼表面上的糖蛋白。一般認(rèn)為該蛋白質(zhì)在病毒進(jìn)入被感染細(xì)胞期間參與了膜融合過程。這是因?yàn)樵诜窃试S溫度下，那些該基因受到了損傷的溫度敏感性病毒突變體將不能從病毒感染的細(xì)胞中分泌出來(Desaietal.J.Gen.Virol，69，1147-1156，1988)。該蛋白質(zhì)是在感染的后期表達(dá)的，所以當(dāng)其不存在時(shí)仍有大量的病毒蛋白質(zhì)合成。
所有基因操作均按“MolecularCloning”，ALaboratoryManual，eds，Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
A.表達(dá)HSVgH基因之細(xì)胞系的產(chǎn)生gH基因存在于I型HSV基因組的唯一長區(qū)域(UnigueLongregion，UL)中，即核苷酸46382和43868之間(McGeochetal.，J.Gen.Virol.69，1531-1574，1988)?？稍谫|(zhì)粒pAF2中得到該基因之克隆的拷貝。該質(zhì)粒是經(jīng)切割得自質(zhì)粒pTZgH的、包含完整pH編碼序列的BglⅡ-XhoⅠ片段，并將此片段克隆到上述質(zhì)粒pSP64T的BglⅡ位點(diǎn)中而產(chǎn)生的(GompelsandMinson，J.Virol，63，4744-4755，1989)。然后由質(zhì)粒pSVD4(Everett，Nucl，AcidsRes.11，6647-6667，1983)中切掉包含糖蛋白D(gD)基因之啟動(dòng)子序列的HindⅢ片段(以gD基因的起始位置為準(zhǔn)，從核苷酸-392延伸到+11)，并克隆到pAF2的唯一HindⅢ優(yōu)點(diǎn)以產(chǎn)生pGH1(圖1)，這樣即可利用以正確方向連接的啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)gH基因的表達(dá)。因此該質(zhì)粒即含有處于1型HSVgD基因啟動(dòng)子控制下的完整的gH編碼序列。然后純化該質(zhì)粒，并使用常規(guī)磷酸鈣共沉淀技術(shù)(GrahamandVanderEb，Virology52，456-467，1973)與質(zhì)粒pNEO(PharmaciaLKB，BiotechnologyInc.)一起共轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中。然后使細(xì)胞在藥物G418中傳代來選擇已獲得了新霉素抗性的Vero細(xì)胞，并用有限稀釋法克隆這些細(xì)胞的集落。在組織培養(yǎng)物中擴(kuò)增這些新霉素抗性細(xì)胞，然后用2型HSV病毒感染所得樣品。用2型HSV病毒感染具有誘導(dǎo)從存在于互補(bǔ)細(xì)胞基因組中之1型gD啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄，從而刺激互補(bǔ)細(xì)胞中1型gH蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的作用。使用已知如特異地識(shí)別I型gH蛋白質(zhì)的多克隆抗血清(Desai et al，1988，文獻(xiàn)同上)，以Western印跡轉(zhuǎn)移法，根據(jù)gH蛋白質(zhì)的表達(dá)來篩選被感染細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。然后保留表達(dá)所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞并制備其冷凍貯存品。該材料代表了gH+互補(bǔ)細(xì)胞系。
B.產(chǎn)生帶有已中斷之gH基因的HSVI型病毒從質(zhì)粒pUG102(GompelsandMinson，Virology153，230-247，1986)上切掉含有g(shù)H編碼序列連同HSV側(cè)翼序列的6432堿基對BglⅡ片段，并克隆到質(zhì)粒pAT153(TwiggandSherrat，Nature，283，216，1980)中以產(chǎn)生pGH2(圖2)。用只在gH編碼序列內(nèi)的兩個(gè)位置(相當(dāng)于Mcgeoch等人(1988，文獻(xiàn)同上)之序列編號(hào)的核苷酸44955和46065)上切割該序列的PvuⅡ消化上述質(zhì)粒，并從兩片段中純化較大的一個(gè)。然后按下述方法制備含有位于細(xì)胞肥大病毒(CMV)直接早期基因啟動(dòng)子下游，來自大腸桿菌之完整β半乳糖苷酶基因的DNA片段。首先將所有成對的互補(bǔ)寡核苷酸(如圖3a所示)退火并與Bg1Ⅱ消化的、磷酸酶處理的pSP64T(KriegandMelton，Nucl.AcidsRes.12，7057-7071，1984)連接，產(chǎn)生如圖3b中所示的質(zhì)粒pSP64Ta。所加接頭還包含大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的起始密碼子和前三個(gè)密碼子。然后使用圖4a中所示的兩個(gè)寡核苷酶，以聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-MolecularCloning，ed.Sambrooketal.，文獻(xiàn)同上)由質(zhì)粒pUG-H1(GompelsandMinson，1989，引文同上)擴(kuò)增CMV直接早期基因啟動(dòng)子的“核心區(qū)”，其中所說的兩個(gè)寡核苷酶分別相當(dāng)于序列中核苷酶-302至-288和-13至-36[核苷酶序號(hào)與Akrigg等人(VirusResearch，2，107-121，1985)所述的CMV直接早期基因的起始點(diǎn)相關(guān)]。這些寡核苷酸還在其5′端含有限制性酶HindⅢ的酶切點(diǎn)，在寡核苷酸退火到啟動(dòng)子上游的情況下，還含有另一個(gè)SmaⅠ位點(diǎn)。然后用HindⅢ消化PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物DNA，并克隆到HindⅢ消化的pSP64Ta中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pCMVIEP(圖4b)。最后，用BamHI消化質(zhì)粒pSC8(Chakrabartietal.，Mol.Cell.Biol.5，3403-3409，1985)，分離含有大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因之完整拷貝、而只缺少編碼序列之5′最末端的DNA片段，并克隆到pCMVIEP的唯一Bg1Ⅱ位點(diǎn)中以產(chǎn)生pCMVIlacZ(圖5)。然后再用SmaI消化pCMVlacZ以分離含有處于CMVIE啟動(dòng)子控制下的β-半乳糖苷酶基因的DNA片段，并與純化的上述pGH2的PvuⅡ片段連接，以產(chǎn)生pGH3，該質(zhì)粒包括了被功能性β-半乳糖苷酶基因隔斷的gH基因的拷貝(圖6)。下一步是用該中斷的變體置換HSV基因組中的野生型gH基因，其方法是使HSVDNA和質(zhì)粒pGH3之間發(fā)生重組，然后選擇那些已獲得了功能性β-半乳糖苷酶基因的病毒。因此可用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣沉淀技術(shù)(Graham and Van der Eb，1973，引文同上)將質(zhì)粒pGH3 DNA連同從純化的HSV病毒粒子中分離的純化的HSV DNA(Killington and Powell，“Techniques in VirologyA Practical Approach”(ed，B.W.J.Mahy)pp.207-236，IRL Press，Oxford(1985))一起共轉(zhuǎn)染到表達(dá)gH基因的細(xì)胞(A部分中所述的gH+互補(bǔ)細(xì)胞系)中。然后在顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)(該底物在β-半乳糖苷酶作用下變成藍(lán)色物質(zhì))存在下，使用瓊脂覆蓋層，按標(biāo)準(zhǔn)的噬斑檢驗(yàn)法將由此轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)得到的子代HSV病毒鋪敷在gH+互補(bǔ)細(xì)胞單層上，由含有并表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的病毒基因組感染后得到的噬斑即顯現(xiàn)藍(lán)色。因此這些病毒基因組應(yīng)攜帶有被中斷之gH基因的變體，從平皿的適當(dāng)部分中挑取瓊脂栓，以從這些噬斑中回收病毒，通過在gH+互補(bǔ)細(xì)胞系中培養(yǎng)病毒來制備病毒貯備樣品。因?yàn)檫@些病毒攜帶gH基因的非功能性變體，所以它們應(yīng)能在不含有并表達(dá)gH基因之內(nèi)源功能性拷貝的細(xì)胞上形成噬斑，這樣即可根據(jù)檢測病毒樣品在野生型Vero細(xì)胞單層上形成噬斑的能力并與gH互補(bǔ)細(xì)胞相比較來進(jìn)一步證實(shí)之。最后，從這些貯備病毒中制取病毒DNA，并用Southern印跡檢測法檢查gH基因周圍的預(yù)期之DNA結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步證實(shí)了正確的遺傳結(jié)構(gòu)后，將病毒樣品接種到gH+互補(bǔ)細(xì)胞系的大批量培養(yǎng)物(感染復(fù)數(shù)＝0.01)中，3天后收獲感染的細(xì)胞，以從中大量制備gH基因缺陷性病毒。用超聲波破碎被感染的細(xì)胞以釋放出細(xì)胞相關(guān)病毒，將超聲處理的總混合物儲(chǔ)存于-70℃下作為病毒總貯備品。在gH+互補(bǔ)細(xì)胞系上進(jìn)行噬斑檢測，以確定病毒貯備品的滴度。然后用該病毒貯備物的樣品按前述方法制備工作原液，再按下述方法用這些工作原液感染實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。
C.對gH-HSV和加熱殺死的病毒之保護(hù)作用的比較研究為了估計(jì)宿主對該病毒的免疫學(xué)反應(yīng)，按照下述實(shí)驗(yàn)方案對小鼠進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。
按下述方法比較活gH+病毒制劑和失活之野生物(WT)病毒(SC16病毒株)制劑的保護(hù)效應(yīng)。
用于疫苗接種之失活野生型病毒的制備用低感染復(fù)數(shù)(0.01pfu/細(xì)胞)的Vero細(xì)胞培養(yǎng)1型HSV(SC16病毒株)。3天后收獲病毒，并用Dounce勻漿法回收胞漿內(nèi)病毒。以500×g離心15分鐘除去細(xì)胞核，并使用BeckmanSW27轉(zhuǎn)子，在40%蔗糖緩沖物(12K)上離心60分鐘，以從上清液中回收病毒。稀釋堆積成帶的病毒，經(jīng)蔗糖梯度離心(Killington and Powell，1985，引文同上)沉淀并純化。從梯度中收獲病毒帶，并離心回收病毒。將病毒重新懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，在幼小倉鼠(BHK)細(xì)胞上以噬斑滴定檢測傳染力，并用電子顯微鏡進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)。制劑的顆粒傳染力比例為110顆粒/pfu。在PBS中將病毒稀釋到2.5×1010pfu/ml，于20℃用β-丙內(nèi)酯處理60分鐘使病毒失活。然后分成若干等份置-70℃下保存。
用于疫苗接種之活gH-病毒的制備基本上按上述制備野生型病毒的方法制備，不同的是病毒生長在含有并表達(dá)1型HSVgH基因的gH+互補(bǔ)細(xì)胞系中，并且不經(jīng)β-丙內(nèi)酯處理滅活。該制劑的顆粒傳染力比例為150∶1。將其濃度調(diào)到2.5×1010gfu/ml，分成若干等份加在PBS中于-70℃下保存。
疫苗接種程序通過微滴施用并在動(dòng)物右耳上劃痕，用加于2ul磷酸鹽緩沖鹽水中的各種不同劑量的失活WT病毒或活gH-病毒接種下列各組4周齡雌性balb/c小鼠(購自Tucks U.K.Ltd)A組對照-無病毒B組 5×104pfu病毒疫苗C組 5×105pfu病毒疫苗D組 5×106pfu病毒疫苗E組 5×107pfu病毒疫苗14天后，用2×106pfuHSV-1病毒株SC16(野生型病毒)在左耳上作相似接種以攻擊所有小鼠。5天后殺死小鼠并檢驗(yàn)在左耳和右頸神經(jīng)節(jié)CⅡ、CⅢ、和CⅣ(結(jié)合的)中的病毒傳染力。為進(jìn)行潛伏期研究，于1個(gè)月后殺死其他接種疫苗的和受攻擊的動(dòng)物，并切除CⅡ、CⅢ和CⅣ神經(jīng)節(jié)進(jìn)行潛伏感染檢驗(yàn)。將標(biāo)本置于培養(yǎng)基中保溫5天，制成勻漿并用標(biāo)準(zhǔn)的噬斑檢驗(yàn)法檢查傳染性病毒的存在。下列結(jié)果均以pfu/器官數(shù)表示。
表1接種活gH-病毒后在感染的急性期內(nèi)所存在之攻擊病毒的滴度
＊合并的頸神經(jīng)節(jié)cⅡ、cⅢ和cⅣ
表2接種滅活的WTHSV-1后在感染的急性期內(nèi)存在之攻擊病毒的滴度
＊合并的頸神經(jīng)節(jié)cⅡ、cⅢ和cⅣ
表3接種活gH-HSV-1后作為存在于頸神經(jīng)節(jié)中之潛伏病毒的攻擊病毒滴度
＊合并的頸神經(jīng)節(jié)cⅡ、cⅢ和cⅣ
表4接種滅活的WTHSV-1后頸神經(jīng)節(jié)中潛伏攻擊病毒的滴度
＊合并的頸神經(jīng)節(jié)cⅡ、cⅢ和cⅣ
(p.f.u＝噬斑形成單位;gH-是有g(shù)H基因缺陷的病毒)。
這些結(jié)果顯示了急性感染期內(nèi)耳部和頸神經(jīng)節(jié)中存在的攻擊病毒wtSC16的滴度。因此其中低滴度表明用gH-病毒接種的效果好，而高滴度表明效果差。從這些結(jié)果中可明顯看出，用活gH+HSV病毒進(jìn)行疫苗接種要比用等量滅活WT病毒的效果好得多。為防止攻擊病毒在耳部復(fù)制，所需要的滅活病毒制劑的劑量為5×107pfu，而所需活gH-病毒的劑量要少100-1000倍。用5×105pfu或更多的活gH-病毒作疫苗接種，也能阻斷急性感染期攻擊病毒在頸神經(jīng)節(jié)中的復(fù)制，同時(shí)還顯示對頸神經(jīng)節(jié)中潛伏感染的形成有明顯的保護(hù)作用。
缺少gH基因的HSV作為抗外來抗原免疫的載體將SIVmac142病毒株的gp120基因?qū)雊H-HSV病毒的基因組中可用上述缺失必要基因的病毒作為將外來抗原傳遞給免疫系統(tǒng)的安全載體，且上述的gH-HSV病毒即是一個(gè)這樣的適用載體。可用該病毒表達(dá)任何所需外來抗原，但特別引人關(guān)注的還是表達(dá)人類免疫缺陷病毒(HIV)即愛滋病病毒的主要抗原性蛋白質(zhì)。為此可以一種在重組病毒感染正常細(xì)胞(即非互補(bǔ)細(xì)胞)期間確保其表達(dá)的方式將這些序列插入gH-HSV病毒基因組中。用這樣的病毒感染個(gè)體，可在其重新活化后逐步造成潛伏感染，導(dǎo)致突然產(chǎn)生外來抗原，進(jìn)而刺激針對該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。
因?yàn)槟壳斑€不能直接在人體內(nèi)對此方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，所以作為初始階段的工作，可使用猴愛滋病病毒SIVmac(從獼猴體內(nèi)分離的猴免疫缺陷病毒)在猴體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。為此目的所使用的適當(dāng)SIV基因是編碼作為該病毒主要抗原性靶蛋白質(zhì)之一的gp120蛋白質(zhì)的基因。因此將該基因?qū)雊H-HSV基因組中，并估測以該病毒作為疫苗保護(hù)猴對抗SIV攻擊的效力。
首先將SIVgp120基因克隆到細(xì)胞肥大病毒IE核心啟動(dòng)子(Gompels and Minson，1989，文獻(xiàn)同上)的后面，然后再將含有g(shù)p120基因和上游CMV啟動(dòng)子的DNA暗盒克隆到質(zhì)粒pGH2中(圖2)。將所得質(zhì)粒與從gH-HSV中純化的DNA一起共轉(zhuǎn)染到gH+互補(bǔ)細(xì)胞系中，經(jīng)篩選破壞了β-半乳糖苷酶基因的克隆分離重組病毒，該重組病毒已獲得了gp120基因，并以其取代了存在于gH-HSV病毒中的β-半乳糖苷酶基因。
A.構(gòu)建將SIVgp120編碼序列重組到HSV基因組中的質(zhì)粒整個(gè)程序如圖7中所示，從已克隆SIV基因組的DNA拷貝(Chakrabartietal.Nature328，543(1987)))切掉ScaI限制性酶切片段(相當(dāng)于堿基5240-8721)并克隆到質(zhì)粒pUC118(VieraandMessing，MethodsinEnzymology，153，3，1987)的SacI位點(diǎn)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pSIV1，然后用定點(diǎn)誘變法將其轉(zhuǎn)變成便于操作的單股DNA。使用合成的寡核苷酸5′GAAGAAGGCTATAGCTAATACAT
經(jīng)定點(diǎn)誘變(Brierleyetal，Cell57，537，1989)改變包含SIVenv基因(位于6090-8298間)的該DNA區(qū)域，以在位置6053-6058處引入EcoRV酶的限制性酶切位點(diǎn)。
然后使用合成的寡核苷酸5'CAAGAAATAAACTATAGGTCTTTGTGC在相當(dāng)于env基因序列g(shù)p120和gp40區(qū)域間之裂解位點(diǎn)的SIVenv基因內(nèi)的位置7671-7676處導(dǎo)入第二個(gè)EcoRV位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pSIV2。再用EcoRV消化SIV2，制得相當(dāng)于SIVenv基因之gp120部分的DNA片段(1617堿基對)。
使用下列兩個(gè)合成的寡核苷酸，以PCR技術(shù)由質(zhì)粒pUG-H1(GompelsandMinson，1989，文獻(xiàn)同上)制得GMV直接早期基因啟動(dòng)子的核心區(qū)。
上游引物5' ATC GAATTC CTATAG CCTGGCATTATGCCCAGTACATGEcoRI EcoRV下游引物5'TCAAAGCTT CTATAG CCCGGGGAGCTCTGATTATATAGACCTCCCHindIII EcoRV SmaI
然后用EcoRⅠ和HindⅢ酶切割該反應(yīng)的產(chǎn)物，產(chǎn)生一DNA片段，再將其克隆到用EcoRⅠ和HindⅢ消化的質(zhì)粒pUC118中，得到質(zhì)粒pCMVIE2，該質(zhì)粒在CMV啟動(dòng)子序列的下游處有一個(gè)唯一的SmaI位點(diǎn)。按上述方法制備含有SIVmacgp120編碼序列的EcoRV片段。然后將其克隆到該SmaI位點(diǎn)中，并選擇具有以正確方向插入的SIV編碼區(qū)，從而得以從啟動(dòng)子開始表達(dá)該編碼序列的質(zhì)粒pSIV3。然后用EcoRV消化該質(zhì)粒以產(chǎn)生包含SIV序列和CMV啟動(dòng)子的平頭DNA片段，將該片段克隆到PuvⅡ消化的pGH2中(圖2)，得到pGH-120。
B.構(gòu)建攜帶重組gH-HSV和SIVgp120由按上面所述方法構(gòu)建的gH-HSV病毒中純化DNA，并與純化的pGH-120DNA一起共轉(zhuǎn)染到gH+互補(bǔ)細(xì)胞中。然后在X-gal存在下，使用瓊脂覆蓋層按前述的標(biāo)準(zhǔn)噬斑檢驗(yàn)法將分離自該轉(zhuǎn)染混合物的子代病毒鋪敷在gH+互補(bǔ)細(xì)胞的單層上。由于親代gH-病毒攜帶了位于殘留之gH編碼序列內(nèi)的功能性β-半乳糖苷酶基因，所以當(dāng)存在X-gal時(shí)將形成藍(lán)色的噬斑。然而，由于重組病毒已獲得了SIVgp120編碼序列并以其取代了β-半乳糖苷酶基因，故將產(chǎn)生白色噬斑。經(jīng)挑取瓊脂栓，從這些白色噬斑回收病毒，并通過在gH+互補(bǔ)細(xì)胞系中繁殖這些病毒來制備病毒貯備品。從這些貯備品中制取病毒DNA，并使用衍生于SIV編碼序列的適當(dāng)探針，以Southern印跡法檢查gH基因周圍之正確DNA結(jié)構(gòu)的存在。最后按前述方法制備用于在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行疫苗接種的病毒原液。
可按本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備并使用含有減毒病毒的疫苗。例如，疫苗也可含有一種或多種賦形劑和/或佐劑，可按本領(lǐng)域中已知的技術(shù)確定由疫苗提供的減毒病毒的有效劑量。
權(quán)利要求
1.突變病毒，就產(chǎn)生傳染性病毒所必需的基因來說其基因組是有缺陷的，而且其能夠保護(hù)以其免疫的敏感物種免受相應(yīng)野生型病毒的感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的突變病毒，其對于以其免疫之敏感物種的細(xì)胞是有傳染性的。
3.突變病毒，就產(chǎn)生傳染性病毒所必需的基因來說其基因組是有缺陷的，而且其基因組包括來源于該病毒以外之外源病原體的免疫原性蛋白質(zhì)的遺傳材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的突變病毒，其對于敏感物種的細(xì)胞是有感染性的，從而在被此突變病毒感染的所說的物種之細(xì)胞中表達(dá)了外源免疫原性蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的突變病毒，其中免疫原性蛋白質(zhì)在正常情況下對所說的病原體敏感的感染物種內(nèi)，賦予了對抗所說病原體的免疫力。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的突變病毒，其中病毒能夠隨著定期再活化而在被感染物種中產(chǎn)生潛伏性感染。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)的突變病毒，其中外源蛋白質(zhì)來源于免疫缺陷病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的突變病毒，其中外源蛋白質(zhì)是免疫缺陷病毒蛋白。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的突變病毒，其衍生于單純性皰疹病毒(HSV)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的突變病毒，其中所說的缺陷基因是HSV糖蛋白gH基因。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中之任一項(xiàng)的突變病毒在制備疫苗中的應(yīng)用。
12.包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)之突變病毒的疫苗。
13.制備根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)之突變病毒的方法，該方法包括在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)就所說基因來說為有缺陷的病毒基因組，宿主細(xì)胞也表達(dá)補(bǔ)充該病毒基因的基因，從而得以產(chǎn)生所說的突變病毒。
全文摘要
一種用作疫苗的突變病毒，其中病毒的基因組就產(chǎn)生傳染性病毒的必要基因來說是有缺陷的。一方面該突變病毒能保護(hù)由其免疫的敏感物種免于遭受相應(yīng)野生型病毒的感染；另一方面，該突變病毒可用作免疫原性蛋白質(zhì)的載體，該免疫原性蛋白質(zhì)衍生于病原體并且是由摻入突變病毒中的外來DNA編碼的。可在表達(dá)某補(bǔ)償缺陷之基因的重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生突變病毒。突變病毒較好是對被保護(hù)的宿主有感染性的，但缺陷基因允許在被感染的宿主中至少表達(dá)某些病毒基因，借以引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/245GK1076728SQ9210203
公開日1993年9月29日 申請日期1992年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月24日
發(fā)明者S·C·英格理斯, M·E·G·布爾斯尼爾, A·C·閔森 申請人:免疫有限公司