專利名稱：人類免疫缺陷病毒相關(guān)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人類免疫缺陷病毒(HIV)的p17gag蛋白衍生而來(lái)的肽片段，該病毒是獲得性免疫缺陷綜合征(愛(ài)滋病)或前愛(ài)滋病(pre-AIDS)(也叫做愛(ài)滋病相關(guān)綜合征或ARC)的病原生物體。這些肽片段可直接用作檢測(cè)血液中HIV反轉(zhuǎn)錄病毒的診斷劑，或可直接用作檢測(cè)抗HIV反轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的抗體或激發(fā)識(shí)別HIV的p17gag蛋白或其片段的抗體的診斷劑。本發(fā)明還涉及p17gag蛋白肽的片段或類似物，它們具有其“母本”肽的免疫原性抗原決定簇。進(jìn)一步說(shuō)，本發(fā)明還涉及這些p17肽片段及類似物的應(yīng)用，它們作為一種愛(ài)滋病疫苗的組分能激發(fā)保護(hù)性抗體，本發(fā)明還涉及所得的愛(ài)滋病疫苗的成份。
在過(guò)去的幾年中，人們已進(jìn)行了大量的研究，首先是確定愛(ài)滋病的病因，正確地鑒定出反轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-III，ARV及其它病毒，現(xiàn)在統(tǒng)稱為HIV，為病原生物體后，人們開(kāi)始集中精力詳盡分析基因組成，分子生物學(xué)，感染機(jī)制，生物化學(xué)，檢測(cè)和治療的高敏度方法，治療和治愈。在這些領(lǐng)域已取得很大進(jìn)展，但人們還需做更多的工作以有效地與愛(ài)滋病的傳播作斗爭(zhēng)。其中一個(gè)重要的與高傳染性HIV病毒的傳播作斗爭(zhēng)的方法是發(fā)展診斷血液中是否存在HIV病毒或抗HIV病毒抗體的高敏度性試驗(yàn)。早期檢測(cè)可使治療較容易，以與疾病作斗爭(zhēng)，或減慢HIV感染向嚴(yán)重的或癥狀明顯的愛(ài)滋病發(fā)展的進(jìn)程。通過(guò)準(zhǔn)確的診斷使受感染的病人知道已感染HIV，能促使他們改變或注意其生活方式，以減少傳播病毒的危險(xiǎn)。另外，通過(guò)識(shí)別抗原決定簇而確定的保護(hù)性抗體，能提供發(fā)病和/或診斷愛(ài)滋病或前愛(ài)滋病的更有效機(jī)制。然后對(duì)這類發(fā)病的或得到早期診斷的血清陽(yáng)性個(gè)體施用疫苗，以產(chǎn)生治療血清陽(yáng)性個(gè)體的合適的保護(hù)性抗體。
最近，美國(guó)專利4，520，113Gallo等人描述了一種檢測(cè)愛(ài)滋病及前愛(ài)滋病人血清中抗體的方法，該方法用稱為H9/HTLV-III的細(xì)胞系的溶胞物作為抗原，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、Western Blot技術(shù)基礎(chǔ)上的條狀放射免疫測(cè)定(RIA)，或間接免疫熒光方法。主要免疫活性或特異性是針對(duì)p41(分子量41，000)，p41是組成HIV衣殼抗原的一種蛋白。其它抗原如p65(分子量65，000)，p60(分子量60，000)，p55(分子量55，000)，及p24(分子量24，000)也用在檢測(cè)血清中被抗體識(shí)別。這個(gè)方法沒(méi)有100%的準(zhǔn)確性。
美國(guó)專利4，735，896中，C.Y.Wang和J.G.Wang提供了在體液中檢測(cè)和診斷愛(ài)滋病，ARC及前愛(ài)滋病情況的方法，這一方法使用具有約21個(gè)氨基酸的一段順序的化學(xué)合成肽，該順序?qū)?yīng)于HIV的HTLV-III株的跨膜蛋白p41的一個(gè)片段。
但是，HIV的各種病毒株的衣殼蛋白容易發(fā)生遺傳漂變，即氨基酸順序的改變，這樣，抗一種衣殼蛋白的抗體可能不與只有些微不同的衣殼蛋白的病毒結(jié)合。
在公開(kāi)的同期申請(qǐng)?zhí)?64，599，申請(qǐng)日為1986年5月19日的申請(qǐng)文本中，A.Goldstein和S.Wang(相應(yīng)于在1987年11月25日出版的歐洲專利申請(qǐng)0，246，829)提供了診斷和治療愛(ài)滋病，ARC和前愛(ài)滋病的不同方法，同時(shí)還提供了一種AIDS疫苗，這一方法是在某種程度上基于觀察到的并由其它研究者證實(shí)，組抗原特異性蛋白p17(也被某些研究者稱為p18)包括一個(gè)更高度保守的區(qū)域。與HIV的替換衣殼或表面蛋白不同，p17(gag)蛋白的所有氨基酸順序在至今發(fā)現(xiàn)的HIV所有病毒株中基本上是一樣的。另外，最近的研究發(fā)現(xiàn)抗p17蛋白抗體存在于健康的帶有HIV的個(gè)體中，并且隨著向癥狀明顯的愛(ài)滋病發(fā)展而降低。為形成有效的抗病毒感染細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞免疫，需要在人血清中存在p17抗體。參見(jiàn)如J.M.A.Lange等人“對(duì)外層病毒核心蛋白p17的抗體活性的降低在人類免疫缺陷病毒感染中是比抗p24抗體的降低更早的疾病發(fā)展的血清學(xué)標(biāo)志”，AIDS，Vol.l，No.3，155-159(1987)。在題目中將p17稱為“外層病毒核心蛋白”，是根據(jù)H.Gelderblom及其它人的最近報(bào)告，他們認(rèn)為，與p24內(nèi)層核心蛋白不同，p17蛋白位于或靠近病毒結(jié)構(gòu)的表面(H.Gelderblom等人，“人類免疫缺陷病毒(HIV)的微細(xì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)蛋白的免疫定位”，Virology，Vol.156，171-176(1987)。最近這些有關(guān)p17蛋白位于外表面，以及隨疾病的發(fā)展p17抗體降低的研究，給Goldstein和Wang的發(fā)展以合成肽為基礎(chǔ)的一種愛(ài)滋病疫苗和診斷劑的方法提供了證據(jù)，該合成肽由HIV的p17gag蛋白的92到109位的共18個(gè)氨基酸順序組成。更確切地說(shuō)，30-mer[Ser-86]肽，命名為HGP-30，在HIV-1病毒株SF-2的85及1141位點(diǎn)之間，具有式(Ⅰ)的氨基酸順序Tyr-Ser-Val-His-Gln-Arg-Ile-Asp-Val-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-Gly-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala (Ⅰ)顯示出能激發(fā)抗體，該類抗體能在體外實(shí)驗(yàn)中和各種不同的HIV株，即它是組特異性，而不是株特異性的。實(shí)際上，在對(duì)兔、猴子和猿所做的成功的安全性和免疫原性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，已開(kāi)始進(jìn)行臨床試驗(yàn)，以測(cè)試在HGP-30基礎(chǔ)上建立的疫苗的體內(nèi)安全性和有效性。
在本申請(qǐng)文本中，氨基酸號(hào)碼順序同先前申請(qǐng)864，599中的號(hào)碼順序不同，先前HGP-30對(duì)應(yīng)于氨基酸順序86及115位點(diǎn)之間，這個(gè)不同是根據(jù)遺傳學(xué)家(參見(jiàn)，如人類反轉(zhuǎn)錄病毒和愛(ài)滋病，1987Ed.，G.Myers等人，由理論生物學(xué)和生物物理學(xué)集團(tuán)出版，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mex ico 87545)蛋白化學(xué)家所采用的不同的編號(hào)系統(tǒng)，特別是N端的1號(hào)位編號(hào)不同。遺傳學(xué)家把HIV1的p17gag肽中的蛋氨酸(Met)定為1號(hào)位，而本發(fā)明中，第一號(hào)位點(diǎn)是N端十四烷?；拾彼?Gly)。
國(guó)際PCT申請(qǐng)WO86/01827，巴斯德學(xué)院及國(guó)家科學(xué)研究中心的Alizon等人，于1986年3月27日出版，主要針對(duì)這些DNA順序或其片段，它們能與LAV病毒的基因組RNA雜交，并且包括為每個(gè)完整衣殼和核心蛋白編碼的DNA片段。雖然沒(méi)給出特定實(shí)施例，但它建議這些DNA的使用包括，用于診斷目的，及生產(chǎn)疫苗的病毒抗原的表達(dá)。
歐洲專利申請(qǐng)0，230，222AL，出版于1987年7月29日，針對(duì)與HTLV-III的gag蛋白產(chǎn)物免疫學(xué)上相當(dāng)?shù)亩嚯模哂腥鐖D8或

圖16給出的氨基酸順序，或者它是其14kd，16kd或24kd蛋白水解多肽片段，或者是通過(guò)氨基酸置換形成的與這些多肽相關(guān)的多肽，氨基酸置換是通過(guò)在產(chǎn)生多肽的重組細(xì)胞中的突變而發(fā)生的。這個(gè)公開(kāi)物還涉及基因及重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽的方法，測(cè)試人血液的方法，疫苗和試劑盒。實(shí)施例表明了gag蛋白片段表達(dá)質(zhì)粒的生產(chǎn)，及含gag表達(dá)質(zhì)粒的酵母培養(yǎng)物的生長(zhǎng)及純化，聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western Blot分析，細(xì)胞標(biāo)記，及對(duì)愛(ài)滋病的診斷試驗(yàn)的概述。
英國(guó)專利申請(qǐng)G.B.2，181，435A，出版于1987年4月23日、Hu等人(Oncogen)，包括黑猩猩上的攻擊感染的數(shù)據(jù)，但只與衣殼蛋白產(chǎn)物有關(guān)。然而，它暗示由重組牛痘病毒產(chǎn)生的gag相關(guān)蛋白是含有真正核心蛋白的主要抗原決定簇的免疫反應(yīng)性蛋白。但是，沒(méi)有對(duì)主要抗原決定簇下定義。在第12頁(yè)34-44行，它提出任何限制性內(nèi)切酶都可用來(lái)產(chǎn)生含衣殼或gag順序的片段，只要這些酶不破壞蛋白基因產(chǎn)物的抗原性，抗原性位點(diǎn)包括約7到14個(gè)氨基酸。至于一個(gè)疫苗的配制，它提示疫苗包括只含衣殼相關(guān)抗原決定簇或與其它抗原決定簇如gag相關(guān)抗原決定簇一起配制而成。參考了早期研究結(jié)果，即愛(ài)滋病人在早期無(wú)癥狀階段產(chǎn)生抗衣殼和核心蛋白的抗體，但隨著疾病的發(fā)展及癥狀的出現(xiàn)，抗gag抗體減少。因此，建議用在HTLV-III的LAV相關(guān)疾病的免疫預(yù)防或免疫治療中的疫苗制劑包括gag相關(guān)抗原決定簇。不過(guò)，沒(méi)有明確指出gag蛋白，其本身，或它們的抗體將提供有用的疫苗。各種部分與桿狀病毒gag重組子，牛痘病毒gag重組子，及gag相關(guān)蛋白組織培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。它概括說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物對(duì)抗p25和p18的單克隆抗體是有免疫反應(yīng)性的。
上述三個(gè)公開(kāi)專利中沒(méi)有一個(gè)鑒定任何特異性p17(或p15)肽或其肽片段。
最近，幾個(gè)獨(dú)立的研究組已能生產(chǎn)出抗HIVp17的中和單克隆抗體，而抗p24，p41和p17不同抗原決定簇的單克隆抗體無(wú)效。在各種中和試驗(yàn)中有效的抗p17的單克隆抗體與HGP-30結(jié)合。相反，中和抗衣殼抗體不與HGP-30結(jié)合。參見(jiàn)如Papsidero，L.D.等人“人體免疫缺陷病毒1型-與p17核心蛋白反應(yīng)的中和單克隆抗體的定性和抗原決定簇圖譜”，J.Virology，Vol.63，No.1，267-272(1989);Yoshihara，P.等人“用抗核心和抗衣殼蛋白的單克隆抗體進(jìn)行HIV中和作用研究”，IV.Int.Conf.on AIDS，Abstract ＃3071。以下表1中列出了代表性數(shù)據(jù)。
表Ⅰ抗HIVp17的中和單無(wú)隆抗體識(shí)別HGP-30
來(lái)源 中和作用 Western Blot HIV HGP-30Sarin + p17/p55 1600 1600Yoshihara + p17/p55 1600 400Ruscetti + p17/p55 200 800Ruscetti + p17/p55 100 200Ruscetti + 9p 160 800 0Yoshihara - p24/p55 1600 0Yoshihara - 0 0 0來(lái)源表示對(duì)抗體及中和作用數(shù)據(jù)負(fù)責(zé)的科學(xué)家。效價(jià)表示稀釋倍數(shù)，它至少是ELISA中用全HIV提取物或合成HGP-30肽的對(duì)照值的兩倍。
不過(guò)，只有很少的研究描述大量p17的純化，而對(duì)確定自然感染情況下天然p17上的免疫原性抗原決定簇方面的研究則更少。一些“未發(fā)表”的研究表明全p17缺乏中和活性，但是，免疫顯性但非中和抗原決定簇的存在可能會(huì)使這些觀點(diǎn)不能立足。其它一些研究也會(huì)因?yàn)椴捎眠^(guò)小的抗原決定簇，如長(zhǎng)度上少于10個(gè)氨基酸，可能導(dǎo)致不合適的抗原決定簇折疊及遞呈而無(wú)效。
但是可能不是所有的p17上的抗原決定簇會(huì)產(chǎn)生中和抗體，與所得數(shù)據(jù)一致的結(jié)論表明不是所有抗p17單克隆抗體在體外對(duì)中和是有效的(cf.Yoshihara等人，ibid)。然而，這樣的抗原決定簇將產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這些抗體將通過(guò)不是抑制體外病毒感染的機(jī)制起作用。這些機(jī)制可能包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種肽，它們呈現(xiàn)天然p17gag HIV蛋白的抗原決定簇，并與愛(ài)滋病、前愛(ài)滋病及ARC的病人的抗體有免疫反應(yīng)活性。這些肽根據(jù)定義將是候選的診斷劑和疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供對(duì)準(zhǔn)確測(cè)量p17抗體的存在和水平有效的診斷劑，該抗體能在暴露于HIV的病人的體液中識(shí)別特異性的p17抗原決定簇。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供診斷方法和試劑盒，它能從血清學(xué)上確定含有由肽所定義的p17抗原決定簇的愛(ài)滋病病毒顆粒的存在與否。
本發(fā)明的另一目的是通過(guò)將任何新的肽之間相互連結(jié)或與同一個(gè)免疫原性載體材料連結(jié)而提供新的免疫原，并將這些免疫原用于激發(fā)抗p17特異性抗原的抗體，然后，將這些抗體用于免疫檢測(cè)中，測(cè)定培養(yǎng)液或體液中p17或其片段。
本發(fā)明的另一目的是提供能激發(fā)抗體的免疫原性材料，這些抗體能有效地中和HIV，因此能用作愛(ài)滋病疫苗中活性成分。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供特異性肽，它仍能去除血清中有害或無(wú)用的抗體，或能富集血清中有用的抗體。在免疫預(yù)防中用經(jīng)這種處理的血清以保護(hù)感染個(gè)體，他們?cè)谝呙缃臃N時(shí)不能激發(fā)合適的保護(hù)性抗體。
圖1是說(shuō)明HIV的p17gag蛋白的假設(shè)定向的圖解。
圖2是HIV-p17(HB10株)的初級(jí)氨基酸順序及HIV-2和SIVp17蛋白的初級(jí)氨基酸順序圖表。
圖3是描繪p17中的肽的初級(jí)氨基酸順序的另一張圖表。
圖4是標(biāo)繪用天然HIVp17免疫的兔中，HIVp17肽的抗體效價(jià)的圖。
圖5是個(gè)條線圖，說(shuō)明4個(gè)暴露于活HIV的恒河猴血清中抗本發(fā)明的p17肽片段的抗體的ELISA分析結(jié)果的圖。
根據(jù)本發(fā)明，p17gag蛋白可被分成5個(gè)主要部分或片段，每一個(gè)都具有潛在的重要免疫原性抗原決定簇，這五個(gè)肽從N末端開(kāi)始命名為肽A(1-32)，肽B(32-50)，肽C(51-84)，肽D(85-114)，及肽E(114-131);其中肽D是HGP-30，它是在同期專利申請(qǐng)第864，599號(hào)中公開(kāi)的30-mer肽，這整個(gè)出版物在此結(jié)合作為參考。每個(gè)肽都具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，但都有能被對(duì)HIVp17血清陽(yáng)性的各個(gè)個(gè)體中的抗體識(shí)別的抗原決定簇。因此，這些肽中的每一個(gè)均可提供診斷個(gè)體體液中HIVp17抗體的存在的有用試劑，及對(duì)暴露于HIV的個(gè)體測(cè)量血液中或其它體液中抗p17的抗體以測(cè)定感染的發(fā)展的試劑。
更特定地說(shuō)，本發(fā)明以上及其它的目的將通過(guò)以下詳細(xì)的敘述和較佳的實(shí)施例以及附圖變得更清楚，這些目的是這樣達(dá)到的，從其一方面看，是通過(guò)一個(gè)或更多合成肽，這些肽具有人體免疫缺陷病毒，HIV，尤其是HIV-1的p17gag蛋白共同的免疫原性抗原決定簇，所述肽是從具有對(duì)應(yīng)于下式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)和(Ⅴ)的部分或全部氨基酸順序的肽中選出的，包括其類似物，類似物順序中一個(gè)或更多的氨基酸可能被置換，缺失或插入，只要保存了對(duì)抗從順序的三維構(gòu)型衍生得的HIVp17的抗體的免疫原性反應(yīng)性，也包括肽或其類似物的結(jié)合物肽A(位點(diǎn)1-32)Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys-His (Ⅱ)肽B(位點(diǎn)33-50)Ile-Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu (Ⅲ)肽C(位點(diǎn)51-84)Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-
Thr-Leu (Ⅳ)肽E(位點(diǎn)114-131)Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr(Ⅴ)其中具式(Ⅱ)氨基酸順序的肽含有約26到40個(gè)氨基酸，具式(Ⅲ)氨基酸順序的肽含有約14至27個(gè)氨基酸，具式(Ⅳ)氨基酸順序的肽含有約28至42個(gè)氨基酸，具式(Ⅴ)氨基酸順序的肽含有約12到25個(gè)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種組合物，它是具有對(duì)抗HIVp17抗體有特異性免疫反應(yīng)性的一種肽的混合物，這種肽是從含有約10至36個(gè)氨基酸的肽的組中選出的，這個(gè)順序?qū)?yīng)于(Ⅰ′)的部分或全部順序(包括肽D)(位點(diǎn)91-108)Ile-X1-X2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-X3-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn (Ⅰ′)其中X1是Glu或Asp，X2是Ile或Val，X3是Asp或Glu，及其結(jié)合物和類似物;
及至少是式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)和(Ⅴ)肽中的一個(gè)。
在本發(fā)明的又一方面，提供了具有10到14個(gè)氨基酸包括下式(Ⅰ″)順序的肽Ile-X1-X2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu (Ⅰ″)其中X1是Glu或Asp，X2是Ile或Val，這個(gè)肽對(duì)抗HIVp17抗體有特異性免疫反應(yīng)性。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，前面所述的任何一種肽與免疫原性載體材料共價(jià)結(jié)合以形成一個(gè)免疫原性抗原。較好的是，當(dāng)用于一個(gè)診斷試劑盒時(shí)，通過(guò)一個(gè)針對(duì)抗原的抗體對(duì)肽進(jìn)行標(biāo)記用于血清學(xué)檢測(cè)抗原。
本發(fā)明從其另一方面來(lái)說(shuō)，還提供了用于預(yù)防或治療獲得性免疫缺陷綜合征(愛(ài)滋病)或愛(ài)滋病相關(guān)綜合征(ARC)的疫苗，它包括治療上有效量的一個(gè)或多個(gè)上述式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)的肽，或其與式(Ⅰ′)肽的混合物。
本發(fā)明還提供了減輕與愛(ài)滋病有關(guān)的病毒血癥的方法，包括給暴露于愛(ài)滋病毒的、有得愛(ài)滋病危險(xiǎn)的或受愛(ài)滋病感染的個(gè)體服用治療有效量的，至少一種式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)的抗原性肽或其與式(Ⅰ′)肽的混合物。
本發(fā)明的又一方面是一種檢測(cè)病人體液中愛(ài)滋病毒的方法。根據(jù)此方法，體液的一個(gè)或多個(gè)要檢測(cè)的樣品與一個(gè)或更多的式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)的肽或其與式(Ⅰ′)肽的混合物接觸，然后通過(guò)如放射免疫測(cè)定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，或間接免疫熒光法測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物的形成。當(dāng)使用肽混合物時(shí)，它們可用于單獨(dú)的一個(gè)測(cè)定中，在這種情況下測(cè)定混合物中每個(gè)肽的抗原-抗體復(fù)合物的形成，或者它們可用在分開(kāi)的測(cè)定中用于體液的不同樣品。在后一種情況下，測(cè)定每個(gè)樣品中抗原-抗體復(fù)合物的形成。
作為實(shí)現(xiàn)檢測(cè)愛(ài)滋病病毒的上述診斷方法的一種手段，本發(fā)明還提供了檢測(cè)識(shí)別人體液中HIVp17蛋白抗原決定簇抗體的診斷試劑盒。此試劑盒包括含多井平板的單元附件，多井平板用本發(fā)明的一個(gè)或更多的p17肽片段或類似物包被，及酶測(cè)定的ELISA材料，包括正常動(dòng)物抗血清和酶，標(biāo)記抗-抗體血清及顏色變化指示劑。每個(gè)平板上的井可被不同的肽所包被。在另一個(gè)實(shí)施例中，多井平板上的井被二個(gè)或二個(gè)以上肽的混合物所包被。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種形成抗體富集血清，用于治療或預(yù)防愛(ài)滋病的方法。根據(jù)這個(gè)方法，從一個(gè)個(gè)體處取得體液，如血的一個(gè)樣本，該個(gè)體經(jīng)檢測(cè)對(duì)HIV抗-p17抗體呈陽(yáng)性，但沒(méi)有表現(xiàn)出愛(ài)滋病或ARC的任何癥狀，測(cè)定對(duì)一個(gè)或多個(gè)式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)的免疫顯性抗原決定簇的抗體的存在。然后，體液的一個(gè)或多個(gè)樣本進(jìn)行親和層析法，去除不對(duì)愛(ài)滋病的發(fā)展起保護(hù)作用的抗體，和/或富集血清中對(duì)愛(ài)滋病的發(fā)展起保護(hù)作用的抗體。
最近的發(fā)現(xiàn)得出這個(gè)結(jié)論，即HIVp17位于HIV病毒粒子表面的附近，而不是如p24gag蛋白那樣位于內(nèi)部核心處，除此以外還發(fā)現(xiàn)p17gag蛋白在其N(xiāo)端是十四烷?；?。另外，對(duì)位于離p17C端更近的肽D(稱為HGP-30)的分析表明，此肽含有一個(gè)免疫顯性的B細(xì)胞抗原決定簇，它能誘導(dǎo)中和抗體，及通過(guò)ADCC型機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞毒作用。另一方面，肽C(也稱作HGP-34)在氨基酸51-84位置，具有一段與T細(xì)胞抗原決定簇一致的氨基酸順序，因此能激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。對(duì)p17肽B(也稱為HGP-18)靠近N端33-50位點(diǎn)的中間區(qū)的分析表明，如果有合適的電荷中和膜蛋白存在時(shí)，此肽會(huì)具有合適的親水性和疏水性的平衡，以組成跨膜區(qū)域肽。
根據(jù)以上觀察，本發(fā)明的發(fā)明人假設(shè)HIVp17蛋白延伸通過(guò)整個(gè)HIV病毒粒子或分子的脂質(zhì)雙層膜，十四烷?；腘端區(qū)域肽A(HGP-32)位于膜的內(nèi)表面上，并延伸到內(nèi)表面下，再?gòu)澔啬?。鄰近的區(qū)域肽B(HGP-18)延伸跨過(guò)及通過(guò)膜，即是跨膜區(qū)域肽，在膜的外表面，區(qū)域肽C(HGP-34)，肽D(HGP-30)和肽E(也稱作Ala-HGP-17)(在C端)形成一個(gè)環(huán)。p17的假設(shè)定向在圖1中已圖解說(shuō)明。但需明白，申請(qǐng)人并不受此假設(shè)定向的束縛，也可能有與觀察到的數(shù)據(jù)和氨基酸順序的一致的其它定向。如p17分子可能整個(gè)位于細(xì)胞膜內(nèi)，或整個(gè)位于細(xì)胞膜外，或者p17分子的一部分是內(nèi)部的，而剩下的p17分子是外部的。
p17的氨基酸順序(HIVBH10株)及HIV-2p17蛋白及猿免疫缺陷病毒(SIV)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)在圖2中表示。在圖2中，“+”號(hào)表示所指的蛋白中相應(yīng)位點(diǎn)上是同樣的氨基酸，在邊上標(biāo)明p17HIV氨基酸順序的各種肽片段的位置，同時(shí)，為方便起見(jiàn)，肽A(HGP-32)的氨基酸下劃了一條實(shí)線;肽B(HGP-18)的氨基酸下沒(méi)有劃線;肽C(HGP-34)的氨基酸下劃有一條虛線;肽D(HGP-30)下劃了二條實(shí)線;肽E(Ala-HGP-17)下劃有二條虛線。從圖2中可知，在每個(gè)HIV-1，HIV-2及SIV中，最保守的區(qū)域在十四烷酰基化N端附近，越往C端，同源性越少。但是，在p17肽D(HGP-30)氨基酸91-100位點(diǎn)的區(qū)域中，HIV-2和SIV均有一個(gè)高度保守的區(qū)域(約40%同源性)，重要的是，正是在這個(gè)區(qū)域中存在著免疫顯性抗原決定簇，及異源抗血清中抗HGP-30的中和抗體所針對(duì)的主要位點(diǎn)，如在兔子上進(jìn)行了研究所確定的。
圖3表示了HIV-1 HB10株的p17的初始氨基酸順序，包括依次被命名為HGP-32、HGP-18、HGP-34、HGP-30及Ala-HGP-17的肽A、B、C、D及E，命名中的數(shù)字表示特定p17片段的長(zhǎng)度。為方便起見(jiàn)，在如下所述的固相肽合成中，對(duì)天然發(fā)生的p17氨基酸在某些片段做了些變動(dòng)以方便合成，但這些天然p17片段的類似物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)然，可以認(rèn)為對(duì)整個(gè)p17的5條肽的命名是有點(diǎn)任意的，但與圖1中所示的假設(shè)定向是一致。通常，在選擇每條肽的N端和C端氨基酸時(shí)，是出于合成方便考慮，而不是生物活性，只要保留了免疫顯性抗原決定簇?？稍诎被犴樞蜷L(zhǎng)度上做變動(dòng)，也可以作氨基酸置換、插入或缺失。這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
為證明根據(jù)上述討論的如圖1、2和3中所示的模型的組成整個(gè)HIVp17的5個(gè)鄰近區(qū)域的臨床重要性，如以下實(shí)例中所述通過(guò)固相肽合成制備肽A、B、C和E及肽D′(HGP-(18)2-HIV-1SF-2株的91-108位Ile-Asp-Val-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-Glu-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn)類似物的小樣品。運(yùn)用這些樣品，通過(guò)將兔子暴露于合成肽而首先測(cè)定能識(shí)別這些合成肽的抗體的存在，該兔子先用由高壓液相包譜法(HPLC)純化的天然(完整)HIVp17免疫。圖4中列出了結(jié)果。這個(gè)兔子對(duì)肽C(HGP-34)抗體的效價(jià)最高。基本上沒(méi)有肽B(51-Tyr)(HGP-18)的抗體，對(duì)肽A(33-Lys)(HGP-32)只有很低的效價(jià)。
在另一個(gè)試驗(yàn)中，對(duì)給予活HIV-1的4只恒河猴的血清也評(píng)估了對(duì)肽A、B、C、D及E的抗體，在圖5中列出了結(jié)果。每條肽至少在一個(gè)受攻擊感染猴中有強(qiáng)抗體應(yīng)答。也評(píng)估了自然暴露于HIV病毒及對(duì)p17血清陽(yáng)性的個(gè)體的血清。結(jié)果在下面表Ⅱ中表示。
如在處理的猴子中的情況一樣再進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)，在每種情況下，用ELISA分析測(cè)定，存在著與至少一種合成p17肽類似物具有免疫反應(yīng)性的抗體。表Ⅱ顯示了HIVp17血清陽(yáng)性個(gè)體的ELISA分析的結(jié)果。
表Ⅱ在HIVp17血清陽(yáng)性個(gè)體中存在抗完整、天然p17和p17肽類似物的抗體
注意＊在標(biāo)號(hào)中的數(shù)字對(duì)應(yīng)于所指肽中表示的氨基酸的位點(diǎn)。用ELISA和Western Blot技術(shù)測(cè)定HIVp17。
++＝大于均數(shù)的3 SD+＝大于均數(shù)的2 SD由于至少在3個(gè)血清陽(yáng)性個(gè)體中存在抗所有5個(gè)肽的抗體，這些肽中的每一個(gè)，除了可用作測(cè)定暴露于HIV的診斷劑外，也具有用作亞單位疫苗的潛力。
本發(fā)明的肽由通式(Ⅱ)-(Ⅴ)表示位點(diǎn)1-32Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-GluLys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Leu-Lys-His (Ⅱ)位點(diǎn)33-50Ile-Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-
Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu(Ⅲ)位點(diǎn)51-84Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-Thr-Leu(Ⅳ)位點(diǎn)114-131Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr(Ⅴ)包括其類似物，其中順序中一個(gè)或更多的氨基酸可被置換，缺失或插入，只要保存了對(duì)抗體的免疫原性，該抗體是抗從順序的3維構(gòu)型衍生而來(lái)的HIVp17。另外，根據(jù)習(xí)慣，肽式左端從N端開(kāi)始，到右邊以C端結(jié)束。
雖然并不想限制，但期望能互相變換，同時(shí)又能維持免疫反應(yīng)性的“保守”置換類型包括，如非極性脂肪族中性氨基酸之間的置換，包括甘氨酸(Gly，G)，丙氨酸(Ala，A)，脯氨酸(Pro，P)，纈氨酸(Val，V)，異亮氨酸(Ile，I)及亮氨酸(Leu，L);極性脂肪族中性氨基酸之間的置換，包括絲氨酸(Ser，S)，蘇氨酸(Thr，T)，甲硫氨酸(Met，M)，半胱氨酸(Cys，C)，天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酸胺(Gln，G);在帶電荷的酸性氨基酸之間的置換，包括天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E);在帶電荷的堿性氨基酸之間的置換，包括亮氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R);及芳香族氨基酸之間的置換，包括苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))，組氨酸(His，H)，色氨酸(Trp，W)和酪氨酸(Tyr，Y)，其中括號(hào)中的三字符和單字母代表傳統(tǒng)的各個(gè)氨基酸的3字和單一字母編碼。
更廣泛地說(shuō)，在前述的組中常能發(fā)現(xiàn)可置換的或相互交換的氨基酸，尤其是如下述組中找到Asp，Glu和His;Asn，Gln，Lys，和Arg;Asp，Glu，Lys，和Arg;Phe，His，Tyr，Trp，Asp，Glu，Ser，和Thr;Lys，Ile，Val，Leu，Pro，和Arg;Ser，Thr，Ala，Pro和Val;及Gly，Ala，Pro，Asp，和Glu。另外，在脂肪族中性非極性氨基酸中，較佳的置換包括Glu和Ala，及Val，Ile和Leu。Ser和Thr也是可互相交換氨基酸的較佳組。
當(dāng)在式(Ⅱ)到(Ⅴ)的肽或肽D(式Ⅰ)中有氨基酸缺失時(shí)，較佳的缺失發(fā)生在N端和/或C端的連結(jié)氨基酸中，較佳的是對(duì)稱地或接近對(duì)稱地在每個(gè)N端和C端。當(dāng)它們有內(nèi)缺失時(shí)，較佳地是限制在5個(gè)以內(nèi)，尤其是小于3個(gè)，如1或2個(gè)，當(dāng)有多個(gè)內(nèi)缺失時(shí)，它們可發(fā)生在鄰近氨基酸，或非鄰近氨基酸上。
與此相似，當(dāng)在上述肽中有氨基酸插入時(shí)，優(yōu)先的插入發(fā)生在N和/或C端，較佳的是對(duì)稱地或近似對(duì)稱地在每個(gè)N端和C端。這些插入可同整個(gè)p17鄰近肽片段的氨基酸相同或不同。不管怎樣，內(nèi)部插入通常也是可以的，但如發(fā)生時(shí)，較佳地限制在5個(gè)以內(nèi)，尤其是3個(gè)或更少，如1或2個(gè)，當(dāng)插入多于1個(gè)內(nèi)部氨基酸時(shí)，它仍可以緊接著插入(即在鄰近的氨基酸之間)或非緊接地插入(即在不鄰近的氨基酸之間)。
在N和/或C端的氨基酸插入或置換或缺失常常是很有用的，因?yàn)樗鼈兛捎懈鞣N功能，如作為連接基團(tuán)，一個(gè)修飾基團(tuán)，一個(gè)鑒別基團(tuán)(如便于放射免疫測(cè)定等)，等等。這種置換、插入或缺失簡(jiǎn)化了該肽的合成，如用以下所述的液相或固相肽合成法。
作為置換和插入的特定實(shí)例，在式(Ⅱ)肽A(HGP-32)式(Ⅲ)肽B(HGP-18)及式(Ⅳ)肽C(HGP-34)中做以下修飾以形成在上述試驗(yàn)過(guò)程中所用的類似物肽AC端插入Lys肽BC端插入Tyr肽C56位Cys用Ser置換，及C端插入Lys在肽D(HGP-30)Cys-86用Ser置換，即式(Ⅰ)。
本發(fā)明的肽可通過(guò)傳統(tǒng)的合成肽的方法制備，更特定地說(shuō)，用Schroder和Lubke所描述的方法，The peptides Vol.1(1986)由Academic Press出版，紐約，美國(guó)，或Izumiya等人描述的方法，Synthesis of Peptides(1975)，由Maruzen Publishing Co.Ltd出版，如疊氮化物方法、氯化物方法、酸酐方法、混合酐方法、CCC方法、活性酯方法(對(duì)硝基苯基方法、N-羥基琥珀酰亞胺酯方法、氰基甲基酯方法等)，用Woodward試劑K的方法，碳化二咪唑方法、氧化還原方法、DCC/添加劑(HONB，HOBt，HOSu)方法等。對(duì)上述方法均可用固相和液相合成。
本發(fā)明的肽可根據(jù)以上合成一般多肽的方法制備，一般可以通過(guò)稱作分段的方法將氨基酸按順序一個(gè)一個(gè)縮合到端部氨基酸上，或者將分成幾組的片段偶聯(lián)到端部氨基酸上。更具體地說(shuō)，如在最好采用固相合成法的情況下，C端氨基酸通過(guò)它的羰基與不溶載體連結(jié)。這個(gè)不溶載體并沒(méi)有特別的限制，只要它具有與反應(yīng)性羰基結(jié)合的能力，及對(duì)分段縮合-去保護(hù)反應(yīng)的試劑和反應(yīng)條件不敏感。這些不溶性載體的例子包括鹵代甲基樹(shù)脂，如氯代甲基樹(shù)脂，特別是氯代甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，溴代甲基樹(shù)脂等，羥甲基樹(shù)脂，苯酚樹(shù)脂，叔-丁氧基-羰基酰肼化樹(shù)脂，交聯(lián)聚-N-烯丙酰-吡啶樹(shù)脂等。如果在肽的C端氨基酸具有一個(gè)酰胺功能基團(tuán)的情況下，如天冬酰胺(Asn)
，用二苯甲基胺樹(shù)脂支持物較方便，這樣，酰胺功能基團(tuán)可直接在樹(shù)脂支持物上生成。根據(jù)特佳的實(shí)施例，產(chǎn)生式(Ⅰ)的肽和C端氨基酸包括一酰胺功能基團(tuán)的其它的肽的固相合成法，是在甲基二苯甲基胺樹(shù)脂支持物上進(jìn)行的，如同期Su-SunWang申請(qǐng)849，835，申請(qǐng)日為1986年4月8日中的具體描述，這兒全部結(jié)合作為參考。
去除氨基保護(hù)性基團(tuán)后，一個(gè)氨基受到保護(hù)的氨基酸根據(jù)如通式(Ⅰ)至(Ⅴ)所示的所需氨基酸的順序結(jié)合進(jìn)順序中，通過(guò)其反應(yīng)性氨基與反應(yīng)性羧基縮合，按順序一步步合成。在合成整個(gè)順序后，從不溶性載體上分離肽，產(chǎn)生蛋白，采用如HF、HBr，或其它切割劑。
在以上和以下的描述中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)習(xí)慣命名法，縮寫(xiě)具有以下的含義Boc，叔丁氧基羰基，Bzl，芐基;DCC二環(huán)己基碳化二亞胺;Z，芐氧基羰基;TFA，三氟乙酸，及Cl Z∶2-氯代芐氧基羰基。
以上描述了特異性保護(hù)基團(tuán)，而采用相應(yīng)的傳統(tǒng)保護(hù)性基團(tuán)也在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)。操作者可容易地認(rèn)識(shí)到不管合成什么特定的肽，最好選擇某個(gè)一般的條件，例如已經(jīng)知道的肽合成中所用的每個(gè)氨基酸的α-氨基在偶聯(lián)反應(yīng)中必須受到保護(hù)，以防止涉及到反應(yīng)性α-氨基功能的副反應(yīng)。類似地，對(duì)含有反應(yīng)性側(cè)鏈功能基團(tuán)(如巰基，ε-氨基，羥基，羧基)的氨基酸來(lái)說(shuō)，在含有側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸開(kāi)始偶聯(lián)及隨后的氨基酸的偶聯(lián)中，這些功能性基團(tuán)必須得到保護(hù)。合適的保護(hù)基團(tuán)對(duì)本領(lǐng)域的人來(lái)說(shuō)是已知的(參見(jiàn)如“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)性基團(tuán)”，M.Mc Omie，Editor，Plenum Press，N.Y.，1973)。
在選擇特定的保護(hù)基團(tuán)時(shí)，必須注意到以下情況一種α-氨基保護(hù)性基團(tuán)必須(1)穩(wěn)定且使α-氨基在偶聯(lián)反應(yīng)的條件下呈惰性，及(2)在發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)后容易被去除，且同時(shí)不去除側(cè)鏈的保護(hù)性基團(tuán)或改變肽片段的結(jié)構(gòu)。一種側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須(1)穩(wěn)定且使側(cè)鏈功能性基團(tuán)在發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的條件下呈惰性，(2)在去除α-氨基保護(hù)性基團(tuán)的條件下穩(wěn)定，及(3)在所需氨基酸順序合成之后可被容易地去除，而不改變肽鏈的結(jié)構(gòu)，或使其含有的手性中心外消旋。合適的α-氨基功能基團(tuán)的保護(hù)基為叔丁氧羰基(BOC)，芐氧羰基(Z)，二苯基異丙基，叔戊基氧基羰基，異冰片基氧基羰基，1，1-二甲基-2，5-二甲氧芐氧基羰基，0-硝基苯基亞磺?；?-氰基-叔丁氧基羰基，9-芴基甲氧基羰基及其類似物，尤其是叔丁氧基羰基(BOC)。
作為羧基保護(hù)基團(tuán)有能形成酯的基團(tuán)，如形成烷基酯(如甲基，乙基，丙基，丁基，叔丁基等的酯)，芐基酯，對(duì)硝基芐基酯，對(duì)甲氧基芐基酯，對(duì)氯芐基酯，二苯甲基酯等，和能形成酰肼的基團(tuán)得到芐酯基酰肼，叔丁氧羰基酰肼，三苯甲基酰肼等。
作為保護(hù)精氨酸的胍基的基團(tuán)，可以是硝基，甲苯磺?；?Tos)，對(duì)甲氧基苯磺酰基，芐酯基，異冰片基氧基羰基，剛玉基氧基羰基(admantyloxycarbonyl)等。也可以與酸形成鹽的形式保護(hù)胍基(如苯磺酸，甲苯磺酸，鹽酸，硫酸等)。
蘇氨酸的羥基可通過(guò)如已知的酯化或醚化作用保護(hù)。對(duì)所述酯化作用合適的基團(tuán)，可以是低級(jí)鏈烷?；?如乙?；?，芳酰基(如苯甲?；?，及從碳酸衍生的基團(tuán)，如芐氧基羰基，乙氧基羰基等。作為合適的醚化基團(tuán)，可以是芐基，四氫吡喃基，叔丁基等。蘇氨酸的羥基不一定需要保護(hù)。甲硫氨酸可以亞砜的形式保護(hù)。其它較佳的對(duì)特定氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基包括，對(duì)酪氨酸芐基，0-溴代芐氧基羰基(Br Z)，2，6-二氯芐基，異丙基，環(huán)己基，環(huán)戊基和乙酰;對(duì)組氨酸芐基，芐氧羰基，對(duì)甲苯磺?；?，三苯甲基和2，4-二硝基苯基(DNP)，對(duì)色氨酸甲?；?br> 作為從C末端氨基酸開(kāi)始，偶聯(lián)到固相樹(shù)脂支持物的典型過(guò)程，涉及以下步驟。對(duì)于二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹(shù)脂，通過(guò)一個(gè)N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)/1-羥基苯并三唑(HBT)介導(dǎo)的偶聯(lián)進(jìn)行2至24小時(shí)，較好的是約12小時(shí)，在10°與50℃之間反應(yīng)，較好的是25℃，將Nα-Boc-氨基酸或作類似保護(hù)的C端氨基酸連結(jié)到(甲基)二苯甲基樹(shù)脂上，反應(yīng)在溶劑如二氯甲烷或DMF，較好的是在二氯甲烷中進(jìn)行。對(duì)于氯代甲基聚苯乙烯二乙烯基苯型樹(shù)脂是通過(guò)與Nα-保護(hù)氨基酸反應(yīng)使其連接到樹(shù)脂上，尤其是Boc-氨基酸，以它的銫，四甲基銨，三乙基銨，4，5-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]-十一碳-5-烯，或在乙醇，乙腈，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的類似的鹽，尤其是DMF中的銫鹽與氯代甲基樹(shù)脂反應(yīng)在升高的溫度下，如在40℃到60℃之間，較好的是約50℃，反應(yīng)約12到48小時(shí)，較好的是約為24小時(shí)。
Nα-保護(hù)基的去除可在某種溶液中進(jìn)行，如在二氯甲烷中的三氟乙酸溶液，在二氧雜環(huán)己烷中的鹽酸溶液，乙酸中的鹽酸溶液，或其它強(qiáng)酸溶液中進(jìn)行，較好的是50%在二氯甲烷中的三氟乙酸溶液，在約室溫下進(jìn)行。隨后的已保護(hù)的氨基酸的偶聯(lián)可在本領(lǐng)域熟知的自動(dòng)多肽合成儀中進(jìn)行。每個(gè)已保護(hù)的氨基酸最好加入約2.5或更多過(guò)量的摩爾數(shù)，偶聯(lián)在二氯甲烷，二氯甲烷/DMF混合物，DMF等溶液中進(jìn)行，尤其是二氯甲烷中在約室溫下進(jìn)行。也可用其它已知在肽合成的縮合反應(yīng)中有用的溶劑，如二甲亞砜，吡啶，氯仿，二氧雜環(huán)己烷，四氫呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷等，也可用合適的這些溶劑的混合物。
縮合/偶聯(lián)反應(yīng)的溫度可以從已知的對(duì)肽合成的縮合反應(yīng)有用的范圍內(nèi)選擇。通常在約-40℃到60℃之間，較佳的是在約-20℃至0℃之間。偶聯(lián)劑一般是在二氯甲烷中的DCC，但也可是N，N′-二異丙基碳化二亞胺或其它碳化二亞胺，它們或者是單獨(dú)使用，或者是在HBT，N-羥基琥珀酰亞胺，乙基-2-羥基亞氨基-2-氰基乙酸鹽，其它N-羥基酰亞胺或肟的存在下。另外，也可用已保護(hù)的氨基酸活性酯(如對(duì)硝基苯基，戊基氟代苯基等)或?qū)ΨQ酐。
偶聯(lián)，去保護(hù)/切割反應(yīng)和多肽衍生物的制備宜在約-10℃至+50℃之間進(jìn)行，更好的是在約20℃至25℃之間。任何個(gè)別反應(yīng)的確切溫度當(dāng)然依賴于底物，試劑，溶劑及其它，這些都在操作者的技術(shù)范圍內(nèi)。完全去保護(hù)的多肽將通過(guò)運(yùn)用任何或所有以下類型的色譜法的順序純化以乙酸鹽形式在弱堿性樹(shù)脂上離子交換;凝膠滲透色譜法，如在Sephadex G-25上;在非衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(如Amberlite XAD)上疏水性吸收色譜法;硅膠吸收色譜法;離子交換色譜法，如在Sephadex G-25上，或逆流分配法;高效液相色譜法(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基硅膠鍵合柱(Silica bonded phase column)上的反相HPLC上裝柱。
雖然通過(guò)上述的化學(xué)制備法，尤其是上面描述的高效率的固相肽合成法可制備本發(fā)明的合成肽，但是用本領(lǐng)域所熟知的基因工程技術(shù)產(chǎn)生新穎的HIVp17肽片段或其類似物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此，運(yùn)用合適的酶及微生物(如細(xì)菌諸如大腸桿菌)，可將編碼所需多肽的DNA順序整合入微生物的基因組中，使得微生物表達(dá)所感興趣的特定肽。
一旦獲得并純化特定肽后，它可用作半抗原來(lái)制備抗原性免疫原，通過(guò)抗原可以大量而穩(wěn)定地獲得對(duì)HIV和類似病毒的p17gag蛋白有特異性交叉反應(yīng)性的，及對(duì)愛(ài)滋病毒有中和能力的抗體。然后，特異性抗體可用作抑制愛(ài)滋病毒復(fù)制的抗血清。通過(guò)將這些抗體與載體結(jié)合用在如親和層析中，可以純化HIV中的免疫反應(yīng)性蛋白。特異性抗體也可用作不同株的HIV反轉(zhuǎn)錄病毒的各種免疫學(xué)測(cè)定中的特異性抗體。因此根據(jù)本發(fā)明的抗體，在具高度特異性的直接診斷血清中愛(ài)滋病毒存在方面很有價(jià)值。
如上所述，具有HIV中和能力的抗體可通過(guò)用本發(fā)明的p17肽免疫健康正常的人或動(dòng)物而得到。但是，在有些情況下，抗特定病毒片段的抗體實(shí)際上可能是有害的，如會(huì)使結(jié)合抗體的病毒容易鉆進(jìn)靶細(xì)胞。這種有害的抗體實(shí)際上在有關(guān)愛(ài)滋病病毒的文獻(xiàn)中已提到過(guò)，尤其是對(duì)某些衣殼蛋白的抗體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)重要特征是篩選出抗本發(fā)明肽的任何有害的或潛在有害的抗體，同時(shí)也富集所需的抗體。可使用親和色譜法技術(shù)去除不需要的肽，和/或純化或富集所需的肽。在此所用的親和色譜法包括將抗原(如本發(fā)明的肽或類似物)與不溶性基質(zhì)結(jié)合，然后使經(jīng)免疫患者的血清通過(guò)裝填了結(jié)合抗原的柱。然后，通過(guò)合適的洗脫可以去除不需要的抗體并富集所需的抗體。將肽與不溶性基質(zhì)偶聯(lián)的技術(shù)及隨后在親和色譜法中用的洗脫對(duì)本領(lǐng)域來(lái)說(shuō)是熟知的，可以用任何這些適用于肽和蛋白的方法。例如，根據(jù)一個(gè)較好的將肽偶聯(lián)到不溶性基質(zhì)(溴化氰-激活的Sepharose 4B-來(lái)自Pharmacia，N.J.)的步驟，用10-3M HCl(1克/200毫升)活化不溶性基質(zhì)?；罨幕|(zhì)用偶聯(lián)緩沖液(如0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH＝8.0)洗滌二次，一凝膠形式的基質(zhì)的量等分成足夠使5毫克肽配有1克膠，并在離心管中離心(如1200r.p.m.)成丸。要偶聯(lián)的肽溶解于偶聯(lián)緩沖液中，加入離心管中，在40℃輕輕振搖約8至20個(gè)小時(shí)。偶聯(lián)肽的基質(zhì)(Sepharose)各用酸性(如0.1M乙酸鹽，1M Na Cl pH 8.0)和堿性(如0.1M二碳酸鹽，1M Na Cl，pH＝8.0)緩沖液洗滌三次。
從患者抗血清中去除不需要的抗體(抗結(jié)合的肽)可以如下通過(guò)結(jié)合肽的Sepharose來(lái)進(jìn)行將Sepharose肽混合物放入玻璃柱中，將10毫升在緩沖液中的抗血清(如磷酸緩沖液-PBS，pH＝7.4)加入柱中。然后用PBS緩沖液洗脫柱，洗脫液以1毫升等分收集。洗脫液中將含有不與肽結(jié)合的抗體。
相反，如果結(jié)合肽是激發(fā)所需抗體的，目的是要富集結(jié)合抗體，那么可以通過(guò)如用0.1M甘氨酸，pH＝2做為緩沖液裝填柱來(lái)去除結(jié)合抗體。然后用20毫升PBS緩沖液洗滌柱，洗脫液含不與肽結(jié)合的所需抗體。通過(guò)每管加入50升1M Tris-HCl，pH9.5以中和洗脫液。
具有p17gag蛋白抗原性的多肽及它們激發(fā)產(chǎn)生的抗體可用在診斷方法中，可分別檢測(cè)愛(ài)滋病病毒的抗體或愛(ài)滋病病毒其本身。這些多肽與其抗體可以單獨(dú)或與其它任何或所有的HIV抗原和抗體一起裝入診斷盒中。這些方法和診斷盒中，單獨(dú)或與其它抗原或抗體一起采用了本發(fā)明的多肽或抗體，可以快速和簡(jiǎn)便地確定愛(ài)滋病感染性攜帶者及預(yù)測(cè)ARC和愛(ài)滋病的進(jìn)程。以下給出檢測(cè)愛(ài)滋病病毒的典型的放射免疫測(cè)定和ELISA的簡(jiǎn)單描述。
用放射免疫測(cè)定法檢測(cè)愛(ài)滋病病毒如上產(chǎn)生的抗體連接于固相物質(zhì)，例如在試管內(nèi)，該抗體是抗愛(ài)滋病毒的p17gag蛋白的式(Ⅰ)-(Ⅴ)氨基酸順序的抗原性決定簇，在管中加入病人血清樣本，并加入如上產(chǎn)生的具有愛(ài)滋病病毒p17gag蛋白抗原性的已知量多肽，該多肽已用諸如放射活性碘的放射性同位素標(biāo)記。在病人血清中的任何愛(ài)滋病病毒(具有相關(guān)的gag蛋白)將同具有愛(ài)滋病病毒p17gag蛋白抗原性的標(biāo)記多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合連接抗體。去除過(guò)量的液體，洗滌試管，并測(cè)定放射活性量。試管中的放射活性計(jì)數(shù)低則表示陽(yáng)性結(jié)果，即病人血清中含有愛(ài)滋病病毒。除了上述的固相RIA外，在某些情況下用液相RIA可能更方便。在液相RIA情況下，識(shí)別愛(ài)滋病病毒的抗體，即抗肽(Ⅰ)，抗肽(Ⅱ)，抗肽(Ⅲ)等抗體不與固相物質(zhì)連接，而是在液相中，在-5標(biāo)記抗原性材料的競(jìng)爭(zhēng)中同病人血清反應(yīng)。然后可用任何適宜的方法檢測(cè)抗體-抗原互相反應(yīng)復(fù)合物。如用對(duì)第一抗體有反應(yīng)活性的第二抗體(如第一個(gè)抗體在另一個(gè)動(dòng)物中激發(fā)出抗抗體抗體)與不溶性小珠連接，可用來(lái)從液相中提取出復(fù)合物。
ELISA方法檢測(cè)愛(ài)滋病病毒用按照本發(fā)明制備的具有愛(ài)滋病病毒p17gag蛋白的抗原性的肽包被微量滴定板，然后加入病人血清樣本。孵育一段時(shí)間，以使結(jié)合肽與血清中的任何抗愛(ài)滋病病毒的p17gag抗體互相反應(yīng)，然后洗滌板。加入與酶連接的p17肽制劑，該肽可以是全肽，或者是與板上的肽相同的肽片段(例如所謂的“夾心”)。孵育使抗原-抗體反應(yīng)，然后再次洗滌板。然后，在微量滴定板中加入酶底物，孵育一段時(shí)間使酶與底物反應(yīng)，測(cè)量最終反應(yīng)物的吸收值。吸收值有大的變化表示陽(yáng)性結(jié)果。
以上大致描述的測(cè)量抗原的放射免疫測(cè)定法和ELISA對(duì)本領(lǐng)域的人來(lái)說(shuō)是熟知的。
本發(fā)明的肽可以作為標(biāo)記抗原用于放射免疫測(cè)定(RIA)或酶免疫測(cè)定法(EIA)中，尤其是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中，通過(guò)加入放射性物質(zhì)如125Ⅰ、131Ⅰ、3Ⅱ(氚)，14C等;各種酶試劑如過(guò)氧化物酶(POX)，胰凝乳蛋白酶原，羧肽酶原，甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶，淀粉酶，磷酸化酶，D-Nase，P-Nase，β-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等?？梢詡鹘y(tǒng)方式加入上述放射性物質(zhì)。例如，放射性碘125Ⅰ的加入，可以采用氯胺T，通過(guò)氧化碘化方法進(jìn)行(W.M.Hunter and F.C.Greenwood，Nature，194，495(1962)，Biochem.J.，89，144(1963))，或通過(guò)用Bolten-Hunter試劑(125I-碘化對(duì)羥基苯基丙酸-N-羥基-琥珀酰亞胺酯)如Biochem.J.，133，529(1973)中所述。參見(jiàn)美國(guó)專利4，264，571中例2等。
更特定地說(shuō)，這個(gè)方法可在合適的溶劑中，如0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中在氯胺T存在下在室溫進(jìn)行10到30秒。所用的肽，放射性125Ⅰ和氯胺T有一定的比例，當(dāng)每個(gè)酪氨酸分子介入1個(gè)放射性碘原子時(shí)，每份含1nM酪氨酸的肽中加入1mCi放射性碘和10至100nM氯胺T，當(dāng)每個(gè)酪氨酸分子介子2個(gè)放射性碘原子時(shí)，每份含1nM酪氨酸的肽中加入2mCi放射性碘和10至100nM的氯胺T。通過(guò)傳統(tǒng)的分離技術(shù)從反應(yīng)混合物中分離和純化所制備的放射性碘標(biāo)記肽，如用萃取，分配，柱層析，透析等。如需要的話，所得的肽可以冷凍干燥加以保存。
對(duì)于氨基酸順序中有Tyr的式(Ⅱ)或(Ⅴ)的肽，或?qū)尤隩yr或用Tyr置換的式(Ⅲ)或(Ⅳ)的肽的類似物，可以通過(guò)用如美國(guó)專利4，339，427中例36中所述的方法使125Ⅰ直接摻入Tyr。
酶試劑的加入可通過(guò)已知的方法如傳統(tǒng)的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行，例如，B.F.Erlanger等人的方法(Acta Endocrinol，Suppl.，168，206(1972))，M.H.Karol等人的方法(Prol.Natl.Acad.Sci.U.S.A，57713(1967))等。即肽與酶在pH4到6的緩沖液中反應(yīng)，如1mM乙酸鹽緩沖液(pH4.4)，在氧化劑如NaIO4的存在下在室溫反應(yīng)2到5小時(shí)，接著用NaBH4或其類似物還原。所用的酶量可為每摩爾肽用1至3摩爾，較佳的氧化劑用量是每摩爾肽約100到300摩爾，還原劑用量是每摩爾氧化劑用約1到2摩爾。所得的酶標(biāo)記肽可通過(guò)類似于放射性碘標(biāo)記肽那樣的方法標(biāo)記，純化和保存。
本領(lǐng)域的人知道，多肽，即含少于50個(gè)氨基酸的肽，通常不能直接激發(fā)相應(yīng)抗體的產(chǎn)生。由于這個(gè)原因，通常人們把多肽抗原作為半抗原，與半抗原載體，這兒及以后稱作免疫原性載體物質(zhì)，偶聯(lián)或結(jié)合，從而激發(fā)特異性抗體的產(chǎn)生，并使該抗體有足夠高的效價(jià)，因此很易重新獲得，在本發(fā)明中，雖然優(yōu)先用HIVp17gag肽(包括類似物)作為半抗原，與免疫原性載體物質(zhì)連接，但是下述情況也在本發(fā)明范圍內(nèi)，尤其是對(duì)小于約26個(gè)氨基酸的肽，將肽直接用作疫苗或用作激發(fā)特異性抗體的免疫原性抗原，當(dāng)然也包括用于本發(fā)明的診斷方面。另外，將任何新肽以其多聚體的形式運(yùn)用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如二聚體，三聚體或寡聚體，即含合成肽氨基酸的重復(fù)順序。因此合成肽可以被多聚化以建立含二個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單位的鏈，這樣重復(fù)順序既可用作“載體”又可作為免疫學(xué)活性位點(diǎn)。
以下，將詳盡描述將本發(fā)明肽用作半抗原以生產(chǎn)免疫原性抗原的方法。
以上所述的抗原是通過(guò)把本發(fā)明的肽用作半抗原，使肽與一個(gè)合適的免疫原性載體物質(zhì)在半抗原-載體結(jié)合劑存在下反應(yīng)而制備的。在這種情況下，通常用于抗原制備中的高分子量天然及合成肽均可用作與半抗原結(jié)合的載體，另外，較小的肽或分子，如tufsin(一種四肽)，tufsin的類似物，和胞壁酰二肽，及它們的類似物，也可用作“免疫原性載體物質(zhì)”。
這兒所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性載體物質(zhì)”包括這些材料，它們具有能獨(dú)立在宿主動(dòng)物中激發(fā)免疫原性應(yīng)答的性能，并且它們可以通過(guò)多肽中的自由羧基，氨基或羥基與免疫原性載體物質(zhì)上相應(yīng)的基團(tuán)之間形成肽鍵或酯鍵而直接共價(jià)偶聯(lián)到多肽上，或者通過(guò)常規(guī)雙重功能連結(jié)基團(tuán)成鍵。這種載體的例子包括動(dòng)物血清中的白蛋白，如馬血清白蛋白，牛血清白蛋白，兔血清白蛋白，人血清白蛋白，羊血清白蛋白等;動(dòng)物血清球蛋白，如馬血清球蛋白，兔血清球蛋白，人血清球蛋白，羊血清球蛋白等;動(dòng)物的甲狀腺球蛋白，如馬甲狀腺球蛋白，牛甲狀腺球蛋白，兔甲狀腺球蛋白，人甲狀腺球蛋白，羊甲狀腺球蛋白等，動(dòng)物的紅蛋白，如馬血紅蛋白，牛血紅蛋白，兔血紅蛋白，人血紅蛋白，羊血紅蛋白等;動(dòng)物的血藍(lán)蛋白如Keyhole limpet血藍(lán)蛋白(KCH)等;從蛔蟲(chóng)中提取的蛋白質(zhì)(蛔蟲(chóng)提取物，如日本專利申請(qǐng)(OPI)號(hào)16，414/81，J.Immun.，111 260-268(1973)，ibid.，122，302-308(1979)，ibid.，98，893-900(1967)和Am.J.Physiol.，199，575-578(1960)，或其純化產(chǎn)品);聚賴氨酸，聚谷氨酸，賴氨酸-谷氨酸共聚體，含賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸的共聚體等。最近，用白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素作為免疫原性載體物質(zhì)已制備了疫苗(參見(jiàn)Lepow.M.L.等人，J.of Infectious Diseases，150卷，第3號(hào)，402-406頁(yè)(1984);和Coen Beuvery，E.等人，Infection and Immunity 40，39-45頁(yè)(1983年4月)，這里也可用這些類毒素材料。其它有用的載體在如美國(guó)專利4，575，495中公開(kāi)，包括病毒，如牛痘病毒，有機(jī)多聚物等。
作為半抗原-載體結(jié)合劑，可廣泛使用在抗原制備中常規(guī)應(yīng)用的那些試劑。這些試劑的特定例子包括交聯(lián)酪氨酸，組氨酸，色氨酸等的重氮化合物，如雙重氮化聯(lián)苯胺(BDB)等;交聯(lián)氨基與氨基的脂肪族的二醛，如C2-C7鏈烷醛，諸如乙二醛，丙二醛，琥珀醛，已二醛等，交聯(lián)硫醇基與硫醇基的二順丁烯二酰亞胺化合物，如N-N′-0-亞苯基二順丁烯二酰亞胺，N，N′-間-亞苯基二順丁烯二酰亞胺等;交聯(lián)氨基與硫醇基的順丁烯二酰亞胺羧基-N-羥基-琥珀酰亞胺酯，如間順丁烯二亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯，4-(順丁烯二亞胺甲基-環(huán)己烷-1-羧基-N′-羥基琥珀酰亞胺酯等;用于常規(guī)肽鍵形成反應(yīng)中的試劑，其中酰胺鍵是由氨基和羧基形成的，如脫氫和縮合試劑，例如碳化二亞胺N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺，N-乙基-N′-二甲基氨基-碳化二亞胺，1-乙基-3-二異丙基氨基-碳化二亞胺，1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)-碳化二亞胺等。作為上述的半抗原-載體結(jié)合劑，也可用重氮化芳基羧酸，如對(duì)重氮化苯基乙酸等，和常規(guī)肽鍵形成劑如上述的脫氫和縮合劑一起使用。
酸性肽與免疫原性載體物質(zhì)的共價(jià)偶聯(lián)可以本領(lǐng)域人熟知的方法進(jìn)行。如用于直接共價(jià)偶聯(lián)，可用碳化二亞胺，最佳的是二環(huán)己基碳化二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳化二亞胺作為偶聯(lián)劑。在這種直接偶聯(lián)中，這一步需要用微酸性的介質(zhì)，如pH在約3至6.5的介質(zhì)，更佳的是在約4至6.5之間。
用中性或堿性肽的半抗原制備抗原的偶聯(lián)反應(yīng)可以相似的方式進(jìn)行，但在水溶液中，或pH為7至10的常規(guī)緩沖液溶液中進(jìn)行，較佳的是在pH為8至9的緩沖液中，在約0到40℃之間進(jìn)行，較佳的在約室溫下。反應(yīng)一般進(jìn)行約1至24個(gè)小時(shí)，較佳地是3至5小時(shí)?？捎糜谏鲜龇椒ǖ牡湫偷木彌_液包括0.2M氫氧化鈉-0.2M硼酸-0.2M氯化鉀緩沖液;
0.2M碳酸鈉-0.2M硼酸-0.2M氯化鉀緩沖液;
0.05M四硼酸鈉-0.2M硼酸-0.05M氯化鈉緩沖液;
0.1M磷酸二氫鉀-0.05M四硼酸鈉緩沖液。
在上述方法中，可以適當(dāng)?shù)卮_定單抗原，半抗原-載體結(jié)合劑和載體的比例，但較佳的是載體用量是半抗原重量的約1到6倍，約1至5倍則更佳，半抗原-載體結(jié)合劑用量是半抗原摩爾數(shù)的約5至10倍。通過(guò)上述反應(yīng)，載體通過(guò)半抗原-載體結(jié)合劑與半抗原結(jié)合，得到所需的由肽-載體復(fù)合物組成的抗原。
反應(yīng)完成后，所得的抗原可通過(guò)鹽析法，凝膠過(guò)濾方法，分級(jí)沉淀法等容易地分離和純化。
所獲得的抗原平均每摩爾蛋白與5至60摩爾肽結(jié)合，并使人們隨后制備對(duì)抗原有高度特異性的抗體，尤其是，與每摩爾肽結(jié)合的抗原量以平均為5到20摩爾較佳，尤以8到15摩爾最佳，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的特異性，能使人們得到具高活性和高敏感性的抗體。
用抗原制備抗體是通過(guò)給哺乳動(dòng)物施用上述抗原，最好采用佐劑進(jìn)行的，以在體內(nèi)產(chǎn)生所需抗體，并收集該抗體。通過(guò)在一段時(shí)期內(nèi)重復(fù)注射抗原來(lái)提高效價(jià)。
上述提到的佐劑有明礬，弗氏佐劑(完全或不完全)，精煉和純化的油，如Monomide A271或三十碳六烯，細(xì)菌抽提物(如RIBI)，脂質(zhì)體，ISCOMS等等。
雖然對(duì)用于制備抗體的哺乳動(dòng)物并沒(méi)特別限制，但通常優(yōu)先采用兔或豚鼠，也可用馬，山羊，貓，鼠，牛，綿羊等。在生產(chǎn)抗體時(shí)，如上所述獲得的定量的抗原用生理性鹽溶液稀釋到一合適的濃度，所得的稀釋液與弗氏完全佐劑混合制備懸浮液。給哺乳動(dòng)物施用該懸浮液。例如，將上述懸浮液皮下注入兔子(每次0.1至5毫克抗原量)，然后每?jī)芍苁┯靡淮螒腋∫?，時(shí)間為2至10月，以4至6月較佳，進(jìn)行免疫。在最后一次給藥后1至2周后，收集免疫動(dòng)物血樣，離心并從血中分離得血清，從而收集抗體。根據(jù)這個(gè)方法，可以收集到能選擇性地和愛(ài)滋病病毒的抗原性決定簇，尤其是p17gag蛋白形成復(fù)合物的抗體，該抗體可用作一種免疫病人的抗血清，所述病人有得愛(ài)滋病的危險(xiǎn)(如同性戀者，海地人，靜脈注射毒品使用者等等)，暴露于愛(ài)滋病病毒或具有愛(ài)滋病或ARC的癥狀?；蛘撸捎肦IA，ELISA等法，抗體可用來(lái)分析實(shí)際上任何已知的能引起愛(ài)滋病的HIV株，尤其是HIV-1和HIV-2。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)用于血清學(xué)分析時(shí)，本發(fā)明的抗體可用放射性同位素標(biāo)記用在RIA中，或者用常規(guī)使用的酶或熒光物質(zhì)標(biāo)記，用于ELISA，熒光免疫測(cè)定(FIA)等。另外，本發(fā)明的抗體可以通過(guò)與常規(guī)不溶劑反應(yīng)而成為不溶性。
因此本發(fā)明提供了抗原性p17gag肽及其混合物，包括其類似物，它們能提供中和愛(ài)滋病病毒的強(qiáng)有力疫苗。這樣，本發(fā)明的疫苗可用來(lái)免疫具有得愛(ài)滋病危險(xiǎn)的，或暴露于愛(ài)滋病病毒的病人，或用來(lái)治療患有愛(ài)滋病相關(guān)綜合征或具有明顯癥狀的愛(ài)滋病病人。
當(dāng)用作疫苗時(shí)，最常規(guī)的是通過(guò)肌肉、非腸道的、口服或皮下將疫苗注入宿主?？捎萌魏纹胀ㄒ后w或固體載體，但它們須能被宿主接受，對(duì)宿主沒(méi)有有害副作用，對(duì)疫苗也沒(méi)有有害的作用。磷酸緩沖鹽(PBS)，在生理學(xué)pH，如pH6.8到7.2，較佳為pH7，可用作載體，單獨(dú)用或與一適當(dāng)?shù)淖魟┮黄?。免疫性抗原的濃度?0至200μg范圍內(nèi)，如每次注射約100μg，抗原在一定體積的溶劑中，一般是約0.25到1毫升，如約0.5毫升。在初次注射后可能需要多次注射，，多次注射時(shí)間間隔約2到14天，如約7天。
除了上述對(duì)宿主施用免疫性抗原性肽進(jìn)行主動(dòng)免疫外，也可直接給宿主施用本發(fā)明的抗愛(ài)滋病病毒抗體，該抗體常常是在與宿主不同種的體內(nèi)得到的，雖然也可用與宿主同種的不同個(gè)體中得到的抗體。在這種被動(dòng)免疫抗血清的情況下，一般也可用上述主動(dòng)免疫方法中同樣的使用方法，同型載體相同或更高的劑量。例如，可通過(guò)肌內(nèi)輸注慢慢給予(如約6小時(shí))多達(dá)1.5克的鼠單克隆抗體。
關(guān)于這點(diǎn)，尤其重要的是運(yùn)用式(Ⅰ)-(Ⅵ)的個(gè)體片段或部分或其類似物，分離和去除不需要的、潛在有害的抗體的能力，或分離和富集抗HIV的所需(如中和)抗體的能力，上面所述的片段或部分或類似物保留了HIVp17的免疫顯性抗原決定簇。這樣，如上所述，用本發(fā)明的肽，可以處理感染HIV的健康個(gè)體(或正常的，先前已用本發(fā)明的肽片段接種，并含有完全HIVp17的免疫顯性抗原決定簇的未感染個(gè)體)的血清，使血清中存在保護(hù)性抗體，用親和層析法去除任何不需要的肽和/或富集所需的有用抗體。
另有一個(gè)實(shí)施例是一種疫苗和免疫方法，該方法根據(jù)一種抗獨(dú)特型抗體，該抗體是抗本發(fā)明的任何一種肽的單克隆抗體的抗抗體，激發(fā)的抗單克隆抗體的抗免疫球蛋白血清定義為“抗獨(dú)特型”血清，并識(shí)別激發(fā)抗體的可變區(qū)，直接針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)。這種直接針對(duì)準(zhǔn)結(jié)合位點(diǎn)的抗獨(dú)特型抗體實(shí)際上能替代原來(lái)的抗原。因此，可以采用這種機(jī)制來(lái)免疫和激發(fā)抗p17gag肽片段及其類似物的抗體，與通過(guò)經(jīng)典免疫方案具有同樣的或更高的效率。
下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明合成代表性的肽。
實(shí)施例1 肽B(51-Tyr)制備Ile-Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu-Tyr將Boc-Tyr(Brz)-OCH2-C6H4-樹(shù)脂(2.0克;0.9毫摩爾)置于100毫升肽合成瓶中，在每一循環(huán)中根據(jù)以下步驟(每步用20份體積的溶劑或試劑)開(kāi)始固相合成1.用CH2Cl2洗滌三次;
2.用50%TFA(在CH2Cl2中)預(yù)洗滌，3.在50%TFA中攪拌30分鐘，4.用CH2Cl2洗滌三次，5.用10%三丁胺(Bu3N)在CH2Cl2中)預(yù)洗滌，6.在10%Bu3N中攪拌3分鐘，7.用CH2Cl2洗滌三次，8.與在CH2Cl2中的各2.7毫摩爾Boc-Leu(0.67克)和DCC(0.556克)攪拌60分鐘，9.用CH2Cl2洗滌一次，10.用在CH2Cl2中的50%異丙醇(i-Prou)洗滌二次，11.用CH2Cl2洗滌三次，
12.檢查樹(shù)脂的茚三酮反應(yīng);如果陽(yáng)性則重復(fù)步驟8-12;如果陰性則繼續(xù)下一個(gè)循環(huán)。
用以下Boc-氨基酸依次重復(fù)合成循環(huán)，在步驟8中每次用一個(gè)Boc-Leu，Boc-Gly，Boc-Pro，Boc-Asn，Boc-Val，Boc-Ala，Boc-Phe，Boc-Arg(Tos)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Leu，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Ala，Boc-Trp，Boc-Val，和Boc-Ile.
完成的樹(shù)脂，Boc-Ile-Val-Trp-Ala-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Leu-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu-Tyr(BrZ)-OCH2-C6H4-樹(shù)脂然后用無(wú)水HF(0℃，45分鐘)處理以去保護(hù)，并把肽從樹(shù)脂上切下來(lái)。從1.0克保護(hù)樹(shù)脂上，可得到0.33克粗肽。一部分粗肽(0.16克)在半制型HPLC(Hamilton PRP-12.15×25厘米柱，pH4，磷酸鉀緩沖液，23%/28%乙腈)上純化，得到18毫克所需肽。分析型HPLC顯示它是同源的。
氨基酸分析 Asp，1.10;Ser，1.10;Glu，2.04;Pro，0.93;Gly，1.08;Ala，1.85;Val，1.63;Ile，0.86;Leu，3.00;Tyr，0.93;Phe，0.94;Trp，0.64(acld hydrolysls);Arg，1.94.
實(shí)施例2在位點(diǎn)91-100的肽(Ⅰ′)Ile-Glu-Ile-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu將Boc-Leu-OCH2-C6H4-樹(shù)脂(1.0克，0.5毫摩爾)放在肽合成瓶中，根據(jù)實(shí)施例1中所描述的步驟進(jìn)行固相肽合成，用以下Boc-氨基酸(每個(gè)為1.5毫摩爾)依次與樹(shù)脂上的肽鏈偶聯(lián)，每個(gè)循環(huán)衍生一個(gè)氨基酸BOC-Ala，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Lys(Clz)，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Asp(OBzl)，Boc-Lys(Clz)，Boc-Ile，Boc-Glu(OBzl)和Boc-Ile.
所獲得的完成樹(shù)脂的重量為1.7克，該樹(shù)脂為Boc-Ile-Glu(OBzl)-Ile-Lys(Clz)-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Lys(Clz)-Glu(OBzl)-Ala-Leu-OCH2-C6H4-樹(shù)脂部分此材料(0.88克)然后用無(wú)水HF在0℃處理45分鐘，最后得0.27克粗肽。HPLC純化38毫克此粗肽得20毫克所需肽。分析型HPLC顯示它是同源的。
氨基酸分析Asp，1.00;Thr，0.91;Glu，2.08;Ala，0.90;Ile，1.92;Leu，1.08;Lys，2.00.
實(shí)施例3肽E(Ala-HGP-17)的制備Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr(Ⅴ)將Boc-Tyr(Brz)-OCH2-C6H4-樹(shù)脂(1.0克;0.5毫摩爾)放入肽合成瓶中，根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行固相肽合成，用以下Boc-氨基酸(每個(gè)1.5毫摩爾)依次與不斷增長(zhǎng)的樹(shù)脂上的肽鏈偶聯(lián)，每個(gè)循環(huán)衍生一個(gè)氨基酸Boc-Asn，Boc-Gln，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Val，Boc-Gln，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Ser(Bzl)，Boc-His(DNP)，Boc-Gly，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Asp(OBzl)，Boc-Ala，Boc-Ala，Boc-Ala，Boc-Gln，Boc-Gln和Boc-Ala.
所獲得的完成樹(shù)脂重量為1.95克，該樹(shù)脂為Boc-Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Gly-His(DNP)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Gln-Val-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(Brz)-OCH2-C6H4-樹(shù)脂保護(hù)的肽樹(shù)脂先用在DMF中的苯硫酚處理1小時(shí)以從肽的組氨酸殘基上去除DNP基團(tuán)，然后與無(wú)水HF在0℃攪拌45分鐘以切割與去保護(hù)。反應(yīng)完成后得360毫克粗肽，在HPLC上純化部分粗肽，得到的物質(zhì)在分析型HPLC(用小的慢流動(dòng)微量污染物上顯示大量同源)。
氨基酸分析Asp，2.10;Thr，1.01;Ser，2.09;Glu，3.91;Gly，1.07;Ala，4.05;Val，1.09;Thr，1.07;His，0.01.
實(shí)施例4肽C(56-Ser，85-Lys)的制備Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Ser-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Lys將Boc-Lys(Cl Z)-OCH2-C6H4-樹(shù)脂(0.7克;0.35毫摩爾)放入肽合成瓶中，根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟進(jìn)行固相肽合成循環(huán)，用以下Boc-氨基酸(每個(gè)1.1毫摩爾)依次與樹(shù)脂上的肽鏈偶聯(lián)，每次一個(gè)氨基酸Boc-Leu，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Ala，Boc-Val，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Asn，Boc-Tyr(Brz)，Boc-Leu，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Arg(Tos)，Boc-Leu，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Gly，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Gln，Boc-Leu，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Pro，Boc-Gln，Boc-Leu，Boc-Gln，Boc-Gly，Boc-Leu，Boc-Ile，Boc-Gln，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ser(Bzl;)，Boc-Gly，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Thr(Bzl)和Boc-Glu(OBzl).
所得的完成樹(shù)脂重量為1.28克，它為Boc-Glu(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser(Bzl)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Gly-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Leu-Tyr(Brz)-Asn-Thr(Bzl)-Val-Ala-Thr(Bzl)-Leu-Lys(Clz)-OCH2-C6H4-樹(shù)脂用HF切割和去保護(hù)，得457毫克粗肽。在HPLC上純化得31毫克所需的肽。通過(guò)分析型HPLC，發(fā)現(xiàn)此產(chǎn)物是同源性的。
氨基酸分析 Asp，1.00;Thr，4.15;Ser，4.32;Glu，7.00;Pro，0.76;Gly，3.02;Ala，0.90;Val，0.95;Ile，0.85;Leu，5.99;Tyr，0.97;Lys，0.98;Arg，1.95.
實(shí)施例5肽A(33-Lys)的制備Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys-His-Lys將Boc-Lys(Cl Z)-PAM-樹(shù)脂(1.0克，0.32毫摩爾)放在肽合成瓶中，根據(jù)實(shí)施例1中所述的步驟進(jìn)行固相肽合成的循環(huán)，用以下Boc-氨基酸(每個(gè)1.0毫摩爾)依次與樹(shù)脂上增長(zhǎng)的肽鏈偶聯(lián)，每次衍生一個(gè)氨基酸Boc-His(DNP)，Boc-Lys(Clz)，Boc-Leu，Boc-Lys(Clz)，Boc-Tyr(Brz)，Boc-Lys(Clz)，Boc-Lys(Clz)，Boc-Lys(Clz)，Boc-Gly，Boc-Gly，Boc-Pro，Boc-Arg(Tos)，Boc-Leu，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ile，Boc-Lys(Clz)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Trp(For)，Boc-Arg(Tos)，Boc-Asp(OBzl)，Boc-Leu，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Gly，Boc-Gly，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Leu，Boc-Val，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Ala，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ala和Boc-Gly.
所獲的完成樹(shù)脂的重量為2.23克，它是
Boc-Gly-Ala-Arg(Tos)-Ala-Ser(Bzl)-Val-Leu-Ser(Bzl)-Gly-Gly-Glu(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Arg(Tos)-Trp(For)-Glu(OBzl)-Lys(Clz)-Ile-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-Gly-Lys(Clz)-Lys(Clz)-Lys(Clz)-Tyr(Brz)-Lys(Clz)-Leu-Lys(Clz)-His(DNP)-Lys(Clz)-PAM-樹(shù)脂該肽-樹(shù)脂用在DMF中的苯硫酚處理1小時(shí)，以去除肽上組氨酸殘基上的DNP保護(hù)基，然后在苯甲醚、二甲硫、間甲苯酚和甲苯硫酚存在下用無(wú)水HF(0℃，60分鐘)處理。去除多余HF和二甲硫后，加入新鮮HF，使混合物在0℃反應(yīng)45分鐘。如通常操作得580毫克粗肽。分析型HPLC表明該材料約純度為90%。使用此材料不用進(jìn)一步純化。
氨基酸分析Asp，1.00;Ser，1.45;Glu，1.82;Pro，0.61;Gly，5.11;Ala，1.73;Val，0.85;Ile，0.74;Leu，3.73;Tyr，0.89;Trp，(acld hydr.，not determlned);Lys，6.22;His，0.50;Arg，3.52.
權(quán)利要求
1.一種對(duì)HIVp17的抗體具有特異性免疫活性的肽及其結(jié)合物或類似物，其特征在于它是從下組肽中選出的，該組肽含有約12到25氨基酸，其順序?qū)?yīng)于下列順序的一部分或全部Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr (Ⅴ)其類似物，其中順序中的氨基酸可被置換，缺失或插入，只要保存了從順序的三維構(gòu)型來(lái)的對(duì)HIVp17抗體的免疫活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于它具有式(Ⅴ)中的18個(gè)氨基酸順序。
3.一種對(duì)HIVp17的抗體具有特異性免疫反應(yīng)性的肽及其結(jié)合物或類似物，其特征在于它是從下組肽中選出的，該組肽含約28到42個(gè)氨基酸，其順序相應(yīng)于下列順序中的一部分或全部Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-Thr-Leu (Ⅳ)其類似物，其順序中的氨基酸可被置換、缺失或插入，只要保存了從順序三維構(gòu)型來(lái)的對(duì)HIVp17的抗體的免疫反應(yīng)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其特征在于它含有式(Ⅳ)的34個(gè)氨基酸順序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽，其特征在于它含有下式Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Ser-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Lys。
6.一種對(duì)HIVp17抗體具有特異性免疫活性的肽及其結(jié)合物或類似物，其特征在于該肽是從下列組中選出的，該組肽含有約14到27個(gè)氨基酸，其順序?qū)?yīng)于下列順序的一部分或全部Ile-Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu(Ⅲ)其類似物，其中順序中的氨基酸可被置換，缺失或插入，只要保存了從順序三維構(gòu)型來(lái)的HIVp17抗體的免疫反應(yīng)性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肽，其特征在于它含式(Ⅲ)的18個(gè)氨基酸順序。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肽，其特征在于它含有下式Ile-Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu-Tyr。
9.一種對(duì)HIVp17抗體具有特異性免疫活性的肽，及其結(jié)合物或類似物，其特征在于該肽是從下組中選出的，該組肽含有約26到40個(gè)氨基酸，其順序相應(yīng)于下列順序的一部分或全部Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys-His (Ⅱ)其類似物，其中順序中的氨基酸可被置換，缺失或插入，只要保存了從順序三維構(gòu)型來(lái)的對(duì)HIVp17抗體的免疫反應(yīng)性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其特征在于它含有式(Ⅱ)的32個(gè)氨基酸順序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肽，其特征在于它具有下式Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Trp-Gly-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys-His-Lys
12.一種對(duì)HIVp17抗體有特異性免疫反應(yīng)性的肽其，特征在于它有包括下列順序的10到14個(gè)氨基酸Ile-X1-X2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu其中X1是Glu或Asp，X2是Ile或Val。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的肽，其特征在于它具有下式Ile-Asp-Val-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu.
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述有肽，其特征在于它具有下式Ile-Glu-Ile-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu.
15.一個(gè)呈現(xiàn)對(duì)HIVp17抗體有特異性免疫活性的兩個(gè)或更多肽的混合物及其結(jié)合物及類似物，其特征在于該肽是從下列組中選出的，該組包括(1)含約10到36個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅰ′)的一部分或全部順序Ile-X1-X2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-X3-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn (Ⅰ′)其中X1是Asp或Glu，X2是Val或Ile，X3是Glu或Asp;(2)含約26到40個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅱ)的一部分或全部順序Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys-His-Ile (Ⅱ)(3)含約14到27個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅲ)的一部分或全部順序Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu-Glu-Thr (Ⅲ)(4)含約28到42個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅳ)的部分或全部順序Leu-Glu-Thr-Ser-Gly-Gys-Cys-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-Thr-Leu(Ⅳ)(5)含約12至25個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅴ)的一部分或全部順序Gln-Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr (Ⅴ)這些肽的類似物，其所述順序中的氨基酸可被置換、缺失或插入，只要保存從順序的三維構(gòu)型來(lái)的對(duì)HIVp17抗體的免疫反應(yīng)性。
16.一種免疫原性抗原，其特征在于它包括權(quán)利要求1、4、7或10中的任何肽與免疫原性載體物質(zhì)共價(jià)連接。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的免疫原性抗原，其特征在于所述的肽被標(biāo)記，用于血清學(xué)檢測(cè)所述抗原的抗體。
18.用于預(yù)防或治療獲得性免疫缺陷綜合征或愛(ài)滋病相關(guān)綜合征(ARC)的疫苗，其特征在于它包括將有效治療量的根據(jù)權(quán)利要求1、4、7或10的抗原性肽或根據(jù)權(quán)利要求15的二個(gè)或更多抗原性肽的混合物以及藥學(xué)上有效載體。
19.一種減少與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關(guān)的病毒血癥的方法，其特征在于它包括給暴露于愛(ài)滋病病毒，有得愛(ài)滋病危險(xiǎn)或感染愛(ài)滋病的個(gè)體施用有效治療量的根據(jù)權(quán)利要求1、4、7或10的抗原性肽，或根據(jù)權(quán)利要求15的二個(gè)或更多個(gè)抗原性肽的混合物。
20.一種檢測(cè)病人體液中愛(ài)滋病病毒的方法，它包括使至少一個(gè)體液樣品與一個(gè)或更多的抗體接觸，該抗體抗至少是一個(gè)權(quán)利要求1、4、7或10的肽或權(quán)利要求15的肽的混合物，并通過(guò)放射免疫測(cè)定，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或間接熒光試驗(yàn)測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物的形成。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于它包括使體液樣品與根據(jù)權(quán)利要求15的肽的混合物接觸，然后在所述混合物中測(cè)定每個(gè)肽的抗原-抗體復(fù)合物的形式。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于它包括把病人的多個(gè)體液樣品中的每個(gè)與單個(gè)不同抗原性肽接觸，然后測(cè)定每個(gè)樣品中抗原-抗體復(fù)合物的形成。
23.一種檢測(cè)能識(shí)別人體體液中HIVp17蛋白抗原決定簇的抗體的診斷盒，其特征在于它包括含多井平板的附件，其中多井平板被根據(jù)權(quán)利要求1、4、7或10的一個(gè)或多個(gè)肽或根據(jù)權(quán)利要求15的肽混合物包被，還包括用于酶檢測(cè)的ELISA材料，它包含正常動(dòng)物抗血清和酶，標(biāo)記抗-抗體抗血清及顏色變化指示劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的診斷盒，其特征在于它包括許多多井平板，每一個(gè)平板上的井被所述的一個(gè)不同肽包被。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的診斷盒，其特征在于所述多井平板被兩個(gè)或更多所述肽的混合物所包被。
26.一種形成用于治療愛(ài)滋病的抗體富集血清的方法，其特征在于它包括從抗HIVp17抗體陽(yáng)性但不顯示AIDS或ARC癥狀的個(gè)體上取得體液樣品，測(cè)定抗一個(gè)或更多肽的免疫顯性抗原決定簇的抗體的存在，該肽是從下組中選出的，該組包括(1)含約10到36個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅰ′)的一部分或全部順序Ile-X1-X2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-X3-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn (Ⅰ′)其中X1是Asp或Glu，X2是Val或Ile，X3是Glu或Asp;(2)含約26到40個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅱ)的一部分或全部順序Gly-Ala-Arg-Ala-Ser-Val-Leu-Ser-Gly-Gly-Glu-Leu-Asp-Arg-Trp-Glu-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys-His (Ⅱ)(3)含約14到27個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅲ)的一部分或全部順序Ile-Val-Trp-Ala-Ser-Arg-Glu-Leu-Glu-Arg-Phe-Ala-Val-Asn-Pro-Gly-Leu-Leu (Ⅲ)(4)含約28到42個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅳ)的部分或全部順序Glu-Thr-Ser-Glu-Gly-Cys-Arg-Gln-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Gln-Pro-Ser-Leu-Gln-Thr-Gly-Ser-Glu-Glu-Leu-Arg-Ser-Leu-Tyr-Asn-Thr-Val-Ala-Thr-Leu (Ⅳ)(5)含約12至25個(gè)氨基酸的肽，其順序?qū)?yīng)于式(Ⅴ)的一部分或全部順序 Ala-Gln--Gln-Ala-Ala-Ala-Asp-Thr-Gly-His-Ser-Ser-Gln-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr (Ⅴ)這些肽的類似物，其所述順序中的氨基酸可被置換、缺失或加入，只要保存從順序的三維構(gòu)型來(lái)的對(duì)HIVp17抗體的免疫反應(yīng)性，和所述肽的結(jié)合物及其類似物，使至少一個(gè)體液樣品經(jīng)過(guò)親和層析以去除對(duì)愛(ài)滋病發(fā)展設(shè)有保護(hù)作用的抗體，和/或富集血清中對(duì)愛(ài)滋病的發(fā)展起保護(hù)作用的抗體。
全文摘要
長(zhǎng)度約為12到40個(gè)氨基酸的HIVp17蛋白片段被用作檢測(cè)和治療愛(ài)滋病的診斷劑和疫苗。特異性肽片段從N末端延伸至C末端。經(jīng)測(cè)試對(duì)HIVp17陽(yáng)性的病人血清中的抗體具免疫反應(yīng)性。
文檔編號(hào)A61K39/21GK1052310SQ9010841
公開(kāi)日1991年6月19日 申請(qǐng)日期1990年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月12日
發(fā)明者保羅·H·內(nèi)勒, 王蘇孫 申請(qǐng)人:病毒技術(shù)公司, 喬治·華盛頓大學(xué)