本發(fā)明涉及一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，屬于治療膠質(zhì)母細胞瘤藥物領域。

背景技術：

1、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma,?gbm）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率高達48%，嚴重威脅著人類的生命健康。gbm在腦內(nèi)的浸潤性生長特性使得其治療極具挑戰(zhàn)性，盡管現(xiàn)代醫(yī)療技術如術中導航、術中喚醒等顯微手術，以及分子病理指導下的放化療等綜合治療手段已廣泛應用于gbm的治療，但患者的中位生存期仍不足14.6個月，5年生存率更是低于5%。這一嚴峻的現(xiàn)狀使得gbm的治療成為醫(yī)學界亟待攻克的難題。

2、有研究證實：gbm?呈異質(zhì)性，其內(nèi)僅占一小部分的膠質(zhì)瘤干細胞（glioblastomastem?cells，gscs）是造成?gbm?常規(guī)治療抵抗和復發(fā)的根源，其掌控著膠質(zhì)瘤患者的命運。這些干細胞具有強大的自我更新與成瘤能力，是導致gbm對放化療產(chǎn)生抵抗、實現(xiàn)免疫逃逸以及復發(fā)的主要根源?，F(xiàn)有的治療方案，如手術和術后tmz同步放化療，雖然能在短期內(nèi)殺滅大量已分化的非干性膠質(zhì)母細胞瘤細胞（non-stem?glioblastoma?cells，nsgcs），但對于腦內(nèi)殘留的gscs卻束手無策。因此，只有同時針對gbm中的gscs和nsgcs，才能有望實現(xiàn)gbm的根治。

3、構建哌立福新和sistat3的納米脂質(zhì)體前藥，表面修飾氯代毒素，靶向阻斷akt和stat3，耗竭膠質(zhì)瘤干細胞。解決的問題：哌立福新口服副作用大，腦內(nèi)藥物濃度低。哌立福新合成為脂質(zhì)體后，可以作為遞送核酸類藥物，例如小干擾rna（sirna）的遞送載體，可以實現(xiàn)多條通路的靶向抑制?，F(xiàn)有技術的不足：sirna的轉(zhuǎn)染試劑只是單獨作為遞送載體。

技術實現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明利用哌立福新單藥合成為脂質(zhì)體后，在作為遞送載體的同時，本身可以殺死膠質(zhì)瘤細胞；具體為一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體。

2、本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的，一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，取5mg、?cltx-peg2000-dspe，10?mg、perifosine，10?mg、dspe-peg2000和10?mg、膽固醇，分別溶解在1ml無水乙醇中，得到對應的四種物質(zhì)溶液，并對上述四種物質(zhì)溶液依次取體積2ul，5ul，2ul，5ul，加入300?μl?無水乙醇中，避光磁力攪拌30?min，得到脂質(zhì)體混合液；

3、將100mg、dotap溶于2ml無水乙醇得到dotap溶液，再將10μmol、sirna溶于1l無核酶水得到sirna溶液，取0.6μl、dotap溶液與10μl、sirna溶液渦旋混合，再加入1ml無核酶水，得到sirna水溶液；

4、然后將脂質(zhì)體混合液緩慢滴入sirna水溶液中，避光磁力攪拌30?min，制備后得到c/p/d/sistat3脂質(zhì)體（氯代毒素修飾的哌立福新/sirna脂質(zhì)體）；

5、所述cltx-peg2000-dspe為氯代毒素-聚乙二醇-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。

6、作為本發(fā)明所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體的優(yōu)選方案：所述sirna水溶液中dotap與sirna按照氮磷比10:1混合。

7、作為本發(fā)明所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體的優(yōu)選方案：所述cltx-peg2000-dspe的制備方法如下：

8、將5mg氯代毒素（cltx）與9mg、dspe-peg2000-pdp加入1ml、dmso溶液中，避光，磁力攪拌96?h，將溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量3500?kd的透析袋中，然后在無核酶水中透析48?h，得到透析液，即cltx-peg2000-dspe，將透析袋中液體凍干，-20°c保存?zhèn)溆茫?/p>

9、所述dspe-peg2000-pdp為1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇2000-巰基吡啶。

10、作為本發(fā)明所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體的優(yōu)選方案：所述氯代毒素（cltx）與dspe-peg2000-pdp反應生成cltx-peg2000-dspe的反應方程式如下：

11、。

12、作為本發(fā)明所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體的優(yōu)選方案：檢測所述透析液中2-巰基吡啶在343納米處吸光值無明顯變化時，反應結束。其中，343納米處吸光值，反應48小時后od為4.706，反應72小時后od為5.094，反應84小時后od為5.365，反應96小時后od為5.37。證明氯代毒素與dspe-peg2000-pdp反應生成cltx-peg2000-dspe。

13、作為本發(fā)明所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體的優(yōu)選方案：所述sirna基因序列為：sense?(5’-3’)?caucugccuagaucggcua，antisense?(5’-3’):uagccgaucuaggcagaug。

技術特征：

1.一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，其特征在于：取5?mg、?cltx-peg2000-dspe，10?mg、perifosine，10?mg、dspe-peg2000和10?mg、膽固醇，分別溶解在1ml無水乙醇中，得到對應的四種物質(zhì)溶液，并對上述四種物質(zhì)溶液依次取體積2ul，5ul，2ul，5ul，加入300?μl無水乙醇中，避光磁力攪拌30?min，得到脂質(zhì)體混合液；

2.根據(jù)權利要求1所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，其特征在于：所述sirna水溶液中dotap與sirna按照氮磷比10:1混合。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，其特征在于：所述cltx-peg2000-dspe的制備方法如下：

4.根據(jù)權利要求3所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，其特征在于：所述氯代毒素與dspe-peg2000-pdp反應生成cltx-peg2000-dspe的反應方程式如下：

5.根據(jù)權利要求3所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，其特征在于：檢測所述透析液中2-巰基吡啶在343納米處吸光值，當吸光值無明顯變化時，反應結束；從而證明氯代毒素與dspe-peg2000-pdp反應生成cltx-peg2000-dspe。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種遞送sirna的哌立福新前藥脂質(zhì)體，其特征在于：所述sirna基因序列為：sense?(5’-3’)?caucugccuagaucggcua。

技術總結
本發(fā)明公開了一種遞送siRNA的哌立福新前藥脂質(zhì)體，取CLTX?PEG2000?DSPE，perifosine，DSPE?PEG2000和膽固醇，分別溶解，加入無水乙醇中，避光磁力攪拌，得到脂質(zhì)體混合液；將DOTAP溶于無水乙醇得到DOTAP溶液，再將siRNA溶于無核酶水得到siRNA溶液，取DOTAP溶液與siRNA溶液渦旋混合，再加入無核酶水，得到siRNA水溶液；然后將脂質(zhì)體混合液緩慢滴入siRNA水溶液中，避光磁力攪拌，制備后得到C/P/D/siSTAT3脂質(zhì)體；本發(fā)明將藥物哌立福新作為原料合成為脂質(zhì)體外殼，減少了脂質(zhì)體合成時輔料的使用量。

技術研發(fā)人員：朱玉輻,劉洪梅,杭殿成,張雪峰,金家祺,林玉偉
受保護的技術使用者：徐州醫(yī)科大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/17