本發(fā)明屬于含有機(jī)有效成分的醫(yī)藥配制品技術(shù)領(lǐng)域，涉及hc-067047在藥物或保健品制備領(lǐng)域的新用途。

背景技術(shù)：

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最多的腫瘤類型。據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)顯示：膠質(zhì)瘤約占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的26.9％，而占顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的71％左右。近年來，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢。由于膠質(zhì)瘤的侵襲性生長方式，與周圍的正常腦組織界限模糊，很難通過手術(shù)徹底清除。目前針對(duì)術(shù)后殘留的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，主要采用放療、化療等措施來加以殺滅，然而這些術(shù)后殘留病變對(duì)放療、化療等措施表現(xiàn)出顯著的抵抗性，導(dǎo)致復(fù)發(fā)率明顯高過其他腫瘤。過去的幾十年來，盡管多種新興的治療手段不斷取得進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍不盡如人意，膠質(zhì)瘤患者的生存期依然未有明顯改善。因此，針對(duì)膠質(zhì)瘤的新且有效治療策略和治療藥物是亟待解決的難題。

瞬時(shí)感受器電位辣椒素4型(trpv4:transientreceptorpotential,vanilloidtype4)屬于trp超家族的一員，為非選擇型陽離子通道受體，主要調(diào)節(jié)鈣離子的細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)。hc-067047是新發(fā)現(xiàn)的高效特異的trpv4阻滯劑，目前作為一種科學(xué)研究試劑，主要用于trpv4的阻斷后效應(yīng)的研究。迄今為止，尚無文獻(xiàn)報(bào)道trpv4及其阻滯劑hc-067047在膠質(zhì)瘤中的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于考察trpv4及其阻滯劑hc-067047對(duì)膠質(zhì)瘤的作用，以期開發(fā)出新的抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品，從而為膠質(zhì)瘤的臨床治療或日常保健提供更多有效的備選藥物或保健品。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，trpv4在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞侵襲，而trpv4的阻滯劑hc-067047具有抵抗膠質(zhì)瘤的功能，主要通過阻斷smallrho-gtpase家族信號(hào)通路，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的骨架重塑，減少細(xì)胞偽足，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，在進(jìn)一步的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了上述結(jié)論。

因此，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

hc-067047在制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述抗膠質(zhì)瘤是抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

進(jìn)一步，所述抗膠質(zhì)瘤是通過阻斷smallrho-gtpase家族信號(hào)通路引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞骨架重塑進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明公開了trpv4的阻滯劑hc-067047用于制備抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品的新用途，不僅擴(kuò)大了hc-067047的應(yīng)用范圍，提高了其應(yīng)用價(jià)值，給膠質(zhì)瘤的治療或保健帶來了新的希望，并且，以hc-067047作為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)修飾或改造提高活性或降低副作用，還有助于進(jìn)一步開發(fā)新的抗膠質(zhì)瘤的藥物或保健品。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1顯示了hc-067047能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖無影響，其中a為劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(與dmso組比較，p<0.01)，b為transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(與dmso組比較，p<0.01)，c為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，d為cck-8生長曲線測定結(jié)果。

圖2顯示了hc-067047在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能阻斷smallrho-gtpase家族信號(hào)通路引起細(xì)胞骨架重塑進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，其中a為100nm的hc-067047處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后的免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，b為不同濃度(50nm、100nm)的hc-067047處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后的免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果(*p<0.05；#p<0.01)。

圖3顯示了hc-067047在皮下接種和原位接種的鼠模型上具有抑制膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的功能，其中a為小鼠皮下成瘤的在體圖片及腫瘤體積示意圖，b為小鼠顱內(nèi)成瘤磁共振檢測結(jié)果，c為顱內(nèi)原位成瘤的小鼠的生活狀態(tài)以及小鼠生存曲線，d為顱內(nèi)原位成瘤的死亡小鼠大腦的he染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

一、hc-067047能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖無影響

通過劃痕實(shí)驗(yàn)與transwell小室培養(yǎng)細(xì)胞穿透實(shí)驗(yàn)檢測hc-067047對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響。通過流式細(xì)胞周期檢測和cck-8實(shí)驗(yàn)檢測hc-067047對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。

劃痕實(shí)驗(yàn)：用0.25％的胰酶消化原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)，計(jì)數(shù)適量的細(xì)胞數(shù)用完全培養(yǎng)基重懸后，加入6孔板中培養(yǎng)，至次日細(xì)胞完全貼壁后，pbs洗去漂浮細(xì)胞，分為兩組(hc-067047組和dmso組)，每組3個(gè)孔，每孔作3條劃痕(用10μl移液器套槍頭以直尺倚靠作劃痕)，hc-067047組每孔加入100nm的hc-067047(以dmso為溶劑)，dmso組每孔加入等體積的溶劑dmso，兩組每孔再加入無血清f12/dmem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后0小時(shí)和24小時(shí)于顯微鏡下拍照，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用imagej分析細(xì)胞劃痕的愈合面積。結(jié)果見圖1a，原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)100nm的hc-067047處理24小時(shí)后，劃痕面積縮小了12％；而dmso組劃痕愈合情況良好，面積縮小了32％。

transwell小室培養(yǎng)細(xì)胞穿透實(shí)驗(yàn)：用0.25％的胰酶消化原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)，計(jì)數(shù)適量的細(xì)胞數(shù)用無血清培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶個(gè)/ml，分為兩組(hc-067047組和dmso組)，每組3個(gè)小室(8.0um)，每個(gè)預(yù)包被基質(zhì)膠的小室的上室內(nèi)加入上述細(xì)胞懸液200μl，hc-067047組的下室內(nèi)加入10％血清培養(yǎng)基600μl和100nm的hc-067047(以dmso為溶劑)，dmso組的下室內(nèi)加入10％血清培養(yǎng)基600μl和等體積的溶劑dmso，24小時(shí)后取出小室，用棉簽將小室內(nèi)的基質(zhì)膠和未穿過的細(xì)胞全部擦除，將小室放入4％多聚甲醛內(nèi)固定15分鐘，pbs洗滌2次，甲醇通透10分鐘，pbs洗滌2次，結(jié)晶紫染色5分鐘，pbs洗滌2次，將小室倒扣晾干后，小心取下小室下端的膜，用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察，隨機(jī)采取5個(gè)視野的圖像，image-pro-plus6.0計(jì)數(shù)細(xì)胞。結(jié)果見圖1b，原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)100nm的hc-067047處理24小時(shí)后，穿過transwell微孔的細(xì)胞數(shù)量較dmso組減少了89％。

流式細(xì)胞周期檢測：將原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)按1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔培養(yǎng)在6孔板內(nèi)，次日于細(xì)胞貼壁后，將六孔分為兩組(hc-067047組和dmso組)，hc-067047組每孔加入100nm的hc-067047(以dmso為溶劑)，dmso組每孔加入等體積的溶劑dmso，24小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，pbs洗滌2次，胰酶消化收集細(xì)胞，pbs洗滌2次，用4℃預(yù)冷的70％乙醇重懸并固定細(xì)胞，4℃冷藏過夜，次日取出細(xì)胞懸液，離心去固定液，細(xì)胞沉淀用pbs洗滌2次，用細(xì)胞周期測定試劑盒中的碘化丙啶染色液于室溫下避光染色30分鐘后，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期，分析細(xì)胞周期變化。結(jié)果見圖1c，原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)100nm的hc-067047處理24小時(shí)后，相對(duì)于dmso組，細(xì)胞周期沒有受到明顯影響。

cck-8實(shí)驗(yàn)：將原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)分兩組(hc-067047組和dmso組)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞密度為2×10³個(gè)細(xì)胞/孔，每孔加入含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基100μl，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日將培養(yǎng)基更換為無血清dmem/f12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，向hc-067047組加入100nm的hc-067047(以dmso為溶劑)，dmso組加入等體積的溶劑dmso，然后分別在0、1、3、5和7天的同一時(shí)間點(diǎn)向兩組的5個(gè)復(fù)孔中加入cck-8(cellcountingkit-8)，孵育2小時(shí)后測定細(xì)胞在波長450nm處的吸光值，利用graphpad5.0繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果見圖1d，hc-067047對(duì)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖無明顯的抑制作用。

二、hc-067047通過阻斷smallrho-gtpase家族信號(hào)通路引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞骨架重塑進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測hc-067047處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)改變。通過western-blot免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測hc-067047處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)smallrho-gtpase家族信號(hào)通路的變化。

免疫熒光染色：用細(xì)胞共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)2000個(gè)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)，至正常生長狀態(tài)后，分別給予100nm的hc-067047(以dmso為溶劑)和dmso處理細(xì)胞過夜，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，0.3％trixton-100通透細(xì)胞，5％bsa封閉半小時(shí)，用trpv4抗體(稀釋度為1:100)避光4℃孵育過夜，次日去除抗體孵育液，pbs洗滌3次后，用cy3標(biāo)記的二抗(稀釋度為1:200)室溫下孵育2小時(shí)，pbs洗滌3次后，用fitc-phalloidin(稀釋度為1:100)室溫下避光染色2小時(shí)，棄掉染色液，pbs洗滌3次后，用dapi室溫下避光染色5分鐘，pbs洗滌3次后，于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果見圖2a，用hc-067047處理原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，細(xì)胞的骨架形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞表面的突起和偽足明顯減少，細(xì)胞形態(tài)由原本的長梭狀變成圓而短的形態(tài)，這樣的結(jié)構(gòu)減少了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

western-blot免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)：分別用50nm、100nm的hc-067047(以dmso為溶劑)和dmso處理原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)，ripa細(xì)胞裂解液加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑pmsf混勻后提取細(xì)胞總蛋白，測定濃度后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別用rhoa、gtp-rhoa、cdc42、gtp-cdc42、rac1、gtp-rac1的抗體進(jìn)行免疫雜交，孵二抗后顯示條帶，用image-j軟件計(jì)算條帶灰度值，繪制曲線。結(jié)果見圖2b，hc-067047處理原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的rhoa、cdc42和rac1的活性明顯降低，且呈劑量依賴關(guān)系。

三、hc-067047在皮下接種和原位接種的鼠模型上具有抑制膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的功能

將4周齡的裸鼠隨機(jī)分成兩組(hc-067047組和生理鹽水組)，每組5只，每只裸鼠皮下注射1×10⁵萬個(gè)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)，7天后開始給予荷瘤小鼠腹腔注射給藥，hc-067047組按0.01mg/kg的劑量給予hc-067047(以生理鹽水為溶劑)，生理鹽水組給予等體積的溶劑生理鹽水，連續(xù)給藥21天，期間每日觀察兩組裸鼠的生活狀態(tài)，每周用游標(biāo)卡尺測量并記錄裸鼠的皮下腫瘤體積大小，將體積大小匯總制作腫瘤體積大小變化曲線。結(jié)果見圖3a，hc-067047組裸鼠的腫瘤體積大小較生理鹽水組明顯減小。

將4周齡的裸鼠隨機(jī)分成兩組(hc-067047組和生理鹽水組)，每組5只，每只裸鼠顱內(nèi)原位注射1×10⁵萬個(gè)原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u87細(xì)胞)，3天后開始給予荷瘤小鼠腹腔注射給藥，hc-067047組按0.01mg/kg的劑量給予hc-067047(以生理鹽水為溶劑)，生理鹽水組給予等體積的溶劑生理鹽水，連續(xù)給藥10天，應(yīng)用小動(dòng)物磁共振檢測顱內(nèi)腫瘤大小，每日觀察兩組裸鼠的生活狀態(tài)，記錄裸鼠死亡時(shí)間，至最后1只裸鼠死亡為止，繪制裸鼠生存曲線，然后將每只死亡裸鼠進(jìn)行解剖，取出整塊大腦，肉眼觀察外觀，再進(jìn)行he染色。磁共振檢測顯示，經(jīng)hc-067047處理的裸鼠顱內(nèi)移植瘤的侵襲性生長的體積明顯小于生理鹽水組(圖3b)。顱內(nèi)移植瘤模型建立后15天，觀察裸鼠發(fā)現(xiàn)：生理鹽水組小鼠出現(xiàn)明顯的惡病質(zhì)狀態(tài)，體重減輕，活動(dòng)及進(jìn)食均減少，而經(jīng)hc-067047處理的裸鼠生活狀態(tài)較好，體重正常，活動(dòng)及進(jìn)食均正常。生存曲線顯示，hc-067047能夠明顯地延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間(p<0.01)(圖3c)。he染色結(jié)果顯示，hc-067047組裸鼠大腦中，膠質(zhì)瘤向正常腦組織的遷移明顯受到抑制(圖3d)。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。