本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及鐮形棘豆中具有抗炎活性總黃酮的提取方法。
背景技術(shù)：
：黃酮類化合物是兩個苯環(huán)通過中央三碳相互聯(lián)接而成的一系列化合物。母體結(jié)構(gòu)包括包括黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類以及查爾酮類等。藏藥鐮形棘豆(OxytropisfalcateBunge)(藏藥名為莪達夏)是豆科(Leguminosae)棘豆屬(OxytropisD.C.)多年生草本植物。生長在2700～4300m的河灘、沙地、山坡、草甸，主要產(chǎn)于青藏高原。據(jù)《晶珠本草》記載，鐮形棘豆具有愈合瘡口、利便、防止骨刺產(chǎn)生、治病痛、除毒、止血之功效，并能清毒、治療炭疽病、麻風(fēng)病及流感、扁桃體炎。臨床研究證明，鐮形棘豆對于預(yù)防、治療流行性感冒及慢性氣管炎有獨特療效。并且，藥理實驗證明鐮形棘豆總黃酮苷元是治療慢性氣管炎的有效部分，并能增加腎上腺皮質(zhì)功能，說明黃酮類化合物是鐮形棘豆的重要活性成分。因此，如何有效提取出鐮形棘豆中的總黃酮，具有重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鐮形棘豆中總黃酮的提取方法，包括以下步驟：取鐮形棘豆，加入濃度為70％-80％醇類溶劑，微波提取，所述醇類溶劑與藥材的體積質(zhì)量比為10～35:1mL/g。進一步地，所述醇類溶劑為甲醇或乙醇。進一步地，所述醇類溶劑的濃度為75％。進一步地，所述微波提取的功率為200W～900W。進一步地，所述微波提取的功率為600W～900W，優(yōu)選700W。進一步地，所述微波提取的時間為10分鐘～40分鐘。進一步地，所述微波提取的時間為20分鐘～40分鐘，優(yōu)選30分鐘。進一步地，所述醇類溶劑與藥材的體積質(zhì)量比為20-35:1mL/g，優(yōu)選25:1mL/g。進一步地，所述微波提取溫度為80～95℃，優(yōu)選85℃。本發(fā)明還提供了一種鐮形棘豆中總黃酮提取物，所述提取物是按照下述方法制備得到的：(1)取鐮形棘豆，按照前述的提取方法制備得到鐮形棘豆中總黃酮提取液；(2)濃縮提取液，陶瓷膜濾過，有機膜純化，取濾液，干燥即得。本發(fā)明還提供了前述鐮形棘豆總黃酮提取物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明鐮形棘豆中具有抗炎活性總黃酮的提取方法，簡便快速，可以有效提取出鐮形棘豆中的總黃酮。同時，本發(fā)明得到的鐮形棘豆提取物對LPS誘導(dǎo)的炎癥模型具有顯著的改善作用，主要通過抑制炎癥因子NO、TNF-α等釋放，直接發(fā)揮抑制作用，從而表現(xiàn)出抗炎作用。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實施方式鐮形棘豆于2015年8月采自青海省海北州，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所孫菁副研究員鑒定；蘆丁標準品購自中國藥品檢定所(批號：100080-200707，含量為90.5％，)，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。自制超純水。微波提取儀(RWBC，南京蘇恩瑞公司)METTLERTOLEDOPL203和XS204電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TU-1901型紫外可見分光光度計；料液比的單位為ml/g?？傸S酮測定方法如下：(1)對照品溶液的制備取蘆丁對照品20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加75％乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取25ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml中含蘆丁0.2mg)。(2)標準曲線繪制精密量取對照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分別置25ml量瓶中，各加30％乙醇至6ml，加5％亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6分鐘，再加10％硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加30％乙醇至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2015年版四部)，在500nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。(3)樣品溶液的制備準確稱取1g干燥的鐮形棘豆原料，置于50mL圓底燒瓶中。在選定微波功率、液料比、提取時間、提取溫度、乙醇濃度等條件進行微波提取，提取液過濾并定容至50mL，即為樣品溶液。(4)鐮形棘豆中總黃酮提取率計算精密量取供試品溶液2ml，置25ml量瓶中，加30％乙醇至6ml，照標準曲線制備項下的方法，自“加5％亞硝酸鈉溶液1ml”起，依法測定吸光度，同時取供試品溶液2ml，除不加氫氧化鈉試液外，其余同上操作，作為空白，從標準曲線上讀出供試品溶液中含蘆丁的濃度，根據(jù)下列公式計算，即得。A(％)＝BCm/D×100式中：B為供試液中蘆丁的含量(μg/mL)，C為最終定容體積(mL)，D為稀釋倍數(shù)，m為原料質(zhì)量(g)。實施例1本發(fā)明鐮形棘豆中總黃酮的提取方法發(fā)明人對鐮形棘豆中總黃酮的提取方法進行了多個工藝參數(shù)的考察。(1)微波功率的考察準確稱取1g干燥的鐮形棘豆原料，置于圓底燒瓶中，提取40min，液料比為20:1，提取溫度為50℃，考察不同微波功率對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如表1所示。表1功率(W)200300400500600700800900提取率(％)0.570.680.770.820.961.151.081.01結(jié)果表明，在200W～900W范圍內(nèi)，均可以有效提取出鐮形棘豆中的黃酮。其中，600W～900W范圍內(nèi)效果較佳，700W效果最佳。(2)提取時間的考察準確稱取1g干燥的鐮形棘豆原料，置于圓底燒瓶中，乙醇濃度為75％，提取溫度為50℃，微波功率為700W時，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如表2所示。表2時間(min)101520303540提取率(％)0.670.850.971.131.041.03結(jié)果表明，在10分鐘～40分鐘范圍內(nèi)，均可以有效提取出鐮形棘豆中的黃酮。其中，20分鐘～40分鐘范圍內(nèi)效果較佳，30分鐘效果最佳。(3)液料比的考察準確稱取1g干燥的鐮形棘豆原料，置于圓底燒瓶中，微波功率為700w，提取35min，乙醇濃度為75％時，考察不同液料比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如表3所示。表3結(jié)果表明，在1:10～1:35范圍內(nèi)，均可以有效提取出鐮形棘豆中的黃酮。其中，1:20～1:35范圍內(nèi)效果較佳，1:25效果最佳。(4)溫度的考察準確稱取1g干燥的鐮形棘豆原料，置于圓底燒瓶中，微波功率為700w，提取35min，乙醇濃度為75％時，考察不同溫度比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如表4所示。表4溫度(℃)7080859095提取率(％)0.850.971.151.111.06結(jié)果表明，在70-95℃范圍內(nèi)，均可以有效提取出鐮形棘豆中的黃酮。其中，80～95℃范圍內(nèi)效果較佳，85℃效果最佳。在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，發(fā)明人對提取工藝進行了進一步優(yōu)化篩選，結(jié)果顯示，當微波功率到731W，提取時間為26分鐘，液料比26：1時，該條件下鐮形棘豆中總黃酮提取率為1.56％。實施例2本發(fā)明鐮形棘豆總黃酮提取物的制備1)微波提?。何⒉ㄌ崛」β蕿?31w，提取時間為26min，液料比為26，80％甲醇提取。2)提取液濃縮。3)陶瓷膜過濾除雜：0.2um陶瓷膜，壓力1MPa，流速21ml每分鐘，除去細渣子、泥土等雜質(zhì)，回收透過測溶液。4)有機膜分離純化：采用分子量為2000的分子量有機膜進行純化，壓力為0.7MPa，流速2ml每分鐘，收集透過測溶液5)干燥：微波干燥冷凍干燥噴霧干燥6)黃酮含量>50％.具體組成包括7-羥基二氫黃酮、5,7-二羥基-4’-甲氧黃酮醇、5,7-二羥基雙氫黃酮、2’,4’-二羥基-查爾酮、2’,4’-二羥基二氫查爾酮、蘆丁、刺槐素、(2R,3R)-(+)-香橙素-3-β-D-葡萄糖、山奈酚-3-葡萄糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖、oxytroflavosideA、oxytroflavosideB、CoxytroflavosideC、oxytroflavosideF、oxytroflavosideG。實施例3本發(fā)明鐮形棘豆提取物的制備制備方法：1)微波提?。何⒉ㄌ崛」β蕿?31w，提取時間為26min，液料比為26，75％乙醇提取。2)提取液濃縮。3)陶瓷膜過濾除雜：0.1um陶瓷膜，壓力3MPa，流速50ml每分鐘，除去細渣子、泥土等雜質(zhì)，回收透過測溶液。4)有機膜分離純化：采用分子量為2000的分子量有機膜進行純化，壓力為1MPa，流速50ml每分鐘，收集透過測溶液。5)干燥微波干燥、冷凍干燥、噴霧干燥。6)黃酮含量>50％。具體組成包括7-羥基二氫黃酮、5,7-二羥基-4’-甲氧黃酮醇、5,7-二羥基雙氫黃酮、2’,4’-二羥基-查爾酮、2’,4’-二羥基二氫查爾酮、蘆丁、刺槐素、(2R,3R)-(+)-香橙素-3-β-D-葡萄糖、山奈酚-3-葡萄糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖、oxytroflavosideA、oxytroflavosideB、CoxytroflavosideC、oxytroflavosideF、oxytroflavosideG。實施例4本發(fā)明鐮形棘豆提取物的制備制備方法：1)微波提取，微波提取功率為731w，提取時間為26min，液料比為26，75％乙醇提取。2)提取液濃縮3)陶瓷膜過濾除雜：0.2um陶瓷膜，壓力2MPa，流速30ml每分鐘，除去細渣子、泥土等雜質(zhì)，回收透過測溶液。4)有機膜分離純化：采用分子量為2000的分子量有機膜進行純化，壓力為0.8MPa，流速40ml每分鐘，收集透過測溶液。5)干燥微波干燥、冷凍干燥、噴霧干燥。6)黃酮含量>50％。具體組成包括7-羥基二氫黃酮、5,7-二羥基-4’-甲氧黃酮醇、5,7-二羥基雙氫黃酮、2’,4’-二羥基-查爾酮、2’,4’-二羥基二氫查爾酮、蘆丁、刺槐素、(2R,3R)-(+)-香橙素-3-β-D-葡萄糖、山奈酚-3-葡萄糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖、oxytroflavosideA、oxytroflavosideB、CoxytroflavosideC、oxytroflavosideF、oxytroflavosideG。實施例5本發(fā)明提取物的抗炎活性抗炎活性1)MTT法檢測提取物的RAW264.7細胞毒性IC50>2002)培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7，分別檢測TNF-α，IL-1β、IL-6、NO的指標，檢測方法見文獻：1張磬方，王強松，崔元璐，痹祺膠囊提取物對RAW264.7細胞模型的抗炎作用，中成藥，2014，36(1)：26-30.2汪娟，蔣維，王毅，降香中黃酮類化合物對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細胞抗炎作用研究，細胞與分子免疫學(xué)雜志，2013,29(7)：681-684.3石孟瓊，覃惠林，張永峰，劉英，鄧為，楊文雁，等，木瓜三萜對脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細胞炎癥模型細胞因子的影響，中藥藥理與臨床，2016,32(3)：76-80.4羅福玲，趙恒光，李洪忠，萬敬員，周岐新，粉防己堿對脂多糖誘導(dǎo)下RAW264.7細胞炎癥模型細胞因子的作用，中草藥，2011,42(3):542-545.3)檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明得到的鐮形棘豆提取物對LPS誘導(dǎo)的炎癥模型具有顯著的改善作用，主要通過抑制炎癥因子NO、TNF-α等釋放，直接發(fā)揮抑制作用，從而表現(xiàn)出抗炎作用。當前第1頁1 2 3