抗HCMV UL128基因123-143位點(diǎn)的siRNA序列及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗HCMVUL128基因123-143位點(diǎn)的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-ACGCTGTTACGATTTCAAAAT-3’。本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇的siRNA的cDNA序列GC含量為33.3%，對(duì)應(yīng)UL128mRNA的123-143核苷酸位點(diǎn)。構(gòu)建針對(duì)人巨細(xì)胞病毒UL128基因的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，能有效抑制UL128基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，可在制備治療人巨細(xì)胞病毒感染性耳聾藥物中的應(yīng)用治。
【專利說(shuō)明】抗叩1^1128基因123-143位點(diǎn)的5丨[^八序列及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及分子生物學(xué)和基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及針對(duì)人巨細(xì) 胞病毒UL128基因的siRNA序列的設(shè)計(jì)、篩選及其在制備治療人巨細(xì)胞病毒感染性耳聾藥 物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 先天性耳聾是最常見(jiàn)的出生缺陷，其發(fā)生率約為0. 19T0. 3%，已成為影響我國(guó)優(yōu) 生優(yōu)育和人口素質(zhì)的主要問(wèn)題之一。人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV)可 通過(guò)胎盤(pán)、產(chǎn)道、母乳等途徑在母嬰之間傳播，是導(dǎo)致感染性先天性耳聾最主要的病原體。 兒童先天性感覺(jué)神經(jīng)性耳聾中至少有40%可歸因于HCMV感染，且HCMV感染的致聾率及 耳聾嚴(yán)重程度與病毒負(fù)載量呈正相關(guān)。有癥狀的先天性HCMV感染患兒的耳聾發(fā)生率約 為229T65%，無(wú)癥狀患兒的耳聾發(fā)生率為69T23%，而且感覺(jué)神經(jīng)性耳聾是無(wú)癥狀的先天性 HCMV感染最常見(jiàn)的后遺癥。對(duì)動(dòng)物巨細(xì)胞病毒感染性耳聾模型的研究顯示，除病毒直接導(dǎo) 致細(xì)胞病變效應(yīng)外，炎癥反應(yīng)可能在耳聾發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了更重要的作用。
[0003] 趨化因子（chemokine)是一類能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分 子細(xì)胞因子，根據(jù)其N端半胱氨酸殘基的數(shù)目和位置可以分為CXC ( ?)、〇：(0)、(：（7)和〇\(：(5)4個(gè)亞家族。病毒干擾宿主細(xì)胞趨化因子及其受體相互作 用最直接的方式是自身表達(dá)趨化因子類似物。UL128為HCMV表達(dá)的類趨化因子，主要 具有兩方面的功能：⑴以單體形式存在時(shí)，發(fā)揮體外趨化人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)、結(jié) 合趨化因子受體、影響胞內(nèi)鈣離子濃度、激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等趨化因子功能；⑵與gH、gL、 UL130、UL131A蛋白組成復(fù)合物，在HCMV侵入內(nèi)皮和上皮細(xì)胞過(guò)程發(fā)揮重要作用。目前研究 發(fā)現(xiàn)，在人內(nèi)耳上皮細(xì)胞與PBMC的體外共培養(yǎng)模型中，UL128能顯著促進(jìn)炎癥因子IL-6和 TNF-a的釋放。因此，UL128可能是HCMV感染性耳聾發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白，抑制UL128 的表達(dá)有望成為HCMV感染性耳聾防治的新手段。
[0004] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是序列特異的雙鏈RNA使細(xì)胞內(nèi)同源mRNA 降解，從而產(chǎn)生特異性基因表達(dá)沉默的過(guò)程。RNAi的作用主要由長(zhǎng)約21~23nt的小干擾RNA (siRNA)介導(dǎo)，由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特異性降解，因此要產(chǎn)生有效RNAi 的關(guān)鍵是選擇合適的siRNA作用靶點(diǎn)。RNAi靶點(diǎn)的選擇原則主要包括：①?gòu)陌谢蚱鹗济?碼子下游5(Tl00nt開(kāi)始查找；②選擇以AA或NA (N代表任意堿基)開(kāi)始的序列；③選擇GC 含量在30%-52%左右的mRNA區(qū)域；④避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列；⑤保證靶序列 與其他基因沒(méi)有同源性。目前，制備siRNA的方法主要包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、長(zhǎng)片 段dsRNA經(jīng)RNaseIII降解法、siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄法及PCR制備的siRNA表達(dá)框法等5種。 目前，RNAi已在HIV、HBV、HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要進(jìn)展。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的是提供一種抗HCMV UL128基因123-143位點(diǎn)的siRNA的cDNA序列，其 核苷酸序列是：5' -ACGCTGTTACGAITTCAAAAT-3'。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該cDNA序列在制備治療HCMV感染性耳聾藥物中的應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇的siRNA的cDNA序列GC含量為33. 3%，對(duì)應(yīng) UL128 mRNA的123-143核苷酸位點(diǎn)。構(gòu)建針對(duì)HCMV UL128基因的siRNA真核表達(dá)載體， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染已感染HCMV的MRC-5細(xì)胞和人內(nèi)耳上皮細(xì)胞，能有效抑制 UL128基因的mRNA水平，因此可應(yīng)用于人巨細(xì)胞病毒治療藥物的制備。
[0008] 本發(fā)明的有益之處是：提供的siRNA序列針對(duì)HCMV的類趨化因子編碼基因 UL128,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)用siRNA表達(dá)載體法篩選HCMV UL128基因有效siRNA序列的報(bào)道。 以此序列為基礎(chǔ)的真核表達(dá)載體具有在細(xì)胞中持續(xù)、有效抑制UL128基因mRNA的優(yōu)點(diǎn)，故 可作為HCMV感染性耳聾防治的一個(gè)新靶點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用 于限制本發(fā)明的范圍。
[0010] 實(shí)施例1SiRNA真核表達(dá)載體體外抑制UL128-EGFP融合蛋白的表達(dá) 1. siRNA的設(shè)計(jì)：根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，從UL128 mRNA起始密碼子AUG下游50nt處搜 索NA序列，其3'端相鄰21nt序列作為候選靶點(diǎn)，從中選擇GC含量在3(T52%的siRNA序 列，并通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast功能與人類基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確保無(wú)同源性。最終 選擇的 siRNA 其 cDNA 序列為 5'-ACGCTGITACGATITCAAAAT-3'，GC 含量為 33. 3%，對(duì)應(yīng) UL128 mRNA的123-143核苷酸位點(diǎn)。
[0011] 2.表達(dá)siRNA所需shDNA的合成與制備：表達(dá)siRNA所需shDNA的正義鏈序列 為 5' -GATCCACGCTGTTACGATTTCAAAATTTCGATTTTGAAATCGTAACAGCGTTTTTTA~3,,反義鏈序列 為 5' -AGCTTAAAAAACGCTGTTACGATTTCAAAATCGAAATTTTGAAATCGTAACAGCGTG-3' 委托牛物公 司合成，將正、反義鏈分別退火形成雙鏈。
[0012] 3. siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建：具有U6啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒pSilencer 2. 0-U6 (美國(guó)Ambion公司）用BamH I和Hind III雙酶切，與退火后的shDNA雙鏈連接，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆抽提質(zhì)粒送生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序 鑒定，選取測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒擴(kuò)增、保存。
[0013] 4. siRNA表達(dá)質(zhì)粒體外抑制UL128-EGFP融合蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn) ⑴報(bào)告質(zhì)粒PUL128-EGFP :為表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP)和UL128融合蛋白的質(zhì)粒，由 UL128基因cDNA插入pEGFP-Nl(美國(guó)Clontech公司）的Hind III和EcoR I位點(diǎn)構(gòu)建而成， 由于EGFP位于UL128的下游，且共用一個(gè)啟動(dòng)子，故EGFP的表達(dá)情況可間接反映UL128的 表達(dá)。
[0014] ⑵siRNA表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞：人胚腎細(xì)胞AD293接種12孔 細(xì)胞培養(yǎng)板后，待細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合率，用Invitrogen公司Lipofectamine 2000試劑 將siRNA表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒pUL128-EGFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作方法參照試劑說(shuō)明書(shū)，同時(shí)設(shè) 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pSilencer 2. 0-U6的陰性對(duì)照組和不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照組，5小時(shí)后換培養(yǎng) 液(含10%新生牛血清的DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)。
[0015] ⑶熒光定量RT-PCR檢測(cè)AD293細(xì)胞中UL128 mRNA的表達(dá)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，收集 AD293細(xì)胞，Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，采用TAKARA公司的SYBR PrimeScript RT-RCP Kit檢測(cè)病毒UL128的mRNA，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。UL128基因PCR引物序列為：上游 5'- AAGACCTGACGCCGITCTTG -3'，下游5'-CCAGGITGATCCATCGATAG-3'。內(nèi)參照采用GAPDH， PCR引物序列為：上游5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5' -GAAGATGGTGATGGGAITTC-3'。 結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)UL128 mRNA表達(dá)的抑制率為66. 9%。 [0016] ⑷流式細(xì)胞儀檢測(cè)AD293細(xì)胞中UL128蛋白表達(dá)情況：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后72h，收集每 孔內(nèi)細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2次后重懸于PBS中。用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢 測(cè)每孔細(xì)胞平均突光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity, MFI)及突光陽(yáng)性細(xì)胞比率a, 計(jì)算每孔細(xì)胞的總突光強(qiáng)度（total fluorescence intensity, TFI) =MFI X a。結(jié)果 顯示，與陰性對(duì)照組相比，siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)UL128蛋白表達(dá)的抑制率為59. 6%。
[0017] 本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū) 所限度的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種抗HCMV UL128基因123-143位點(diǎn)的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是： 5' -ACGCTGTTACGATTTCAAAAT-3'。
2. 權(quán)利要求1所述的cDNA序列在制備治療人巨細(xì)胞病毒感染性耳聾藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/20GK104450701SQ201410757235
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】傅君芬, 尚世強(qiáng), 陶然, 鄭琪, 高慧慧 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)