重組人干擾素-α-2b-BCG的干粉劑制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組人干擾素-α-2b-BCG的干粉劑制備方法，屬于生物工程技術(shù)。其是將重組人干擾素-α-2b-BCG菌種接種到含卡那霉素30微升/毫升的Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基中，獲得一級種子液；再在上述培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接獲得濃度標(biāo)準(zhǔn)OD600的A值＞2的二級種子液；使用生物反應(yīng)發(fā)生器進行大規(guī)模深層發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐原位連接切向流中空過濾柱，對發(fā)酵液離散洗滌菌體，再加入等體積的含有20％蔗糖、1~2％明膠、2％氯化鉀、1~4％谷氨酸鈉的混合液進行保護液置換；并經(jīng)慢速預(yù)冷降溫，真空冷凍干燥成干粉劑。這樣獲得的重組人干擾素-α-2b-BCG菌苗活性率高，降低了生產(chǎn)過程中污染的可能性。
【專利說明】重組人干擾素 -a -2b-BCG的干粉劑制備方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，具體是一種重組人干擾素- a -2b-BCG的干粉劑制備方法。
[0002]

【背景技術(shù)】 重組人干擾素- a -2b-BCG (hIFN-α -2b-BCG)是目前用于膀胱腫瘤免疫灌注治療的生 物制劑。
[0003] 以往卡介苗的凍干制備都是采用蘇通馬鈴薯靜置培養(yǎng)，菌膜擠壓去水，鋼瓶研磨 后凍干的方法，首先進行種子活化：啟開工作種子批菌種，在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴 薯培養(yǎng)基或液體蘇通培養(yǎng)基上靜置培養(yǎng)2~3周，培養(yǎng)傳代活化。然后，進行生產(chǎn)培養(yǎng)：可在 蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上再傳一代或直接挑取生長良好的菌膜，接種于蘇通綜合培養(yǎng)基或經(jīng)批 準(zhǔn)的其他培養(yǎng)基的表面，在培養(yǎng)瓶中，37?39°C恒溫、靜置培養(yǎng)疒14天。生產(chǎn)用培養(yǎng)基為蘇 通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基或液體蘇通綜合培養(yǎng)基。倒入三角瓶內(nèi)加蒸餾水，加熱 使全部溶解；紗布或G3砂芯漏斗過濾后用純氫氧化銨NH 4OH矯正PH至7. 2?7. 4 ;用三角瓶 進行分裝，經(jīng)15磅121 °C，3(Γ40分鐘滅菌備用（馬鈴薯培養(yǎng)基需要將土豆切塊，去離子蒸餾 水中煮沸2(Γ30分鐘，靜置冷卻后脫脂棉紗布過濾，其余按照以上操作進行）培養(yǎng)結(jié)束后逐 瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應(yīng)廢棄。收集菌膜壓干后，移入盛有不銹鋼珠瓶內(nèi)，鋼 珠與菌體的比例應(yīng)根據(jù)研磨機轉(zhuǎn)速控制在一適宜的范圍，并盡可能在低溫下研磨，加入適 量無致敏原保護液稀釋成一定濃度的原液。最后冷凍干燥：以明膠、蔗糖或谷氨酸鈉作為凍 干保護劑/賦形劑，進行真空冷凍干燥。對產(chǎn)品進行質(zhì)量檢測。
[0004] 上述凍干粉劑制備雖然操作成本低廉，但是操作復(fù)雜，生長緩慢，活菌率低，容易 產(chǎn)生污染，過程可控性差。
[0005] 由于重組干擾素 -a-2b_BCG在膀胱腫瘤免疫灌注治療中，用量大，活性要求高， 因此，需要更高效、可控，自動化程度高，活菌率高的大批量生產(chǎn)方法。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，重組干擾素-a-2b_BCG凍干粉劑生產(chǎn)過程操作 復(fù)雜，生長緩慢，活菌率低，容易產(chǎn)生污染，過程可控性差等問題，而提供一種重組人干擾 素 -a -2b_BCG的干粉劑制備方法。
[0007] 本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0008] -種重組人干擾素 -a -2b_BCG的干粉劑制備方法，其實按以下步驟制備的： a.種子活化和培養(yǎng)基制備 采選重組干擾素 -a -2b_BCG菌種并接種于含卡那霉素30微升/毫升的新鮮配制的 Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中獲得一級活化種子液；將一級活化種子液重新接種至上述 培養(yǎng)基中，獲得濃度達標(biāo)準(zhǔn)〇D_的A值>2的二級種子液； 其中的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基是按以下重量份的原料制成的，Middlebrook 7H9 5份、甘油5份、Tween80 5份，加入900份蒸饋水121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘制成A 液；另將葡萄糖2份、牛血清白蛋白5份、NaCl 0. 8份加入100份蒸餾水，0. 22 μ m濾膜過濾 除菌后制成B液，將A液、B液混合制得； b. 生物反應(yīng)器深層培養(yǎng) 發(fā)酵罐中最終裝料容積比6~7:10的發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后，將二級種子液接種到發(fā) 酵罐中，深層發(fā)酵培養(yǎng)7~10天，發(fā)酵期間取樣檢測生長情況并涂玻片抗酸染色檢測無污 染，檢測OD6c?值達2. O以上，收集發(fā)酵液； 其中每升發(fā)酵培養(yǎng)基按以下重量份數(shù)比的原料制備的：7H9 5份、甘油5份、TweenSO 5 份、葡萄糖2份，蒸餾水溶解；培養(yǎng)基配置后調(diào)節(jié)PH至7. (Γ7. 5,高壓蒸汽原位滅菌； c. 離散洗滌和保護液置換 發(fā)酵罐原位連接切向流中空過濾柱I. 5PD600,用3倍體積以上的0. 9%氯化鈉溶液進 行發(fā)酵液置換洗滌，再用6倍以上的1 %谷氨酸鈉無菌液進行置換洗滌，繼續(xù)菌液富集培養(yǎng) 4飛倍，最后加入相同體積的混合液，得到BCG終含量約為4*108CFU/mL的凍干保護劑； 其中的混合液含有20%蔗糖、1~2%明膠、2%氯化鉀、廣4%谷氨酸鈉； d. 真空冷凍干燥 每個西林瓶中分裝上述凍干保護劑1毫升，在真空冷凍干燥機中，慢速預(yù)冷降溫，負壓 充氮壓塞制成凍干粉末。
[0009] 這樣設(shè)計的本發(fā)明具有的優(yōu)點是： ① 擴增生長高效，菌體離散度好，制備效率高，單次生產(chǎn)量大，菌苗活性率高，適合大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)； ② 生產(chǎn)過程易檢測； ③ 制備過程條件參數(shù)可控，容易優(yōu)化和放大，更好地做到不同批次產(chǎn)物各種指標(biāo)的一 致性； ④ 發(fā)酵培養(yǎng)和洗滌富集是在全封閉自動化系統(tǒng)中進行，極大減少了污染的機會； ⑤ 直接富集散在菌體進行凍干制備，避免了研磨等容易造成的污染和細菌物理損耗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明中發(fā)酵產(chǎn)物的離散洗滌和保護液置換步驟的生產(chǎn)流程示意圖。
[0011] 圖中：1.閥門 2.洗滌置換液容器 3.第一蠕動泵 4.發(fā)酵罐 5.第二蠕動泵 6.過濾柱 7.廢液閥門 8.第三蠕動泵 9.廢液容器 10.產(chǎn)品閥門 11.收獲容器。
[0012]

【具體實施方式】 下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0013] 一 ·主要材料及設(shè)備 I. Middlebrook (米德爾布魯克）7H9培養(yǎng)基系在售商品 附表I Middlebrook 7H9培養(yǎng)基成分

【權(quán)利要求】
1. 一種重組人干擾素-a -2b-BCG的干粉劑制備方法，其是按以下步驟制備的： a. 種子活化和培養(yǎng)基制備 采選重組干擾素-a -2b_BCG菌種并接種于含卡那霉素30微升/毫升的新鮮配制的 Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中獲得一級活化種子液；將一級活化種子液重新接種至上述 培養(yǎng)基中，獲得濃度達標(biāo)準(zhǔn)〇D_的A值>2的二級種子液； 其中的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基是按以下重量份的原料制成的，Middlebrook 7H9 5份、甘油5份、Tween80 5份，加入900份蒸饋水121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘制成A 液；另將葡萄糖2份、牛血清白蛋白5份、NaCl 0. 8份加入100份蒸餾水，0. 22 ii m濾膜過濾 除菌后制成B液，將A液、B液混合制得； b. 生物反應(yīng)器深層培養(yǎng) 發(fā)酵罐中最終裝料容積比6~7:10的發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后，將二級種子液接種到發(fā) 酵罐中，深層發(fā)酵培養(yǎng)7~10天，發(fā)酵期間取樣檢測生長情況并涂玻片抗酸染色檢測無污 染，檢測OD6tltl值達2. 0以上，收集發(fā)酵液； 其中每升發(fā)酵培養(yǎng)基按以下重量份數(shù)比的原料制備的：Middlebrook 7H9 5份、甘油5 份、TWeen80 5份、葡萄糖2份，蒸餾水溶解；培養(yǎng)基配置后調(diào)節(jié)PH至7. (T7. 5,高壓蒸汽原 位滅菌； c. 離散洗滌和保護液置換 發(fā)酵罐原位連接切向流中空過濾柱I. 5PD600,用3倍體積以上的0. 9%氯化鈉溶液進 行發(fā)酵液置換洗滌，再用6倍以上的1 %谷氨酸鈉無菌液進行置換洗滌，繼續(xù)菌液富集培養(yǎng) 4飛倍，最后加入相同體積的混合液，得到BCG終含量約為4*108CFU/mL的凍干保護劑； 其中的混合液含有20%蔗糖、1~2%明膠、2%氯化鉀、廣4%谷氨酸鈉； d. 真空冷凍干燥 每個西林瓶中分裝上述凍干保護劑1毫升，在真空冷凍干燥機中，慢速預(yù)冷降溫，負壓 充氮壓塞制成凍干粉末。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人干擾素_ a -2b_BCG的干粉劑制備方法，其特征在于：菌種采選后接種于含卡那霉素30微升/毫升的新鮮配制的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基 250mL中，恒溫35?38°C、轉(zhuǎn)速10(T200rpm、飽和濕度下，于2000mL燒瓶中震搖培養(yǎng)疒10天 獲得一級活化種子液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人干擾素_ a -2b_BCG的干粉劑制備方法，其特征在于：生 物反應(yīng)器深層培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度設(shè)定為35~38°C，接入過濾空氣，通氣速度0. 5 SLPM，轉(zhuǎn)速 15(T250rpm穩(wěn)定2h后，確定溶氧度DO-I值為100%，PH穩(wěn)定至7. (T7. 5 ;二級種子新鮮培養(yǎng) 液無菌加入發(fā)酵罐時，設(shè)定的發(fā)酵參數(shù)：接入過濾空氣通氣的起始速度〇. 5 SLPM，起始轉(zhuǎn)速 150rpm，根據(jù)溶氧度80?90%關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣保持0? 5?2. 0 SLPM和轉(zhuǎn)速150?400 rpm，溫度維 持35?39°C，培養(yǎng)基采用Middlebrook 7H9溶液，消泡劑采用植物豆油。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人干擾素_ a -2b_BCG的干粉劑制備方法，其特征在于：所 述慢速預(yù)冷降溫是從室溫開始下降，在2. 5~3. 5h到達設(shè)定預(yù)冷-35~-45°C溫度后維持1~2 小時，第一階段升華干燥溫度-KT-20°C，維持12~16小時，升華干燥真空度為0. 3毫巴，第 二階段解析干燥保持溫度25~30°C，時間設(shè)定為4~6小時。
【文檔編號】A61P35/00GK104324365SQ201410574032
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】孫二琳, 丁娜, 王麗寧, 韓瑞發(fā) 申請人:孫二琳, 韓瑞發(fā), 天津市泌尿外科研究所