生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜及其制備方法。該方法先進行細菌纖維素膜的制備與純化；純化后的細菌纖維素膜放入蒸餾水中攪拌均勻，用高速剪切機剪切，經過高壓微射流均質，得納米纖維分散液；將玉米醇溶蛋白和水難溶性生物活性物質溶解在乙醇-水溶液中，得醇溶液；將酪蛋白酸鈉溶解在水中，攪拌下加入所述醇溶液中，得混合液；除去乙醇，離心，得到富含有生物活性分子的玉米醇溶蛋白納米顆粒；納米纖維分散液與富含有生物活性的玉米醇溶蛋白顆?；旌希瑪嚢杈鶆?，并進行超聲處理；真空抽濾，快速成膜；干燥。本發(fā)明的復合膜材料具有良好的機械性能、生物相容性、可生物降解性，且該膜具備可調控的抗菌、抗氧化等生物活性。
【專利說明】生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高強度生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜材料的制備 方法，原料全部采用食品級以及可完全降解的生物材料，屬于傷口敷料等生物醫(yī)用材料、食 品工業(yè)技術等相關領域。

【背景技術】
[0002] 細菌纖維素 （Bacterial Cellulose, BC)是由木醋桿菌等菌屬發(fā)酵產生的，由 β -1，4糖苷鍵組成的不帶有支鏈的納米纖維聚合物，正越來越受到人們的關注。與傳統(tǒng)的 纖維素相比，細菌纖維素具有許多優(yōu)點，如純度高，具有高機械強度、高持水性、良好的生物 相容性、透氣透濕性、可生物降解性、無毒性、對液體具有很強的吸附能力等特性，因此被廣 泛地應用在生物醫(yī)用材料、食品、造紙、化妝品（生物纖維面膜、眼膜）等領域。然而，由于 受自身性質所限，單一 BC材料的實際應用范圍往往較窄，限制了其進一步的應用。
[0003] 為了賦予細菌纖維素材料以特異性的抗菌抗氧化等功能，現(xiàn)有技術多是采用直接 浸泡法將細菌纖維素置于一些生物活性物質溶液中，后凍干，或者溶液共混后傾倒，烘干等 方法制備復合膜材料，此類方法耗時長，不利于工業(yè)化生產。而且大多數(shù)生物活性物質，如 多酚類抗菌抗氧化劑、磺胺嘧啶銀等，往往存在溶解度差、穩(wěn)定性不足等問題，因此該方法 制備的抗菌抗氧化類材料實際效用不大。


【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決上述現(xiàn)有技術的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種高強度生物活性 細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜材料的制備方法，該方法克服了現(xiàn)有技術制備細菌纖維 素復合膜材料耗時長、實際效用低等缺陷。
[0005] 玉米醇溶蛋白（zein)是玉米中的主要蛋白質，不溶于水，可溶于60%?95%的醇 溶液中，該蛋白作為天然可降解材料，本身具有強疏水性而不需要交聯(lián)，不會在水中劇烈釋 放荷載物，溶劑蒸發(fā)時可發(fā)生自組裝形成具有不同形態(tài)的納米顆粒，因此，成為包載材料的 首選。然而，細菌纖維素親水性極強，如何實現(xiàn)親水性納米纖維在疏水性蛋白中的均一分散 性，成為本發(fā)明關鍵。
[0006] 本發(fā)明首先利用反溶劑技術制備可荷載活性因子（天然抗菌劑/抗氧化劑）的水 溶性玉米醇溶蛋白顆粒，與經高壓微射流均質制備的細菌纖維素納米纖維進行均一復合； 并首次采用模擬工業(yè)抄紙的方式快速制備高強度細菌纖維素基活性生物復合膜材料。本發(fā) 明采用納米化包埋技術（即反溶劑技術制備可荷載活性因子的顆粒），選擇合適的包載材 料，將這些活性物質包埋其中形成活性納米顆粒，達到增強其溶解性和穩(wěn)定性，并達到延長 有效作用周期（控釋）的目的，后模擬工業(yè)抄紙技術快速制備復合膜材料。制得的復合膜 材料一方面具有特異性抗菌抗氧化的生物活性，高強度、環(huán)保等特點；另一方面，該膜制備 方式綠色節(jié)能、快速高效，為大規(guī)模工業(yè)化生產高強度生物活性細菌纖維素基復合膜材料 提供了新視角和技術基礎。
[0007] 本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的，采用如下技術方案：
[0008] 生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜材料的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)細菌纖維素膜的制備：利用木醋桿菌菌種接種于種子培養(yǎng)液制備細菌纖維素 膜；
[0010] 2)細菌纖維素膜的純化
[0011] 將細菌纖維素膜用清水沖洗后浸泡于堿溶液中，煮沸；將細菌纖維素膜浸泡于蒸 餾水中煮沸，換水；重復兩次煮沸2-5次；然后將細菌纖維素膜其浸泡于蒸餾水中，直至中 性；
[0012] 3)納米纖維分散液的制備
[0013] 將步驟2)中得到的純化后的細菌纖維素膜放入蒸餾水中攪拌均勻，用高速剪切 機剪切，再經過高壓微射流均質，得納米纖維分散液；
[0014] 4)富含生物活性分子的玉米醇溶蛋白納米顆粒的制備
[0015] 將玉米醇溶蛋白和水難溶性生物活性物質溶解在乙醇-水溶液中，得醇溶液；將 酪蛋白酸鈉溶解在水中，攪拌下加入所述醇溶液中，得混合液；攪拌均勻后，通過旋轉蒸發(fā) 儀除去乙醇，離心，得到富含有生物活性分子的玉米醇溶蛋白納米顆粒；所述混合液中，玉 米醇溶蛋白的質量分數(shù)為1 %?5 %，生物活性物質的質量分數(shù)為0. 1 %?1 %，酪蛋白酸鈉 的質量分數(shù)為1 %?5% ;所述水難溶性生物活性物質為水難溶性的抗菌和/或抗氧化物 質；
[0016] 5)細菌纖維素納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆?；旌弦旱闹苽?br> [0017] 將步驟3)中制得的納米纖維分散液與步驟4)制備的富含有生物活性的玉米醇 溶蛋白顆?；旌?，攪拌均勻，并進行超聲處理，得到納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆粒混合 液；所述納米纖維與玉米醇溶蛋白顆粒的質量比為（1?10) :1 ;
[0018] 6)細菌纖維素生物復合濕膜制備
[0019] 將納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆粒混合液先進行真空脫氣，模擬工業(yè)抄紙技 術，真空抽濾，成膜，得到具有生物活性的細菌纖維素生物復合濕膜；
[0020] 7)干燥
[0021] 將步驟（6)中得到的具有生物活性的細菌纖維素生物復合濕膜進行恒溫干燥或 者熱壓干燥，得生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜。
[0022] 為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，步驟3)中，所述的蒸餾水與細菌纖維素的質 量比為（1?5) :1。
[0023] 步驟3)中，所述高速剪切機的轉速為8000?12000rpm，剪切時間為10?20min。
[0024] 步驟3)中，所述高壓微射流的均質壓力為5000?20000psi，均質次數(shù)為1?20 次。
[0025] 步驟4)中，乙醇-水溶液中乙醇質量濃度為60%?95% ;所述離心的轉速為 IOOOrpm?5000rpm，離心的時間為IOmin?30min ;所述水難溶性的抗菌和/或抗氧化物 質為紅霉素、百里香酚或白藜蘆醇。
[0026] 步驟5)中，超聲處理的時間為IOmin?20min，超聲功率為100W?200W，工作效 率為40%?60%，工作溫度為20°C?30°C。
[0027] 步驟6)中，所述真空脫氣的時間為20min?60min ;所述真空抽濾選用孔徑為 0. 45-0. 65 μ m的纖維素微孔濾膜對細菌纖維和玉米醇溶蛋白顆?；旌弦哼M行真空抽濾，快 速成膜。
[0028] 步驟7)中，所述恒溫干燥為25?60°C恒溫干燥；所述熱壓干燥為85?KKTC， 0. 1?0. 2MPa下進行干燥。
[0029] 所述利用木醋桿菌菌種接種于種子培養(yǎng)液制備細菌纖維素膜為取活化后的木醋 桿菌菌種接種于種子培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，按1?10 %的質量比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖 勻，靜置培養(yǎng)，得到細菌纖維素膜。發(fā)酵培養(yǎng)液成分：1. 8 %-2. 2 % D-葡萄糖，0. 45 %-0. 6 % 蛋白胨，0· 45% -0· 6%酵母膏，0· 11% -0· 115%檸檬酸，0· 25% -0· 30% Na2HPO4 · 12H20,其 余為蒸餾水，PH3-5 ;培養(yǎng)方法：接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，并在30°C -35°C下振蕩培養(yǎng) 12h后，1?10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，搖勻，在30°C下靜置培養(yǎng)5天，得到細菌纖維素 膜。
[0030] 本發(fā)明產物可用于傷口敷料等生物醫(yī)用材料、食品活性包裝材料以及美容化妝材 料；
[0031] 與原有產品相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0032] (1)本發(fā)明獨特地利用反溶劑化技術制備富含生物活性物質的水溶性玉米醇溶蛋 白顆粒，賦予細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜材料生物活性和特異功能性。
[0033] (2)本發(fā)明首次提出了以模擬造紙工業(yè)抄紙的方式快速制備細菌纖維素基復合膜 材料的新構想，使材料制備方法快速高效，綠色安全無污染，為大規(guī)模工業(yè)化生產提供了新 視角和技術基礎。
[0034] (3)本發(fā)明采用多次經過高壓微射流均質制備細菌纖維素納米纖維穩(wěn)定均一分散 液，并采用反溶劑技術制備富含生物活性物質的水溶性蛋白顆粒，實現(xiàn)了強親水性的細菌 纖維素納米纖維在疏水性蛋白中的均一分散。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為實施例2的表面原子力平面圖，掃描范圍5微米X5微米，比例尺500nm ;
[0036] 圖2為對比實施例2的表面原子力平面圖，掃描范圍5微米X5微米，比例尺 500nm ；
[0037] 圖3為玉米醇溶蛋白顆粒的投射電鏡圖。圖中顯示了運用反溶劑技術制備的玉米 醇溶蛋白顆粒的形態(tài)；
[0038] 圖4為實施例3細菌纖維素納米纖維、玉米純溶蛋白顆粒及紅霉素混合液的透射 電鏡電鏡圖。圖中顯示了親水性的細菌纖維素納米纖維在疏水蛋白中的均一分散。

【具體實施方式】
[0039] 為更好地理解本發(fā)明，下面結合符合和實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā) 明的實施方式不限于此。
[0040] 實施例1
[0041] 步驟1、細菌纖維素膜的制備
[0042] 培養(yǎng)基成分：2.0% D-葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5 %酵母膏，0. 115 %檸檬酸， 0· 27% Na2HPO4 · 12H20,其余為蒸餾水，pH5. 0
[0043] 培養(yǎng)方法：接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，并在30°C下振蕩培養(yǎng)12h后，10%的比例 接種發(fā)酵培養(yǎng)基，搖勻，在30°C下靜置培養(yǎng)5天，得到細菌纖維素膜。
[0044] 步驟2、細菌纖維素膜的純化
[0045] 取上述制備的細菌纖維素膜，用清水沖洗3次，浸泡于濃度為0. 2mol/L NaOH溶液 中，在90°C下煮沸30min后取出，再將此膜浸泡于蒸餾水中，在90°C下煮沸30min，換水，重 復3次，然后將其浸泡于蒸餾水中，直至中性，得到純化后的細菌纖維素膜；
[0046] 步驟3、細菌纖維素納米纖維水溶液的制備
[0047] 將上述純化的細菌纖維素放入蒸餾水中，蒸餾水與細菌纖維素的質量比為1 :1， 攪拌均勻后，用高速剪切機在12000rpm下高速剪切20min，后通過高壓微射流在20000psi 下均質10次，得到細菌纖維素納米纖維水溶液；
[0048] 步驟4、富含生物活性玉米醇溶蛋白納米顆粒的制備
[0049] 準確稱取I. 25g玉米醇溶蛋白和0. 25g未經改性過的百里香酚，溶解于25mL乙 醇體積百分含量為80 %的乙醇-水溶液中，得玉米醇溶蛋白溶液；I. 25g酪蛋白酸鈉溶于 62. 5mL去離子水中，將其迅速倒入攪拌中的玉米醇溶蛋白溶液中，使用磁力攪拌器充分攪 拌使其混合均勻。后將此混合液置于旋轉蒸發(fā)儀中，除去乙醇，再于4000rpm下離心lOmin， 得到富含生物活性的玉米醇溶蛋白納米顆粒；
[0050] 步驟5、細菌纖維素納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆?；旌弦旱闹苽?br> [0051] 將步驟3中得到細菌纖維素納米纖維水溶液與步驟4得到的富含生物活性的蛋白 顆粒進行混合，細菌纖維素納米纖維（干重）與蛋白顆粒的質量比為5:1，攪拌均勻后，將 此混合液置于超聲破碎機中，選擇超聲時間為20min，超聲功率為120W，工作效率為50%， 設定溫度為25°C。
[0052] 步驟6、真空抽濾，快速成膜
[0053] 取步驟5中制得的混合液，在I. OMPa的真空條件下脫氣30min，選用0. 65um孔徑 的纖維素微孔濾膜對此混合液進行真空抽濾，模擬工業(yè)抄紙技術，快速成膜，得到具有抗菌 活性的高強度細菌纖維素生物復合濕膜；
[0054] 步驟7、干燥
[0055] 將步驟6得到的細菌纖維素生物復合濕膜在90°C，0. IMPa下熱壓干燥，即得到具 有抗菌活性的高強度細菌纖維素生物復合膜材料。
[0056] 對比實施例1
[0057] 步驟1、細菌纖維素膜的制備
[0058] 培養(yǎng)基成分：2. O % D-葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5 %酵母膏，0. 115 %檸檬酸， 0· 27% Na2HPO4 · 12H20,其余為蒸餾水，pH 4. 5。
[0059] 培養(yǎng)方法：接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，并在30°C下振蕩培養(yǎng)12h后，10%的比例 接種發(fā)酵培養(yǎng)基，搖勻，在30°C下靜置培養(yǎng)5天，得到細菌纖維素膜。
[0060] 步驟2、細菌纖維素膜的純化
[0061] 取上述制備的細菌纖維素膜，用清水沖洗3次，浸泡于0.2mol/L NaOH溶液，在 90°C下煮沸30min后取出，再將此膜浸泡于蒸餾水中，在90°C下煮沸30min，換水，重復3 次，然后將其浸泡于蒸餾水中，直至中性，得到純化后的細菌纖維素膜；
[0062] 步驟3、細菌纖維素納米纖維水溶液的制備
[0063] 將上述純化的細菌纖維素放入蒸餾水中，蒸餾水與細菌纖維素的質量比為1 :1， 攪拌均勻后，用高速剪切機在12000rpm下高速剪切20min，后通過高壓微射流在20000psi 下均質10次，得到細菌纖維素納米纖維水溶液；
[0064] 步驟4、細菌纖維素納米纖維混合液的制備
[0065] 將步驟3中得到細菌纖維素納米纖維水溶液與蒸餾水按照一定比例混合，納米纖 維與蒸餾水的質量比為1 : (500?1000)，攪拌均勻后，將其置于超聲破碎機中，選擇超聲時 間為30min，超聲功率為320W，工作效率為45%，設定溫度為25°C。
[0066] 步驟5、真空抽濾，快速成膜
[0067] 取步驟4中制得的混合液，在I. OMPa的真空條件下脫氣30min，選用0. 65um孔徑 的纖維素微孔濾膜對此混合液進行真空抽濾，模擬工業(yè)抄紙技術，快速成膜，得到高強度細 菌纖維素濕膜；
[0068] 步驟6、干燥
[0069] 將步驟5得到的細菌纖維素生物復合濕膜在90°C，0. IMPa下熱壓干燥，即得到具 有高強度細菌纖維素生物膜材料。
[0070] 將以上試驗制得的復合膜材料進行機械強度的測試，得到如下表1結果：
[0071] 表1實施例1與對比實施例1的對比
[0072]

【權利要求】
1. 生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜材料的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： 1) 細菌纖維素膜的制備：利用木醋桿菌菌種接種于種子培養(yǎng)液制備細菌纖維素膜； 2) 細菌纖維素膜的純化 將細菌纖維素膜用清水沖洗后浸泡于堿溶液中，煮沸；將細菌纖維素膜浸泡于蒸餾水 中煮沸，換水；重復兩次煮沸2-5次；然后將細菌纖維素膜其浸泡于蒸餾水中，直至中性； 3) 納米纖維分散液的制備 將步驟2)中得到的純化后的細菌纖維素膜放入蒸餾水中攪拌均勻，用高速剪切機剪 切，再經過高壓微射流均質，得納米纖維分散液； 4) 富含生物活性分子的玉米醇溶蛋白納米顆粒的制備 將玉米醇溶蛋白和水難溶性生物活性物質溶解在乙醇-水溶液中，得醇溶液；將酪蛋 白酸鈉溶解在水中，攪拌下加入所述醇溶液中，得混合液；攪拌均勻后，通過旋轉蒸發(fā)儀除 去乙醇，離心，得到富含有生物活性分子的玉米醇溶蛋白納米顆粒；所述混合液中，玉米醇 溶蛋白的質量分數(shù)為1%?5%，生物活性物質的質量分數(shù)為0. 1%?1%，酪蛋白酸鈉的質 量分數(shù)為1%?5% ;所述水難溶性生物活性物質為水難溶性的抗菌和/或抗氧化物質； 5) 細菌纖維素納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆?；旌弦旱闹苽? 將步驟3)中制得的納米纖維分散液與步驟4)制備的富含有生物活性的玉米醇溶蛋白 顆?；旌?，攪拌均勻，并進行超聲處理，得到納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆?；旌弦?；所 述納米纖維與玉米醇溶蛋白顆粒的質量比為（1?10) :1 ; 6) 細菌纖維素生物復合濕膜制備 將納米纖維與玉米醇溶蛋白納米顆?；旌弦合冗M行真空脫氣，模擬工業(yè)抄紙技術，真 空抽濾，成膜，得到具有生物活性的細菌纖維素生物復合濕膜； 7) 干燥 將步驟￠)中得到的具有生物活性的細菌纖維素生物復合濕膜進行恒溫干燥或者熱 壓干燥，得生物活性細菌纖維素-玉米醇溶蛋白復合膜。
2. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的蒸餾水與細菌纖維素的 質量比為（1?5) :1。
3. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述高速剪切機的轉速為 8000?12000rpm，剪切時間為10?20min。
4. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述高壓微射流的均質壓力為 5000?20000psi，均質次數(shù)為1?20次。
5. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中，乙醇-水溶液中乙醇質量濃度 為60%?95% ;所述離心的轉速為lOOOrpm?5000rpm，離心的時間為lOmin?30min ;所 述水難溶性的抗菌和/或抗氧化物質為紅霉素、百里香酚或白藜蘆醇。
6. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟5)中，超聲處理的時間為lOmin? 20min，超聲功率為100W?200W，工作效率為40%?60%，工作溫度為20°C?30°C。
7. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟6)中，所述真空脫氣的時間為 20min?60min ;所述真空抽濾選用孔徑為0. 45-0. 65 μ m的纖維素微孔濾膜對細菌纖維和 玉米醇溶蛋白顆?；旌弦哼M行真空抽濾，快速成膜。
8. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，步驟7)中，所述恒溫干燥為25?60°C恒 溫干燥；所述熱壓干燥為85?KKTC，0. 1?0. 2MPa下進行干燥。
9. 根據(jù)權利1所述的制備方法，其特征在于，所述利用木醋桿菌菌種接種于種子培養(yǎng) 液制備細菌纖維素膜為取活化后的木醋桿菌菌種接種于種子培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，按1? 10%的質量比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖勻，靜置培養(yǎng)，得到細菌纖維素膜。
【文檔編號】A61K8/73GK104225669SQ201410421901
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權日:2014年8月25日
【發(fā)明者】楊曉泉, 王麗英, 萬芝力 申請人:華南理工大學