納絡酮用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及納絡酮用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用，本發(fā)明還提供了納絡酮和編碼NeuroD1?cDNA的慢病毒聯(lián)用在用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。由于沒有明顯的副作用，納絡酮的使用劑量可以保證其對空間學習記憶能力具有足夠的促進作用。本發(fā)明納絡酮和編碼NeuroD1?cDNA的慢病毒聯(lián)用，由于阻斷了腦部內(nèi)源性的嗎啡類似物對空間學習記憶能力的影響，可以有效提高海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生的效率以及空間學習記憶能力。
【專利說明】納絡酮用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納絡酮的新用途，特別涉及一種納絡酮用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。

【背景技術】
[0002]原有理論認為在成體動物體內(nèi)不會產(chǎn)生新的神經(jīng)細胞。但是，隨著科學研究的進步和深入，研究人員發(fā)現(xiàn)成體動物體內(nèi)存在神經(jīng)干細胞。而神經(jīng)干細胞可以在適當?shù)那闆r下分化成為不同種類的神經(jīng)細胞，從而補充生命過程中損失的神經(jīng)細胞或者為多種高級神經(jīng)活動提供支持。成體動物體內(nèi)的神經(jīng)干細胞分化成為不同種類的神經(jīng)細胞的過程一般稱為成體神經(jīng)發(fā)生。雖然，已有多項研究表明神經(jīng)干細胞以及成體神經(jīng)發(fā)生可以廣泛地存在于腦部的多個區(qū)域，但是一般認為神經(jīng)干細胞以及成體神經(jīng)發(fā)生主要存在和發(fā)生于海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone, SGZ)以及腦室下區(qū)(subventricular zone, SVZ)。
[0003]其中，海馬齒狀回顆粒下層的神經(jīng)干細胞以及成體神經(jīng)發(fā)生一個重要的生理功能就是為空間學習記憶提供支撐?？臻g學習記憶是檢測空間定向、反應時間，視知覺和結構應用等能力，從而評價其認識水平的一種行為模式，是一類關于場景和事件的學習記憶?？臻g學習記憶是一種簡單的學習記憶，同時是動物體很多復雜行為的基本組成部分之一，如:覓食、歸巢、躲避天敵等。因此，空間學習記憶具有重要的生理意義。
[0004]空間學習記憶受到多條信號通路、多種因子以及多種外界環(huán)境的復雜調(diào)節(jié)。其中，很多因素都是通過影響海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生影響空間學習記憶的。例如:隨著年齡的增長，在成體神經(jīng)發(fā)生效率下降的同時，空間學習記憶能力也會逐漸衰退；長期或者多次使用成癮類藥物如嗎啡、咖啡因、酒精等，也會在降低空間學習記憶能力同時降低機體的空間學習記憶能力。此外，在某些神經(jīng)退行性疾病如阿爾采默氏疾病(老年性癡呆)發(fā)生和發(fā)展的過程中，海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力都會受到影響。
[0005]目前來說，提高空間學習記憶能力的方法十分有限。I)一定程度的運動可以提高海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力。但是，此方法的投入產(chǎn)出比不高，往往花費大量的時間和精力獲得的提升并不明顯。此外，這一方法對衰老、藥物以及疾病導致的空間學習記憶能力損傷效果甚微。2)適度的壓力(stress)也可以對成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力產(chǎn)生正面影響，但是，過高的壓力對成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力反而會產(chǎn)生負面的影響。同時，由于個體差異，不同機體對不同壓力的反應也并不相同。因此機體承受壓力的程度難以控制在最佳狀態(tài)。3)在海馬齒狀回顆粒下層控制部分基因表達在理論上可以促進成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力。海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生過程受到多個轉錄因子的特異性調(diào)控，如:NeuroDl, Doublecortin等,但是高表達這些因子對成體神經(jīng)發(fā)生的促進作用仍然有待證明。4)部分藥物具有一定的神經(jīng)保護作用，可以延緩成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力受到衰老、藥物以及疾病影響時產(chǎn)生的降低，但是難以在正常情況下提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力。
[0006]綜上，現(xiàn)有提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶的方法或多或少都存在著:效果不顯著或者個體差異性強等問題，在實際的生產(chǎn)生活中應用性不強。因此，亟需一個效果顯著、穩(wěn)定性強以及個體差異不明顯的方法來提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術問題是:克服現(xiàn)有技術中提高學習記憶能力的方法促進不顯著，以及促進不穩(wěn)定的缺點，本發(fā)明提供一種納絡酮用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種納絡酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種提高空間學習記憶能力的組合；包括獨立使用的編碼NeuroDl cDNA的慢病毒和納絡酮。利用編碼NeuroDl cDNA的慢病毒提高海馬齒狀回顆粒下層中轉錄因子NeuroDl的表達和活性，從而抑制或者降低由腦部內(nèi)源性的嗎啡類似物導致的成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力的下降。同時，利用阿片類藥物拮抗劑(納絡酮，naloxone)在阻斷腦部內(nèi)源性的嗎啡類似物的生理作用的同時，提高成體神經(jīng)發(fā)生以及空間學習記憶能力。
[0010]本發(fā)明采用的技術方案為:
[0011]本發(fā)明提供了納絡酮在用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。
[0012]本發(fā)明還提供了納絡酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用在用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。
[0013]本發(fā)明還提供了一種提高空間學習記憶能力的組合，包括獨立使用的編碼NeuroDlcDNA的慢病毒和納絡酮。
[0014]所述納絡酮的結構式如下:
[0015]

N^\^CH2
/--\ 0?
HO°--
[0016]所述NeuroDl cDNA 序列如下(SEQ ID NO I):
[0017]atgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgggcgagcctcagccccaaggtcccccaagctggacagatgagtgtctcagttctcaggacgaggaacacgaggcagacaagaaagaggacgagcttgaagccatgaatgcagaggaggactctctgagaaacgggggagaggaggaggaggaagatgaggatctagaggaagaggaggaagaagaagaggaggaggaggatcaaaagcccaagagacggggtcccaaaaagaaaaagatgaccaaggcgcgcctagaacgttttaaattaaggcgcatgaaggccaacgcccgcgagcggaaccgcatgcacgggctgaacgcggcgctggacaac
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tttaccatgcactaccctgcagcgacgctggcagggccccaaagccacggatcaatcttctcttccggtgccgct
gcccctcgctgcgagatccccatagacaacattatgtctttcgatagccattcgcatcatgagcgagtcatgagt
gcccagcttaatgccatctttcacgattag。
[0018]所述編碼NeuroDl cDNA 的慢病毒(Ientivirus)使用 “ Invitrogen” 公司的“BLOCK-1T?Lentiviral Pol II miR RNAi Express1n System，，試劑盒制備。其中，NeuroDlcDNA被克隆到試劑盒中的V5-DEST中，再與其他三個質(zhì)粒pLPl, pLP2和pLP/VSVG共同轉染到293FT細胞中，并收集細胞培養(yǎng)液；過濾后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細胞(MEF)確定病毒的感染滴度(Transducing Unites，TU)，并最終獲得滴度在I X 109TU/ml的病毒濃縮液。
[0019]更具體地，所述編碼NeuroDl cDNA的慢病毒，利用“Invitrogen”公司的^ BLOCK-1 T?Len t i v i r a I Pol II miR RNAi Express1n System，，試劑盒制備；V5-DEST質(zhì)粒利用SpeI和XhoI內(nèi)切酶處理，獲得去除不必要片斷的質(zhì)粒骨架；利用上游包含SpeI酶切位點(5，-actgactagtaccatgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgg-3，)，下游包含 XhoI 酶切位點(5，-actgctcgagctaatcgtgaaagatggcattaagctgggcactc-3，)的引物擴增 NeuroDlcDNA并在酶切之后與質(zhì)粒骨架進行連接，構建表達質(zhì)粒V5-ND ;構建好的表達質(zhì)粒V5-ND與其他三個質(zhì)粒pLPl，pLP2和pLP/VSVG共同轉染到293FT細胞中，在完成質(zhì)粒轉染后的三天內(nèi)收集細胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液再經(jīng)過簡單的過濾(0.45微米)之后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細胞(MEF)確定病毒的感染滴度(Transducing Unites，TU)，并最終獲得滴度在lX109TU/ml的病毒濃縮液。
[0020]本發(fā)明所具有的有益效果:
[0021]本發(fā)明提供了一種納洛酮在制備提高空間學習記憶能力的藥物中的新的應用。由于沒有明顯的副作用，納絡酮的使用劑量可以保證其對空間學習記憶能力具有足夠的促進作用。嗎啡鎮(zhèn)痛作用的半數(shù)有效劑量一般是lmg/kg，而本發(fā)明納絡酮的使用劑量可以完全阻斷10mg/kg嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。
[0022]由于沒有明顯的副作用，本發(fā)明編碼NeuroDl cDNA的慢病毒的使用劑量都可以保證其對空間學習記憶能力具有足夠的促進作用。其中，編碼NeuroDl cDNA的慢病毒可以保證海馬齒狀回顆粒下層中>95%的細胞被感染，同時提高海馬區(qū)NeuroDl表達到原有水平的300%左右。
[0023]本發(fā)明納絡酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用，由于阻斷了腦部內(nèi)源性的嗎啡類似物對空間學習記憶能力的影響，可以有效提高海馬齒狀回顆粒下層的成體神經(jīng)發(fā)生的效率以及空間學習記憶能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為V5-DEST質(zhì)粒的基本構造圖，引自“Invitrogen”公司的“BLOCK-1T?Lentiviral Pol II miR RNAi Express1n System” 試劑盒的產(chǎn)品說明書。
[0025]圖2:V5-DEST質(zhì)粒多克隆位點附近的DNA序列，包括NeuroDl cDNA的插入位點(黃色)，引自 “Invitrogen”公司的“BLOCK-1T? Lentiviral Pol II miR RNAi Express1nSystem”試劑盒的產(chǎn)品說明書。
[0026]圖3為納絡酮使用后對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響結果對比圖。
[0027]圖4為編碼NeuroDl cDNA的慢病毒對海馬區(qū)NeuroDl表達的影響結果對比圖。
[0028]圖5納絡酮和編碼NeuroDl cDNA的慢病毒聯(lián)用對小鼠學習記憶能力的促進作用的結果對比圖。

【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不限定本發(fā)明的保護范圍。
[0030]實施例1
[0031 ] 1、獲得小鼠組織中的RNA，并獲得cDNA
[0032]將小鼠組織放在液氮中研磨成粉末后，再以每10mg組織加入1mlTRIzol (Invitrogen公司)研磨,注意樣品總體積不能超過所用TRIzol體積的10%。研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1ml TRIzoI液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。取上層水相于一新的離心管，按每1ml TRIzol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。棄去上清液，按每1ml TRIzol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4°C下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55°C -60 V水溶10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70 %乙醇并保存于_70°C。
[0033]利用Quant Reverse Transcriptase試劑盒(天根生化科技)合成cDNA。按照下表配置混合液，在37°C中孵育I小時。
[0034]

【權利要求】
1.納絡酮在用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。
2.納絡酮和編碼NeuroDlcDNA的慢病毒聯(lián)用在用于制備提高空間學習記憶能力的藥物中的應用。
3.一種提高空間學習記憶能力的組合，其特征在于:包括獨立使用的編碼NeuroDlcDNA的慢病毒和納絡酮。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種提高空間學習能力的組合，其特征在于:所述編碼NeuroDl cDNA 的慢病毒使用 “Invitrogen” 公司的 “BLOCK-1T? Lentiviral Pol II miRRNAi Express1n System”試劑盒制備。其中，NeuroDl cDNA被克隆到試劑盒中的V5-DEST中，再與其他三個質(zhì)粒pLPl，pLP2和pLP/VSVG共同轉染到293FT細胞中，并收集細胞培養(yǎng)液；過濾后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細胞確定病毒的感染滴度，并最終獲得滴度在I X 109TU/ml的病毒濃縮液。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種提高空間學習能力的組合，其特征在于:所述編碼NeuroDl cDNA 的慢病毒，利用 “ Invitrogen” 公司的 “BLOCK-1T? Lentiviral Pol II miRRNAi Express1n System”試劑盒制備；V5_DEST質(zhì)粒利用SpeI和XhoI內(nèi)切酶處理,獲得去除不必要片斷的質(zhì)粒骨架；利用上游包含SpeI酶切位點(actgactagtaccatgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgg),下游包含 XhoI 酶切位點(actgctcgagctaatcgtgaaagatggcattaagctgggcactc)的引物擴增NeuroDl cDNA并在酶切之后與質(zhì)粒骨架進行連接,構建表達質(zhì)粒V5-ND ;構建好的表達質(zhì)粒V5-ND與其他三個質(zhì)粒pLPl，pLP2和pLP/VSVG共同轉染到293FT細胞中，在完成質(zhì)粒轉染后的三天內(nèi)收集細胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液再經(jīng)過簡單的過濾(0.45微米)之后，通過使用氯化銫梯度離心純化和富集慢病毒，利用小鼠成纖維細胞確定病毒的感染滴度，并最終獲得滴度在I X 109TU/ml的病毒濃縮液。
【文檔編號】A61P25/28GK104127415SQ201410393385
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權日:2014年8月11日
【發(fā)明者】鄭輝, 李文, 何松蔚, 孫昊 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院