一種回心康片的制備方法及其在抑制肛門肉瘤細(xì)胞s-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種回心康片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的回心康片的制備方法，由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得人參皂苷Rg1含量有很大提高。本發(fā)明還提供了回心康片在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】-種回心康片的制備方法及其在抑制肛門肉瘤細(xì)胞S-180 細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種回心康片的制備方法及其在抑制小鼠肛 門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 回心康膠囊標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10737(ZD-0737)-2002,記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科心 系分冊(cè)。由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g 作為原料藥制成，具有益氣活血，鎮(zhèn)靜平肝的功效。用于氣虛血瘀，肝陽上亢引起的胸痹，眩 暈，癥見胸痹，胸悶，心悸，頭暈等癥，冠心病，高血壓屬上述證候者。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有回心康膠囊在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報(bào)道， 而中藥直接打粉，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用， 嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種回心康片的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種回心康片在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180 細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的方案實(shí)現(xiàn)的： 一種回心康片的制備方法，由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七 26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成：取，三七、何 首烏、回心草，加入到〇) 2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積 百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C0 2流量l-3ml/g生藥· min，萃取時(shí)間 180-220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入10L的60%乙醇，投入微波萃取 裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，力口 到D101大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并 干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制 顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0. 3g。
[0007] 上述的回心康片的制備方法中，所述C02超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體 積百分比為5%。
[0008] 上述的回心康片的制備方法中，所述C02超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009] 上述的回心康片的制備方法中，所述C02超臨界萃取中萃取溫度為40°C。
[0010] 上述的回心康片的制備方法中，所述C02超臨界萃取中C02流量2ml/g生藥·η?η。
[0011] 上述的回心康片的制備方法中，所述C02超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
[0012] 上述的回心康片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 上述的回心康片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0014] 上述的回心康片在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中，回心康膠囊每次5粒，一日3次?；匦目的z囊服藥量大。采用本發(fā)明 方法制備成的回心康片每片重0. 3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的 條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗(yàn)證明。且制備成片劑，患者隨水吞下 即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0016] 試驗(yàn)一、不同方法制備的回心康片中人參阜苷Rgl含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明回心康片：按實(shí)施例1方法制備，使用3012g原料藥，經(jīng)提取制 成400片，每片重0. 3g。原回心康膠囊，按照WS-10737(ZD-0737)-2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。 Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；人參皂苷Rgl對(duì)照品（中國(guó)藥 品生物制品檢定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄V D)測(cè)定。
[0018] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水 (20 :80)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rgl 1峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。
[0019] 對(duì)照品溶液的制備取在60°C減壓干燥2小時(shí)的人參皂苷Rgll對(duì)照品適量，精密 稱定，加甲醇制成每lml含0. 5mg的溶液，即得。
[0020] 本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備 取本發(fā)明的回心康片，研細(xì)，精密稱定，研細(xì)，取 1.2g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流1小時(shí)，棄去乙醚液，藥渣揮去乙 醚，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取至無色，甲醇液蒸干，殘?jiān)铀?0ml溫?zé)?使溶解，放冷，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用1%氫氧 化鈉溶液振搖提取2次，每次30ml，棄去堿液，正丁醇液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次 30ml，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?5ml，分次溫?zé)崛芙猓爬?，通過已處理好的D101 型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1. 5cm，長(zhǎng)15cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50ml洗脫， 棄去20%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍?量轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0021] 對(duì)照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本對(duì)照的40片(薄膜衣片除去包衣)，精密稱定， 研細(xì)，取3g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流1小時(shí)，棄去乙醚液，藥渣揮 去乙醚，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取至無色，甲醇液蒸干，殘?jiān)铀?0ml 溫?zé)崾谷芙猓爬?，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用1%氫 氧化鈉溶液振搖提取2次，每次30ml，棄去堿液，正丁醇液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次 30ml，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?5ml，分次溫?zé)崛芙?，放冷，通過已處理好的D101 型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1. 5cm，長(zhǎng)15cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50ml洗脫， 棄去20%乙醇洗脫液，繼用70%乙醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍?量轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
[0022] 測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10--1，注入液相色譜儀，測(cè) 定，即得。
[0023] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明回心康片中人參皂苷Rgl的含量為2-4mg/片；而原回心康膠囊中人 參皂苷Rgl的含量為〇. 38mg/袋，每次服用量2片的人參皂苷Rgl含量為原顆粒劑含量的 2-4倍，在服用量減少的情況下，人參皂苷Rgl含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的回心康片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 WS-10737 (ZD-0737)-2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的回心康膠囊。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例1 取鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g，取 三七、何首烏、回心草加入到〇)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，C0 2流量2ml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間200min， 得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入10L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行 微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹 脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取 物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片， 制成400片，每片重0. 3g。
[0027] 經(jīng)檢測(cè)，成品中人參皂苷Rgl的含量為3. 89mg/片。
[0028] 實(shí)施例2 取鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g，取 三七、何首烏、回心草加入到〇)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C0 2流量3ml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間180min， 得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入10L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行 微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹 脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取 物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片， 制成400片，每片重0. 3g。
[0029] 經(jīng)檢測(cè)，成品中人參皂苷Rgl的含量為2. 59mg/片。
[0030] 實(shí)施例3 取鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七26g、山楂650g、甘草260g，取 三七、何首烏、回心草加入到〇)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C0 2流量lml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間220min， 得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入10L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行 微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹 脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取 物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片， 制成400片，每片重0. 3g。
[0031] 經(jīng)檢測(cè)，成品中人參皂苷Rgl的含量為1. 98mg/片。
[0032] 實(shí)施例4 :回心康片抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料 1.實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033] 1. 2實(shí)驗(yàn)藥物 研究藥物：本發(fā)明回心康片：按實(shí)施例1方法制備。
[0034] 藥液儲(chǔ)液：稱取100mg回心康片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2--m濾器過濾， 500--ldoff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0. 2--m濾器過濾無水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0035] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM( GIBC0公司Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) ;Trypsin (AMRESC0 公司）;EDTA (AMRESC0 公司）;Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司l);Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公 司）；MTT (Biosharp 批號(hào)：0793) :PBS (實(shí)驗(yàn)室自配）； 1. 4實(shí)驗(yàn)器材 萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào)：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型 號(hào)：SPECTRAMAX 190);C02培養(yǎng)箱（FORMA型號(hào)：3111);超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào)：S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型 號(hào)：P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào)：BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號(hào)：MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號(hào)：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號(hào)：2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀 器廠型號(hào)：KA-1000);0. 2--m 濾器（MILLIP0RE 型號(hào)：SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿（NEST 公司）、 96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實(shí)驗(yàn)方法 1) L5178Y細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng) 至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中， lOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3 X 104個(gè)/ml。
[0037] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180--1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱 中（37°C，5%C0 2)常規(guī)培養(yǎng)。
[0038] 3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入回心康片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0039] 4) 24h 后加入 20--1 MTT 溶液（5mg/ml，即 0· 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200--1二甲基亞砜，置搖 床上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0042] 7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示：細(xì)胞增值抑制率（%)=(對(duì)照孔0D值-給藥 孔0D值)、對(duì)照孔0D值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0043] 3.統(tǒng)計(jì)處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean土S. D
【權(quán)利要求】
1. 一種回心康片的制備方法，由鉤藤780g、回心草910g、何首烏26g、黃芪260g、三七 26g、山楂650g、甘草260g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成： 取，三七、何首烏、回心草，加入到C0 2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶 劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C0 2流量l-3ml/g生藥· min， 萃取時(shí)間180-220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入10L的60%乙醇，投 入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃 取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回 收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀 粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成400片，每片重0. 3g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述0)2超臨界萃取中夾 帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中萃 取壓力為25 MPa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中萃 取溫度為40°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中 C02 流量 2ml/g 生藥· min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中萃 取時(shí)間為200min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為 700W。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的回心康片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取 時(shí)間為8分鐘。
9. 權(quán)利要求1所述的回心康片在制備抑制小鼠肛門肉瘤細(xì)胞S-180細(xì)胞增殖藥物中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/20GK104095963SQ201410311691
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】關(guān)軍 申請(qǐng)人:關(guān)軍