化合物icg-001在制備治療慢性腎臟病的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及小分子化合物ICG-001(一種Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑)的新用途，具體涉及化合物ICG-001在制備治療慢性腎臟病(CKD)的藥物中的用途。本發(fā)明提供了ICG-001在治療CKD中的應(yīng)用，其療效顯著，且未見明顯毒副作用。因此，本發(fā)明所述的ICG-001可制備成用于治療CKD的藥物制劑。
【專利說明】化合物ICG-001在制備治療慢性腎臟病的藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小分子化合物ICG-001 (-種Wnt/ β -catenin信號通路拮抗劑）的新 用途，具體涉及化合物ICG-001在制備治療慢性腎臟病（CKD)的藥物中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 慢性腎臟?。–KD)正成為一種"公眾健康問題"，嚴(yán)重危害人類健康并消耗大量衛(wèi) 生資源。然而，目前臨床上尚缺乏有效延緩CKD進(jìn)展的藥物。針對CKD的發(fā)病機制，尋找有 效地抑制或延緩CKD進(jìn)展的藥物無疑是當(dāng)前腎臟病學(xué)界的當(dāng)務(wù)之急，成為亟待攻克的戰(zhàn)略 重點之一。
[0003] 大量的研究表明，Wnt/i3-catenin信號通路在多種CKD發(fā)生發(fā)展中占有重要 地位（J Am Soc N印hrol, 2009, 20:1997-2008 ;J Am Soc N印hrol, 2011，22:1642-1653)， β -catenin作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)并促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展（J Am Soc N印hrol, 2011，22:90-103 ;J Biol Chem, 2010, 285:24665-24675)。ICG-001 是一個小分子 化合物（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:12682-12687)，能夠特異地阻斷 β -catenin 下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制Wnt/0-catenin信號通路。本發(fā)明涉及利用ICG-001作為一 種新穎的、有效性的Wnt/ β -catenin信號活化的拮抗劑，阻斷體內(nèi)關(guān)鍵的促纖維化信號通 路，從而抑制CKD進(jìn)展過程中腎組織損傷和腎臟纖維化、延緩或/和逆轉(zhuǎn)CKD的病程。
[0004] 單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UU0)、阿霉素腎?。ˋDR)、5/6腎切除（5/6NX)是經(jīng)典的CKD 動物模型，UU0模型的特點是可以快速完整地展示梗阻側(cè)腎小管間質(zhì)纖維化的不同病理 階段和特征，包括炎細(xì)胞浸潤、小管細(xì)胞的增殖和凋亡、肌成纖維細(xì)胞的活化、纖連蛋白 (Fibronectin)和I型膠原（Collagen I)的沉積；ADR腎病是目前常用的模擬人類腎小球疾 病的模型，其特點是大量蛋白尿、腎小管內(nèi)管型、腎小管塌陷、進(jìn)行性局灶節(jié)段硬化（FSGS) 和球性硬化、嚴(yán)重腎間質(zhì)纖維化和炎癥形成；5/6NX模型的特點是動脈高壓、蛋白尿、腎小 球硬化，該模型與臨床CKD相似，是研究CKD及并發(fā)高血壓的理想模型。
[0005] 在病理上，通常采用Masson染色，來觀察組織細(xì)胞外膠原蛋白沉積情況。而更具 體的組織纖維化則常常應(yīng)用肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白平滑肌肌動蛋白α (α-SM)、纖連蛋 白和I型膠原的免疫染色和免疫印跡方法（Western blotting)來定性、定量觀察和評估。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供小分子化合物ICG-001 (-種Wnt/ β -catenin信號通路拮 抗劑）的新用途。
[0007] 本發(fā)明所述的用途是小分子化合物ICG-001在制備治療慢性腎臟?。–KD)的藥物 中的用途，可以有效抑制和延緩CKD的進(jìn)展。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明所述的用途的進(jìn)一步特征，所制備的藥物包括：治療上有效劑量的化 合物ICG-001，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
[0009] 本發(fā)明的實驗證明，小分子化合物ICG-001在小鼠動物實驗中無明顯毒副作用。 發(fā)明人對ICG-001進(jìn)行UUO、ADR腎病、5/6NX模型實驗。結(jié)果表明：與UU0、ADR、5/6NX模型 組比較，腹腔注射ICG-001組腎臟間質(zhì)膠原沉積顯著減少，a -SMA、纖連蛋白及I型膠原均 顯著降低，Wnt/β -catenin下游靶基因表達(dá)明顯下調(diào)，表明ICG-001能有效抑制UUO、ADR 腎臟和5/6NX腎臟組織纖維化，拮抗Wnt/ β -catenin信號通路；并且，在5/6NX模型中觀察 至IJ ICG-001對于血壓的有效抑制作用，提示抑制纖維化同時還具有抗高血壓作用。
[0010] 綜上所述，ICG-001具有顯著抑制腎臟組織纖維化和CKD進(jìn)展的作用，且無明顯毒 副作用，因此可用于制備有效抑制CKD進(jìn)展的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是UU0模型各組小鼠腎臟Masson染色圖。該圖中，從左到右，1 :假手術(shù)組 (Sham) ;2 :UU0 模型組（UUO+PBS) ;3 :UU0+ICG-0012mg/kg/d 組；4 :UU0+ICG-0015mg/kg/d 組。
[0012] 圖2是檢測UU0模型各組小鼠腎臟纖維化指標(biāo)纖維連接蛋白（Fibronectin) 與I型膠原（Collagen I)的免疫染色圖。該圖中，Sham :假手術(shù)組；UU0 :模型對照組； UU0+ICG-001 :用藥組。
[0013] 圖3檢測ADR模型各組小鼠腎臟PAS染色圖。該圖中，從左到右，1 :生理鹽水組； 2 :ADR模型組；3 :ADR+ICG-001中期治療組；4 :ADR+ICG-001晚期治療組。
[0014] 圖4檢測ADR模型各組小鼠腎臟MASSON染色圖。該圖中，從左到右，1 :生理鹽水 組；2 :ADR模型組；3 :ADR+ICG-001中期治療組；4 :ADR+ICG-001晚期治療組。
[0015] 圖5是Western blotting法檢測各組小鼠腎臟β-catenin及其下游祀基因蛋白 水平的代表圖。該圖中，左圖為免疫印跡檢測的代表性結(jié)果，Ctrl :生理鹽水組；Veh. :ADR+ 生理鹽水組；ICG-w:ADR+ICG中期治療組；ICG-t :ADR+ICG晚期治療組；右圖為所有結(jié)果的 統(tǒng)計圖，Ctrl :生理鹽水組；ADR :模型對照組；ADR+ICG-w :中期治療組；ADR+ICG-t晚期治 療組。圖中，Col I :1型膠原；Col III :111型膠原；a -SMA : α平滑肌肌動蛋白。
[0016] 圖6檢測5/6ΝΧ模型各組大鼠腎臟MTS(Masson)和PAS染色圖。該圖中，左：假手 術(shù)組；中：5/6NX模型組；右：5/6NX+ICG-001治療組。
[0017] 圖7是Western blotting法檢測各組大鼠腎臟β-catenin的下游祀基因蛋白水 平的代表圖。該圖中，左圖為免疫印跡檢測的代表性結(jié)果，右圖為所有結(jié)果的統(tǒng)計圖；Ctrl : 假手術(shù)組；5/6NX :5/6NX模型組；Vehicle :生理鹽水注射組；ICG-001 :ICG-001治療組。
[0018] 圖8是各組大鼠尿蛋白和血壓檢測圖。該圖中，左圖為尿蛋白檢測的結(jié)果，右圖 為血壓的檢測結(jié)果圖；Ctrl :假手術(shù)組；5/6NX :5/6NX模型組；Vehicle :生理鹽水注射組； ICG-001 : ICG-001 治療組。

【具體實施方式】
[0019] 下面僅以實施例的方式結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0020] 實施例一 ：ICG-001對UU0小鼠腎臟纖維化的抑制
[0021] 1、實驗動物：⑶-1小鼠，雄性，體重20-22g，SPF級。先將動物稱重、編號，選擇健 康、體重在20-22g的小鼠15只，隨機分為3組，每組5只。包括假手術(shù)組、模型對照組及用 藥組。
[0022] ICG-001購于上海佰世凱化學(xué)科技有限公司。
[0023] 2、各組處理
[0024] 1)假手術(shù)組：室溫，3%戊巴比妥鈉以1ml/公斤體重麻醉小鼠后，選擇左背側(cè)肋緣 下l-2cm為切口；局部消毒后，逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，發(fā)現(xiàn)左側(cè)輸尿管后隨即逐 層縫合。局部消毒后，核實標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。
[0025] 2)模型對照組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，找到左側(cè)輸尿 管后，于輸尿管上1/3段結(jié)扎，逐層縫合。局部消毒后，核實標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。
[0026] 3)用藥組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，找到左側(cè)輸尿管 后，于輸尿管上1/3段結(jié)扎，逐層縫合。局部消毒后，核實標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。
[0027] 3、實驗過程
[0028] ICG-001用生理鹽水稀釋。各組分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅觀察。模型對照組僅給予 生理鹽水腹腔注射。用藥組予以含有2mg/kg和5mg/kg體重的ICG-001的生理鹽水腹腔注 射。飼養(yǎng)7天后殺死各組小鼠，均取左側(cè)腎臟，分別予以10%中性緩沖甲醛固定及液氮冷冰 凍組織。甲醛固定組織在經(jīng)脫水、包埋、切片、制片后，分別予以Masson染色及α-SM、纖連 蛋白及I型膠原免疫染色。冰凍組織勻漿后提取蛋白，用免疫印跡法（Western Blot)檢測 β -catenin及其祀基因表達(dá)水平。
[0029] 4、實驗結(jié)果
[0030] (1) Masson染色檢測腎臟組織纖維化程度
[0031] I、ICG-001減少UU0小鼠腎間質(zhì)膠原沉積
[0032] 實驗結(jié)果如圖1所示，用藥組小鼠腎間質(zhì)膠原沉積明顯低于模型對照組。
[0033] II、ICG-001減少UU0小鼠腎間質(zhì)纖維化
[0034] 實驗結(jié)果如圖2所示，與模型對照組比較，用藥組小鼠腎間質(zhì)纖連蛋白、I型膠原 水平明顯降低。
[0035] 實施例二：ICG-001對ADR小鼠腎臟纖維化的抑制
[0036] 1、實驗動物：BABL/c小鼠，雄性，體重20_22g，SPF級。先將動物稱重、編號，選擇健 康、體重在20-22g的小鼠24只，隨機分為4組，每組6只。包括生理鹽水組、模型對照組、 中期治療組、晚期治療組。
[0037] ICG-001購于上海佰世凱化學(xué)科技有限公司。
[0038] 2、各組處理
[0039] 1)生理鹽水組：室溫，尾靜脈注射生理鹽水2ml。
[0040] 2)模型對照組：阿霉素溶解于生理鹽水，10mg/kg體重尾靜脈一次注射。
[0041] 3)用藥組：于阿霉素注射后1周或3周注射含有5mg/kg體重的ICG-001的生理 鹽水每日腹腔注射，持續(xù)注射兩周。
[0042] 3、實驗過程
[0043] 各組分籠飼養(yǎng)。每周留取尿液標(biāo)本并稱量體重。飼養(yǎng)5周后殺死各組小鼠，均取 左側(cè)腎臟，分別予以10%中性緩沖甲醛固定及液氮冷冰凍組織。甲醛固定組織在經(jīng)脫水、包 埋、切片、制片后，分別予以Masson染色及α-SM、纖連蛋白及I型膠原免疫染色。冰凍組 織勻楽后提取蛋白，用免疫印跡法（Western Blot)檢測β-catenin及其祀基因表達(dá)水平。
[0044] 4、實驗結(jié)果
[0045] (1) Masson染色檢測腎臟組織纖維化程度
[0046] I、ICG-001減輕ADR小鼠腎組織形態(tài)改變
[0047] 實驗結(jié)果如圖3所示，用藥組小鼠腎組織形態(tài)趨于正常，未見大量腎小球硬化，腎 小管管型及腎小管塌陷等病理改變。
[0048] II、ICG-001減少ADR小鼠腎間質(zhì)膠原沉積
[0049] 實驗結(jié)果如圖4所示，用藥組小鼠腎間質(zhì)膠原沉積明顯低于模型對照組。
[0050] III、ICG-001減少ADR小鼠腎間質(zhì)纖維化
[0051] 實驗結(jié)果如圖5所示，與模型對照組比較，用藥組小鼠腎組織纖連蛋白、I型膠原、 ΠI型膠原和a -SMA水平明顯降低。
[0052] 實施例三：ICG-001對5/6ΝΧ大鼠腎臟纖維化和高血壓的抑制
[0053] 1、實驗動物：SD大鼠，雄性，體重200_220g，SPF級。先將動物稱重、編號，選擇健 康、體重在200-220g的大鼠18只，隨機分為3組，每組6只。包括假手術(shù)組、模型對照組及 用藥組。
[0054] ICG-001購于上海佰世凱化學(xué)科技有限公司。
[0055] 2、各組處理
[0056] 1)假手術(shù)組：室溫，3%戊巴比妥鈉 30mg/公斤體重麻醉大鼠后，局部消毒后，選擇 左背側(cè)肋緣下l-2cm為切口，逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜后即縫合，核實標(biāo)記，置于相 應(yīng)鼠籠。
[0057] 2)模型對照組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜局部消毒后，逐 層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，發(fā)現(xiàn)左側(cè)腎臟后切除上下極，一周后（記〇周）進(jìn)行右側(cè)腎 臟全切，于第6周開始每日注射生理鹽水。局部消毒后，核實標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。
[0058] 3)用藥組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，發(fā)現(xiàn)左側(cè)腎臟后切 除上下極，一周后（記〇周）進(jìn)行右側(cè)腎臟全切，于第6周開始注射5mg/kg的ICG-001藥 物（每周三次）。局部消毒后，核實標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。
[0059] 3、實驗過程
[0060] 各組分籠飼養(yǎng)。每周留取尿液標(biāo)本并稱量體重。飼養(yǎng)12周后以大鼠尾動脈脈搏 測壓法檢測血壓，后殺死各組大鼠，留取血液和尿液標(biāo)本分別檢測血清肌酐和尿蛋白；均 取左側(cè)腎臟，分別予以10%中性緩沖甲醛固定及液氮冷冰凍組織。甲醛固定組織在經(jīng)脫 水、包埋、切片、制片后，分別予以Masson、PAS染色，用免疫印跡法（Western Blot)檢測 β -catenin其靶基因纖連蛋白及I型膠原表達(dá)水平。
[0061] 4、實驗結(jié)果
[0062] (1) ICG-001減輕5/6NX大鼠腎間質(zhì)纖維化和腎組織形態(tài)改變
[0063] 實驗結(jié)果如圖6所示，用藥組大鼠腎組織形態(tài)改變明顯減輕，未見明顯腎間質(zhì)纖 維化（Masson染色），腎小球硬化等改變（PAS染色）。
[0064] (2) ICG-001抑制5/6NX大鼠的腎纖維化基因表達(dá)
[0065] 實驗結(jié)果如圖7所示，與模型對照組比較，用藥組大鼠腎組織纖連蛋白和I型膠原 水平明顯降低。左圖為纖連蛋白和I型膠原的免疫印跡代表性結(jié)果，右圖為所有結(jié)果的統(tǒng) 計圖。
[0066] (3) ICG-001抑制5/6NX大鼠的尿蛋白和血壓增高
[0067] 實驗結(jié)果如圖8所示，與模型對照組比較，用藥組大鼠腎尿蛋白及血壓明顯降低。
[0068] 綜上所述，ICG-001可以明顯減少UUO、ADR小鼠和5/6NX大鼠腎間質(zhì)膠原蛋白沉 積，顯著降低UU0、ADR小鼠和5/6NX大鼠腎組織纖連蛋白、I型膠原、III型膠原、a -SMA表 達(dá)水平，并可以明顯抑制CKD模型中的異?；罨摩?catenin信號通路及血壓增高。因此， ICG-001可以能成為有效抑制CKD進(jìn)展、抑制高血壓的新藥。
【權(quán)利要求】
1. 化合物ICG-001在制備治療慢性腎臟病的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物包括：治療上有效劑量的化合 物ICG-001，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
【文檔編號】A61P13/12GK104055779SQ201410262364
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】劉友華, 周麗麗 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院