己烯雌酚在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種己烯雌酚在制備預(yù)防或治療流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首先檢測(cè)了己烯雌酚對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示己烯雌酚的最大無(wú)毒性濃度為25.0μM；其次，在完全無(wú)毒性的濃度范圍內(nèi)測(cè)定了己烯雌酚的抗病毒活性，結(jié)果顯示這種小分子化合物具有顯著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈劑量依賴效應(yīng)；最后，檢測(cè)了己烯雌酚對(duì)不同型和亞型的流感病毒的抗病毒活性，結(jié)果顯示己烯雌酚可以劑量依賴地抑制所有被檢測(cè)流感病毒株的復(fù)制，表明己烯雌酚的抗流感病毒活性具有廣譜性。因此，本發(fā)明首次披露了己烯雌酚是一種新型廣譜抗流感病毒藥物，可以用于制備預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物。
【專利說(shuō)明】己烯雌酚在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種己烯雌酚在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒屬。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也稱甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負(fù)鏈RNA組成，分別以節(jié)段I至節(jié)段8命名。病毒基因組全長(zhǎng)約13.6kb，編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進(jìn)一步分為17個(gè)H(H1-H17)和10個(gè)N(Nl-NlO)亞型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型。而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感多為H5、H7和H9亞型，其中以H5N1亞型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆發(fā)，僅在人和海豹中發(fā)現(xiàn)。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，可感染人類和豬。
[0003]流感病毒的整個(gè)生活周期需要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)完成。感染的起始是病毒顆粒表面的HA刺突識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體。唾液酸與次末端半乳糖的連接鍵，決定了病毒的宿主特異性，該連接鍵在禽類中為α (2-3),在人類中為α (2_6)。病毒吸附細(xì)胞后，細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用攝入病毒。在細(xì)胞內(nèi)，網(wǎng)格蛋白分子解離，病毒與內(nèi)涵體融合形成吞噬體，使得病毒粒子周圍的PH值下降至5.0左右。在此pH條件下，病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使位于輕鏈(HA2) N端的融合肽暴露，從而引起病毒囊膜與細(xì)胞膜融合。低PH環(huán)境也致使大量H+經(jīng)由M2離子通道進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致Ml蛋白與vRNPs的解離。兩者的共同結(jié)果致`復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均發(fā)生在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。mRNA在核內(nèi)合成后轉(zhuǎn)移到胞漿，合成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。而后開(kāi)始裝配子代病毒，神經(jīng)氨酸酶可水解細(xì)胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點(diǎn)釋放出來(lái)。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解為HAl和HA2多肽，這樣的病毒粒子才具有感染性，從而開(kāi)始新一輪病毒的復(fù)制。
[0004]流感病毒在人類中已流行傳播了 300多年，數(shù)年即有一次暴發(fā)流行，數(shù)十年則有一次全球性的大流行。流感流行每年可導(dǎo)致25萬(wàn)~50萬(wàn)例死亡，300萬(wàn)~500萬(wàn)重病例，全球約共有5~15%的人被感染。接種疫苗和使用抗病毒藥物是應(yīng)對(duì)流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原變異能力強(qiáng)，在大流行前基本上不可能大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。目前，經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)正式上市的抗流感病毒藥物有兩類:(1)以金剛烷胺和金剛乙胺為代表的M2離子通道阻斷劑。此類藥只對(duì)甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用，研究表明藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且由于廣泛使用使得耐藥株普遍存在，所以CDC建議此類藥物不再用于預(yù)防流感病毒感染。(2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑，此類藥的代表是奧斯他韋和扎拉米韋。此類藥物對(duì)所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來(lái)關(guān)于奧斯他韋的耐藥株確不斷有報(bào)道。因此，研究并開(kāi)發(fā)新型抗流感病毒藥物有重要意義。
[0005]己烯雌酹(Diethylstilbestrol)又名二乙基己烯雌酹,化學(xué)名為3,4-雙(對(duì)羥基苯酚)一 3-己烯，為人工合成的非留體類雌激素物質(zhì)，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。主要用于雌激素低下或缺乏癥及激素平衡紊亂引起的功能性出血、閉經(jīng)，還可用于死胎引產(chǎn)前，以提高子宮肌層對(duì)催產(chǎn)素的敏感性，以及前列腺癌的故息療法。在上世紀(jì)七八十年代曾作為避孕藥廣泛使用，隨后因?yàn)槌霈F(xiàn)遺傳毒性被FDA禁用。
[0006]目前為止，并未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于己烯雌酚抗流感病毒的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種小分子化合物己烯雌酚在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，從而為臨床上流感的治療提供一種安全高效毒副作用小的小分子化合物。己烯雌酚在無(wú)毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制流感病毒的復(fù)制，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為治療或預(yù)防流感病毒感染疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0008]為了證明己烯雌酚在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的可行性，本發(fā)明采取了以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證:
[0009]A.己烯雌酚對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn):MDCK細(xì)胞按8 X IO3個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，以100.0 μ M為最高濃度按照2梯度稀釋共計(jì)9個(gè)梯度的己烯雌酚進(jìn)行處理，每組重復(fù)兩個(gè)孔，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，Alamarblue法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，己烯雌酚對(duì)MDCK的CC5tl (半數(shù)致死濃度)約為73.5 μ Μ。
[0010]B.己烯雌酚對(duì)抗流感病毒活性的評(píng)價(jià):將MDCK細(xì)胞按照1.5 X IO4細(xì)胞/孔接種于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18-24h后，用IOOTCID5q的病毒液(A/PuertoRico/8/34 (HlNl))感染細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度梯度藥物。細(xì)胞于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示己烯雌酚能夠明顯抑制流感病毒的復(fù)制，其IC5tl為5.7 μ M。
[0011]C.己烯雌酚對(duì)抗流感病毒廣譜性分析:將MDCK細(xì)胞按照1.5Χ IO4細(xì)胞/孔接種于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用IOOTCId50/ 孔病毒液(分別為 A/WSN/S3IN (HlNl)，A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6)，A/Duck/Hubei/216/1983 (H7N8)，B/human/Huber/1/2007))感染細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度梯度藥物。細(xì)胞于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示己烯雌酚能夠明顯抑制甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒亞型H6N6株、甲型流感病毒亞型H7N8株和乙型流感病毒的復(fù)制，切均具有劑量依賴效應(yīng)。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0013]1.己烯雌酚是小分子化合物，其CC5tl為73.5 μ M。己烯雌酚能夠劑量依賴的抑制流感病毒復(fù)制，其IC5tl (半數(shù)抑制濃度)為5.7 μ Μ。選擇指數(shù)(SI)約為13.0。這說(shuō)明己烯雌酚是低毒高效的抗流感病毒的藥物。
[0014] 2.己烯雌酚能夠劑量依賴的抑制甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒亞型Η6Ν6株、甲型流感病毒亞型Η7Ν8株和乙型流感病毒的復(fù)制，具有非常廣譜的抗病毒活性。
[0015]3.利用現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將己烯雌酚作為活性成分制成片劑、膠囊、顆粒齊?、口服液、緩釋制劑、控釋制劑、納米制劑或注射劑等任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為一種己烯雌酚細(xì)胞毒性檢測(cè)示意圖。
[0017]圖2為一種己烯雌酚處理流感病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)液上清中神經(jīng)氨酸酶活性示意圖。
[0018]圖3為一種己烯雌酚抗流感病毒活性廣譜性檢測(cè)示意圖，其中:
[0019]圖3Α為甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株(A/WSN/S31N(HlNl))；
[0020]圖3Β 為甲型流感病毒亞型 Η6Ν6 株(A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6))；
[0021]圖3C 為甲型流感病毒亞型 H7N8 株(A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8))；
[0022]圖3D 為乙型流感病毒(B/human/Huber/1/2007)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為了更好地闡述本發(fā)明的內(nèi)容，下面 申請(qǐng)人:將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范圍不局限于以下實(shí)施例。
[0024]目前，抗流感病毒藥物體外篩選模型分為細(xì)胞培養(yǎng)模型和病毒酶的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)篩選模型。酶反應(yīng)篩選模型具有高通量的特點(diǎn)，但篩選的化合物仍需進(jìn)行更多的細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和體內(nèi)毒性、藥效實(shí)驗(yàn)等以確定其效果。細(xì)胞培養(yǎng)模型是最常用的篩選模型，其優(yōu)點(diǎn)在于:可提供大量遺傳性狀相同的細(xì)胞為研究對(duì)象，操作方便，可消除其它外界因素的影響，并可以檢測(cè)藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機(jī)理研究提供更多基礎(chǔ)。本發(fā)明采用細(xì)胞培養(yǎng)篩選法檢測(cè)己烯雌酚對(duì)流感病毒感染MDCK細(xì)胞，基于對(duì)上清中神經(jīng)氨酸酶活性的檢測(cè)定量分析己烯雌酚抗流感病毒活性。
[0025]實(shí)施例1:己烯雌酚抗流感病毒活性的評(píng)價(jià)
[0026]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0027]1.1細(xì)胞、病毒和藥物
[0028]MDCK細(xì)胞購(gòu)自ATCC，病毒A/PuertoRico/8/34 (HlNl)由雞胚培養(yǎng)擴(kuò)增得到，己烯雌酚(CAS:56-53-1)購(gòu)于 Sigma 公司。
[0029]1.2實(shí)驗(yàn)儀器
[0030]多功能檢測(cè)儀PerkinElmer,倒置顯微鏡Costar。
[0031]2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
[0032]2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0033]37°C，5%C02加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10% FBSU00U/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞至90%匯合度后 傳代，傳代比例1/3 - 1/4。
[0034]2.2病毒培養(yǎng)
[0035]取9~11日齡SPF雞胚，接種病毒前用驗(yàn)蛋器檢查，并在遠(yuǎn)離胚胎的位置標(biāo)記，消毒并打孔后按0.2ml/枚接種24血凝效價(jià)的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒溫箱孵育48h(接種24h后死亡的雞胚一般為操作不當(dāng)致死，棄之)。取出雞胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒雞胚氣室，無(wú)菌操作剪去氣室外殼，毛細(xì)吸管吸取雞胚尿囊液和羊水，3000rpm4°C離心301^11，檢測(cè)血凝效價(jià)，20(^1/管分裝并置_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0036]2.3己烯雌酚的細(xì)胞毒性檢測(cè)
[0037]MDCK細(xì)胞按8 X IO3細(xì)胞/孔(100 μ I)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用；用細(xì)胞維持液(DMEM+2%血清)將藥物以100.0μ M為最高濃度按照2梯度稀釋共計(jì)9個(gè)梯度進(jìn)行處理，每梯度2個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后棄掉培養(yǎng)上清，于每孔中加入100 μ I含有10%Alamarblue試劑的新DMEM培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh，Ih后用多功能檢測(cè)儀分別測(cè)量熒光和吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0038]結(jié)果顯示(圖1)己烯雌酚在25.0μ M范圍內(nèi)對(duì)MDCK細(xì)胞完全沒(méi)有細(xì)胞毒性，說(shuō)明己烯雌酚有比較安全的適用范圍，即己烯雌酚的給藥劑量按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用量為0.0~25.0 μ Μ。
[0039]2.4基于神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)己烯雌酚抗A/PuertoRico/8/34 (HlNl)病毒株的活性[0040]2.4.1.實(shí)驗(yàn)原理:MUNANA (4-methylumbelliferyl- a -N-acetyl-neuraminate)是流感病毒神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的催化產(chǎn)物在355nm激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生460nm熒光，熒光強(qiáng)度的變化，可以靈敏反應(yīng)神經(jīng)氨酸酶活性，從而可反應(yīng)細(xì)胞上清中病毒數(shù)量。
[0041]2.4.2.將MDCK細(xì)胞按1.5X IO4細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS清洗兩遍后，加入IOOTCId50病毒液和各濃度梯度藥物共200 μ I于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物以25.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個(gè)梯度，每梯度設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(利巴韋林)、陰性對(duì)照組(病毒感染后無(wú)藥物處理)和實(shí)驗(yàn)藥物組。
[0042]2.4.3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES, ρΗ6.5,4mmol/LCaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反應(yīng)終止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能檢測(cè)儀上測(cè)定熒光值(激發(fā)光波長(zhǎng)355nm,發(fā)射光波長(zhǎng)465nm)。
[0043]2.4.4.計(jì)算各檢測(cè)孔中神經(jīng)氨酸酶被抑制率。
[0044]抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對(duì)照)/ (酶活對(duì)照-空白對(duì)照)*100%
[0045]結(jié)果顯示:隨著己烯雌酚藥物濃度的增加，藥物對(duì)流感病毒復(fù)制的抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)很明顯的劑量依賴效果，在12.5 μ M濃度時(shí)達(dá)到接近100%抑制率。(見(jiàn)圖2)。
[0046]實(shí)施例2:己烯雌酚抗流感病毒廣譜性的評(píng)價(jià)
[0047]在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，本實(shí)施例進(jìn)一步檢測(cè)了己烯雌酚對(duì)甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒亞型Η6Ν6株、甲型流感病毒亞型Η7Ν8株和乙型流感病毒的抗病毒活性。
[0048]1.實(shí)驗(yàn)使用病毒株包括:A/WSN/S31N(H1N1), A/Duck/Hubei/5/2010 (Η6Ν6), A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)，B/human/Huber/1/2007
[0049]2.將MDCK細(xì)胞按1.5 X IO4細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS清洗兩遍后，加入IOOTCId50病毒液和各濃度梯度藥物共200 μ I于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物以25.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個(gè)梯度，每梯度設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)。
[0050]3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES，pH6.5,4mmol/LCaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反應(yīng)終止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能檢測(cè)儀上測(cè)定熒光值(激發(fā)光波長(zhǎng)355nm,發(fā)射光波長(zhǎng)465nm)。
[0051]4.計(jì)算各檢測(cè)孔中神經(jīng)氨酸酶被抑制率。
[0052]抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對(duì)照)/ (酶活對(duì)照-空白對(duì)照)*100%
[0053]結(jié)果顯示:己烯雌酚在藥物濃度范圍內(nèi)明顯抑制了各種毒株流感病毒復(fù)制，并且呈劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)圖3)。其對(duì)甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株、甲型流感病毒H6N6、甲型流感病毒H7N8以及乙型流感病毒的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為12.5μΜ、
8.6 μ Μ、3.0 μ M和2.8 μ Μ，對(duì)應(yīng)的選擇指數(shù)分別為5.9、8.5、24.5和26.2。表明己烯雌酚是一種廣譜的抗流感病毒藥物。
【權(quán)利要求】
1.己烯雌酚在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的流感病毒為甲型流感病毒或乙型流感病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物是以己烯雌酚或其各種鹽形式作為藥物活性成分。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物為口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或經(jīng)皮給藥劑型。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或注射液。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為緩釋制劑、控釋制劑或納米制劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/05GK103877068SQ201410157540
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月19日
【發(fā)明者】吳建國(guó), 陳緒林, 鄔開(kāi)朗, 劉映樂(lè), 潭秋萍, 劉芳 申請(qǐng)人:武漢勝達(dá)康生物科技有限公司