狂犬病病毒ctn-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，包括如下步驟：將RV?CTN-1V5在vero細(xì)胞中連續(xù)傳10代，得到CTN-1V15株；將CTN-1V15株毒種在雞胚中傳1代，獲得的RVCTN雞胚一代病毒；將RV?CTN雞胚一代病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行傳代，使其逐漸適應(yīng)雞胚成纖維細(xì)胞。本發(fā)明提供了RV?CTN-1株對CEC的適應(yīng)方法，通過該方法可使得CTN株在CEC中快速、高效地增殖；獲得的RV?CTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株能在CEC上穩(wěn)定增殖，并具有良好的穩(wěn)定性和免疫保護(hù)性；本發(fā)明還提供了一種利用RV雞胚細(xì)胞適應(yīng)株制備的滅活疫苗，具有良好的免疫保護(hù)性，可用于生產(chǎn)精制純化人用狂犬病疫苗。
【專利說明】狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及狂犬病疫苗領(lǐng)域，具體涉及將狂犬病病毒CTN-1株適應(yīng)于原代雞胚成纖維細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病病毒(Rabies virus, RV)是高度嗜神經(jīng)病毒，為彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus genus)中不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，能引起人獸共患的世界性傳染病一狂犬病。據(jù)報(bào)道全世界每年因狂犬病的死亡人數(shù)約有5.5萬例，實(shí)際死亡人數(shù)應(yīng)明顯高于該統(tǒng)計(jì)數(shù)字(http://www.worldrabiesday.0rg/)。目前除日本、英國、夏威夷等少數(shù)國家和地區(qū)沒有狂犬病發(fā)生以外，該病呈世界性分布。亞洲和非洲是人狂犬病發(fā)生最嚴(yán)重的地區(qū)，占全世界死亡總?cè)藬?shù)的99%。在正式報(bào)告狂犬病的國家中，印度每年有3萬人以上死于狂犬病，居首位；我國近20年每年統(tǒng)計(jì)到的死亡人數(shù)超過 3000 例，居第二位(Yunpeng wang et al., 2012.Journal of AppliedVirology.1:10-19)。目前尚無法醫(yī)治狂犬病，疫苗接種免疫是預(yù)防狂犬病的唯一有效途徑。
[0003]狂犬病疫苗是由滅活或減毒的RV制備。由于RV是嗜神經(jīng)性病毒，幾乎對所有哺乳動(dòng)物的神經(jīng)組織都具有侵染性。世界上首次試用的狂犬病疫苗就是用RV感染兔脊髓研制的，以后經(jīng)兔腦、小鼠腦、羊腦等動(dòng)物神經(jīng)組織培養(yǎng)，制備疫苗。但由于該類疫苗效力低且存在嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)而被WHO停用(林放濤等.1992.狂犬病學(xué).203-221 ;Meslin F.X.et.al., 1996.Laboratory techniques in rabies.4th ed.WH0.223-313)。1958 年 Kissling等將RV街毒株和固定毒株在原代地鼠腎細(xì)胞中傳代(Kissing P.E.et al., 1958.Proc.Soc Exp Biol Med.98:223-225)。20世紀(jì)60年代以后用細(xì)胞制備疫苗有了很大發(fā)展，人們開始利用各種細(xì)胞來大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病疫苗，特別是人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)疫苗(HDCV)的研制(Wiktor etal., 1964.J Immunol.93:353-366)。由于不存在神經(jīng)元組織，與之前的腦組織疫苗相比，組織培養(yǎng)疫苗不僅更安全，而且更有效。目前已批準(zhǔn)若干種組織培養(yǎng)疫苗，其具有與HDCV相當(dāng)?shù)寞熜Ш桶踩?，例如`純化雞胚細(xì)胞疫苗(PCEC) (Barth et al., 1984.J BiolStand.12:29-64; Schgal et al.，1993.J.Commun.Dis.27:36-43)和純化 vero 細(xì)胞狂犬病疫苗(PVRV) (Suntharasamal et al.，1986.Lancet.2:129-131)。
[0004]RV CTN-1株是WHO和我國有關(guān)部門批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)的毒株，由中國食品藥品檢定研究院建株和保存。20世紀(jì)80年代李宏玲等將RV CTN-1株在vero細(xì)胞中培養(yǎng)進(jìn)行適應(yīng)傳代，得到較高滴度的CTN vero細(xì)胞適應(yīng)株，可用于疫苗生產(chǎn)(李宏玲等.1989.生物制品學(xué)雜志.2:22-25)。董關(guān)木等進(jìn)一步證實(shí)RV CTN-1株可在vero細(xì)胞內(nèi)快速適應(yīng)，滴度可到7.0logLD5cZml以上，并可多次收獲病毒培養(yǎng)液(董關(guān)木等.1995.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展.23:82-85)。目前已有多家生產(chǎn)單位應(yīng)用RV CTN-1株生產(chǎn)vero細(xì)胞疫苗并取得生產(chǎn)文號和投產(chǎn)(俞永新.2008.狂犬病和狂犬病疫苗.第二版:192-208)。但veix)細(xì)胞基質(zhì)為永生性傳代細(xì)胞系，因此有必要檢測終產(chǎn)品中的細(xì)胞殘留DNA (Ref.歐洲藥典.2004.中國藥典.2010)，因?yàn)槠淇赡芫哂袀鬟f潛伏病毒和其他物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。WHO也規(guī)定人用制品的殘留 DNA 劑量應(yīng)不超過 IOng (WHO Expert Committee on Biological Standardition.Recommendations inactivated rabies vaccine for human use produced in cellsubstrates andembryonated eggs.Genava.WH0.2005)。
[0005]Rudolph Barth等人(US4115195)描述了生產(chǎn)狂犬病疫苗的過程，其中多種RV毒株均可利用雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast cells, CEC)制備狂犬病疫苗,如VPll株、Pasteur株、PM株、Flury LEP和Flury HEP。他們在專利中具體提供了利用 RV 固定株 VPl1、Flury LEP 和 Flury HEP 感染 CEC 的實(shí)例。PATEL Pradip Maganlal和 PATEL PankajRamanbhai (PCT/IN2008/000262)描述了 Pitman moore 株(Wistar 株P(guān)M-HDCS\1503-3M)適應(yīng)于CEC，所得到的RV毒株產(chǎn)量高且生產(chǎn)時(shí)間短，易于成規(guī)模生產(chǎn)。1984年底我國的陳道民和林放濤擇用Flury (LEP)株68代雞胚固定毒(獸用活疫苗株)適應(yīng)到CEC培植人用狂犬病疫苗株，初步獲得一株既能使用CEC又具有與a G株(3)免疫原性相仿的狂犬病雞胚細(xì)胞適應(yīng)株一武漢(Wuhan)34株(陳道民等.1988.中國人壽共患病雜志.4:28-30)。但未見到有關(guān)該適應(yīng)毒株進(jìn)一步的報(bào)道。王遠(yuǎn)征等人也嘗試將RV aG株在CEC上進(jìn)行傳代適應(yīng)，得到滴度可達(dá)7.0lgLD5tlAil的毒株，但該毒株是否已完全適應(yīng)于CEC尚不確定(王遠(yuǎn)征等.2012.中國生物制品學(xué)雜志.25:669-671)。迄今為止，還沒有文獻(xiàn)提及使RV CTN-1株適應(yīng)于CEC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種使狂犬病病毒CTN-1株適應(yīng)于原代雞胚成纖維細(xì)胞的方法以及利用方法得到的CTNCEC25株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。
[0007]本發(fā)明提供了狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，包括如下步驟:
[0008]步驟一:將RV CTN-1V5在vero細(xì)胞中連續(xù)傳10代，得到CTN-1V15株。
[0009]步驟二:將CTN-1V15株毒種在雞胚中傳I代，獲得的RV CTN雞胚一代病毒。
[0010]步驟三:將RV CTN雞胚一代病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行傳代，使其逐漸適應(yīng)雞胚成纖維細(xì)胞。
[0011]所述步驟一中，是用PH7.4的PBS將RV CTN-1V5做10倍系列稀釋，然后按照1: 100~1: 1000的比例接種vero單層細(xì)胞，37 °C吸附60分鐘后補(bǔ)加細(xì)胞維持液，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)4~6天收獲病毒上清液，如此連續(xù)傳10代，得到CTN-1V15 株。
[0012]所述步驟二中，是將CTN-1V15株毒種經(jīng)ρΗ7.4的PBS經(jīng)1:10~1:1000稀釋后，取病毒稀釋液經(jīng)卵黃囊接種6~7日齡的SPF雞胚，每胚0.5ml，置于37~39°C、相對濕度40~80%的全自動(dòng)孵蛋箱內(nèi)進(jìn)行孵育，孵育至72~144小時(shí)，收取瀕臨死亡但未死亡的胚胎，去除雞胚的頭后，將軀干研磨粉碎，并按照雞胚重量加入病毒保護(hù)液制備成10%的病毒懸液，然后2000rpm、4°C離心10分鐘，如此傳一代獲得CTNCE01。
[0013]所述步驟三中，是將CTNCE01用pH7.4的PBS以10°~10_4稀釋后，按照接種比例1:10~1: 5X IO5與CEC懸液混合均勻，分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于35~37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病變收獲病毒液，繼續(xù)將病毒在CEC懸液上按照上述培養(yǎng)條件進(jìn)行傳代，適應(yīng)并穩(wěn)定后得到CTNCEC25株。
[0014]步驟三中傳代所使用的培養(yǎng)基為以199培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，補(bǔ)充牛血清、HEPES和人血白蛋白，使牛血清的終含量為3~10%，HEPES終含量為20mmol/L，人血白蛋白的終含量為
0.3~3%，并用7.5%的碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4~7.8。
[0015]步驟三中傳代所使用的溫度為33~36°C。
[0016]步驟三中傳代病毒接種的最佳MOI為0.001~0.05FFU/細(xì)胞，收獲病毒液的最佳時(shí)間為接種后72~96小時(shí)。
[0017]每一代毒種的病毒滴度均采用細(xì)胞熒光灶轉(zhuǎn)化單位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
[0018]本發(fā)明還提供了 CTNCEC25株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。
[0019]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0020]第一方面，本發(fā)明提供了 RV CTN-1株對CEC的適應(yīng)方法，通過該方法獲得了一株RVCTN雞胚細(xì)胞適應(yīng)株一RV CTNCEC25株，該毒株能在CEC上穩(wěn)定增殖，并具有良好的穩(wěn)定性和免疫保護(hù)性。
[0021]第二方面，本發(fā)明提供了一種合適的培養(yǎng)工藝，可使得CTN株在CEC中快速、高效地增殖。
[0022]第三方面，本發(fā)明提供了一種利用RV雞胚細(xì)胞適應(yīng)株建立三級病毒種子庫，制備的滅活疫苗，具有良好的免疫保護(hù)性，其濃縮純化前原液效價(jià)即可到5IU/ml，可用于生產(chǎn)精制純化人用狂犬病疫苗。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0023]圖1RVCTNCEC25株的傳代歷史。
[0024]圖2RVCTN-1株在CEC上的早期病變現(xiàn)象。
[0025]圖3RVCTN-1株在CEC上的后期病變現(xiàn)象。
[0026]圖4RVCTN-1株馴化過程中的病毒增殖趨勢。
[0027]圖5RVCTNCEC25株穩(wěn)定性考察代次的細(xì)胞病變現(xiàn)象。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明提供了狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0029]步驟一:將RV CTN-1V5在vero細(xì)胞中連續(xù)傳10代，得到CTN-1V15株。
[0030]步驟二:將CTN-1V15株毒種在雞胚中傳I代，獲得的RV CTN雞胚一代病毒。
[0031]步驟三:將RV CTN雞胚一代病毒在雞胚成纖維細(xì)胞(CEC)中進(jìn)行傳代，使其逐漸適應(yīng)CEC。
[0032]本發(fā)明涉及在CEC上適應(yīng)RV CTN-1株，所采用的是SPF級白來航雞種蛋(簡稱SPF級種蛋，來源:新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，地址:中國廣東省新興縣勒竹鎮(zhèn)欖根溫氏集團(tuán)總部后山SPF場，下同)，馴化所采用的RV CTN-1株來源于中國食品藥品檢定研究院，為CTN-1株vero細(xì)胞5代毒種，即RV CTN-1V5株。SPF種蛋和RV CTN-1株是WHO批準(zhǔn)用于制造人狂犬病疫苗的基質(zhì)和病毒株。
[0033]本發(fā)明所涉及的CEC懸液的制備過程如下所示:[0034]選用產(chǎn)出一周以內(nèi)、形態(tài)正常、蛋殼厚薄均勻一致、無裂紋、蛋白濃稠的SPF級白來航雞種蛋(來源:新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，地址:中國廣東省新興縣勒竹鎮(zhèn)欖根溫氏集團(tuán)總部后山SPF場，下同)，放入37~39°C、相對濕度40~80%的孵蛋器內(nèi)進(jìn)行孵育，用檢卵燈觀察是否為受精卵及其活力。選用9~11日齡、雞胚發(fā)育正常、可見清晰的血管及活動(dòng)的雞胚。用0.2% (m/v)新潔爾滅溶液浸泡5分鐘后撈出，氣室向上置于蛋托上,然后用2% (m/v)碘酊和75% (v/v)酒精消毒后移入超凈臺內(nèi)。用無菌鑷子取出雞胚，放入盛有I XHanks溶液的平皿內(nèi)。去除雞胚的頭、內(nèi)臟，放入滅菌廣口瓶內(nèi)，用無菌剪刀剪切成I~3mm3的組織塊，按照每枚雞胚5~8ml的量加入預(yù)熱至37°C的0.1% (m/v)胰酶溶液，置于37°C水浴箱內(nèi)消化15~30分鐘。消化完畢，加入50~250ml細(xì)胞生長液(以199培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度為3~5% (v/v)的牛血清，199培養(yǎng)基可購自北京清大天一科技有限公司，型號為M199MD505，下同。為區(qū)別后面的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基最終溶液標(biāo)記為MO)，用無菌細(xì)胞吹打管吹打分散細(xì)胞得到細(xì)胞懸液。取1.0ml細(xì)胞懸液經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4，下同)10倍稀釋后與等體積0.4% (m/v)臺盼藍(lán)混合均勻后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞密度為0.8~1.4X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的懸液，備用。
[0035]本發(fā)明所涉及的PBS (pH7.4)的制備方法如下所示:
[0036]稱取8.0g氯化鈉，0.2g氯化鉀，0.27g磷酸氫二鉀，1.42g磷酸二氫鈉，加入800ml注射用水充分?jǐn)嚢杌靹?，然后加?8%的濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容至1000ml。經(jīng)121 °C、15分鐘滅菌后，室溫保存?zhèn)溆谩?br> [0037]以下將通過具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明:
[0038]實(shí)施例1
[0039]以CTN-1V5株為母毒株，通過多條傳代途徑和工藝的比較篩選，發(fā)現(xiàn)按下列工藝路線傳代獲得的毒株能逐漸適 應(yīng)在雞胚細(xì)胞中的生長，該狂犬病毒雞胚細(xì)胞適應(yīng)株被命名為 CTNCEC25 株。
[0040]步驟一:將CTN-1V5株在vero細(xì)胞上進(jìn)行傳代，以提高病毒滴度。
[0041]用PBS(pH7.4)將RV CTN_1V5(來源于中國食品藥品檢定研究院，為CTN-1株vero細(xì)胞5代毒種)做10倍系列稀釋，然后按照1:100~1:1000的比例接種vero單層細(xì)胞(來源于中國食品藥品檢定研究院，121代)，37 °C吸附60分鐘后補(bǔ)加細(xì)胞維持液(以199培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度10% (v/v)的牛血清，pH7.2~8.0)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)4~6天收獲病毒上清液，如此連續(xù)傳10代，得到病毒滴度可達(dá)7.51gLD50/ml以上的 CTN-1V15 株。
[0042]步驟二:將CTN-1V15株毒種在雞胚中傳I代，獲得的RV CTN雞胚一代病毒。
[0043]隨后將獲得的CTN-1V15株毒種經(jīng)PBS (ρΗ7.4) 1:10~1:1000稀釋后，取病毒稀釋液經(jīng)卵黃囊接種6~7日齡的SPF雞胚，每胚0.5ml，置于37~39°C、相對濕度40~80%的全自動(dòng)孵蛋箱內(nèi)進(jìn)行孵育，逐日觀察(24小時(shí)內(nèi)死亡的接種胚記為非特異性死亡)，孵育至72~144小時(shí)，收取瀕臨死亡但未死亡的胚胎，去除雞胚的頭后，將軀干研磨粉碎，并按照雞胚重量加入病毒保護(hù)液(以199培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加終濃度20% (v/v)牛血清，pH7.2~8.0)制備成 10% (m/v)的病毒懸液,然后 2000rpm (Revolutions Per Minute,rpm)、4°C離心10分鐘，取上清按照1.0ml/支分裝至專用凍存管，取樣進(jìn)行病毒滴度測定，如此傳一代，獲得RV CTN雞胚一代病毒即CTNCEOI，檢測其滴度為5.21gLD50/mL.[0044]步驟三:將RV CTN雞胚一代病毒在雞胚成纖維細(xì)胞(CEC)中進(jìn)行傳代，使其逐漸適應(yīng)CEC。
[0045]將步驟二獲得的RV CTN雞胚一代病毒(CTNCE01)用PBS (pH7.4)適宜稀釋后(10°~10_4)，按照不同的接種比例(1:10~1:5 X IO5)與前述制備好的CEC懸液(MO，細(xì)胞密度為0.8~1.4X IO6個(gè)細(xì)胞/ml)混合均勻，分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于35~37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病變(主要表現(xiàn)為病變細(xì)胞聚集，圓縮，更快老化與脫落，見圖2)收獲病毒液，繼續(xù)將病毒在CEC上按照上述培養(yǎng)條件進(jìn)行傳代。
[0046]傳代過程中采用倒置顯微鏡觀察接種病毒后的細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，病毒在細(xì)胞上的病變漸漸增強(qiáng)，病變的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)疏松、空泡、胞質(zhì)濃縮、胞漿中細(xì)胞器大量破壞甚至溶解的現(xiàn)象(見圖3)，有別于初期病變細(xì)胞只是聚集、圓縮的現(xiàn)象。
[0047]同時(shí)采用細(xì)胞突光灶轉(zhuǎn)化單位實(shí)驗(yàn)(Fluorescence Focus Units Assay, FFU,具體操作如下)對每一代毒種均取樣測定病毒滴度。結(jié)果表明，RV CTN開始不能良好復(fù)制，傳四
[0048]代后，病毒滴度降至最低(4.51gFFU/ml)，但隨后病毒滴度開始緩慢上升，傳至20代后，
[0049]滴度升高并穩(wěn)定至6.0lgFFU/ml (結(jié)果詳見圖4)。
[0050]細(xì)胞 突光灶轉(zhuǎn)化單位實(shí)驗(yàn)(Fluorescence Focus Units Assay, FFU)測定病毒滴度:
[0051]①將待測病毒樣品用PBS先進(jìn)行10倍系列稀釋，再進(jìn)行3倍系列稀釋。然后取50 μ I稀釋后的病毒液接種50 μ I細(xì)胞密度為IXlO6個(gè)細(xì)胞/ml的BSR細(xì)胞(來源于中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所，25代)?；旌暇鶆蚝笾糜?7°C，5%C02培養(yǎng)24小時(shí)。
[0052]②丙酮固定及染色
[0053]a.上述培養(yǎng)24小時(shí)后，倒棄上清液，用PBS (pH7.4)洗滌一遍。
[0054]b.每孔加入50 μ 180% (v/v)冷丙酮，置于_20°C固定30分鐘。
[0055]c.每孔加入50 μ I FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒抗體(Millipore公司，Cat.N0.5100)，置于37°C孵育30分鐘，倒去抗體溶液。
[0056]d.用PBS洗滌三遍，甩干，每孔加入50 μ 180% (v/v)甘油，直接置于熒光顯微鏡下觀察每個(gè)稀釋度的熒光灶數(shù)目。
[0057]e.取> 10個(gè)和< 10個(gè)熒光灶的相鄰兩孔稀釋度的數(shù)據(jù)按照下列公式計(jì)算結(jié)果。
[0058]待測樣品滴度(lg FFU/ml)=lg{[(高稀釋度的熒光平均數(shù)X3+低稀釋度的熒光平均數(shù))1/2X低稀釋倍數(shù)X 1000/50}
[0059]表1
[0060]
【權(quán)利要求】
1.狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一:將RV CTN-1V5在vero細(xì)胞中連續(xù)傳10代，得到CTN-1V15株。 步驟二:將CTN-1V15株毒種在雞胚中傳I代，獲得的RV CTN雞胚一代病毒。 步驟三:將RV CTN雞胚一代病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行傳代，使其逐漸適應(yīng)雞胚成纖維細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，所述步驟一中，是用pH7.4的PBS將RV CTN-1V5做10倍系列稀釋，然后按照1:100~1:1000的比例接種vero單層細(xì)胞，37 °C吸附60分鐘后補(bǔ)加細(xì)胞維持液，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)4~6天收獲病毒上清液，如此連續(xù)傳10代，得到CTN-1V15 株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，所述步驟二中，是將CTN-1V15株毒種經(jīng)pH7.4的PBS經(jīng)1:10~1:1000稀釋后，取病毒稀釋液經(jīng)卵黃囊接種6~7日齡的SPF雞胚，每胚0.5ml，置于37~39°C、相對濕度40~80%的全自動(dòng)孵蛋箱內(nèi)進(jìn)行孵育，孵育至72~144小時(shí)，收取瀕臨死亡但未死亡的胚胎，去除雞胚的頭后，將軀干研磨粉碎，并按照雞胚重量加入病毒保護(hù)液制備成10%的病毒懸液，然后2000rpm、4°C離心10分鐘，如此傳一代獲得CTNCE01。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，所述步驟三中，是將CTNCE01用pH7.4的PBS以10°~10_4稀釋后，按照接種比例1:10~1:5X105與CEC懸液混合均勻，分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于35~37°〇、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病變收獲病毒液，繼續(xù)將病毒在CEC懸液上按照上述培養(yǎng)條件進(jìn)行傳代，適應(yīng)并穩(wěn)定后得到CTNCEC25株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，步驟三中傳代中所使用的CEC懸液制備中采用的培養(yǎng)基為以199培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，補(bǔ)充牛血清、HEPES和人血白蛋白，使牛血清的終含量為3~10%，HEPES終含量為20mmol/L，人血白蛋白的終含量為0.3~3%，并用7.5%的碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4~7.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，步驟三中傳代所使用的溫度為33~36°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，步驟三中傳代病毒接種的最佳MOI為0.001~0.05FFU/細(xì)胞，收獲病毒液的最佳時(shí)間為接種后72~96小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒CTN-1株對原代雞胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)方法，其特征在于，每一代毒種的病毒滴度均采用細(xì)胞熒光灶轉(zhuǎn)化單位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求4得到的CTNCEC25株在制備狂犬病病毒滅活疫苗中的用途。
【文檔編號】A61K39/205GK103865888SQ201410131925
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】郭采平, 王春華, 羅姍, 劉永娣, 容偉華, 李慧, 周維, 周蘭貞, 田華, 張佩, 丁玉江, 黃偉榮, 吳開永, 張運(yùn)佳, 王紅冰, 王錦才, 吳恩應(yīng) 申請人:深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司