一種磷酸化麝香蛸素的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磷酸化麝香蛸素的純化方法，屬化學(xué)純化【技術(shù)領(lǐng)域】。磷酸化麝香蛸素具有非常強(qiáng)烈的降壓活性，但其化學(xué)合成的粗品大量純化很難，限制了其應(yīng)用。本發(fā)明利用二氧化鈦與磷酸化麝香蛸素在酸性環(huán)境中存在較強(qiáng)的路易斯酸堿作用，在堿性環(huán)境中路易斯酸堿作用消失的原理，采用自主研發(fā)的一種磷酸化多肽的純化裝置(申請(qǐng)?zhí)枺?01420158316.9)中，通過上樣——清洗——洗脫三個(gè)關(guān)鍵步驟，借助減壓過濾等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)合成的磷酸化麝香蛸素的純化制備。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)高效，為磷酸化麝香蛸素的純化提供了有效方法，從而促成其在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。
【專利說明】一種磷酸化麝香蛸素的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磷酸化麝香蛸素的純化方法，屬化學(xué)純化【技術(shù)領(lǐng)域】，主要為磷酸化多肽在醫(yī)藥等領(lǐng)域的有效應(yīng)用提供條件。
【背景技術(shù)】
[0002]麝香蛸素(Eledoisin)是從麝香蛸(Eledone)中提取得到的含11個(gè)氨基酸的多妝，其序列為 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2,具有強(qiáng)烈的外周血管舒張及增加冠脈血流量的作用，是已知肽類中最有效的降壓物質(zhì)，其效應(yīng)比硝酸甘油強(qiáng)數(shù)千倍。磷酸化麝香蛸素是將其N端第3位Ser磷酸化后得到的，序列為Pyr-Pro-Ser (PO3H)-LyS-ASp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2，其活性比麝香蛸素高兩倍多(一種強(qiáng)效降壓磷酸肽及其制備方法，申請(qǐng)?zhí)?201410118129.2)，降壓持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)I倍左右。因此磷酸化麝香蛸素將在醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。但由于其存在純化難的問題，限制了其有效應(yīng)用。目前磷酸化麝香蛸素主要通過化學(xué)法合成，雖然磷酸化麝香蛸素比麝香蛸素只多了一個(gè)磷酸基團(tuán)，但要大量制備磷酸化麝香蛸素純品的難度大為增加，原因:一是磷酸化麝香蛸素的化學(xué)合成產(chǎn)率較低，副產(chǎn)物較多；二是色譜法中最常用的反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)，每次純化的量有限(〈lOOmg)，純化過程非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力；三是磷酸化麝香蛸素與其對(duì)應(yīng)的非磷酸化麝香蛸素在最常用的色譜分離中行為非常相似，導(dǎo)致RP-HPLC很難將其分離。因此，要得到磷酸化麝香蛸素的純品，尤其是大量制備，是一項(xiàng)非常重要而又困難的工作。
[0003]針對(duì)磷酸化多肽的分析水平的純化，除了色譜法外，目前發(fā)展的技術(shù)主要有固相金屬親和色譜(IMAC)和金屬氧化物富集法。近期，金屬氧化物親和富集技術(shù)得到了人們極大的關(guān)注，如二氧化鈦(TiO2)和二氧化錯(cuò)(ZrO2)等。2004年P(guān)inkse等(“Selective isolatio n at the femtomole level of phosphopeptides fromproteolytic digests using2D-NanoLC-ESI_MS/MS and titanium oxide precolumns，，，《Analytical Chemistry)), P3935-3943, 2004年)將二氧化鈦技術(shù)引進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，并建立了 TiO2為預(yù)分離的2D-NanoLC-ES1-MS/MS技術(shù)平臺(tái)。近期利用TiO2富集磷酸肽的文獻(xiàn)亦有報(bào)道，并證明了二氧化鈦對(duì)磷酸肽富集的高效性(“A novel titaniumdioxide-polydimethylsiloxane plate for phosphopeptide enrichment and massspectrometry analysis”,《Analytica Chimica Acta》，P105-113, 2014年)。但目前已報(bào)道的技術(shù)主要在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中對(duì)生物樣本中的天然磷酸化多肽進(jìn)行微量相對(duì)富集(申請(qǐng)?zhí)?201310253448.X, 200810202189.7,200810211727.9)，以便提高磷酸化多肽在質(zhì)譜中的檢出率，尚停留在分析水平的純化，無法滿足化學(xué)法合成的磷酸化多肽的大量純化的要求，特別是磷酸化麝香蛸素的純化方法尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種能用于化學(xué)合成的磷酸化麝香蛸素的高選擇性、高特異性的純化方法，為磷酸化麝香蛸素在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供條件。[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]利用二氧化鈦與磷酸根在酸性環(huán)境中存在較強(qiáng)的路易斯酸堿作用，在堿性環(huán)境中路易斯酸堿作用消失的原理并結(jié)合自主研發(fā)的一種磷酸化多肽的純化裝置(申請(qǐng)?zhí)?201420158316.9)而實(shí)現(xiàn)的。首先將二氧化鈦裝填到一種磷酸化多肽的純化裝置中，并在酸性環(huán)境下，將磷酸化麝香蛸素加入純化玻璃管中，由于酸性條件下二氧化鈦表現(xiàn)為路易斯酸，鈦原子將與磷酸根陰離子結(jié)合，起到特異性吸附磷酸化麝香蛸素的目的；然后用酸性較低的清洗液將沒有被吸附的非磷酸化多肽和雜質(zhì)去除；清洗完后，利用堿性環(huán)境下二氧化鈦表現(xiàn)為路易斯堿，失去與磷酸根作用的特點(diǎn)，因此加入堿性溶液，便可洗脫得到純品磷酸化麝香蛸素，從而實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成磷酸化麝香蛸素的純化。具體步驟如下:
[0007](I)移取40 μ m, 300A的二氧化鈦納米粒子到自主研發(fā)的一種磷酸化多肽的純化裝置(申請(qǐng)?zhí)?201420158316.9)中；
[0008](2)用70%乙腈/3%三氟乙酸的浸潤(rùn)液浸潤(rùn)二氧化鈦納米粒子，混懸，0.05~
0.09mbar條件下減壓移除浸潤(rùn)液；
[0009](3)將樣品溶解在70%乙腈/3%三氟乙酸的上樣液中，之后加入(2)中，混懸，
0.05~0.09mbar條件下減壓移除上樣液；
[0010](4)分別加入清洗液60%乙腈/0.1 %三氟乙酸、50%乙腈/0.1 %三氟乙酸、50%乙腈洗漆，混懸，0.05~0.09mbar條件下減壓移除清洗液,除去非磷酸化多肽和雜質(zhì)；
[0011](5)加入洗脫液0.lmol/L氨水，混懸，移除洗脫液，洗脫磷酸化麝香蛸素；
[0012](6)用色譜 、 質(zhì)譜分析技術(shù)分析鑒定磷酸化麝香蛸素。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
[0014]1.為磷酸化麝香蛸素的純化提供有效方法?；瘜W(xué)合成的磷酸化麝香蛸素的粗產(chǎn)品產(chǎn)物比較復(fù)雜，純化難度大，本發(fā)明借助二氧化鈦與磷酸化麝香蛸素之間的特異性作用，可以高特異性地對(duì)磷酸化麝香蛸素吸附，從而起到純化的效果，將促成其在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0015]2.方法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)高效。與傳統(tǒng)的多肽純化方法相比，本發(fā)明的方法(I)操作非常簡(jiǎn)便，無需昂貴的儀器(如高效液相色譜法儀器、制備型色譜柱等)；(2)效果經(jīng)濟(jì)高效，溶劑的用量比傳統(tǒng)常用的色譜法大大節(jié)省(大約可以節(jié)省10倍左右)，所耗時(shí)間也極大縮短(一個(gè)樣本大約只需10分鐘左右，傳統(tǒng)的純化方法，特別依賴儀器，一個(gè)僅僅50mg左右的樣本大約需要90分鐘左右，如果樣本量大，還要重復(fù)上樣，時(shí)間上也將相應(yīng)翻倍，溶劑的用量同樣也要翻倍)。
[0016]3.特別適用于與其對(duì)應(yīng)的非磷酸化多肽色譜行為非常相近的磷酸化多肽的純化。色譜行為相近的多肽采用最常用的RP-HPLC很難將其分離，有時(shí)即使多次分離也很難實(shí)現(xiàn)，而采用二氧化鈦與磷酸基團(tuán)的親和富集作用，可以很好的特異性地純化磷酸化多肽。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為納米二氧化鈦材料用于化學(xué)合成的磷酸化多肽的純化流程示意圖。
[0018]圖2為色譜行為非常相近的麝香蛸素和磷酸化麝香蛸素高效液相色譜分析圖。(a)磷酸化麝香蛸素的高效液相色譜色譜圖；(b)麝香蛸素的高效液相色譜圖。
[0019]圖3為化學(xué)合成的三個(gè)多肽純品混合后的MALD1-T0F-MS圖。(a)未經(jīng)二氧化鈦純化MS分析；(b)經(jīng)過二氧化鈦純化后MS分析。(c)為清洗二氧化鈦玻璃管中殘留的非磷酸化多肽和雜質(zhì)的質(zhì)譜圖；(d)為洗脫下的磷酸化多肽[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2]的質(zhì)譜圖。
三個(gè)多肽純品分別為:
[0020]憐酸化多妝I =Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2
[0021]非憐酸化多妝2 =Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Phe (Cl)-Gly-Leu-Met-NH2
[0022]非憐酸化多妝3:Pyr-Pro-Ser-LyS-Asp-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2
[0023]圖4為單體法化學(xué)合成磷酸化磨香蛾素Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1 Ie-Gly-Leu-Met-NH2的MALD1-TOF-MS圖。(a)未經(jīng)二氧化鈦純化MS分析；(b)經(jīng)過二氧化鈦純化后MS分析。
[0024]圖5為總體法化學(xué)合成磷酸化磨香蛾素Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1Ie-Gly-Leu-Met-NH2的MALD1-TOF-MS圖。(a)未經(jīng)二氧化鈦填料純化MS分析；(b)經(jīng)過二氧化鈦填料純化后MS分析?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
[0026]磷酸化麝香蛸素與其它兩個(gè)非磷酸肽混合后的簡(jiǎn)單樣本的純化制備:
[0027]稱取IOOmg的二氧化鈦到帶有篩板的純化玻璃管中，加入70%乙腈/3% TFA的溶液10mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液0.05~0.09mbar條件下減壓濾除，等待上樣；稱取磷酸化多妝 I 純品 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2 和兩個(gè)非憐酸化多妝純品[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Phe(Cl)-Gly-Leu-Met-NH2 和 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2]各 IOmg,混合后，溶解在 70% 乙腈/3% TFA 的溶液20mL中，上下震蕩混勻5分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；加入60%乙腈/0.1 % TFA的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液減壓濾除；加入50%乙腈/0.1%TFA的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液減壓濾除；加入50%乙腈的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；最后加入0.lmol/L的氨水溶液洗三遍，體積分別為20mL、10mL、10mL，上下震蕩混勻各3分鐘，將溶液在0.05~
0.09mbar條件下減壓濾除到干凈的容器中。進(jìn)行MALD1-TOF-MS分析。圖3中(a)為磷酸化多妝[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr (PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2 和兩個(gè)非憐酸化多妝Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Phe(Cl)-Gly-Leu-Met-NH2和 Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-AlB-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2]混合后經(jīng)二氧化鈦玻璃管純化前的質(zhì)譜圖；圖3中(b)為未被二氧化鈦吸附而流出的非磷酸化多肽和雜質(zhì)的質(zhì)譜圖；圖3中(c)為清洗二氧化鈦玻璃管中殘留的非磷酸化多肽和雜質(zhì)的質(zhì)譜圖；圖3中(d)為洗脫下的磷酸化多肽[Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr (PO3H)-Gly-Leu-Met-NH2]的質(zhì)譜圖。磷酸化多肽用標(biāo)記。可見磷酸化多肽簡(jiǎn)單樣本可用本發(fā)明方法很好純化。
[0028]實(shí)施例2
[0029]單體法化學(xué)合成的磷酸化麝香蛸素的純化制備:
[0030]稱取Ig的二氧化鈦到帶有篩板的純化玻璃管中，加入70 %乙腈/3 % TFA的溶液10mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除，等待上樣；稱取IOOmg 單體法化學(xué)合成的憐酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2]粗品，將其溶解在70%乙腈/3% TFA的溶液20mL中，上下震蕩混勻5分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；加入60%乙腈/0.1 % TFA的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；加入50%乙腈/0.1% TFA的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液減壓濾除；加入50%乙腈的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；最后加入0.lmol/L的氨水溶液洗三遍，體積分別為20mL、IOmL, IOmL,上下震蕩混勻各3分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除到干凈的容器中。進(jìn)行MALD1-TOF-MS分析。圖4中(a)與圖4中(b)為單體法化學(xué)合成的憐酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser (PO3H) -Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2]粗品經(jīng)二氧化鈦玻璃管純化前后的質(zhì)譜圖。磷酸化麝香蛸素用標(biāo)記?？梢妴误w法化學(xué)合成的磷酸化麝香蛸素雖然副產(chǎn)物較多，但仍可用本發(fā)明方法很好純化制備。
[0031]實(shí)施例3
[0032]總體法化學(xué)合成的磷酸化麝香蛸素的純化制備:
[0033]稱取Ig的二氧化鈦到帶有篩板的純化玻璃管中，加入70 %乙腈/3 % TFA的溶液10mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除，等待上樣；稱取IOOmg總體法化學(xué)合成的磷酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser (PO3H)-Lys-Asp-Ala-Phe-1le-GIy-Leu-Met-NH2]粗品，將其溶解在70%乙腈/3% TFA的溶液20mL中，上下震蕩混勻5分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；加入60%乙腈/0.1 % TFA的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；加入50%乙腈/0.1 %TFA的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；加入50%乙腈的溶液20mL，上下震蕩混勻I分鐘，將溶液在0.05~0.09mbar條件下減壓濾除；最后加入0.lmol/L的氨水溶液洗三遍，體積分別為20mL、10mL、10mL，上下震蕩混勻各3分鐘，將溶液在0.05~0.09mba`r條件下減壓濾除到干凈的容器中。進(jìn)行MALD1-TOF-MS分析。圖5中(a)與圖5中(b)為總體法化學(xué)合成的磷酸化磨香蛾素[Pyr-Pro-Ser(PO3H)-Lys-Asp-Ala-Phe-1le-Gly-Leu-Met-NH2]粗品經(jīng)二氧化鈦玻璃管純化前后的質(zhì)譜圖。磷酸化麝香蛸素用標(biāo)記?？梢娍傮w法化學(xué)合成的磷酸化麝香蛸素雖然副產(chǎn)物較多，但仍可用本發(fā)明方法很好純化制備。
【權(quán)利要求】
1.一種磷酸化麝香蛸素的純化方法，其特征在于該方法步驟如下: (1)移取40μ m, 300A的二氧化鈦納米粒子到自主研發(fā)的一種磷酸化多肽的純化裝置(申請(qǐng)?zhí)?201420158316.9)中； (2)用70%乙腈/3 %三氟乙酸的浸潤(rùn)液浸潤(rùn)二氧化鈦納米粒子，混懸,0.05~`0.09mbar條件下減壓移除浸潤(rùn)液；(3)將樣品溶解在70%乙腈/3%三氟乙酸的上樣液中，之后加入(2)中，混懸，0.05~`0.09mbar條件下減壓移除上樣液； (4)分別加入清洗液60%乙腈/0.1 %三氟乙酸、50%乙腈/0.1 %三氟乙酸、50%乙腈洗滌，混懸，0.05~0.09mbar條件下減壓移除清洗液，除去非磷酸化多肽和雜質(zhì)； (5)加入洗脫液0.lmol/L氨水，混懸，移除洗脫液，洗脫磷酸化麝香蛸素； (6)用色譜、質(zhì)譜分析技`術(shù)分析鑒定磷酸化麝香蛸素。
【文檔編號(hào)】A61P9/12GK103864897SQ201410131632
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】隋少卉, 董俊軍, 游炎富, 李建, 吳為輝, 李善茂, 劉基偉, 張鳴, 蔣輝, 劉尚義 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍防化學(xué)院