甘草苷在制備治療高催乳素血癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及甘草苷在制備治療高催乳素血癥藥物中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明將甘草苷施用于高催乳素血癥動(dòng)物模型和細(xì)胞模型抑制了催乳素的分泌和合成，D2R基因沉默緩解了甘草苷對催乳素分泌和合成的抑制作用。甘草苷通過D2R介導(dǎo)其對催乳素分泌和合成的抑制，表明甘草苷可以作為治療高催乳素血癥的藥物。
【專利說明】甘草苷在制備治療高催乳素血癥藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及甘草苷在制備治療高催乳素血癥藥物中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 高催乳素血癥是最常見的腺垂體疾病，由內(nèi)外環(huán)境因素引起。從病理改變看，可 分為腫瘤性高催乳素血癥，產(chǎn)后型高催乳素血癥，特發(fā)性高催乳素血癥，藥源性高催乳素血 癥。藥源性高催乳素血癥是臨床常見的不良反應(yīng)，發(fā)生率高達(dá)42%-66% [Halbreich U.，et al.. Hyperprolactinemia and schizophrenia ：mechanisms and clinical aspects. Journal of psychiatric practice2003;9:344_353]，短期內(nèi)引起泌乳、閉經(jīng)，長期會(huì)造成 體重增加、骨質(zhì)疏松及增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率，嚴(yán)重影響患者的身心健康及治療 的依從性。
[0003] 催乳素的調(diào)節(jié)是一個(gè)很復(fù)雜的系統(tǒng)，涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、代謝產(chǎn)物、 機(jī)體的激素信號改變等。這些因素大體可以分為兩類：催乳素釋放因子（PRF)和催乳 素抑制因子（PIF) [Madhusoodanan S，· et al· Hyperprolactinemia associated with psychotropics-a review. Human psychopharmacology2010 ;25 :281-297] 〇 多巴胺是 最主要的催乳素抑制因子（PIF)，它通過垂體催乳素細(xì)胞膜上的多巴胺D2受體（D2R)， 抑制催乳素的合成和釋放[Cookson J.，et al· Prolactin，hyperprolactinaemia and antipsychotic treatment ：a review and lessons for treatment of early psychosis. J Psychopharmacol2012 ；26 :42-45]〇
[0004] MMQ細(xì)胞是一種來源于大鼠垂體瘤細(xì)胞的典型高催乳素血癥細(xì)胞模型[Judd AM. , et al. Characterization of the MMQ cell, a prolactin-secreting clonal cell line that is responsive to dopamine. Endocrinologyl988 ; 123 :2341-2350] 〇 MMQ 細(xì)胞的細(xì)胞膜上含有多巴胺D2受體（D2R)，能夠?qū)Χ喟桶芳岸喟桶奉愃幬锓磻?yīng)。溴隱 亭等多巴胺受體激動(dòng)劑能夠激動(dòng)MMQ細(xì)胞上的D2R，抑制其胞內(nèi)催乳素的分泌。傳統(tǒng) 中藥方劑如芍藥甘草湯組方獨(dú)特，療效可靠，配比簡單，在我們先前的臨床實(shí)踐中被應(yīng) 用于改善高催乳素血癥的相關(guān)癥狀[Judd AM.，et al. Characterization of the MMQ cell， a prolactin-secreting clonal cell line that is responsive to dopamine. Endoci'inologymSS ;123 :2341-2350]。但中藥方劑治療，由于方劑本身的特殊性，治療機(jī) 制模糊，不利于臨床推廣和機(jī)制探索。
[0005] 甘草苷是一種從甘草中提取的黃酮類天然化合物，具有抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)作 用[Zhao Z. , et al. Antidepressant-like effect of liquiritin from Glycyrrhiza uralensis in chronic variable stress induced depression model rats. Behavioural brain research. 2008194 ：108-113Chen ZA. ,et al. Liquiritin potentiate neurite outgrowth induced by nerve growth factor in PC12cells. Cytotechnology2009 ； 60 ：125-132Wang W.,et al. Antidepressant-like effects of liquiritin and isoliquiritin from Glycyrrhiza uralensis in the forced swimming test and tail suspension test in mice. Progress in neuro-psychopharmacology&biological pSychiatry2008 ;32 :1179-1184]，但是甘草苷具有治療藥源性高催乳素血癥的作用還未 被報(bào)道。甘草苷作為甘草中的活性成分，其作為候選藥物在治療高催乳素血癥方面的療效 值得期待。
[0006] RNA干擾（siRNA)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性基因沉默 現(xiàn)象[Fire A.，et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNAin Caenorhabditis elegans.Naturel998 ;391 :806-811]，因其具有沉默效率高、特異 性強(qiáng)以及操作簡便等優(yōu)于傳統(tǒng)基因敲除手段的優(yōu)點(diǎn)而得到迅速發(fā)展，現(xiàn)成為生命科學(xué)領(lǐng)域 中重要的石開究工具[Arziman Z. , et al. E-RNAi ：a web application to design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Res2005;33:W582-W588]。siRNA 與蛋白質(zhì)結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC)。該復(fù)合物能夠結(jié)合到同源的 mRNA上并誘導(dǎo)其降解。
[0007] 為了研究候選藥物對高催乳素血癥的療效及其作用機(jī)制，通常采用siRNA干擾的 技術(shù)方案：利用針對D2R的siRNA，干擾D2R的功能，給研究對象施用候選藥物，通過檢測催 乳素的合成和分泌情況，驗(yàn)證該候選藥物是否具有治療高催乳素血癥的功效。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于公開甘草苷在制備治療高催乳素血癥藥物中的應(yīng)用。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明的高催乳素血癥是藥源性高催乳素血癥。藥源性高催乳素血癥是 由抗精神病藥物引起的。
[0010]引發(fā)藥源性高催乳素血癥的抗精神病藥物包括氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜、三氟拉 嗪、硫利達(dá)嗪。氯普噻噸、氟哌啶醇、氟哌利多、五氟利多、舒必利、氯氮平 [0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，甘草苷能明顯抑制催乳素的分泌。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，甘草苷能明顯抑制催乳素的合成。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，針對D2R基因的SiRNA能明顯抑制D2R的表達(dá)。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，D2R基因沉默能明顯緩解甘草苷介導(dǎo)的催乳素分泌的抑制。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，D2R基因沉默能明顯緩解甘草苷介導(dǎo)的催乳素合成的抑制。
[0016] 本發(fā)明的實(shí)施方案是在高催乳素血癥模型大鼠和MMQ細(xì)胞-高催乳素血癥細(xì)胞模 型中進(jìn)行的。
[0017] 本發(fā)明使用的高催乳素血癥模型大鼠是由抗精神病藥物舒必利誘導(dǎo)而成的。
[0018] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1顯示了甘草苷對催乳素分泌的影響，其中：
[0020] 圖la顯示了甘草苷對高催乳素血癥模型大鼠催乳素分泌的影響；
[0021] 圖lb顯示了甘草苷對MMQ細(xì)胞催乳素分泌的影響；
[0022] 圖2顯示了甘草苷對高催乳素血癥模型大鼠垂體部位催乳素合成的影響，其中：
[0023] 圖2a顯示了利用QPCR檢測甘草苷對高催乳素血癥模型大鼠垂體部位催乳素基因 轉(zhuǎn)錄水平的影響；
[0024] 圖2b顯示了利用免疫印跡檢測甘草苷對高催乳素血癥模型大鼠垂體部位催乳素 基因表達(dá)水平的影響；
[0025] 圖3顯示了 D2R基因沉默對MMQ細(xì)胞中D2R基因沉默的效果監(jiān)測；
[0026] 圖4顯示了 D2R基因沉默對MMQ細(xì)胞催乳素分泌的影響；
[0027] 圖5顯示了 D2R基因沉默對MMQ細(xì)胞中催乳素表達(dá)的影響，其中：
[0028] 圖5a顯示了利用QPCR檢測D2R基因沉默對MMQ細(xì)胞中催乳素基因轉(zhuǎn)錄水平的影 響；
[0029] 圖5b顯示了利用免疫印跡檢測D2R基因沉默對MMQ細(xì)胞中催乳素基因蛋白水平 的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0031] 實(shí)施例1甘草苷對高催乳素血癥模型大鼠和MMQ細(xì)胞催乳素分泌的影響
[0032] 1.主要儀器：ELISA檢測儀（UTRA0)，細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo)。
[0033] 2.主要材料和試劑：碘[1251]催乳素放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術(shù)研 究所），DMEM培養(yǎng)基（Gibco)。
[0034] 3.高催乳素血癥動(dòng)物模型建立
[0035] 48只SD雌性大鼠（180g-220g)，購于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。室內(nèi)環(huán)境：明-暗周 期12h :12h(早上7 :00開始給予光照），自然光照，溫度23±1°C。動(dòng)物自由飲水、攝食。動(dòng) 物內(nèi)眥靜脈取血前禁食12h。動(dòng)物每天進(jìn)行陰道涂片來確保實(shí)驗(yàn)干預(yù)及血樣采集時(shí)，動(dòng)物處 于動(dòng)情間期。
[0036] 動(dòng)物被隨機(jī)分成6組（n=8)。8只為對照組，不做任何處理。40只模型組每天 給予舒必利腹腔注射（40mg，2次/天），14天后模型動(dòng)物分別給予生理鹽水（陰性對照 組-CTRL)、溴隱亭lmg/kg (陽性對照組-BMT)、甘草苷（10、20、40mg/kg)(分別表示為 LiqlO、Liq20、Lip40)14天，給藥方式為灌胃，動(dòng)物內(nèi)眥靜脈取血，血液2500Xg離心15分 鐘后，放入-20°C冰箱儲(chǔ)存。
[0037] 4.細(xì)胞培養(yǎng)和處理
[0038] MMQ細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別給予甘 草苷0、1、10、100 μ Μ干預(yù)MMQ細(xì)胞24h，溴隱亭1 μ Μ為陽性對照組。
[0039] 5.檢測血清中和細(xì)胞培養(yǎng)基中催乳素的含量
[0040] 利用碘[1251]催乳素放射免疫分析試劑盒，按照說明書的步驟分別檢測血清中和 細(xì)胞培養(yǎng)基中催乳素的含量。
[0041] 6.統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的方式，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí) 驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，Ρ〈0. 05視為差異有顯著性（*代表Ρ〈0. 05 ; # 代表 Ρ〈〇· 01)。
[0042] 結(jié)果分析：（1)各實(shí)驗(yàn)組之間血清催乳素存在明顯差異（F=6. 528, Ρ=0. 001)。模型 組大鼠血清催乳素是未處理組的1. 6倍。給予甘草苷干預(yù)組血清催乳素分別降低24. 1% (10mg/kg 組），26. 9% (20mg/kg 組），35. 5% (40mg/kg 組）。溴隱亭陽性對照組降低 36. 6% (圖la)。上述結(jié)果表明甘草苷抑制了催乳素的分泌。圖中圖2:甘草苷干預(yù)SD大鼠血清催 乳素水平。CTRL為未做任何處理的對照組，SPR為模型組，BMT為溴隱亭陽性對照組，LiqlO、 20、40 分別為甘草苷 10、20、40mg/kg。
[0043] (2)甘草苷能夠明顯抑制MMQ細(xì)胞催乳素的分泌，且為劑量依賴性 (F=4. 243, Ρ=0· 009)(圖 lb)。
[0044] 實(shí)施例2甘草苷對高催乳素血癥模型大鼠垂體部位催乳素基因表達(dá)的影響
[0045] 1. QPCR檢測催乳素基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
[0046] 1. 1主要儀器：PCR儀（ABI公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad)，細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo)。
[0047] 1. 2主要材料和試劑：mRNA提取純化試劑盒（CWbio. Co. Ltd)，HiFi-MMLVcDNA第一 鏈合成試劑盒，DMEM培養(yǎng)基（Gibco)。
[0048] 1. 3熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測催乳素基因mRNA水平：大鼠垂體部位 總RNA提取根據(jù)總RNA提取試劑盒（CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0581)說明書進(jìn)行。用 HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0744)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作 按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。GAPDH基因（內(nèi)參）的引物為5' -TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3 '（上 游引物）和5' -TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3'（下游引物）。催乳素基因的引物為 5' -TCAATGACTGCCCCACTTCT-3'（上游引物）和 5' -AAACAGAGGGTCATTCCAGG-3'（下游引 物）。反應(yīng)體系：用 UltraSYBR Mixture (With R0X) (CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0956)進(jìn)行擴(kuò)增， 實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C 10min，（95°C 15s，60°C 60s)*45個(gè)循環(huán)。 RealTime反應(yīng)體系為：
[0049] 2 XUltraSYBR Mixture : 10 μ 1
[0050] 上游引物（10uM) : 0. 4μ 1
[0051] 下游引物（10uM) : 0. 4μ 1
[0052] 模板： 2 μ 1
[0053] 加入滅菌蒸餾水至20 μ 1。
[0054] 2. Western blot檢測催乳素蛋白表達(dá)的變化
[0055] 大鼠垂體部位組織用組織裂解液（150mM氯化鈉+1 % NP-40 (去垢劑）+0. 1 % SDS(去垢劑）+2yg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑）（使用前加入）+2yg/ml Leupeptin(蛋 白酶抑制劑）（使用前加入）或ImM PMSF(蛋白酶抑制劑）+1.5mM EDTA(蛋白酶抑制 齊[J) +lmM NaVanadate (磷酸脂酶抑制劑））裂解，用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測 定，各實(shí)驗(yàn)組取50 μ g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，接著加入催乳素抗體在 4°C孵育過夜，膜用TBST液洗滌3次，然后再用辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠 (中杉金橋有限公司，1 :5000)室溫孵育lh。用ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑孵育5min后曝 光、顯影、定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)對X-光片進(jìn)行掃描并計(jì)算光密度值。蛋白相對表達(dá) 量=待測蛋白的光密度值/內(nèi)參的光密度值。管家蛋白GAPDH為內(nèi)參。
[0056] 3.統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的方式，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí) 驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P〈0. 05視為差異有顯著性（*代表P〈0. 05 ; # 代表 Ρ〈〇· 01)。
[0057] 結(jié)果分析：圖2(a、b)顯示，單因素方差分析表明，組間催乳素mRNA表達(dá) 的差異明顯（F=7. 096, P〈0. 001)，western Blot結(jié)果垂體部位催乳素組間差異明顯 (F=66. 512, P〈0. 001)。這些結(jié)果表明，甘草苷能夠明顯抑制模型大鼠催乳素的合成、分泌和 表達(dá)，并且有劑量依賴特性。
[0058] 實(shí)施例3siRNA對MMQ細(xì)胞中D2R基因沉默效果的檢測實(shí)驗(yàn)
[0059] 1. 1主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo)。
[0060] 1. 2主要材料和試劑：脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen)，DMEM培養(yǎng)基（Gibco)。
[0061] 1.3 合成 siRNA
[0062] 在Genebank中找到D2R的基因序列（GenBank-ID :NM_012547)。由上海吉?jiǎng)P基因 公司設(shè)計(jì)及化學(xué)合成，共設(shè)計(jì)三對siRNA序列，2. 00D(5nmol)*2只，如下：
[0063] siRNAl ：
[0064] 正義鏈：5 ' -caGCAGGATTCACTGTGACAT-3，，
[0065] 反義鏈：5' -ATGTCACAGTGAATCCTGCTG-3' ；
[0066] siRNA2 ：
[0067] 正義鏈：5 ' -caGGATTCACTGTGACATCTT-3 '，
[0068] 反義鏈：5' -AAGATGTCACAGTGAATCCTG-3' ；
[0069] siRNA3 ：
[0070] 正義鏈：5，-aaCCTGTGTGCCATCAGCATT-3，，
[0071] 反義鏈：5, -AATGCTGATGGCACACAGGTT-3,；
[0072] 空靶基因 siRNA(siNT)
[0073] 正義鏈：5' -UUAAGUAGCUUGGCCUUGAtt-3 '，
[0074] 反義鏈：5' -UCAAGGCCAAGCUACUUAAtt-3 '。
[0075] 2.沉默效率驗(yàn)證
[0076] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng):MMQ細(xì)胞在含10% FBS的DMHM培養(yǎng)基中，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱培 養(yǎng)。
[0077] 2. 2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞按1X104/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% C〇2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 試劑2000(購自于Invitrogen公司）的說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和實(shí) 驗(yàn)組（20nM)，其中陰性對照組siRNA為通用對照siRNA，即siNT，與D2R基因的序列無同源 性，濃度為20nM/孔。同時(shí)分別轉(zhuǎn)染。
[0078] 2. 3免疫印跡（western blot)檢測D2R基因蛋白表達(dá)水平：按照3. 2的方法轉(zhuǎn)染 MMQ細(xì)胞后48小時(shí)，用細(xì)胞裂解液（150mM氯化鈉+1% NP-40(去垢劑）+0. 1% SDS (去垢 齊[J)+2yg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑）（使用前加入）+2ytg/ml Leupeptin(蛋白酶 抑制劑）（使用前加入）或ImM PMSF(蛋白酶抑制劑）+1. 5mM EDTA(蛋白酶抑制劑）+lmM NaVanadate(磷酸脂酶抑制劑））收集細(xì)胞，用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測定， 各實(shí)驗(yàn)組取50 μ g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂奶粉封閉，接著加入D2R抗體在4 °C孵 育過夜，膜用TBST液洗滌3次，然后再用辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠（中杉 金橋有限公司，1 :5000)室溫孵育lh。用ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑孵育5min后曝光、顯 影、定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)對X-光片進(jìn)行掃描并計(jì)算光密度值。蛋白相對表達(dá)量=待 測蛋白的光密度值/內(nèi)參的光密度值。管家蛋白β-actin為內(nèi)參。
[0079] 3.統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的方式，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí) 驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P〈0. 05視為差異有顯著性（*代表P〈0. 05 ; # 代表 Ρ〈〇· 01)
[0080] 結(jié)果分析：siRNA與siNT瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MMQ細(xì)胞48小時(shí)后，siRNAl組MMQ細(xì)胞D2R蛋 白的表達(dá)水平（0. 23±0. 12)與 siNT組（0. 81±0. 24)、空白對照組（CTRL) (0. 94±0. 21)相 比有了顯著減少，siRNA對MMQ細(xì)胞的D2R蛋白表達(dá)抑制率為73. 7% (F=23. 89, P=0. 00)。 siRNA2組MMQ細(xì)胞D2R蛋白的表達(dá)水平（0. 68±0. 19)，siRNA3組MMQ細(xì)胞D2R蛋白的表 達(dá)水平（(λ 57±0· 24)與siNT陰性對照組（(λ 81±0· 24)、空白對照組（(λ 94±0· 21)相比， 對MMQ細(xì)胞的D2R蛋白表達(dá)抑制率分別為22%和35%。這些數(shù)據(jù)表明siRNAl能在蛋白水 平強(qiáng)力抑制D2R的表達(dá)（圖3)。每組三個(gè)平行樣。因此在下面的實(shí)驗(yàn)中均使用siRNAl進(jìn) 行基因的沉默，即下文中的siRNA即代表siRNAl。
[0081] 實(shí)施例4D2R基因沉默對MMQ細(xì)胞催乳素分泌的影響
[0082] 催乳素ELISA檢測試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中催乳素的含量：首先將標(biāo)準(zhǔn)品和待檢 測樣本各50 μ 1加入到相應(yīng)的反應(yīng)孔中。每孔加入100 μ 1酶連物（大連泛邦公司），輕輕混 勻30s,室溫60min。用洗漆液洗板5次，加入100 μ 1顯色液，輕輕混勻10s,室溫20min。每 孔加入50 μ 1終止液，輕輕混勻30s，30min內(nèi)在ELISA檢測儀上測定各孔的吸光度（A450nm 值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣本的催乳素含量。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，取平均值。
[0083] 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：方法同實(shí)施例3
[0084] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組、空白對照組每組中細(xì)胞分別進(jìn)行下列 處理：不加藥物（CTRL)處理、甘草苷100yM(Liql00)處理、溴隱亭ΙμΜ(ΒΜΤ)處理，24小 時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基利用ELISA檢測試劑盒檢測催乳素的分泌情況。
[0085] 統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的方式，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié) 果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P〈0. 05視為差異有顯著性（*代表P〈0. 05 ;#代 表 Ρ〈0· 01)
[0086] 結(jié)果分析：甘草苷處理后與同組的陰性對照（siNT)和空白對照（CTRL)相比，MMQ 細(xì)胞催乳素的分泌減少了，但是經(jīng)過siRNA干擾后，甘草苷抑制MMQ細(xì)胞催乳素分泌的結(jié)果 消失了，表明甘草苷通過D2R的介導(dǎo)，抑制了催乳素的分泌（圖4)。
[0087] 實(shí)施例OT2R基因沉默對MMQ細(xì)胞中催乳素基因表達(dá)的影響
[0088] 1. QPCR檢測催乳素基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
[0089] 1. 1主要儀器：PCR儀（ABI公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad);細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo)。
[0090] 1. 2主要材料和試劑：mRNA提取純化試劑盒（CWbio. Co. Ltd)，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試 齊[J (Invitrogen)，DMEM 培養(yǎng)基（Gibco)，HiFi-MMLVcDNA 第一鏈合成試劑盒。
[0091] 1. 3細(xì)胞培養(yǎng):MMQ細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱培 養(yǎng)。
[0092] 1.4細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞按1X104/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% C〇2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，在無雙抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 試劑2000(購自于Invitrogen公司）的說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和實(shí) 驗(yàn)組（20nM)，其中陰性對照組siRNA為通用對照siRNA，即siNT，與D2R基因的序列無同源 性，濃度為20nM/孔。同時(shí)分別轉(zhuǎn)染。
[0093] 1. 5熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測催乳素基因mRNA水平：總RNA提取根據(jù)總RNA提 取試劑盒（CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0581)說明書進(jìn)行。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒 (CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0744)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。GAPDH基因（內(nèi)參） 的引物為 5'-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3'（上游引物）和 5'-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3'（下 游引物）。催乳素基因的引物為5' -TCAATGACTGCCCCACTTCT-3'（上游引物）和 5' -AAACAGAGGGTCATTCCAGG-3'（下游引物）。反應(yīng)體系：用 UltraSYBR Mixture (With R0X) (CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0956)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?95°C 10min，（95°C 15s，60°C 60s)*45 個(gè)循環(huán)。RealTime 反應(yīng)體系為：
[0094] 2 XUltraSYBR Mixture : 10 μ 1
[0095] 上游引物（10uM) : 0. 4μ 1
[0096] 下游引物（10uM) : 0. 4μ 1
[0097] 模板： 2 μ 1
[0098] 加入滅菌蒸餾水至20 μ 1。
[0099] 1. 6統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的方式，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí) 驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，Ρ〈0. 05視為差異有顯著性（*代表Ρ〈0. 05 ; # 代表 Ρ〈〇· 01)
[0100] 結(jié)果分析：QPCR結(jié)果顯示，甘草苷處理后與同組的陰性對照（siNT)和空白對照 (CTRL)相比，MMQ細(xì)胞催乳素mRNA的水平下降，表明甘草苷抑制了催乳素基因的轉(zhuǎn)錄，但是 siRNA干擾后，甘草苷抑制MMQ細(xì)胞催乳素基因轉(zhuǎn)錄的趨勢消失了，表明甘草苷通過D2R的 介導(dǎo)，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了催乳素的合成（圖5a)。LiqlOO為甘草苷（100μΜ)，ΒΜΤ為溴隱 孕（1 μ Μ)。
[0101] 2. Western blot檢測催乳素蛋白表達(dá)的變化
[0102] Western blot的步驟同實(shí)施例2。
[0103] 統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的方式，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié) 果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P〈0. 05視為差異有顯著性（*代表P〈0. 05 ;#代 表 Ρ〈0· 01)
[0104] 結(jié)果分析：western Blot結(jié)果顯示，甘草苷處理后與同組的陰性對照（siNT)和空 白對照（CTRL)相比，催乳素蛋白量降低，表明甘草苷抑制了催乳素的表達(dá)，但是siRNA干擾 后，甘草苷降低MMQ細(xì)胞催乳素表達(dá)的趨勢消失了，表明甘草苷通過D2R的介導(dǎo)，抑制了催 乳素的合成（圖5b)。LiqlOO為甘草苷（100 μ Μ)，BMT為溴隱亭（1 μ M)。
[0105] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1. 甘草苷在制備治療高催乳素血癥藥物中的應(yīng)用。
2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述高催乳素血癥是藥源性高催乳素血癥。
3. 權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥源性高催乳素血癥是由抗精神病藥物 引起的。
4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗精神病藥物包括氯丙嗪、奮乃靜、氟奮 乃靜、三氟拉嗪、硫利達(dá)嗪、氯普噻噸、氟哌啶醇、氟哌利多、五氟利多、舒必利、氯氮平。
【文檔編號】A61K31/7048GK104107186SQ201410088699
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】王傳躍, 徐志卿, 張志洋 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院