流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗的制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗的制備及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了SEQ?ID?No.1所示的DNA分子。本發(fā)明公開的HAdV嵌合疫苗可以覆蓋HAdV傳染病病原體，保護(hù)更多人群免受流感病毒和HAdV之害，為實現(xiàn)“一苗兩用”或“一苗多用”奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗的制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]呼吸道傳染病至今仍然是世界上導(dǎo)致死亡的主要原因之一，而腺病毒(Adenovirus, AdV)和流感病毒則是重要的呼吸道病原體。眾所周知，腺病毒在自然界分布十分廣泛，是兒童呼吸道疾病的常見病原之一。在3歲以下小兒急性上呼吸道感染中約5%-10%是由腺病毒引起的。從我國北方和南方各地住院病兒的臨床調(diào)查結(jié)果，證實3、7型腺病毒是腺病毒肺炎的主要病原，由它們所導(dǎo)致的下呼吸道感染占所有腺病毒感染的50%。而腺病毒因其型別多、致病范圍廣，給人類健康和生命安全造成了嚴(yán)重威脅，越來越受到社會關(guān)注。與此同時，人們不會忘記歷史上的三次流感暴發(fā)流行，給全世界帶來的災(zāi)難性后果，特別是近年來出現(xiàn)的H5、H7亞型禽流感病毒跨越種屬屏障感染人的事件，給人類再次敲響了警鐘。因此人腺病毒和流感的防控已成為當(dāng)今生命科學(xué)的重大問題。
[0003]目前，疫苗接種是預(yù)防和控制人類傳染病的最有效措施。在過去的50多年中，流感疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗，已經(jīng)為人類健康作出了重要貢獻(xiàn)。近年來美國和俄羅斯研制的流感減毒活疫苗，是一種降低了毒力并能在最佳適應(yīng)溫度下生長的減毒人流感病毒株，臨床實驗證實是安全、有效的，可以有效預(yù)防流感，該疫苗的廣泛應(yīng)用為人類在21世紀(jì)征服流感提供了美好前景。然而，對于人類呼吸道腺病毒而言，至今還沒有被批準(zhǔn)使用的疫苗，但對于疫苗的研究一直是國際社會關(guān)注的重點。盡管腺病毒疫苗發(fā)展迅速，研制 的腺病毒滅活疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗，為人類呼吸道腺病毒的免疫預(yù)防提供了候選疫苗，但尚未大規(guī)模應(yīng)用。從研究看因為腺病毒有51個血清型之多，各個型別之間的差異較大，疫苗免疫后誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生潛在免疫過激，并且注射免疫不能產(chǎn)生黏膜免疫以及傳統(tǒng)減毒活疫苗還存在不穩(wěn)定和潛在免疫過激等問題，給疫苗的發(fā)展提出了挑戰(zhàn)。
[0004]近年來，一是抗原免疫生物信息學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展為針對腺病毒六鄰體主要保護(hù)性抗原表位設(shè)計產(chǎn)生了重大影響，為實現(xiàn)提高B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體滴度、減低免疫過激、提升全面保護(hù)的腺病毒疫苗研制提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持；二是反向遺傳技術(shù)快速發(fā)展，為研制安全、有效、多價的減毒活疫苗提供了先進(jìn)技術(shù)，使得流感病毒作為遞送系統(tǒng)顯現(xiàn)了良好的發(fā)展前景，同時為嵌合病毒達(dá)到“一苗兩用”或“一苗多用”的目的提供了理論依據(jù)；三是噴鼻免疫途徑為嵌合病毒針對人腺病毒設(shè)計出具有產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答、實現(xiàn)免疫交叉保護(hù)，成為人腺病毒疫苗的重要發(fā)展方向。因此，以上技術(shù)集承、整合為研制安全、有效、實用的人腺病毒疫苗提供了科學(xué)保證。
[0005]一、抗原免疫生物信息技術(shù)的迅速發(fā)展，為腺病毒疫苗的研發(fā)提供了新策略
[0006]早在50年代中期，人們試圖用手術(shù)切除的扁桃體、增殖體建立細(xì)胞培養(yǎng)系時，發(fā)現(xiàn)有一種傳染性因子可使培養(yǎng)的上皮細(xì)胞出現(xiàn)退變，1956年這種因子被正式命名為腺病毒(Adenovirus)。它能引起人類呼吸道、胃腸道、泌尿系及眼的疾病。人類腺病毒(humanadenovirus, HAdV)屬于哺乳動物AdV屬，為無包膜的雙鏈DNA病毒，呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑為70~90nm。根據(jù)物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)分為A~G7組，每一組包括若干血清型，共51型，其中1-8，19，21，35血清型都與嚴(yán)重急性呼吸道疾病相關(guān)，而3、7型是致病性最高的兩種。國外也有不少文獻(xiàn)報道:3、7型腺病毒引起急性的呼吸道疾病在美國軍隊新兵訓(xùn)練營中流行較為嚴(yán)重。從病毒結(jié)構(gòu)看，HAdV衣殼蛋白由252個殼粒組成，其中240個殼粒組成蛋白衣殼的20個面，其組成蛋白被稱為六鄰體(HeXon，120KD)，是主要的包膜蛋白；12個殼粒位于20面體的頂角，被稱為五鄰體(penton,82KD);還有三聚體蛋白的纖維(fiber,62KD)。其中，六鄰體是腺病毒的主要抗原蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，抑制病毒構(gòu)象的改變，從而中和病毒體。六鄰體含有大量的抗原決定簇，包括型特異性和亞屬特異性抗原表位以及中和性抗原表位。基底(pedestal)包含兩個區(qū)域Pl和P2區(qū)，塔區(qū)由4個環(huán)(loop)構(gòu)成，即Loopl、Loop2、Loop3、Loop4區(qū)。近年來，由于腺病毒六鄰體蛋白的結(jié)構(gòu)特異性，編碼中和抗原表位，參與免疫反應(yīng)，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點。由此可見，HAdV由于其特殊、復(fù)雜的病原學(xué)特性，給HAdV的防控提出了難題。
[0007]疫苗是控制傳染病最有效的手段。在人類戰(zhàn)勝疾病和傳染病的斗爭中，疫苗發(fā)揮了重要作用，腺病毒疫苗也不例外。美國早在六十年代已采用包有腸溶衣的腺病毒減毒活疫苗對新兵訓(xùn)練營的成年人進(jìn)行免疫實驗，發(fā)現(xiàn)可以減少百分之九十的腺病毒引起的發(fā)熱癥狀，但是通過血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)這種活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度十分低。七十年代使用腺病毒腸溶活疫苗進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)血清中IgM、IgG、IgA升高，但是在鼻分泌物中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的IgA型抗體。腺病毒減毒活疫苗雖然在美軍中使用效果良好，但是美軍中仍存在著ARD爆發(fā)的現(xiàn)象，有研究采用DNA芯片以及PCR技術(shù)證實，接種現(xiàn)有腺病毒減毒活疫苗后，接種者仍能共感染(Co-1nfection)其它型別的腺病毒，證明現(xiàn)有減毒活疫苗的對其它型別的腺病毒沒有交叉免疫保護(hù)能力。因此，HAdV亞單位疫苗責(zé)無旁貸成為本領(lǐng)域的重要發(fā)展目標(biāo)。
[0008]在過去數(shù)年中，腺病毒作為一種基因載體被廣泛應(yīng)用于基因治療和嵌合疫苗研究中，而腺病毒感染大大阻礙了這種基因治療的療效，同時人們不會忽視這種嵌合疫苗帶來的潛在副反應(yīng)。近年來，抗原免疫生物信息學(xué)的發(fā)展對HAdV六鄰體主要保護(hù)性抗原表位設(shè)計產(chǎn)生了重大影響，為實現(xiàn)保護(hù)性抗原的T、B細(xì)胞優(yōu)勢表位疫苗研發(fā)提供了理論技術(shù)支持。有文獻(xiàn)報道應(yīng)用噬菌體展示短肽技術(shù)探索腺病毒表位，用3型腺病毒中和抗體篩選噬菌體隨機(jī)十五肽庫，經(jīng)三輪篩選后，隨機(jī)挑取了 22個噬菌體克隆，分別加入3型腺病毒感染的Hela細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 / 22個克隆菌體短肽對3型腺病毒感染Hela細(xì)胞具有保護(hù)作用。另有學(xué)者通過計算機(jī)比較腺病毒六鄰體氨基酸序列，結(jié)合2型腺病毒三維結(jié)構(gòu)圖提示的多肽暴露情況以及抗原性預(yù)測分析，選擇六鄰體蛋白基因的937~1230，2166~2607及937~2607編碼序列。此區(qū)域涵括的預(yù)測的抗原位點在呼吸道腺病毒型間具有很高的同源性，在腺病毒顆粒上可能具有較好的暴露性并可能含有型間或組特異性抗原表位。國外也有人應(yīng)用Ad2的Loopl區(qū)的抗原決定簇在B組柯薩奇病毒中的表達(dá)，以柯薩奇病毒作為載體，重組II型腺病毒六鄰體蛋白的LI環(huán)可以使其在HeLa細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)，所表達(dá)的蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生既抗腺病毒又抗柯薩奇病毒的中和抗體，進(jìn)而研制多價的基因工程疫苗。
[0009]二、流感病毒反向遺傳技術(shù)的發(fā)展，為制備流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗病毒株提供了可靠保證[0010]目前，反向遺傳學(xué)技術(shù)在流感病毒領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展，流感病毒的8質(zhì)粒病毒拯救系統(tǒng)在國內(nèi)外已經(jīng)成為成熟的技術(shù)，使得以流感病毒作為遞送系統(tǒng)表達(dá)外源基因成為很有吸引力的研究方向，重組呼吸道傳染病疫苗的研究熱點集中在流感病毒身上。流感病毒作為開發(fā)其它傳染病病原體疫苗的載體有許多優(yōu)勢:(I)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答；(2)流感疫苗由于抗原變異需要每年生產(chǎn)；(3)HA和NA表面蛋白的結(jié)構(gòu)和功能決定了能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行基因操作而不影響它們的功能；(4)流感病毒已經(jīng)形成了高效的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)；(5)小鼠和雪貂為重組流感病毒疫苗候選株呼吸道黏膜免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)的研究提供了很好的動物模型。與其他載體如腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒相t匕，流感病毒在復(fù)制周期不會形成DNA中間產(chǎn)物，此外由于它不會整合進(jìn)宿主的染色體，使得其具有更高的安全性。用于流感病毒基因組操作的策略有:外源蛋白嵌合入表面糖蛋白HA和NA，產(chǎn)生另外的基因片段，改造非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。
[0011]鑒于流感病毒反向遺傳技術(shù)取得的突破性進(jìn)展，已有大量文獻(xiàn)報道將流感病毒作為遞送系統(tǒng)成功制備了能夠達(dá)到有效免疫保護(hù)的、多價的嵌合疫苗候選株，為疫苗的研究拓寬了發(fā)展前景。2004年Horimoto等構(gòu)建了嵌合體病毒(A/B),該病毒含有嵌合體(A/B)的HA和B型病毒全長NA片段。該研究為從單一宿主菌株開發(fā)減毒活疫苗提供了一種新的思路。2005年Maeda Y等通過反向遺傳學(xué)技術(shù)產(chǎn)生一種重組的A型流感病毒，該病毒的編碼區(qū)是副流感病毒的HA/NA外功能區(qū)，能夠在雞胚中有效繁殖但在小鼠體內(nèi)卻是減毒的。當(dāng)用重組病毒鼻內(nèi)給藥小鼠后，全部都能產(chǎn)生抵抗流感病毒和副流感病毒的抗體。這種雙價的活疫苗的免疫保護(hù)效果明顯優(yōu)于聯(lián)合疫苗。同年Zhu NanLi等報道小肽能夠插入流感病毒HA抗原的“l(fā)oop”環(huán)區(qū)域，隨后的研究顯示，B.anthracis的保護(hù)性抗原(PA)大片段多肽能被插入流感病毒H3亞型HA的功能區(qū)，嵌合HA-PA基因的重組流感病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞和雞胚傳代后，遺傳穩(wěn)定性好，動物實驗結(jié)果表明，重組病毒能夠引起HA和PA蛋白誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。2003年Kawaka等將GFP基因整合入NA基因的特定位置后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組流感病毒粒子組裝的效率可高達(dá)91%。2005年Andrej Egorov等先后將GFP和IL-2插入NSl的開放閱讀框，結(jié)果成功得到了重組的流感病毒株。
[0012]以上所述是目前將流感病毒作為遞送`系統(tǒng)表達(dá)外源基因的研究現(xiàn)狀，而國內(nèi)外，將流感病毒基因組作為表達(dá)HAdV病毒抗原表位的載體，用于研制流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗在國內(nèi)外還未見報道。
[0013]三、噴鼻免疫流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗，是提升安全、全方位免疫保護(hù)的
基石
[0014]2003年6月，美國Medimmune公司生產(chǎn)的流感三價減毒活疫苗Flumist被FDA批準(zhǔn)和投入使用，適用于2-17歲健康少年兒童以及18-49歲健康成人，臨床實驗結(jié)果顯示該疫苗是安全和有效的。到2012年2月，美國FDA批準(zhǔn)流感四價減毒活疫苗上市，該疫苗通過鼻腔接種，使用方法簡便，應(yīng)用范圍廣泛，使得以冷適應(yīng)流感減毒活疫苗為遞送系統(tǒng)表達(dá)外源基因研制其他疫苗開辟了新的天地，帶來了新的機(jī)遇。流感病毒作為一種強(qiáng)有力的疫苗載體通過遞送不同的抗原進(jìn)入鼻組織能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)和黏膜的T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，減毒活疫苗通過鼻內(nèi)免疫，可以誘導(dǎo)局部和全身免疫，因而對上呼吸道和下呼吸道感染有防御作用。減毒活疫苗誘生的免疫應(yīng)答類似于對野生型病毒的應(yīng)答。對于呼吸道黏膜感染的HAdV疫苗來說，注射接種不是理想的免疫途徑，也不方便。因此，發(fā)展鼻腔途徑是疫苗免疫的最佳選擇。
[0015]鼻道富有淋巴樣組織，是鼻腔接種疫苗的靶部位，即鼻相關(guān)淋巴樣組織(NALT)，它主要位于喉部的淋巴樣組織環(huán)，稱為Waldeyer氏環(huán)。研究表明，鼻腔黏膜面積約150cm2，上皮細(xì)胞間隙較大并與毛細(xì)血管緊密相連，血管和淋巴結(jié)豐富，鼻黏膜的單位血流量約40ml/min，比肌肉、腦、肝臟的都大，實際上鼻咽部是良好的免疫器官，有豐富的抗原提呈細(xì)胞，能對抗原有效的提呈、加工，產(chǎn)生黏膜免疫和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，并且局部的黏膜免疫，還能引起呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位黏膜免疫應(yīng)答的相通性，但以呼吸道最強(qiáng)。
[0016]噴鼻免疫是目前研究活躍的領(lǐng)域，近年也有許多企業(yè)開發(fā)鼻腔接種疫苗，特別是呼吸道傳染性疾病疫苗，如流感減毒活疫苗通過鼻腔接種，不僅可以產(chǎn)生局部黏膜免疫，還可以產(chǎn)生系統(tǒng)免疫，并且產(chǎn)生具有交叉免疫保護(hù)。因此，開發(fā)鼻腔接種的流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗替代注射具有很大的應(yīng)用前景，這是由于鼻腔免疫具有簡單、有效、非常適于廣大人群的自我使用，同時使得機(jī)體能夠抵抗HAdV和流感兩種病原體感染，并且對HAdV疫苗免疫應(yīng)答類型可以轉(zhuǎn)變，由此達(dá)到更加安全的目的，為HAdV和流感的免疫預(yù)防提供保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的是提供一種流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗的制備及其應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明提供SEQ ID N0.1所示的DNA分子。
[0019]一種重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該病毒按照如下方法制備:
[0020]將分別含有冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因和冷適應(yīng)、減毒流感病·毒的NS基因的表達(dá)質(zhì)粒，以及分別含有靶標(biāo)流感病毒的HA基因和靶標(biāo)流感病毒的NA基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到重組流感病毒；
[0021]在如下所述基因中的至少一種基因的開放讀碼框中的任意位置插入或替換為HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因:
[0022](I)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因；
[0023](2)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因；
[0024](3)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因；
[0025](4)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因；
[0026](5)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因；
[0027](6)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因；
[0028](7)靶標(biāo)流感病毒的HA基因；
[0029](8)靶標(biāo)流感病毒的NA基因；
[0030]所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因，以及靶標(biāo)流感病毒的HA基因和NA基因位于不同的表達(dá)質(zhì)粒上；
[0031]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因為HAdV的六鄰體蛋白全基因和/或HAdV的六鄰體蛋白的優(yōu)勢抗原表位基因。
[0032]上述重組病毒中，所述宿主細(xì)胞為MDCK、Vero、293T、C0S細(xì)胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培養(yǎng)的細(xì)胞；[0033]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因為HAdV的六鄰體蛋白塔區(qū)Loopl和Loop2的優(yōu)勢抗原表位基因的融合基因。
[0034]上述任一所述的重組病毒中，所述HAdV為3型HAdV或7型HAdV ；
[0035]所述3型HAdV具體為HAdV-3病毒株VR-3 ；
[0036]所述7 型 HAdV 具體為 HAdV-7 病毒株 GZ08，GenBank accession N0.GQ478341。
[0037]上述任一所述的重組病毒中，所述HAdV的六鄰體蛋白塔區(qū)Loopl和Loop2的優(yōu)勢抗原表位基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不。
[0038]上述任一所述的重組病毒中，所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間；
[0039]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因與所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位核苷酸之間連有5’ -UAAUG-3’序列；
[0040]和/ 或，
[0041]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換；
[0042]和/ 或，
[0043]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述靶標(biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換。
[0044]上述任一所述的重組病毒中，`所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒為冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒或冷適應(yīng)、減毒B型流感病毒；
[0045]所述冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒具體為H2N2亞型冷適應(yīng)、減毒流感病毒，再具體為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)；
[0046]所述靶標(biāo)流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種，再具體為HlNl亞型流感病毒，再具體為流感病毒株A/California/07/2009 (HlNl)；
[0047]所述靶標(biāo)流感病毒為未經(jīng)過任何處理的(如未經(jīng)過減毒、未經(jīng)過冷適應(yīng))的普通野生型流感病毒。
[0048]上述任一所述的重組病毒中，所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間所得序列為SEQ ID N0.2中第41-1162位核苷酸所示；
[0049]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.3中第40-759位核苷酸所示；
[0050]所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?qū)⑺霭袠?biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.4中第35-650位核苷酸所示。
[0051]構(gòu)建所述表達(dá)質(zhì)粒時，上述PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因、NS基因、HA基因或NA基因，均在各自的5’端連接有各自基因的3’ NCR序列，均在各自的3’端均連接有各自基因的5’ NCR序列；
[0052]所述表達(dá)質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)粒為雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pAD3000 ；[0053]構(gòu)建所述表達(dá)質(zhì)粒時，均將各基因插在雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pAD3000的BsmBI位點。
[0054]上述任一所述的病毒制備得到的嵌合疫苗也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0055]上述DNA分子在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HAdV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0056]和/ 或，
[0057]上述任一所述的病毒在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HAdV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0058]和/ 或，
[0059]上述嵌合疫苗在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HAdV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0060]所述流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種；
[0061 ]所述 HAdV 為 3 型 HAdV 或 7 型 HAdV ；
[0062]所述3型HAdV具體為HAdV-3病毒株VR-3 ；
[0063]所述7 型 HAdV 具體為 HAdV-7 病毒株 GZ08，GenBank accession N0.GQ478341。
[0064]本發(fā)明提供的HAdV嵌合疫苗可以覆蓋HAdV傳染病病原體，保護(hù)更多人群免受流感病毒和HAdV感染，為實現(xiàn)“一苗兩用”或“一苗多用”奠定了基礎(chǔ)?！ぁ緦＠綀D】

【附圖說明】
[0065]圖1為構(gòu)建流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗的重組策略示意圖。
[0066]圖2為重組病毒rFLU/HAdV/NSl的電鏡形態(tài)學(xué)鑒定以及顆粒大小和分布情況。
[0067]圖3為小鼠免疫rFLU/HAdV/NSl的抗體效價測定結(jié)果。
[0068]圖4為小鼠免疫rFLU/HAdV/NSl產(chǎn)生IFN- y、IL-4細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0069]圖5為小鼠免疫rFLU/HAdV/NSl產(chǎn)生針對HAdV_3的黏膜抗體效價。
[0070]圖6為rFLU/HAdV/NSl免疫小鼠對腺病毒株攻擊的免疫保護(hù)效果。
【具體實施方式】
[0071 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0072]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0073]pAD3000 在文獻(xiàn)“Hoffmann E，Mahmood K, Yang CF, Webster RG, GreenbergHB，Kemble G.Rescue of influenza B virus from eight plasmids.Proc Natl AcadSc1.2002;99(17):11411-6.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。
[0074]6-8周齡BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。
[0075]10-12周齡的雪貂購自中國無錫Angora安哥魯公司。
[0076]2012-2013年流感病毒當(dāng)年流行株A/California/07/2009 (HlNl)由國家流感中心提供，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。分別擴(kuò)增該病毒株的HA、NA基因，再分別插入到雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體PAD3000的BsmBI位點，構(gòu)建得到該病毒株的重組質(zhì)粒pD-HA、pD-NA。
[0077]冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)(簡寫A/AA/6/60)在文獻(xiàn)“Yang P, Duan Y, Wang C, Xing L, Gao X, Tang C, Luo D, Zhao Z, Jia ff, Peng D, Liu X，WangX.1mmunogenicity and protective efficacy of a live attenuated vaccine againstthe2009pandemic A HlNlin mice and ferrets.Vaccine.2011Janl7; 29 (4):698-705.，，中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。該病毒株的6個內(nèi)部基因PB2、PBU PA、NP、NS、M，分別插入到雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體pAD3000的BsmBI位點，構(gòu)建得到該病毒的重組質(zhì)粒 pD-PB2、pD-PB UpD-PA, pD_NP、pD_NS、pD_M。
[0078]流感病毒A/PR/8/1934(PR8)病毒株在文獻(xiàn)“Li C，Yang P, Sun Y，Li T, WangC，Wang Z, Zou Z, Yan Y, Wang ff, Wang C，Chen Z, Xing L, Tang C，Ju X, Guo F，Deng J, ZhaoY, Yang P, Tang J, Wang H, Zhao Z, Yin Z, Cao B, Wang X, Jiang C.1L_17response mediatesacute lung injury induced by the2009pandemic influenza A (HlNl) virus.CellRes.2012Mar ;22(3):528-38.”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。
[0079]HAdV-3 病毒株 VR-3,購自 ATCC。
[0080]HAdV-7 病毒株GZO8 (GenBank accession N0.GQ478341)在文獻(xiàn)“Qiu H, Li X，TianX, Zhou Z, Xing K, Li H, Tang N, Liu ff, Bai P, Zhou R.Serotype-specific neutralizingantibody epitopes of human adenovirus type3(HAdV-3)and HAdV_7reside in multiplehexon hypervariable regions.J Virol.2012Aug; 86 (15): 7964-75.，，中公開過，公眾可從
中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得。
[0081]HAd V的六鄰體蛋白塔區(qū)由4個環(huán)(loop)構(gòu)成，即Loopl、Loop2、Loop3、Loop4區(qū)，下述實施例中L1、L2分別表示Loopl和Loop2。
[0082]實驗例1、流感病毒為載體的嵌合HAdV-HeXOn-Ll/L2優(yōu)勢抗原表位的HAdV嵌合疫苗 rFLU-HAdV/NSl 的制備
[0083]一、3 型和 7 型的 HAdV 中 Hexon_Ll/L2 (HAdV-Hexon_Ll/L2)優(yōu)勢抗原表位序列如SEQ ID N0.1所示,經(jīng)動物實驗和臨床病人血清驗證,符合下一步實驗要求。
[0084]二、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pHexon-Ll/L2_NSl
[0085]以冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的NSl基因片段為插入HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位基因的靶點，利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pHeXon-Ll/L2-NSl，具體策略如圖1A所示。
[0086]具體是將HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位基因插入到冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的NSl基因開放閱讀框(ORF)的前125氨基酸的編碼基因處，中間加入linker(5' -UAAUG-3')連接，I inker既有終止子作用，又有啟動子作用，最后是NEP蛋白的編碼基因，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pHexon-LI/L2-NSI。
[0087]步驟如下:
[0088](一)合成SEQID N0.2所示的DNA分子，SEQ ID N0.2中自5’末端起第I位至第14位為酶切位點，第15位至第41位為NSl基因3’NCR，第41位至第415位為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60NS基因開放讀碼框的自5’末端起第I位至第375位核苷酸，第416位至第420位為linker，第421位至第699位為HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位基因，第700位至第1162位為NS基因開放讀碼框的自5’末端起第376位至第838位核苷酸，第1163位至第1191位為NS基因5’ NCR,第1192位至第1203位為酶切位點。
[0089](二)BsmBI酶切SEQ ID N0.2所示的DNA分子，得到基因片段；BsmBI酶切pAD3000，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為PHexon-Ll/L2-NS1，將重組質(zhì)粒送測序結(jié)果正確。
[0090]三、將重組質(zhì)粒pHexon-L I/L2-NSI與冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的內(nèi)部病毒基因骨架PB2、PBl、PA、NP、M分別構(gòu)建的重組質(zhì)粒pD_PB2、pD-PBU pD_PA、pD_NP、pD-M，及流感病毒當(dāng)年流行株A/California/07/2009 (HlNl)的HA、NA基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pD-HA、pD-NA,共8種質(zhì)粒各0.2 μ g,等量混合加入10 μ L轉(zhuǎn)染試劑(Effectene,購自Qiagen公司)室溫作用lOmin，共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，33°C，5%C02,培養(yǎng)48_60h，得細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種9日齡SPF雞胚，33°C培養(yǎng)72h，收獲雞胚尿囊液測定HA血凝效價，HA血凝效價的檢測結(jié)果是I: 256-512，獲得嵌合HAdV-HeXOn-Ll/L2優(yōu)勢抗原表位的HAdV嵌合疫苗(rFLU-HAdV/NSl)ο
[0091]四、對步驟三獲得的嵌合疫苗株進(jìn)行鑒定，電鏡觀察病毒形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。圖2表明該疫苗株符合流感病毒典型形態(tài)特征，病毒顆粒大小在80-120nm之間。
[0092]五、將rFLU-HAdV/NSl接種9_11日齡SPF雞胚(購自北京實驗動物研究中心)傳代，取第二代雞胚尿囊液提取病毒RNA，經(jīng)過RT-PCR，擴(kuò)增出PB2、PBU PA, NP、HA、NA、M和NS共8個基因片段，分別將基因片段送公司測序，結(jié)果與預(yù)期基因序列一致。
[0093]六、將rFLU-HAdV/NSl經(jīng)雞胚大量培養(yǎng)，超濾濃縮、蔗糖梯度離心純化后，跑SDS-PAGE電泳，凝膠染色、脫色后，可檢測到相應(yīng)大小的NP、HA1、HA2、NEP蛋白，表明抗原的主要成分沒有丟失。 [0094]七、rFLU-HAdV/NSl的溫度敏感(temperature sensitive, ts)、冷適應(yīng)(coldadapted, ca)和減毒(attenuated, att)表型檢測
[0095]將rFLU-HAdV/NSl接種MDCK細(xì)胞或9-11日齡雞胚，分別于25、33、37和39°C條件下培養(yǎng)3天，收集細(xì)胞上清或雞胚尿囊液測定病毒滴度。結(jié)果表明，該疫苗株具有ts、ca表型。同時，該疫苗株在BALB/c小鼠和10-12周齡的雪貂上表現(xiàn)減毒表型。
[0096]八、rFLU-HAdV/NSl在小鼠體內(nèi)的免疫效果
[0097](一)將rFLU-HAdV/NSl經(jīng)超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心純化后，制備該疫苗的減毒活疫苗劑型。
[0098]選用6-8周齡BALB/c小鼠，分為疫苗組和對照組，每組20只。
[0099]疫苗組:將該疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫2次，間隔2周，設(shè)置免疫劑量為IO4TCID50, IO5TCID50 兩個劑量組，體積為 20 μ I。
[0100]對照組:PBS代替疫苗，同時免疫方式、免疫體積及免疫時間與疫苗組一致。將疫苗組和對照組分別于初次免疫后、加強(qiáng)免疫后2周，經(jīng)小鼠尾靜脈采血，離心收集各組小鼠的血清。采用HI方法測定血清中針對野生型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的抗體效價，同時采用微量中和方法檢測血清中針對HAdV-3病毒株VR-3的特異性抗體產(chǎn)生情況,結(jié)果如圖3所示，圖3中，*代表與對照組相比，p〈0.05 代表與對照組相比，p〈0.01。
[0101]圖3A為血清中針對野生型流感病毒A/California/07/2009 (HlNl)的抗體效價測定結(jié)果。
[0102]圖3B為血清中針對HAdV-3病毒株VR-3的特異性抗體產(chǎn)生情況測定結(jié)果。
[0103]圖3表明，實驗組針對野生型流感病毒A/California/07/2009 (HlNl)的HI中和效價及針對HAdV-3病毒株VR-3的中和抗體效價分別與PBS組比效價顯著升高，表明流感病毒為載體的HAdV嵌合疫苗(rFLU-HAdV/NSl)免疫動物后，血清中可檢測到針對HAdV和流感病毒的高水平的特異性抗體效價，表明該疫苗免疫動物后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對HAdV和流感病毒的雙重免疫應(yīng)答。
[0104](二)采用步驟(一)相同的方法用rFLU-HAdV/NSl分別滴鼻免疫BALB/c小鼠，并設(shè)置對照，于加強(qiáng)免疫后2周，處死動物，分離脾淋巴細(xì)胞，ELISP0T方法檢測疫苗株免疫動物后產(chǎn)生IFN- Y和IL-4細(xì)胞免疫應(yīng)答，結(jié)果分別如圖4A和圖4B所示，圖4中，**代表與對照組相比，P〈0.01。
[0105]圖4表明，rFLU-HAdV/NSl滴鼻免疫后小鼠機(jī)體可產(chǎn)生針對流感病毒PR8和HAdV-3病毒株VR-3的IFN-Y、IL-4細(xì)胞免疫反應(yīng)，與PBS組比差異極顯著(p〈0.01)，表明重組病毒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0106](三)采用步驟(一)相同的方法用rFLU-HAdV/NSl滴鼻免疫BALB/c小鼠，并設(shè)置對照，于加強(qiáng)免疫后2周，ELISA法檢測小鼠肺、鼻灌洗液中針對HAdV-3病毒株VR-3的slgA抗體效價，結(jié)果分別如圖5A和圖5B所示，圖5中，*代表與對照組相比，p〈0.05 代表與對照組相比，P〈0.01。
[0107]圖5表明，rFLU-HAdV/NSl滴鼻免疫后小鼠鼻、肺灌洗液中slgA抗體明顯升高，與PBS組比差異極顯著(p〈0.01)，表明重組病毒能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的黏膜免疫反應(yīng)。
[0108]九、動物保護(hù)性實驗
[0109]采用步驟八的方法用rFLU-HAdV/NSl滴鼻免疫BALB/c小鼠，并設(shè)置對照，于加強(qiáng)免疫后2周，分別用臨床分離的病毒株HAdV-3 (VR-3)、HAdV-7 (GZ08)攻擊BALB/c小鼠，感染劑量為2X IO9VPs,取各組小鼠的肺組織以及正常小鼠的肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢測，結(jié)果如圖6A所示。`
[0110]圖6A表明，PBS組小鼠的肺病理變化明顯，鏡下可見肺水腫，大量炎性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡間質(zhì)增厚，而正常小鼠肺組織形態(tài)完好。rFLU-HAdV/NSl組小鼠肺組織病理病變較PBS組明顯改善，其中IO5TCID5tl高劑量組優(yōu)于IO4TCID5tl低劑量組。
[0111]采用qPCR方法對各組小鼠的肺內(nèi)病毒拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果分別如圖6B和6C所示，圖6中，*代表與對照組相比，p〈0.05。
[0112]圖6B 和 6C 表明，rFLU-HAdV/NSl 組小鼠肺內(nèi)病毒 HAdV-3 (VR-3),HAdV-7 (GZ08)的復(fù)制數(shù)均較PBS組明顯降低。
[0113]結(jié)果表明，重組疫苗rFLU-HAdV/NSl免疫后小鼠獲得了針對HAdV的免疫保護(hù)性抗體。
[0114]實驗例2、流感病毒為載體的嵌合HAdV-HeXOn-Ll/L2優(yōu)勢抗原表位的HAdV嵌合疫苗rFLU-HAdV/M的制備
[0115]一、3型和7型的HAdV中HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位序列如SEQ ID N0.1所示，按照實施例1中步驟一的方法驗證，符合下一步實驗要求。
[0116]二、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pHexon-Ll/L2-M
[0117]以冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的M基因片段為插入HAdV-Hexon-Ll/L2優(yōu)勢抗原表位基因的靶點，利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pHeXon-Ll/L2-M，具體策略如圖1B所示。
[0118]具體是將HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位基因插入到冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的M基因開放閱讀框(ORF)的前222位核苷酸和后222位核苷酸之間，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pHexon-L I/L2-M。
[0119]步驟如下:
[0120](一)合成SEQID N0.3所示的DNA分子，SEQ ID N0.3中自5’末端起第I位至第
15位為酶切位點，第16位至第40位為M基因3’NCR，第40位至第261位為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60M基因開放讀碼框的自5’末端起從第I位到第222位核苷酸，第262位至第537位為HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位基因，第538位至第759位為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60M基因開放讀碼框的自5’末端起從第761位到第982位核苷酸，第760位至第782位為M基因5’ NCR,第783位至第794位為酶切位點。
[0121](二)BsmBI酶切SEQ ID N0.3所示的DNA分子，得到基因片段；BsmBI酶切pAD3000，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pHexon-Ll/L2-M,將重組質(zhì)粒送測序結(jié)果正確。
[0122]三、將重組質(zhì)粒pHexon-Ll/L2_M，與冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/AA/6/60的內(nèi)部病毒基因骨架PB2、PBl、PA、NP和NS分別構(gòu)建的重組質(zhì)粒pD_PB2、pD_PBl、pD_PA、pD_NP、pD-NS，及流感病毒當(dāng)年流行株A/California/07/2009 (H1N1)的HA、NA基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pD-HA、pD-NA,按照實施例1中步驟三的方法將8種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，37°C，5%C02，培養(yǎng)48-60h，得細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種9日齡SPF雞胚，35°C培養(yǎng)72h，收獲雞胚尿囊液獲得嵌合HAdV-Hexon-LI/L2優(yōu)勢抗原表位的HAdV嵌合疫苗株(rFLU-HAdV/M)。
[0123]四、對步驟三獲得的疫苗株進(jìn)行鑒定，電鏡觀察病毒形態(tài)，結(jié)果表明該疫苗株符合流感病毒典型形態(tài)特征。
[0124]五、將rFLU-HAdV·/M接種9_11日齡SPF雞胚(購自北京實驗動物研究中心)傳代，取第二代雞胚尿囊液提取病毒RNA，經(jīng)過RT-PCR，擴(kuò)增出PB2、PBU PA、NP、HA、NA、M和NS共8個基因片段，分別將基因片段送公司測序，結(jié)果與預(yù)期基因序列一致。
[0125]六、將rFLU-HAdV/M經(jīng)雞胚大量培養(yǎng)，超濾濃縮、蔗糖梯度離心純化后，跑SDS-PAGE電泳，抗原的主要成分存在。
[0126]七、rFLU-HAdV/M的溫度敏感(temperature sensitive, ts)、冷適應(yīng)(coldadapted, ca)和減毒(attenuated, att)表型檢測
[0127]將rFLU-HAdV/M接種MDCK細(xì)胞或9-11日齡雞胚，分別于25、33、37和39°C條件下培養(yǎng)3天，收集細(xì)胞上清或雞胚尿囊液測定病毒滴度。結(jié)果表明，該疫苗株具有ts、ca表型。同時，該疫苗株在BALB/c小鼠和雪貂動物上表現(xiàn)減毒表型。
[0128]八、rFLU-HAdV/M在小鼠體內(nèi)的免疫效果
[0129]將rFLU-HAdV/M經(jīng)超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心純化后，制備該疫苗的減毒活疫苗劑型。
[0130]選用6-8周齡BALB/c小鼠，分為疫苗組和對照組，每組20只。
[0131 ] 按照實施例1的步驟八的方法對小鼠進(jìn)行rFLU-HAdV/M的免疫，同時設(shè)置對照組。
[0132]將疫苗組和對照組分別于初次免疫后、加強(qiáng)免疫后2周，經(jīng)小鼠尾靜脈采血，離心收集各組小鼠的血清。
[0133]采用HI方法測定血清中針對野生型流感病毒A/California/07/2009 (HlNl)的抗體效價，同時采用微量中和方法檢測血清中針對HAdV-3病毒株VR-3的特異性抗體產(chǎn)生情況，結(jié)果如表2所示。
[0134]表2rFLU_HAdV/M的免疫效果檢測
[0135]
【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.1所示的DNA分子。
2.一種重組病毒，該病毒按照如下方法制備: 將分別含有冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因、冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因和冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的表達(dá)質(zhì)粒，以及分別含有靶標(biāo)流感病毒的HA基因和靶標(biāo)流感病毒的NA基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到重組流感病毒； 在如下所述基因中的至少一種基因的開放讀碼框中的任意位置插入或替換為HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因: (1)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PB2基因； (2)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PBl基因； (3)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的PA基因； (4)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NP基因； (5)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因； (6)冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因； (7)靶標(biāo)流感病毒的HA基因； (8)靶標(biāo)流感病毒的NA基因； 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因為HAdV的六鄰體蛋白全基因和/或HAdV的六鄰體蛋白的優(yōu)勢抗原表位基因。`
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的病毒，其特征在于:所述宿主細(xì)胞為MDCK、Vero、293T、C0S細(xì)胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培養(yǎng)的細(xì)胞； 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因為HAdV的六鄰體蛋白塔區(qū)Loopl和Loop2的優(yōu)勢抗原表位基因的融合基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的病毒，其特征在于:所述HAdV為3型HAdV或7型HAdV； 所述3型HAdV具體為HAdV-3病毒株VR-3 ； 所述 7 型 HAdV 具體為 HAdV-7 病毒株 GZ08，GenBank accession N0.GQ478341。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的病毒，其特征在于:所述HAdV的六鄰體蛋白塔區(qū)Loopl和Loop2的優(yōu)勢抗原表位基因的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一所述的病毒，其特征在于:所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間； 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因與所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位核苷酸之間連有5’ -UAAUG-3’序列； 和/或， 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換； 和/或， 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述靶標(biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一所述的病毒，其特征在于:所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒為冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒或冷適應(yīng)、減毒B型流感病毒； 所述冷適應(yīng)、減毒A型流感病毒具體為H2N2亞型冷適應(yīng)、減毒流感病毒，再具體為冷適應(yīng)、減毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)； 所述靶標(biāo)流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種，再具體為HlNl亞型流感病毒，再具體為流感病毒株A/California/07/2009 (HlNl)0
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一所述的病毒，其特征在于:所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因插在所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的NS基因的開放讀碼框的自5’末端起第375位至第376位核苷酸之間所得序列為SEQ ID N0.2中第41-1162位核苷酸所示； 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因是將所述冷適應(yīng)、減毒流感病毒的M基因的開放讀碼框的自5’末端起第223位核苷酸至第760位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.3中第40-759位核苷酸所示； 所述HAdV的結(jié)構(gòu)蛋白基因?qū)⑺霭袠?biāo)流感病毒的NA基因的開放讀碼框的自5’末端起第184位核苷酸至第1253位核苷酸替換所得序列為SEQ ID N0.4中第35-650位核苷酸所示。
9.由權(quán)利要求2-8任一所述的病毒制備得到的嵌合疫苗。
10.權(quán)利要求1所述的DNA分子在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HAdV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 和/或， 權(quán)利要求2-8任一所述的病毒在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HAdV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；` 和/或， 權(quán)利要求9所述的嵌合疫苗在制備預(yù)防和/或治療流感病毒和/或HAdV引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述流感病毒為A型流感病毒或B型流感病毒，所述A型流感病毒具體為Hl亞型-H16亞型中的任意一種； 所述HAdV為3型HAdV或7型HAdV。
【文檔編號】A61P31/16GK103865923SQ201410041722
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】楊鵬輝, 王希良, 張紹庚, 劉娜, 段躍強(qiáng), 張培瑞, 李志偉, 王兆海 申請人:中國人民解放軍第三0二醫(yī)院